专利名称：重组人类子宫珠蛋白在炎症类和纤维变性类疾病治疗中的应用的制作方法
技术领域：
概略地，本发明涉及利用天然人子宫珠蛋白(hUG)或重组人子宫珠蛋白(rhUG)治疗炎症类和纤维变性类疾病。人们已经确定UG(hUG或rhUG)的新的生理作用和疗法。具体地，本发明涉及通过施用hUG或rhUG抑制PLA2s和/或防止纤连蛋白沉淀的方法以治疗炎症类和纤维变性类疾病。此外，本发明提供具有炎症和纤维变性特征的疾病的治疗方法，这些疾病如新生儿呼吸窘迫综合症(RDS)、一种危险的临床疾病-支气管肺发育不良(BPD)和肾病之一的肾小球性肾炎。本发明也提供通过施用子宫珠蛋白促使肿瘤经其受体得到抑制以治疗癌症的方法。更进一步，本发明提供从产生子宫珠蛋白受体的细胞中纯化此类受体以及利用纯化的受体确定UG受体配基和子宫珠蛋白结构类似物的方法。
本申请引用的文件涉及本发明现有技术的，其中的每一方面在此均被引入作为参考。
背景技术：
炎症类，纤维变性类和癌症疾病近年来，有关炎症类和纤维变性类疾病的治疗药物的研发引起了更广泛的关注。新生婴儿呼吸窘迫综合症是肺泡表面活性剂缺乏性疾病。由于这种疾病是造成早产儿死亡的主要原因，因而更引起了人们的特别关注。虽然表面活性剂疗法的引用可显著地提高RDS病人的存活率，但患者中慢性炎症类和纤维变性类疾病发生的显著比例仍然是主要问题。同样地，当患者的肾脏因堵塞而不能其发挥滤血功能时，遗传性纤连蛋白沉淀性肾小球肾炎就会导致晚期肾衰竭。肾炎具有纤连蛋白沉淀和肾纤维变性的特征，这将致使肾功能衰竭，最后，会致使肾不能支持生命体的活动。
PLA2(磷脂酶A2)是水解甘油磷脂Sn2位点酯键的内源酶，该酶是参与炎症类和纤维变性类疾病的众多蛋白之一。PLA2也能水解肺泡表面活性剂的磷脂。子宫珠蛋白(也称CC10,CC16,CC17，尿蛋白-1,P-1，孕酮结合蛋白，PCB结合蛋白，克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)，胚泡激酞，视黄酮结合蛋白，磷脂结合蛋白，α2微球蛋白)可抑制体外PLA2的活性。
子宫珠蛋白是小球状同源二聚体蛋白。该蛋白的分子量为15.8kDa，但它在电泳凝胶中的移动却与10kDa大小的蛋白相一致。在成年人的肺部，人类子宫珠蛋白的含量丰富，约占可溶性蛋白总量的7％。但在发育的人类胎儿体内，直到妊辰后期人类子宫珠蛋白的表达才被完全激活。因而，足月前婴儿的细胞外肺液中人类子宫珠蛋白的含量远低于成人体内的含量。胰脏中也有UG的表达。
由于PLA2s从胞外磷脂库释放花生四烯酸(AA)，因而其在炎症性应答中发挥决定性作用。在称为花生四烯酸级联的应答过程中，AA可被代谢成若干有效的炎症性介质。
数种急性和慢性临床疾病的特征是血浆或局部PLA2活性升高(见下文表1)。
表1．与LA2活力相关的临床疾病
a成人呼吸窘迫综合症现在还没有有效的PLA2抑制剂可供临床使用。到目前为止，只有少数PLA2抑制剂进入临床试验阶段，但还没有一种抑制剂能投放市场。
纤连蛋白(Fn)是200kDa的糖蛋白，它以数种不同形式存在并被分泌到不同组织中。Fn是一种必需的糖蛋白，小鼠Fn基因的靶向破坏显示了其在胚胎发育中的主要作用。在炎症、细胞粘着、组织修复和纤维样变性过程中，Fn也起着关键的作用并沉淀在受伤部位。血浆纤连蛋白(pFn)由肝脏分泌并在血浆中循环。在肺部，当炎症和伤痛发生时，细胞纤连蛋白即可被分泌。上述两种形式的纤连蛋白是炎症细胞和成纤维细胞的趋化性因子。当炎症发生时，大量炎症细胞和成纤维细胞会浸入肺部，这能致使肺部纤维样变性和最终的死亡。在人类临床疾病，如婴儿呼吸窘迫综合症，支气管肺发育障碍和肾小球性肾炎的病人体内，人们已检测到高水平的Fn。
癌症的治疗性和预防性药物的研发代表了人们向科学和药物的不间断的挑战。因为癌细胞不能被免疫系统作为异物所识别，所以它们能不受抑制的生长直至重要的身体机能受到影响。现在，癌症的治疗方法主要包括化疗和放疗，而上述两种疗法对癌细胞和正常细胞同样是高度有害的。到目前为止，人们已经找到非自然发生的，无毒害的，抑制肿瘤细胞生长的胞外因子。UG的作用纯化的人子宫珠蛋白的氨基酸序列分析显示它与其他的UG类蛋白如兔子宫珠蛋白结构上相似，但不完全一致。人类子宫珠蛋白与兔子宫珠蛋白的70个氨基酸中的39个是完全相同的(见
图1)。UG类蛋白包括人UG/CC10、大鼠CC10、小鼠CC10、和兔UG。这些子宫珠蛋白在抗原性方面表现出种属专一性和组织专一性的差异，同时在组织分布以及体外生化活力方面也具有差异。关于UG类蛋白的组织和种属起源，已经有多种不同的叙述，如鼠肺、人尿、唾液、血液组分、兔的子宫、鼠和人类的前列腺、和人肺。目前，这些蛋白的生理学作用还不清楚。
尽管经过多年的研究，人们对这些蛋白在体内的生物学作用仍然不清楚。UG类蛋白之间结构一致性的缺乏使得基于体外试验或其他结构相关蛋白表现出的活性所作的预测--某种蛋白在人类体内是否具有治疗功能，难以成立。例如，在同样的实验中，人子宫珠蛋白所结合的孕酮的量少于兔子宫珠蛋白结合的孕酮量的5％。人子宫珠蛋白的等电点(4.6)低于兔子宫珠蛋白的等电点(5.4)。
Stipp等(1996)报道了关于可产生中止子宫珠蛋白表达的子宫珠蛋白剔除小鼠方面的研究进展。这种小鼠具有克拉拉(Clara)细胞，该细胞具有替代原有子宫珠蛋白分泌颗粒体的奇特的胞内结构。除此之外，该细胞没有其他表型。由于可预期伴随有肺炎和纤维变性的肺功能，因而，此项发明是非常有意义的。而且，这种剔除小鼠没有肾脏、胰脏或生殖系统异常的证据，这就暗示出子宫珠蛋白在控制体内纤维样变性的炎症方面不具备显著的作用。
Leyton等(1994)报道了子宫珠蛋白的抗转移特性，这一特性归因于子宫珠蛋白对肿瘤细胞释放花生四烯酸的抑制作用(授于Patierno等人的美国第5,696,092号专利)。借助多种类型的肿瘤细胞，Kundu等(1996)继续了这方面的研究，并发现了ECM的侵害性抑制作用。在效应细胞中，ECM入侵与190kDa的UG结合蛋白的存在相关。子宫珠蛋白无法抑制缺乏UG结合蛋白的细胞的ECM入侵活力。
发明目的因此，本发明的目的是提供预防或治疗早期癌细胞生长的方法，该方法包括施用肿瘤抑制有效量的重组人子宫珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物。
本发明更进一步的目的是提供由肿瘤抑制有效量的rhUG和药品上可接受的载体或稀释剂组成的药物组合物。上述组合物应由还原型和非还原型、单体和二聚体rhUG混合物组成。优选地，该组合物应由还原型单体rhUG组成。
本发明另外的目的是提供通过抑制纤连蛋白凝集和/或沉淀而预防和治疗肿瘤转移的方法，该方法包括施用抑制纤连蛋白有效量的rhUG或其片段或其衍生物。
更进一步，本发明的目的是提供刺激血细胞生成的方法，该方法由施用血细胞生成有效量的rhUG或其片段或其衍生物组成。
再进一步，本发明的目的是提供包含血细胞生成刺激有效量的rhUG或其片段或其衍生物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
本发明另外的目的是提供从样品中纯化子宫珠蛋白受体的方法，该方法包含下列步骤(a)使该样品与结合在在固相支持物上的rhUG接触；(b)从固相支持物上洗脱子宫珠蛋白受体的纯化样品。
更进一步，本发明的目的是提供纯化的，并可用于筛选含有化合物、多肽或蛋白的样品的子宫珠蛋白受体。上述的化合物、多肽或蛋白均是UG结构类似物和/或UG受体的配基。
最后，本发明的目的是提供靶向子宫珠蛋白受体的方法，该方法即施用有效量的rhUG以治疗或预防早期癌细胞生长和肿瘤的转移，或刺激血细胞生成。
发明概述现在已知，在体内PLA2s的抑制和防止纤连蛋白沉淀及纤维样变性方面，子宫珠蛋白发挥着主要的生理作用。在转基因剔除小鼠的新品系以及涉及肺炎和纤维样变性的新生儿呼吸窘迫综合症(RDS)的猴子模型中所进行的结合实验证实了这些影响。本发明中的珠蛋白剔除小鼠(下文称UG KO小鼠)表现出致死性肾小球性肾炎和肾实质纤维变性，这两种疾病分别是早期和晚期发作性疾病。对正常小鼠施用外源性Fn会在其肾脏引起Fn的沉积，但施用等摩尔量的Fn和rhUG则不会出现上述现象。
rhUG的存在会引起体内PLA2活性的下降。在第一个实验中，UG KO小鼠的表型显示与同窝出生且具有功能性UG基因的小鼠的血浆中PLA2的活性相比，UG缺乏时血浆中PLA2的活性显著地提高。在第二个实验中，对RDS早期的猴子施用rhUG的结果显示肺泡外液中PLA2的活性受到了抑制。
其余的实验证实在体外条件下，PLA2能降解用于RDS治疗的人工表面活性剂(典型的表面活性剂如Survanta)，而UG能抑制PLA2的降解作用。这些实验证实经气管或静脉施用UG后，UG介导了PLA2的抑制和Fn的沉淀。
子宫珠蛋白剔除小鼠的实验证实rhUG可应用于一些疾病的治疗中，该疾病与子宫珠蛋白的不足或这种蛋白本身发生了功能性的变性有关。现在，人们又发现rhUG可用于治疗或预防炎症类或纤维变性类疾病，这些疾病与循环中或炎症、纤维变性部位的功能性内源rhUG的不足有关。在某种肺炎或纤维变性类疾病中，包括有可能发展成新生儿BPD的早产婴儿，人们已经发现其血浆和/或支气管肺泡灌洗液中hUG水平的下降。因而，UG可用于补充不足的或防御性内源子宫珠蛋白以预防或治疗上述炎症类和纤维变性类疾病。
在腺癌和致癌性病毒转化的上皮细胞中，子宫珠蛋白的表达剧烈地减少或完全消失。通过用人类子宫珠蛋白(hUG)-cDNA构建体稳定转染腺癌细胞，可发现抑制贴壁不依赖性生长和胞外基质入侵的强制性UG表达仅存在于表达了UG受体的细胞中。利用纯化的hUG进行的受体阳性细胞的治疗也出现了同样的结果。这些资料显示UG既通过自分泌途径又通过旁分泌途径发挥其对癌细胞的抑制作用。这是对细胞外肿瘤抑制剂的首次证明和第一次表明子宫珠蛋白可以被用于治疗原发癌和转移癌。而且，现在已经发现成年的UG缺陷小鼠可以形成肿瘤，这证明了UG所具有的体内肿瘤抑制剂的特性。
根据其中的一个方面，本发明提供预防或治疗原发癌细胞生长的方法，该方法由施用肿瘤抑制有效量的重组人子宫珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物组成。
根据更进一步的方面，本发明提供预防或治疗原发癌细胞生长的方法，该方法由施用肿瘤抑制有效量的重组人子宫珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物以靶向子宫珠蛋白受体组成。
更进一步，本发明提供由肿瘤抑制有效量的rhUG和可用于制药的载体或稀释剂组成的药物组合物。在优选的实施方案中，rhUG是还原型的和单体的，且纯度为约75％～约100％，更优选地，纯度为约90％～100％最优选地，纯度至少为约95％。
此外，本发明提供通过抑制纤连蛋白聚集和/或沉淀以预防和治疗肿瘤转移的方法，该方法由施用纤连蛋白抑制有效量的rhUG或其片段或其衍生物组成。本发明的这一方面还包括施用纤连蛋白抑制有效剂量的rhUG以靶向子宫珠蛋白的受体。
更进一步，本发明提供刺激造血作用的方法，该方法由施用刺激造血有效量的rhUG或其片段或其衍生物组成，其中还包括施用纤连蛋白抑制有效量的rhUG以靶向子宫珠蛋白的受体。
本发明也提供由刺激造血有效量的rhUG或其片段或其衍生物和药学上可接受的载体或稀释剂组成的药物组合物，其中rhUG具有约75％～约100％的纯度，更优选地，具有约90％～约100％的纯度，最优选地，具有至少95％的纯度。
另一方面，本发明提供从产生子宫珠蛋白受体的细胞样品中纯化该受体的方法，该方法由下列步骤组成使该样品与结合在固相支持物上的rhUG接触；从固相支持物上洗脱子宫珠蛋白受体的纯化样品。
本发明也提供还原型rhUG的制备方法，该方法由使氧化型rhUG与还原试剂如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇接触一段时间并确保足够的温度以还原rhUG组成。在优选的实施方案中，还原型rhUG是单体的。
更进一步，本发明提供制备子宫珠蛋白受体的抗体的方法，该方法由用纯化的子宫珠蛋白受体免疫动物和分离所得抗体组成。
最后，本发明提供可用于筛选含有化合物、多肽或蛋白的样品的子宫珠蛋白受体。上述的化合物、多肽或蛋白均是UG结构类似物和/或UG受体的配基。关于这一点上，子宫珠蛋白受体可应用于试剂盒中用以筛选含有化合物、多肽或蛋白的样品。上述的化合物、多肽或蛋白均是UG结构类似物和/或UG受体的配基。
附图简述本发明将参照附图更详细地描述如下图1表示UG类蛋白的序列对比；图2表示转基因剔除小鼠的预期靶结构；限制性位点B表示BamⅢ,E表示EcoRⅠ,H表示HindⅢ；图2B-2D表示通过PCR和Southern印迹分析进行的转基因胚胎子代的基因组结构的检定；(B)ES R1靶细胞克隆的Southern印迹分析，其中wt表示野生型；(C)来源于子代尾部活体组织的基因组DNA的典型PCR分析；基因型和相应PGR产物如下UG+/+,304bp；UG+/-,304和667bp；UG-/-,667bp；(D)小鼠尾部基因组DNA的Southern印迹；图2E表示RT-PCR分析证实UG-/-小鼠肺部组织中UG-mRNA的缺失；同窝出生且分别具有UG+/+,UG+/-,UG-/-基因型小鼠的肺部组织总RNA的RT-PCR分析；在UG+/+和UG+/-基因型小鼠的肺中，可检测到273bp的RT-PCR产物，但UG-/-基因型小鼠肺中却缺乏上述产物；图2F表示Western印迹分析证实UG-/-小鼠肺部组织中UG蛋白的缺乏；在非还原条件下，用4～20％的梯度SDS-PAGE对来源于肺溶解产物的蛋白(每一30微克)进行分析，并与兔抗鼠UG进行免疫杂交；图2G表示免疫组织化学法证实UG-/-小鼠肺组织切片中UG的缺乏；UG+/+小鼠(上图)的支气管上皮细胞上的黑色斑点显示UG的免疫反应性；下图显示UG-/-小鼠肺中UG的免疫反应性的缺乏。
图3A-3J为正常小鼠与UG-/-小鼠肾脏切片的组织病理学比较分析，其结果显示只有在剔除小鼠体内，才会发生非正常的实质性纤维变性和肾小球纤连蛋白沉淀；UG+/+小鼠(A)与同窝出生且基因型为UG-/-小鼠(B)的肾脏苏木精和伊红染色切片；(C)10月龄的小鼠肾切片，患有严重的实质纤维变性；(D)表示(C)中同一小鼠肾脏的一个区域，该区域显示出肾小管增生(放大倍数40倍，g表示肾小球；f表示纤维变性；t表示肾小管)；(E)患有严重肾病的UG-/-小鼠肾小球沉淀的透射电镜图(放大倍数6,000倍)；(F)表示(E)中放大60,000倍的插图，该图表示胶原蛋白的长线状纤丝结构以及与纤连蛋白相一致的短扩散状结构；(G)用小鼠Fn抗体进行的UG+/+小鼠肾脏切片的Fn免疫荧光检测；(H)患有严重肾病的UG-/-小鼠肾脏切片的Fn免疫荧光检测；UG+/+小鼠(I)和UG-/-小鼠(J)肾脏切片的Mason’s trichrome染色；UG-/-小鼠肾脏切片中肾小球上浅蓝色斑点为胶原蛋白(放大倍数40倍)。
图4A表示Fn的聚集仅存在于UG-/-小鼠的肾脏中；来源于UG+/+小鼠和UG-/-小鼠的血浆、肾脏和肝脏的Fn的免疫沉淀和Western印迹；多亚基Fn条带(粗箭头)仅存在于UG-/-小鼠肾脏的裂解产物中。
图4B和4C表示体外UG-Fn复合物的形成；(B)等摩尔浓度UG和Fn的温育，再用UG或Fn抗体进行的免疫沉淀和Western印迹分析；免疫沉淀既包含Fn(泳道2上图)，又包含UG(泳道2，下图)；上下两图的泳道1表示UG和Fn的标准样；(C)4℃温育等摩尔浓度125I-UG和Fn一小时，再用6％非还原、非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳以分离上述混合物；泳道1，考马斯亮蓝染色的UG-Fn复合物；泳道2，UG-Fn复合物的放射自显影图。
图4D表示UG-Fn复合物存在于正常的、非UG-/-小鼠的血浆中；利用Fn抗体进行的UG+/+小鼠和UG-/-小鼠血浆的免疫沉淀以及利用Fn和UG抗体进行的Western印迹；Fn(上图)；UG(下图)；Std表示UG和Fn的标准样；
图4E表示体外经UG得到的Fn自聚体的剂量依赖性抑制；在UG缺乏(泳道2)和各种剂量UG(泳道3-5)存在条件下，125I-Fn与非标记Fn的亲和交联；UG缺乏条件下形成的高分子量、放射性Fn条带以剂量依赖性方式还原；泳道1，当UG和DSS缺乏时，125I-Fn与非标记Fn的亲和交联；空心箭头所示为多聚体Fn；下方细箭头所示为220kDa Fn。
图4F表示UG抑制Fn胶原复合物的形成；在UG缺乏(泳道3)和存在(泳道4)条件下，125I-胶原蛋白I与非标记Fn的亲和交联；泳道1，经考马斯亮蓝染色的胶原蛋白I；胶原蛋白I的α1-α1链和胶原蛋白I的α2-α2链；泳道2,UG和DSS缺乏时，125I-胶原蛋白I与非标记Fn的亲和交联。
图5A-5F表示UG缺乏条件下，正常小鼠和UG-/-小鼠肾脏Fn沉淀的免疫组织化学分析；(A)静脉注射等摩尔浓度Fn和UG的野生型小鼠的肾脏切片；(B)静脉注射(A)中相同剂量Fn但无UG的UG+/+小鼠的肾脏切片；(C)静脉注射Fn和UG混合物的、且明显健康的UG-/-小鼠肾脏切片；(D)静脉注射Fn(Fn的量与(C)中相同，但无UG)的UG-/-小鼠的肾脏切片；(E)生长于只添加可溶性Fn培养基上的培养细胞内的Fn-原纤维的生成；(F)与(E)完全相同的细胞培养，但其培养基内含有等摩尔浓度可溶性hFn和UG混合物(放大倍数40倍，g表示肾小球)。
图6A-6B表示为检测临床样品中UG-Fn复合物而进行的症状分析的流程图；图7表示UG二聚体可通过8.0kDa MWCO透析膜，但无法通过3.4kDa MWCO透析膜。
图8表示125I-hUG(还原型)与NIH 3T3细胞特异性结合的斯卡查德(Scatchard)图；图中的数据来自三次实验，其中的每一数据点表示三次实验数据的均值。
图9表示hUG结合蛋白与NIH 3T3(泳道1-3)，肥大细胞瘤(泳道4-5)，肉瘤(泳道6-7)，淋巴瘤(泳道8-9)细胞亲和交联的SDS-PAGE的放射自显影图。将还原型125I-hUG分别与上述每种细胞进行培养以促使二者在非标记的，还原型hUG缺乏或存在条件下的结合，再将其与二琥珀酰亚胺基辛二酸(DSS)进行交联(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS；泳道3:(+)非标记hUG,(+)DSS；泳道4:(+)DSS；泳道5:(+)非标记hUG,(+)DSS；泳道6:(+)DSS；泳道7:(+)非标记还原型hUG,(+)DSS；泳道8:(+)DSS；泳道9:(+)非标记还原型hUG,(+)DSS；)。
图10表示亲和纯化的UG结合蛋白SDS-PAGE分析的放射自显影图。
图11表示不同的细胞因子和其他试剂对UG结合蛋白表达的影响的SDS-PAGE分析的放射自显影图。
图12表示从Prc/RSV-hUG转染的和野生型(WT)的子宫腺癌和前列腺癌中提取的总RNA的RT-PCR分析。泳道1和泳道2代表不同的克隆的分离株。图12B表示非转染的和转染的细胞群产生的子宫珠蛋白的Western印迹分析。
图13A和13B表示HEC-1A细胞侵入ECM时，hUG诱导表达的结果。
图14 HEC-1A(a)表示软琼脂上对照细胞(pRC/RSV载体单独转染子宫腺癌细胞)的形态学，而HEC-1A(b)表示hUG表达构建体转染的细胞的形态学。
图15表示UG-受体存在于HEC-1A(效应器)细胞中，但不存在于HTB-81(非效应器)细胞中(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS；和泳道3:(+)hUG,(+)DSS)。在非转染的(a)和pRSV/hUG转染的HEC-1A与HTB-81细胞内，125I-hUG与其结合蛋白的亲和交联。在非标记的，还原型hUG缺乏和存在条件下，用还原型125I-hUG培养这些细胞以促使二者间的结合，然后再用DSS进行交联。
优选实施方案的详述rHUG本发明的rHUG具有与天然人子宫珠蛋白基本上相同的氨基酸序列。具有与天然人子宫珠蛋白“基本上相同”相同的氨基酸序列的一段氨基酸序列包括与天然人类子宫珠蛋白具有至少75％同源性的rHUG。在更优选的实施方案中，rHUG至少具有85％的同源性，最优选地，rHUG与天然UG至少具有98％同源性。
本发明提供的方法还包括UG片段或衍生物的应用。术语“片段”是指具有天然蛋白序列中六个或更多连续氨基酸的天然hUG氨基酸序列的一部分。术语“衍生物”是指UG多肽类似物，包括一个或更多氨基酸的替代和/或一个或更多化学部分的添加，如酰化试剂，磺酸化试剂，二硫键的羧甲基化，或复合的或螯合的金属或盐离子，如Mg+2,Ca+2,Na+，但所有这些修饰的前提条件是该衍生物保留了母体分子的生物学活性。
UG类蛋白包括从小鼠，大鼠，兔等分离，并基本上具有与天然人子宫珠蛋白相同的氨基酸序列和/或基本上具有序列相似性的蛋白。关于序列相似性，UG类蛋白中氨基酸可进行替代，如酪氨酸替代苯丙氨酸或甘氨酸替代丙氨酸。基本上类似的UG类蛋白大约具有30％的序列相似性。优选地，具有50％的序列相似性，更优选地，至少具有75％的序列相似性，最优选地，至少具有90～95％的序列相似性。UG受体配基是与UG受体结合并调节其全部或部分活力的多肽，蛋白或化学组分(如有机配基)。子宫珠蛋白结构类似物是具有与天然子宫珠蛋白基本上相似的二级和三级结构特征的化合物，多肽或蛋白，或片段或由此而来的衍生物。同时，该结构类似物至少保留天然蛋白50％的活力，优选地，至少保留75％的活力。在最优选地实施方案中，结构类似物至少保留天然蛋白90％的活力。
更进一步，本发明中应用的的UG是基本上纯的。术语“基本上纯的”是指UG具有约75～约100％的纯度。在优选的实施方案中，UG具有约90～约100％的纯度，在最优选的实施方案中，UG具有至少95％的纯度。UG的临床应用另一方面，本发明提供治疗或预防炎症类或纤维变性类或癌症类疾病的方法，该方法包括给哺乳动物，可能是动物或人类，施用有效剂量的UG。
下表中的一系列疾病是与UG的缺乏，过高的PLA2活力和纤连蛋白沉淀相关的典型实例。
表2重组子宫珠蛋白的临床应用(按UG特性分类)
表(续)
在人类炎症类/纤维变性类疾病中，UG缺乏，PLA2活力，纤连蛋白聚集与沉淀和肿瘤抑制，子宫珠蛋白受体之间典型的关系如下概述。新生儿肺段支气管发育不良(婴儿BPD)新生儿BPD具有严重性炎症和不可逆转的肺部纤维变性特征，其通常是呼吸窘迫综合症(RDS)的结果。然而，胎粪性呼吸窘迫综合症或感染也可能引起婴儿BPD。
由于肺部hUG的合成可能受发生在妊辰后期的表面活性剂的共调节，故新生儿BPD中已暗示出hUG的缺乏。因而，早产儿就可能缺乏UG和表面活性剂。HUG缺乏可能引起PLA2活力的升高和Fn相关的纤维变性，而上述两方面影响均与婴儿BPD中的炎症和纤维变性相关。一些婴儿对合成性表面活性剂不发生应答反应，这可能归因于过高的PLA2活力。因此，UG可用于治疗新生儿BPD。
优选的给药途径是经气管内的直接滴注法或系统途径。多器官衰竭(MOF)MOF已暗示出归因于细菌性脓毒病或外伤的过高的PLA2活力。该疾病具有系统性炎症应答，包括迅速的，大量的组织损伤和肺、肾脏、胰腺、肠与血管功能丧失的特征。最近的证据指出MOF引发系统可溶性磷脂酶A2活力的升高，组织细胞膜的直接降解和基本磷脂的水解，基本磷脂如肺泡表面活性剂。在临床环境中，直接抑制PLA2的尝试至今还未成功。
在MOF条件下，内源性UG的量不足以对抗过度激活的PLA2。外源施用UG用于能治疗MOF。
周边器官衰竭(ROF)包括对器官的损伤，但不包括起初受外伤或感染影响的器官。通常，周边器官衰竭包括多个周边器官，并将导致多器官衰竭。例如，胰腺炎是胰腺应答酒精摄入、感染或外伤时发生的炎症，该疾病可能导致成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肾衰竭(ARF)和系统性休克。炎症性肠炎或腹膜炎能导致ROF/MOF。ROF/MOF和高水平的循环活化PLA2相联。系统性施用huG可以防止ROF/MOF。向ROF/MOF病人体内直接注射UG能减弱严重程度或消除介导器官衰竭和休克的PLA2。胰腺炎所有类型的胰腺炎均涉及系统性的和局部的Ⅰ型可溶性PLA2活力的升高。通常，胰腺炎会导致肺机能不全或ARDS，该疾病具有肺部可溶性PLA2活力升高的特性。因而，作为体内可溶性Ⅰ型PLA2s的抑制因子，UG是治疗两种类型急性胰腺炎的优良候选药物，并可作为所有类型胰腺炎中肺机能不全的预防手段。
优选的给药途径是静脉注射途径。炎症性肠病炎症性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎、直肠炎(direticulitis)和克罗恩氏病，该疾病具有局部产生和Ⅱ型可溶性PLA2活力升高的特性。IBD中，循环性的，可溶性PLA2活力也可能升高。在严重的病例中，作为升高的PLA2活力的结果(和胰腺炎相似)，IBD导致了肺机能不全或ARDS。
IBD中外源性UG施用的理论基础与胰腺炎是相同的通过抑制PLA2,Fn聚集和/或沉淀负调节炎症应答和预防周边器官(肺和肾)的涉及。
在住院治疗的病人中，优选的给药途径是静脉注射途径。细菌性肺炎人们发现与死于细菌性肺炎的病人相比，幸存者的BAL体液中具有2-3倍水平的UG。肺部细菌感染可能过度激活内源可溶性PLA2。可施用UG以抑制或控制上述影响。
如果病人有插管，优选的给药途径是气管内途径；如非插管病人，优选静脉内给药。透析并发症主要的透析并发症是血栓症，即自发形成的血液凝块。在病人体内，这些血液凝块通常会堵塞血管通路，影响治疗，并引起局部缺血，有时会影响生命。血液透析病人的第二个问题是负责将透析过的血液返回到病人的主要循环内的近心端静脉的炎症和/或纤维变性。由于会导致阻力或压力的增加，因而，妨碍了透析血液返回的近心端静脉的纤维变性通常可被检测到。第三个问题是纤维变性和血管通路位点的关闭或瘘管。第四个问题是加速的动脉硬化。第五个问题是最有可能归因于Fn沉淀作用的残余肾机能的丧失。
上述过程中内源性UG被透析掉的可能性为这些问题提供解释。内源性UG的选择性去处使得循环性Fn免于聚集。这就为血液凝块的形成或沉淀在红细胞上作准备，并通过相互粘着或粘着到血管内腔引发凝集应答。谷胺酰转移酶是(TGs)负责构建发现于基底膜，皮肤和血液凝块中的大分子点阵晶格的酶。在作为活化的TGs,Fn和血液其余成分的酶作用底物的自由UG缺乏条件下，凝块就会交联在一起。
血管腔内Fn的沉淀可解释近端静脉和血管通路位点的炎症和纤维变性以及加速的动脉硬化。血管内皮处的纤连蛋白沉淀促进血小板和白细胞粘着。当PLA2抑制作用缺乏时，这两者可能会被聚集。Fn的血管沉淀物也可能促进脂肪、胆固醇和发现于动脉粥样斑块的蛋白的局部堆积。目前已知纤连蛋白是动脉粥样斑块和肾小球沉淀的主要成分，该肾小球沉淀与肾病以及主要和残余肾功能相关。所以，UG的施用可能会通过减少炎症和纤连蛋白沉淀从而减弱或消除上述问题。
优选，UG施用途径是透析之前、透析过程中或透析后的静脉注射。
可替代地，向透析缓冲液中添加UG或用UG预包被透析膜或两种方法都采用，可预防内源性UG的丧失。器官移植术语“器官”是指，例如，实体器官，如肾脏，肝脏和心脏以及骨髓，角膜和皮肤。
有两种类型的器官排斥急性排斥和慢性排斥。急性排斥是包含PLA2活力和通过破坏移植物的炎症细胞进行渗透的炎症过程。
慢性排斥包含Fn-介导的移植物的纤维变性，该过程包括限于移植物的动脉粥样硬化。因而，UG的施用可以用于治疗或预防急性和慢性移植物的排斥。
优选的给药途径是注射。
器官移植的另外一方面问题是器官在从供体摘除之前、转运过程中以及在受体身体中的局部缺血，这将促进急性排斥。局部缺血会引起PLA2的活性升高和组织坏死。所以，子宫珠蛋白可以用来预防性类局部缺血。所以，子宫珠蛋白的优选形式是作为灌流液或者贮藏缓冲液，保存离体的活体器官。Ⅰ型糖尿病的预防Ⅰ型糖尿病是自身免疫反应引起胰腺组织坏死造成的。胰腺在正常情况下，向循环系统分泌可溶性的PLA2和hUG。本发明中，报导了在子宫珠蛋白剔除(KO)小鼠的胰腺中有坏死的病灶(下文中称作“UGKO小鼠”)。
由于缺少子宫珠蛋白，UG KO小鼠表现出了相似的胰腺组织坏死，这种坏死会引发自身的免疫反应。所以子宫珠蛋白可以预防或者终止Ⅰ型糖尿病的缓慢进展。优选的给药途径是注射。预防和治疗肾病变UG KO小鼠的肾的Fn沉积和纤维变性与人类肾病的肾的Fn沉积和纤维变性相同。所以，子宫珠蛋白给药可以预防或者减缓病人危险期肾病变的进程，例如Ⅱ型糖尿病。预防和治疗眼部炎症眼部的炎症包括色素层炎、视网膜炎、和外科手术后的炎症，这些炎症是以PLA2活性的升高为特征。所以，子宫珠蛋白可以通过局部、眼内或者系统的给药来减轻眼部的炎症。动脉硬化动脉硬化是指全身的血管纤维加厚。它是Fn在血管壁沉积所引发或促成的。动脉粥样硬化是动脉硬化的一种形式，除了Fn沉积，还有胆固醇沉积。所以，施用子宫珠蛋白可以预防或减轻动脉硬化。急性肾衰竭急性肾衰竭(ARF)是周边器官炎症、感染或直接外伤引起PLA2在循环系统的释放和激活的典型结果。急性肾衰竭过程中对肾脏的破坏是非常严重的，炎症可以造成急性的组织破坏，也可能分解肾脏的纤维质生成，而导致长时间的肾功能衰减。子宫珠蛋白的抗炎性和抗纤维质变性的特性在UG KO小鼠中表现出特殊的相关性。
优选的给药途径是静脉注射或者系统给药。预防和治疗原发肿瘤生长肿瘤发生是细胞生长失控和入侵周围组织的结果。子宫珠蛋白通过作用于它的细胞受体而表现出的肿瘤抑制因子活性暗示了它作为一种预防和/或者治疗人类癌症药剂的潜力。进一步而言，老年缺乏子宫珠蛋白的小鼠的肿瘤发展表明了长时间缺乏子宫珠蛋白在癌症中的生理意义。
优选的给药途径是静脉注射或者系统给药。预防和治疗肿瘤的转移纤连蛋白沉积在肿瘤细胞粘连和肿瘤细胞转移中的作用以被清楚描述(Snyder等人，“纤连蛋白临床医学的应用”CRC CriticalREV.Clin.Lab.Sci.23(1):15-34(1985))。子宫珠蛋白在活体中阻止纤连蛋白聚集和沉积的能力表明子宫珠蛋白在预防和治疗人类癌症转移中的效用。
优选的给药途径是系统给药。预防和治疗HIV感染人类白细胞被人体免疫缺陷病毒感染是通过至少两类膜结合HIV受体所促使的。子宫珠蛋白可以通过阻断一个或者更多的HIV受体而预防白细胞的感染。
所以，外源的人类子宫珠蛋白可以通过注射或者系统给药于感染了HIV的病人或者暴露于HIV的人群。刺激血细胞生成以缺乏白细胞和/或者红细胞为特征的临床疾病可以用刺激血细胞生成的试剂进行治疗。受上述临床疾病影响的病人包括接受化学疗法、透析的病人和遗传性贫血的病人。因为人类子宫珠蛋白已被证实是一种白细胞生长因子(Aoki等人，1996)和HAF可以刺激红细胞和白细胞生长，所以人类子宫珠蛋白可以用来治疗人类贫血。所有的生长因子都是通过膜结合细胞受体而发挥它们的作用，所以，子宫珠蛋白和它的衍生物可以用来靶向子宫珠蛋白的受体，而刺激血细胞生成。
优选的给药途径包括注射和系统给药。
总体上，下述无限制疾病列表与PLA2抑制和/或者纤连蛋白沉积和/或者肿瘤抑制和/或者子宫珠蛋白受体的靶向相关。借助本发明的方法，上述每一方面均可作为治疗和预防候选者。关节/骨骼类风湿性关节炎和肉瘤；自身免疫 类风湿性关节炎，多发性硬化，Ⅰ型糖尿病，色素层炎，牛皮癣，系统红斑性狼疮(SLE)和Crohn疾病；胰 胰腺炎，肉瘤和癌；腹膜 腹膜炎，阑尾炎，肉瘤和癌；血管/全身败血性休克，胶原血管疾病，动脉硬化，动脉粥样硬化，过敏性休克，血吸虫病，创伤诱导性休克，癌，内皮痛和肉瘤；肾 急性肾衰竭，肾的细菌感染，肾肿瘤造成的炎症，化疗或者抗体治疗导致的纤维质变性的预防，糖尿病性肾病的预防，预防和/或者治疗自发性肾病，肉瘤和癌肝脏 肝炎，病毒性肝炎，肝硬化，肉瘤，癌；膀胱 膀胱炎，尿道炎，输尿管炎症，间质膀胱炎，肉瘤和癌；生殖/雌性阴道炎，宫颈炎，骨盆炎症性疾病，卵巢炎症(输卵管炎)，子宫内膜炎，阴道白假丝酵母病，输卵管炎症或者纤维质变性，肉瘤和癌；生殖/雄性阴茎炎，前列腺炎，精管和顶囊炎症，睾丸炎症，输精管、附睾和前列腺炎症，肉瘤和癌；眼 色素层炎症，视网膜炎症，外伤，化学药品或者烟雾造成的灼伤，CMV视网膜炎造成的眼部炎症，结膜炎(细菌感染)，病毒感染，传染性试剂造成的眼部炎症，眼部外科手术后造成的眼部炎症，包括白内障摘除，激光外科，角膜移植，肿瘤摘除，成视网膜细胞瘤造成的眼部炎症(肿瘤)，放射性照射造成的眼部炎症，变态性应答造成的炎症，肉瘤和癌；心脏 心内膜炎，肉瘤和癌；肺支气管哮喘，成人呼吸性窘迫综合症，肺炎，自发性纤维质变性，化疗引起的肺纤维质变性(博来霉素，氨甲蝶呤)，暴露于化学药品环境引起的肺纤维质变性(石棉，洗涤剂，污染物，例如dioxin和汽车尾气中的PCB)，烟雾的吸入，溺水恢复过程中的肺部炎症，新生儿呼吸窘迫综合症，肉瘤和癌；肠炎症性肠疾病，结肠炎，Crohn’s疾病，direticulitis，新生期的坏死性小肠炎症，传染性试剂、轮状病毒、脊髓灰质类病毒、HIV造成的炎症，胃溃疡，胃食管反流疾病，扁桃体炎，肉瘤和癌；痔移植 在进行某一器官或组织移植手术后，为控制炎症、纤维质变性和排斥的给药；耳部 中耳炎，肉瘤和癌；皮肤 牛皮癣，荨麻疹，变应性和皮肤病，硬皮病，接触皮炎，化学药品引起的皮肤病(毒药长春藤、橡木和暴露于类似于PCB等化学药品引起的)，氯，氨，(洗涤剂，有毒试剂)，肉瘤和癌；脾/胸腺 肉瘤和癌；肌肉 肉瘤和癌；生血细胞/淋巴 肉瘤和癌；胚胎 肉瘤和癌；腺体 肉瘤和癌；(内分泌腺)肉瘤和癌；
此外，子宫珠蛋白可以单独给药，也可以与其他的活性试剂或者组分联合给药，用于治疗或预防上述疾病。这里所指的活性试剂或者组分包括但不限于类固醇、非类固醇类抗炎药(NSAIDs)、化学剂、止痛药、免疫活疗剂、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗、免疫抑制剂、造血生长因子、激素、细胞因子、抗体、抗凝剂、心血管药物、致育药物，还包括口服耐受性药物、维生素和矿物质。
本发明是关于子宫珠蛋白在预防或者治疗PLA2、纤连蛋白以及癌和子宫珠蛋白受体相关疾病的用途。关于预防一种病况中的“预防”指的是阻止疾病在易感或潜伏易感人群中的发展，或者限制疾病的恶化或发展，而术语“治疗”指的是一种疾病或者病理学状况的好转。
子宫珠蛋白可以通过给药而靶向于子宫珠蛋白的受体。子宫珠蛋白受体的靶向是指诱导配基与受体进行特异性结合，而促使对细胞生长进行影响。
子宫珠蛋白可以静脉内给药，或者在治疗新生儿呼吸性窘迫综合症RDS/BPD和成人呼吸性窘迫综合症，也可以液体或半气溶胶的形式通过气管插管给药。其他可用的给药途径包括局部的、眼部的、皮肤的、经皮的、肛门的、系统的、肌内的、缓释、口服的、阴道的、十二指肠内的、腹膜内的和结肠内的给药。上述的组分可以按照服药所需剂量给受试者或者病人服药，或者根据内科的，营养的和兽医等领域技术人员所熟知的技术，同时考虑年龄、性别、体重、和特殊受验者或病人的疾病和给药路线因素进行给药。本发明的组分也可以按照控制释放的制剂进行给药。组分也可以与其他活性试剂同时给药或者按照次序给药，同时考虑年龄、性别、体重、和特殊受验者或病人的疾病和给药途径因素。
本发明的组合物的例子包括口服给药的可食性的组分，例如胶囊、片剂、和类似的为口准备的液体制剂，如口的，鼻的，肛门的，阴道的等等，还有悬液、糖浆和酏剂，和为胃肠外的、皮下的、皮内的、肌内的和静脉内给药的制剂(例如，可注射给药)，例如无菌悬浮液和乳剂。然而，在血液中给药时，组合物中的活性原料可能与蛋白质复合，血蛋白的沉淀作用可能造成凝血的发生，技术人员应该考虑到这一点。
在上述的组合物中，子宫珠蛋白可以混合于合适的载体、稀释剂、或者赋形剂，如无菌水、生理盐水、葡萄糖、DMSO、乙醇、或者类似物中。
子宫珠蛋白能以冻干的形式提供并恢复再组成，例如，在等离子水中，盐水中，葡萄糖溶液中，或者DMSO缓冲液中。在一定的盐溶液中，观察到某些rhUG的沉淀作用；这种观察可以应用于一种分离创造性化合物的方法，例如，用盐析的方法。
进一步而言，本发明还包括一种提供子宫珠蛋白的试剂盒。这种试剂盒包括一个单独的容器，里面含有合适的载体、稀释剂或者赋形剂。这种试剂盒含有一种另外的试剂，它可以通过共同给药或者按次序给药来减轻或者缓和上述疾病的影响。另外的试剂可以用单独的容器提供，也可以与子宫珠蛋白混合。另外，试剂盒包括混合或者调匀原料以及给药的说明书。
本发明还考虑了一种治疗或者预防缺乏内源功能子宫珠蛋白为特征的癌症的方法，这种方法包括给病人服用这种治疗所需的补偿量子宫珠蛋白。术语“补偿量”指的是使局部肺的或者全局总的子宫珠蛋白的浓度(内源功能性子宫珠蛋白和外源子宫珠蛋白)达到正常范围所需的子宫珠蛋白的量。特别是，局部内源子宫珠蛋白的正常范围是大约大于50微克子宫珠蛋白每毫克白蛋白或者大于50毫克每升。血浆子宫珠蛋白的浓度的正常范围是大于15微克每升。此外，可以服用过量的子宫珠蛋白，使其数量足够饱和可溶和不可溶(膜结合)的身体内子宫珠蛋白接合部位，这种数量可以超过上述定义的子宫珠蛋白的补偿量，子宫珠蛋白的循环水平可以接近正常水平的20-200倍。
本发明的组合包含一定数量的天然和/或者重组的hUG，以达到预期目的，即增长血浆或者组织中子宫珠蛋白的水平，以产生抑制肿瘤和/或者结合纤连蛋白减轻其在(肿瘤)转移中的作用的预期效果。组合物包含有效量的基本上纯的天然和/或者重组的人类子宫珠蛋白，与药用可接受的载体或者稀释剂相联合。子宫珠蛋白能以还原或者单体的形式存在，或者两者共存。
子宫珠蛋白可以一次给药的数量是20ng/kg到500mg/kg。一次、多次或者连续给药的量可以达到10克。
这里所用的术语“肿瘤抑制有效量”指的是子宫珠蛋白抑制肿瘤和预防或减少肿瘤在病人体内或者组织内转移所需要的量。术语“纤连蛋白结合有效量”指的是子宫珠蛋白结合纤连蛋白，以减少聚集和/或者沉积，进而预防和减少肿瘤转移所需的量。同样的，术语“刺激血细胞生成有效量”指的是通过子宫珠蛋白给药刺激红细胞和白细胞生长所需子宫珠蛋白的量。此外，术语“抗HIV有效量”指的是足够封闭一个或者多个HIV受体所需子宫珠蛋白的量。典型地，为治疗成人癌症一次服用子宫珠蛋白的量可以从0.2μg/kg到500mg/kg，而一段时间内给药的量可以达到几克。对于新生儿而言，在治疗新生儿呼吸性窘迫综合症时，其一次用量范围可以从50ng/kg到100mg/kg，或者在一段时间内连续给药的量可以达到10克。有效和安全的连续注入速率在50ng/kg/hr到500mg/kg/hr之间。
此外，本发明提供一种利用rhUG结合到固相支持物上进行亲和层析，从而提纯子宫珠蛋白受体的方法。这个方法包括将在亲和层析之前溶解或部分提纯牛的心脏、脾、器官、肺、肝和主动脉样品与具有子宫珠蛋白(或其片般或其衍生物，或者子宫珠蛋白类似蛋白质或者子宫珠蛋白受体配基)偶联配基的固体支持物接触。子宫珠蛋白可以共价结合到固相支持物上，例如溴化氰活化的琼脂糖4B，或者通过本领域已知的任何方法，或者任何固相支持物上。子宫珠蛋白受体蛋白可以被合适的缓冲液从固体支持物上洗脱下来。
进一步而言，本发明提供了一种制备还原型rhUG的方法。本发明的方法包括在合适的温度条件和时间内，如37℃和15分钟内，将被氧化或者部分氧化的rhGU与还原剂接触，例如二硫苏糖醇或者β-巯基乙醇，以还原rhUG。在一个优选的实施方案中，本发明的方法产生了还原的单体rhUG。本领域的普通技术人员应该可以知道任何合适的还原剂或者还原剂的组合，在正确的时间内和合适的温度条件下，还原rhUG，并可以用高压液体层析，SDS-PAGE或者其他合适的检测方法证实。
另外，子宫珠蛋白的受体可以采用该领域的技术人员已知的已知标准技术进行提纯，并用来筛选具有子宫珠蛋白类似结构化合物、多肽、蛋白质和/或者子宫珠蛋白受体配基。基于这一点，提纯的子宫珠蛋白可以应用为一种试剂盒，用来筛选子宫珠蛋白类似物和/或者子宫珠蛋白受体配基。这种筛选方法包括将含有一种或者几种化合物、肽、和/或者蛋白质样品与提纯的子宫珠蛋白受体接触，检测样品中一种或多种成分与子宫珠蛋白受体的结合反应。这种结合相互作用，例如配体和受体的相互作用，可以通过紫外吸收光谱的变化或者通过本领域技术人员已知的方法进行检测，这种结合相互作用也暗示了样品中子宫珠蛋白结构类似物和/或者子宫珠蛋白受体配给的存在。
最后，提纯的子宫珠蛋白受体可以用来制备受体的抗体。这种抗体可以用来刺激和激活子宫珠蛋白的受体，也可以应用该领域技术人员中已知的标准技术进行抗体制备，例如，用提纯的子宫珠蛋白受体免疫小鼠，制备杂交瘤，筛选子宫珠蛋白的受体的抗体。参考Sambrook等人，“分子克隆实验手册，第二版”，Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,1989。
实施例本发明将参照下列非限制性的实施例作进一步描述。份额和百分比以重量为标准，除非另有说明。实施例1体内试验重组的人子宫珠蛋白可以通过Mantile等人的方法获得(1993)。在受孕142天通过子宫剖开术(C-section)分娩后，称取大约重400g的一个雄性和雌性的P.cynocephalus。这是RDS的确定模型(Coalson,J.J.等人，BPD的狒狒模型Ⅱ病理学特征。Exp.Mol.Pathol.37:355-350(1982))。
分娩之后，幼儿用Ketamine(10mg/kg)麻醉，并用直径2.5毫米的气管插管进行插管。血气与血压通过经皮肤注射到桡动脉的动脉线进行监测。一个较深的静脉线经皮放入到隐静脉，用来注入液体、抗体和药物。动物饲养于伺服控制红外暖箱里，采用标准的时间周期的，压力调控的，带有增湿器的通气器进行通气，并维持在36-37℃。初始的设置是FiO21.0，速率为40每分钟，I/E比率为1∶1.5，正的末端呼出气压(PHEP)为4厘米水柱，需要的吸气压峰值应该足够箱内空间的巡回。FiO2保持在1.0,PIP通过调控，维持在PaCO2为40±10托。血气、血细胞比容、电解质、凝血酶血时间、部分凝血致活酶时间和灵活性(dextrostix)每小时进行监控。取血研究用相同血容量的成年狒狒血代替。静脉内液体随同电解质给药的速率为10cckg/ar，当心脏速率超过180次每分钟时可以根据需要进行增加。当碱缺乏超过10的时候，可以服用碳酸氢钠(2mep/kg)。氨苄青霉素(两次分开给药的剂量是50毫克每千克每天)和庆大霉素(两次分开给药的剂量是5毫克每千克每天)在实验持续过程中连续供给。
一个动物接受了肺泡表面活性剂和PBS(处理1)，第二个动物(处理2)接受了肺泡表面活性剂和两倍剂量的1mg/kg rhUG。活性剂和rhUG都是通过气管插管直接给药于肺部。所用的肺泡表面活性剂是Survanta(罗斯实验室)，是从牛的肺部提取的肺泡表面活性剂制剂，除了磷脂外，还含有肺泡表面活性剂脱辅基蛋白质B和C。第一剂量的rhUG与肺泡表面活性剂同时给药，第二剂量的给药是在第一次给药的四个小时后。动物的动脉血气、电解质和EKG得到监控。在用肺泡表面活性剂治疗的50小时后，处死动物。在24小时和48小时，用含有蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟，10μg/ml的亮抑酶肽，10μg/ml抑胃酶肽和杆菌肽)的PBS灌洗肺部。肺部灌洗液在-80℃冷冻直至鉴定PLA2活性。总蛋白用Bradford方法测定(Bio Rad)。肺部灌洗液中的PLA2活性根据Levin等人(1986；上文)的方法测定，并在下表中列出。
表3．活体内测定子宫珠蛋白的结果
上面所给的数据是两次测定的平均值。这些结果表明气管内的rhUG给药抑制了活体内PLA2的活性。接受了肺泡表面活性剂和rhUG的动物与只接受肺泡表面活性剂而没有rhUG的动物相比，其肺部灌洗液中具有可观察到的较低PLA2活性。这些数据证实了rhUG和肺泡表面活性剂的共同给药，对保护肺泡表面活性剂磷脂具有意义。
实施例2．体外利用可溶的PLA2抑制人工表面活性剂的的水解体外利用可溶性PLA2,rhUG可以抑制人工表面活性剂的水解。Survanta是从牛的肺部提取的人工表面活性剂制剂，可用来治疗未足月呼吸窘迫综合症的新生儿和呼吸窘迫综合症(ARDS)成人。Survanta被第一组可溶的PLA2水解，如猪的，胰的PLA2，其特征是作为一种底物，具有与荧光卵磷脂底物相竞争的能力，并产生花生四烯酸产物。
Survanta是一种体外的底物，可以被第一组可溶的PLA2降解。在体外，Survanta可以迅速被人的肺部细胞外液中的PLA2降解。RhUG可以抑制Survanta在体外的降解。实施例3．构建子宫珠蛋白剔除小鼠建立一种转基因的子宫珠蛋白剔除小鼠的目的是为了测定子宫珠蛋白在哺乳动物生理中的作用，同时也为了产生一个子宫珠蛋白在几种炎性临床疾病治疗的模型。第一步是构建一个合适的DNA载体，用这种载体，可以靶向并阻碍小鼠的内源子宫珠蛋白基因。将来源于129/SVI小鼠品系子宫珠蛋白剂基因(RAY,1993)，含有外显子3和侧翼序列，长度为3.2个kb的BamHⅠ-EcoRⅠ DNA片段亚克隆到pPNW载体的相应位点上，如Lei等人(1996)所述。将NotⅠ和XhoⅠ限制性位点改造，定向亚克隆到基因的目标载体上。一个含有部分外显子2和其上游序列，长度为0.9kb的片段用PCR(引物 引物-L(来源于内含子)5’-TTC CAA GGC AGA ACA TTT GAG AC-3’；引物-R(来源于外显子2):5’-TCT GAG CCA GGG TTG AAA GG C-3’)得到了扩增。在构建过程中，去除了一个编码27个氨基酸的79bp的外显子2。PCR的片段定位于pPNW编码新霉素抗性基因的上游，产生目的载体pPNWDG。这种载体在图2A中列出，其PGK-neo弹夹结构阻断了子宫珠蛋白基因，破坏了蛋白质的编码序列。
根据Nagy、A.，等人，PNAS 90:8424(1993),pPNWDG基因的目的载体用NotⅠ线性化，通过电穿孔注入ES R1细胞中。电穿孔细胞的Gancyclovir和G-418选择产生了156个克隆。Southern印迹分析鉴定了一个野生型子宫珠蛋白等位基因的5.1kb HindⅢ片段，并在156个可隆中发现了3个克隆含有同源重组产生一个附加的8.2kbHindⅢ片段，如图2B所示。根据Capecchi，科学244:1288(1989)，将这些ES R1克隆注入到C57BL胚泡中。不同的嵌和体产生了两种不同品系小鼠。带有子宫珠蛋白目的基因座的杂合体后代(UG+/-)进行配对，其后代的基因型通过PCR分析，如图2C所示，还有Southern印迹，如图2D所示。实施例4．子宫珠蛋白基因剔除和鼠类的子宫珠蛋白(mUG)蛋白缺失的确认为了证实纯合剔除小鼠(UG-/-)不拥有任何可检测的mUG，子宫珠蛋白基因目标小鼠用来检测包括肺在内的几个器官内子宫珠蛋白mRNA和mUG的表达。一个实验方案为动物饲养和使用委员会通过。总的mRNA在UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠不同器官的得到分离。逆转录酶-多聚酶链式反应用来检测mUG的mRNA。利用mUG特异性引物，目的分子被逆转录，mPr(5’-ATC TTG CTT ACA CAG AGG ACT TG-3’)，产生的cDNA利用PCR引物mPr和mP1(5’-ATC GCC ATC ACA ATC ACTGT-3’)进行扩增。PCR的产物与寡核苷酸探针杂交，mPp(5’-ATC AGAGTC TGG TTA TGT GGC ATC C-3’)来源于子宫珠蛋白基因序列外显子2。在小鼠GAPDH RT-PCR中应用的引物和探针如下所示mGAPDH-r(5’-GGC ATC GAA GGT GGA AGA GT-3’)；mGAPDH-1(5’-ATG GCC TTCCGT GTT CCT AC-3’)；mGAPDH-p(5’-GAA GGT GGT GAA GCA GGC ATCTGA GG-3’)。图2E显示mUG的mRNA在UG+/+、UG+/-小鼠肺中检测到，而在UG-/-没有检测到。相同的数据(未显示)显示mUG的mRNA在UG-/-小鼠的前列腺或者子宫中没有出现，但在具有完整子宫珠蛋白基因的小鼠中出现。
用免疫沉淀和Western印迹分析肺中mUG的蛋白产生了相同的确证性结果，如图2F所示。UG+/+和UG-/-小鼠的肾、肝和肺的组织溶解产物在含有2mM苯甲基磺酰氟和各20μg/ml的抑酶肽、亮抑酶肽和抑胃酶肽A的缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5,1％的曲拉通X-100,0.2％脱氧胆酸，150mM的NaCl,5mM EDTA)中匀浆制备。匀浆液在4℃条件下，17,500×g离心30分钟，通过温育组织溶解液或血浆蛋白(1mg/ml)和鼠的Fn(1∶100稀释)兔抗体进行免疫沉淀反应(E.Harlow和D.Lane，抗体；实验手册，第一版，Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,1988)。在4℃条件下，等摩尔提纯的鼠FN(mFN)与rhUG之间的相互免疫沉淀反应在含有10％甘油，50mMTris-HCl,pH7.5,250mM NaCl,4.3mM磷酸钠液体中进行，接着加入抗-mFn的抗体(1∶100稀释)。在还原状态下，等量的提取组织蛋白(30μg)或者免疫沉淀物在4-20％或者6％SDS-PAGE分离，接着用鼠的Fn兔抗体(1∶2000稀释)或者UG的兔抗体(1∶2000稀释)进行Western印迹。在UG-/-小鼠的组织或者液体中没有检测到mUG的存在，而在UG+/+、UG+/-小鼠的组织中确实含有mUG蛋白。
最后，病理学分析UG-/-小鼠的肺部表明，仅在细支气管上皮细胞缺少特异性免疫染色。将UG-/-、UG+/-和UG+/+小鼠的肺部组织在布安液或者10％的中性福尔马林固定液中固定，然后用石蜡包埋，以4-6微米厚度进行切片。切片用苏木精和曙红(H&E)染色。选取的组织用马森三色法染色，进行胶原检测，PATH用来检测纤维蛋白，冈果红用来检测淀粉样蛋白。为了检测mUG和mFn的免疫化学反应，应用Vectastain Rabbit Elite ABC试剂盒。根据mUG的氨基酸序列(Lys28至Thr49，特异性的KPFNPGSDLQNAGTQLKRLVDT)合成多肽，产生mUG的兔抗体(CytImmune)。这种mFn的兔抗体使用时按1∶1000稀释，mUG抗体使用时按1∶500稀释。
这三组结果证实纯合子子宫珠蛋白剔除小鼠，UG-/-，缺少mUG蛋白，或者任何可检测蛋白的一部分。实施例5．子宫珠蛋白剔除小鼠的表型UG+/-小鼠杂交产生的179个后代中，46(26％)个小鼠是+/+基因型，90(50％)个小鼠是+/-基因型，43(24％)个小鼠是UG-/-基因型，表明分离的mUG基因座是按照孟德尔方式遗传的，UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠在出生上具有相等活力。然而，UG-/-小鼠表现出一种新的表现型，他们发展了一种进化性疾病，这种疾病以恶病质、重的蛋白尿、低血钙，同时伴随体重的极大丧失为特征。蛋白尿是一种疾病，表现为不正常的高浓度血清白蛋白和其他血清蛋白排泄到尿中。它暗示了肾小球机能障碍和肾衰竭。对受此影响的动物(上面描述的肺部)进行肾的组织病理学检查，揭示了爆发性的肾小球疾病，如图3所示。与UG+/+小鼠的肾小球相比，UG-/-小鼠的肾小球细胞数目过少，并有大量的嗜曙红蛋白性质的沉积。UG-/-小鼠致命性的肾疾病时间过程可以是在起始的早期(4-5周的时期)，也可以是起始的晚期(10个月的时期)。那些在起始4周龄时表现健康的UG-/-小鼠，在两个月龄后，出现病灶的肾小球沉积。在大约十个月时，这些小鼠出现了类似于早期死于疾病小鼠的极端恶病质。杂合体表现出轻微的在UG-/-小鼠观察到的肾疾病症状。晚期出现疾病小鼠的肾的组织病理学表明不仅出现了严重的早期肾小球疾病，而且还出现了以肾实质纤维质变性和肾小管增生为特征的疾病(参看图3)。尽管UG-/-小鼠主要病理学在肾中发现，组织病理学研究还发现了在胰中出现坏死的应时病灶区域，这种坏死于血管走向相一致。此外，胸腺和脾病灶区域中，暗示的细胞程序性死亡也已经发现。有趣的是，在胰中表达了mUG的基因，而这种组织同时又是丰富的第一组胞外PLA2的源泉。因为这是一种消化酶，它的激活可能会造成组织伤害。
据报导，子宫珠蛋白具有免疫调控和抗炎的特征，而活性淀粉样蛋白病在炎症应答时发生，这可能是因为mUG无效小鼠的肾小球沉积物是淀粉样蛋白。活性淀粉状蛋白病以淀粉样蛋白和具有免疫力复合物沉积为特征。UG-/-小鼠肾沉积物的同一性通过肾切片免疫组织化学得到确定。UG-/-小鼠与UG+/+小鼠肾切片用Congo red染色，然后在偏振光下进行检测。淀粉样蛋白在检测时产生正的双折射；然而，UG-/-小鼠的肾小球出现清晰的负。为了检测UG-/-小鼠的肾小球中IgA、IgG或者IgM-免疫复合物的存在而进行的免疫荧光研究和为了检测主要的淀粉样蛋白的存在而进行的免疫组织化学分析的结果也都是阴性的。所以，UG-/-小鼠肾小球沉积物既不含有淀粉样蛋白，也不含有免疫复合物，所以，肾小球沉积物并不是炎症反应的结果。实施例6．检测UG-/-小鼠肾中的Fn和胶原蛋白UG-/-小鼠肾的沉积物用透射电子显微镜检查，以阐明它们的结构和形态学特征。一个出现肾小球病变的UG-/-小鼠的肾在福尔马林中固定，然后在环氧树脂中包埋。薄的切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在电子显微镜下观察。在6000倍或者60,000倍时拍摄显微照片。这种沉积物主要含有两种类型的原纤维结构一种是相对罕见的长的纹状原纤维，另外一种是含量丰富的短的弥散原纤维(图3E和3F)。因为ECM蛋白质，如胶原蛋白和纤连蛋白，可以产生类似的原纤维结构，所以UG-/-小鼠肾小球沉积物可能含有这些蛋白质。
肾小球沉积物接着用抗-mFn的抗体进行免疫荧光分析。利用兔抗-mFn和FITC结合的羊抗兔IgG，将福尔马林固定过的组织切片进行免疫荧光反应。同样的，利用mFn、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ、玻连蛋白、层粘连蛋白和骨桥蛋白特异性抗体，进行了免疫荧光研究。利用一个Zeiss Axiophot显微镜拍摄落射荧光。在野生型的小鼠的肾小球中，Fn特异性荧光实际上是检测不到的(图3G)，而在同窝的UG-/-小鼠的肾小球中，特异性荧光非常强烈。当使用马森三色染剂时，UG+/+小鼠的肾小球表现为阴性(图3I)，而UG-/-小鼠的肾小球表现为阳性，这表明在肾小球沉积物中存在胶原蛋白。用胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ特异性抗体进行的免疫荧光反应正是这些结果。因为Fn可以与胞外基质蛋白发生相互作用，我们还利用免疫组织化学的方法，检测了UG+/+小鼠和UG-/-小鼠肾小球中层粘连蛋白、玻连蛋白和骨桥蛋白的存在，结果都是阴性的。实施例7．UG-/-小鼠的肾没有过量产生Fn为了测定是否Fn过量产生可以解释它在肾小球中的沉积，我们利用逆转录酶-多聚链式反应和光密度测定法确定了UG-/-小鼠和UG+/+小鼠肾、肺和肝中Fn-mRNA的相对数量。结果显示在UG+/+和UG-/-动物中，Fn-mRNA的相对数量基本上相同。所以，Fn-mRNA过量产生不可能是Fn在UG-/-小鼠肾小球中沉积的原因。应用还原状态下的SDS-PAGE和Western印迹，我们还比较了UG-/-小鼠和UG+/+小鼠的血浆、肾和肝中Fn蛋白。在野生型小鼠的血浆、肾和肝中，只有220kD的Fn类型可以检测到。然而，UG-/-小鼠的血浆和肝的裂解液中，也具有220kD的Fn类型条带，而肾的裂解液中，明显含有其他共价连接多聚体的Fn条带(图4A)。实施例8．在UG-/-小鼠中升高的血清PLA2活性基于目前的观念，认为Fn基质装配和原纤维生成的关键初始步骤是，至少在一个细胞表面，包括整联蛋白的激活和Fn的自我聚集。因为子宫珠蛋白是可溶的磷脂酶A2有效抑制剂，这种酶是炎症反应途径中的关键酶，UG-/-小鼠中mUG的缺乏，可以促进肾小球肾炎和一种炎性肾疾病的发展。于是，我们测定了根据年龄、性别和体重相匹配的UG+/+小鼠(n=3)和UG-/-小鼠(n=3)血浆中PLA2活性。动物处死后，将每个样品分为三份，根据制造商的操作指南，使用PLA2测定试剂盒(Caymen Chemical)测定PLA2活性。蛋白浓度用Bradford方法进行测定(Bio Rad)，计算PLA2比活。UG-/-小鼠[36+3.3(SEM)]的血浆PLA2比活(μmol/min/mg蛋白)明显高于(p＜0.05)UG+/+小鼠[18+2.8(SEM)]的血浆PLA2比活。这些结果产生了一种可能性，即较高的PLA2活性可以导致磷脂酸(LPA)的产量的增长，接下来启动整合蛋白的活性，使UG-/-小鼠中Fn自我聚集。实施例9．子宫珠蛋白和纤连蛋白在体外的相互反应为了进一步理解子宫珠蛋白是如何阻止Fn的自我组装，rhUG干扰mFn-Fn相互反应的能力得到了测定。温育等摩尔浓度的rhUG和mFn，并允许任何蛋白的结合或者其他作用，然后用抗Fn的抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀产物在还原的状态下，用SDS-PAGE进行分离。如前面所述，用mFn或者mUG抗体进行Western blotting，分别检测每一种蛋白。结果显示纤连蛋白与rhUG发生了相互的免疫沉降反应(图4B)。为了证实这些结果，125I-rhUG与mFn温育，复合物在非变性和非还原状态下，采用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分离(图4C)。在放射自显影中，检测到杂聚(heteromer)的Fn-UG(泳道2)，表明可溶的Fn在体外可以与UG相互作用。为了确定是否Fn-UG的杂聚在体内也发生，UG+/+小鼠和UG-/-小鼠的血浆与抗mFn的抗体进行免疫沉淀反应，而这种抗体是不与rhUG发生交互反应的(图4D)。抗mFn的抗体可以与UG+/+小鼠血浆中的mFn和rhUG两者发生共沉淀反应，而不能与来源于UG-/-小鼠的血浆mFn和rhUG发生共沉淀反应，这表明mFn和rhUG杂聚出现在UG+/+小鼠血浆中。所以，Fn-UG复合物不是简单的在体外人为形成，而是在血浆中自然发生。
为了确定UG结合Fn的特异性和亲和力，我们在UG存在和缺失的条件下用未标记的Fn孵育125I-Fn。用二琥珀酰亚胺基辛二酸(DSS)亲和交联所有的复合物。使用人Fn(hFn)包被的24孔板(Collaborative Biomedice)Products,3μl125I-Fn在UG或Fn(10-12-10-6M)存在和缺失的500μl HBSS中，室温下孵育2小时。SDS-PAGE和用UG抗体对所有的Fn的蛋白印迹没有检测到任何UG污染物。放射标记的复合物用PBS冲洗两遍，然后在1N NaOH中溶解，接着用1N HCl中和，用γ计数器测量其放射性。在一独立实验中，125I-Fn(3μl)与20μl(1mg/ml)小鼠Fn在40μl pH7.6的PBSS中，室温下孵育2小时，还原性rhUG(5-500μg)在HBSS中缺失或以浓度递增的形式存在。试样与0.20mM DSS在室温下交联反应20分钟，然后在SDS-试样缓冲液中煮沸5分钟，在4-20％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，最后放射自显影。在UG缺失情况下，125I-Fn与未标记的Fn形成一个高分子量的放射性复合物，但在UG存在时，形成的Fn-Fn凝集物是以依赖于UG浓度的形式表现出来的(图4E)。
为了确定UG结合Fn对UG及对其自身的结合亲和力是否有差异，进行了结合实验，125I-Fn与未标记的Fn孵育，然后与各种浓度的UG固定在多孔板上。在独立实验中，将各种浓度未标记的可溶性Fn固定后，与125I-Fn进行结合研究。从两种类型的结合实验得到的斯卡查德分析数据显示UG结合Fn的解离常数(kds)13nM和Fn结合自身的解离常数176nM都表现出线性关系。这些结果表明，由于UG对Fn有相对更高的结合亲和力，UG能有效地反作用于Fn的自身聚合。在UG存在和缺失的条件下，放射性碘化(125I)胶原I与未标记的Fn孵育，进行亲和交联实验，方法如同以上对Fn的实验。15μl失活的或没有失活的125I-胶原I(Sp.Act.65.4mCi/mg)，在还原性UG(250μg)存在和缺失的条件下，与Fn孵育，亲和交联，电泳和放射自显影。结果表明，UG反作用于高分子量125I-胶原-Fn凝集物的形成。实施例10:rhUG对肾小球hFn沉积的体内抑制为检验rhUG是否能保护肾小球免于Fn沉积，将单独的可溶性人Fn(hFn)或与等克分子数的rhUG混合的hFn静脉注射到UG+/+和明显健康的UG-/-同窝动物上。
将人Fn(500μg/150μl PBS)施用到UG+/+和明显健康的UG-/-小鼠的尾静脉中，这些2月龄的小鼠重约22克。与之相似，对照小鼠也注射500μg hFn的混合物，此混合物是在150μl PBS中加入等克分子数的rhUG或白蛋白形成的。在最后一次注射后24小时，杀死小鼠，在福尔马林缓冲液中固定各种器官。通过使用单一特异性的抗hFn抗体(GIBCO BRL；clone1)和偶联兔抗鼠IgG(Cappel)的FITC产生的免疫荧光检测肾和其它器官的组织结构部分。在独立实验中，每天给UG+/+小鼠注射只加入1mg hFn的150μl PBS，持续3天。
注射人Fn的基本理论是能够区分内源鼠Fn和施用的hFn。静脉注射的方法和hFn在各种组织中的免疫组织化学检测的方法已有描述。
不管是单独注射hFn还是注射hFn与rhUG(分子比1∶1)的混合物，人Fn在野生型UG+/+小鼠肾小球中的免疫荧光结果是相似的(图5A和5B)。但是，用hFn和UG混合物注射的小鼠在肾小球中显示出微弱的hFn特异的免疫荧光(图5C)，而那些只接受Fn的小鼠却表现出更强的免疫荧光(图5D)。施用hFn和BSA的混合物作对照，没有产生保护作用。为确定UG的这种保护作用是否能通过给UG+/+小鼠注射大剂量Fn所克服，我们每天给每个小鼠注射1mg hFn，持续3天。虽然对UG+/+小鼠小剂量(500μg/小鼠)静脉注射不能产生任何可见的肾小球沉淀(图5A)。然而施用更高的剂量(3mg/小鼠)导致明显的积累。这样，UG抑制了肾小球中Fn的沉淀，并由于内源UG的存在，UG+/+小鼠有比UG-/-小鼠更高的可溶性Fn的沉淀阈值。实施例11组织培养细胞中rhUG对原纤维生成和基质装配的抑制为确定UG是否能在典型的体外组织培养试样中抑制Fn-原纤维生成和基质装配，在培养基中培养鼠胚成纤维细胞，培养基中含有单独的可溶性Fn或等分子克数的hFn和rhUG的混合物。Fn基质装配和原纤维生成如所描述的那样在培养细胞(CRL6336,ATCC)中决定。与那些接受hFn和rhUG混合物的细胞相比(图5F)，在单独用hFn处理的培养细胞中观察到更高程度的原纤维生成(图5E)。实施例12:UG-Fn复合物在临床试样中的检测UG-Fn复合物在临床体液如血清、BAL流体和痰等样品中的检测，对确定此复合物在人类疾病中的作用是很重要的。已经建立了一种检测UG-Fn复合物的液相诊断法，此方法的形式列于图6中。获得的抗体是单一特异的兔抗人蛋白的多克隆抗体，共价联接在一固相支持物上。固体支持物可以是破珠，如磁珠、管子或ELISA板。固相支持物在每次结合反应后提供了完成冲洗步骤所需的柔韧性，以便在使用多种样品时获得更一致的结果。检测用的抗体对Fn是特异的，从许多商业途径获得的抗体也是有效的。与酶如辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗IgG抗体可用于检测标准酶反应中分子链末端的抗Fn的抗体，在酶反应中，酶的底物转变成产色的或发荧光的复合物，即可用分光光度计或荧光计定量测定。这种检测法的检测限量为500μgUG-Fn复合物/ml样品流体。实施例13子宫珠蛋白缺失hUG短暂而严重的缺失可通过临床透析中熟知的血液净化技术创建，这些技术包括血液透析，腹膜透析和连续透析(CRRT)。各种形式的临床透析都包括使用半透膜，从血液中滤去有毒的体内废物，包括如尿素的化学代谢物和如β-2-微球蛋白的小分子蛋白。
UG是一结合极其紧密的蛋白，已知该蛋白在SDS-PAGE中有异常的迁移，与之对应的分子量大约为10-13KDa，但其真实分子量为15.7KDa。所以，人们猜测在透析实验中，UG二聚体是以10-13Kda蛋白存在的。令人惊奇的是，该二聚体如此紧密以致能穿过8.0 Kda的MWCO透析膜。UG也能穿过14.0 Kda的MWCO透析膜。
在这些实施例中使用的透析膜的成分，与为临床透析制造和使用的多数膜的成分相比，即使不完全相同，也非常相似。它们都是由再生纤维素或醋酸纤维素组成的。
在此实验中，取1.0ml两个部分纯化(一个＞90％纯化，另一个大约70％纯化)的rhUG细胞裂解物的等分试样，不加缓冲附加物，用1000ml无缓冲的50mM乙酸铵透析，使用三种尺寸的透析袋3.5Kda,8.0Kda和14.0Kda(Spectra/Por；Thmas Scientific)。在48小时内，每种样品有4次缓冲变化，所有这些均在室温(约25-27℃)下进行。每个透析样品都是从清澈的黄色变成清澈无色的液体。在透析开始和结束时，要检查透析袋是否漏液，主要是对透析袋直接施以压力(压挤)，观察是否有漏液，在这儿没有发现漏液。透析袋两端要双结扎，进而确保不漏液。
图7显示出对这些结果的SDS-PAGE分析。90％纯化的预透析样品示于7和8道，下面3个后透析样品位于1、2和3道。在代表用8.OKda MWCO膜透析过的样品的泳道上，没有出现UG二聚体。以后不同批次的部分纯化的UG制备样品也证实了这些结果。实施例14:hUG结合蛋白与肿瘤细胞的亲和交联以往的研究表明，在许多类型的肿瘤细胞中已发现，同源二聚体的、完全氧化的rhUG可结合到一190Kda的结合蛋白上(Leyton etal,1994；Kundu et al,1996)。目前的实施例表明，还原型rhUG(后来显示为单体)不仅与190Kda的结合蛋白结合，还与49Kda和约32Kda的蛋白结合。结果还表明，这些UG结合蛋白的出现与外源rhUG介导这些肿瘤细胞(NIH 3T3，小鼠乳瘤，肉瘤和淋巴瘤)非侵染表型的能力有关。这些UG结合蛋白的缺失则与外源rhUG(纤维肉瘤)出现时，侵染表型的存在相关。下面的表格提供了新的数据，以演示以前所述的(Kundu et al,1996)在ECM侵染检验中出现的这种表型。肌红蛋白，作为非相关蛋白对照，用于显示对rhUG特异的作用。
简单的说，用胰蛋白酶和EDTA收集汇合的细胞(NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纤维肉瘤)，然后离心，得到的细胞重新悬浮于DMEM/BSA中。侵染室的下部格子中填满了作为化学引诱物的成纤维细胞条件性培养基(FCM)。用Matrigel基底膜基质包被过的PET膜铺在下部格子上。在还原的rhUG存在或确失情况下，将细胞(1.6×105/孔)接种在侵染室的上部格子中，侵染室已用预水合的Matrigel所包被，在湿润的培养箱中于37℃培养24小时。浸入到Matrigel并接触到滤器下表面的细胞用Giemsa染色。滤器的上表面用湿棉花药签擦拭，以除去Matrigel和没有迁移的细胞。侵染室用水冲洗，迁移细胞在倒置显微镜下计数，并用Zeiss摄影显微镜Axiovert405M拍摄显微照片。
总之，还原的rhUG能够在许多类型的肿瘤细胞中介导一种反应，使侵染型转变为非侵染型。结合试验为阐明子宫珠蛋白介导非侵染型细胞的作用机理，对放射标记的rhUG特异结合的这些细胞进行了检测。用钠[125I]碘化物(2mCi；无载体的IODO-BEADS)对rhUG(20ug)进行放射性碘化，反应在PH7.4的150μlPBS中于25℃进行10分钟，并通过SepHadex G-25离心柱层析(1200×g，4分钟)纯化125I-rhUG。纯化得到的无载体的125I-rhUG，其特异活性为25μCi/μg。置于12孔板的细胞汇合(NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纤维肉瘤)用PH7.4的PBS冲洗一遍，然后与各种浓度的还原的125I-UG室温下孵育2小时，125I-UG是溶于PH7.6的Hank1s平衡盐溶液的，其中含有0.5％BSA，缺乏或存在过量为标记的还原的hUG。UG在10mM DTT存在的条件下于37℃还原反应15分钟。通过快速去除未结合的125I-UG使反应停止，然后用PH7.4的PBS冲洗三遍，在1N NaOH中促溶，接着加入等体积的1N HCl，用计数效率约为80％的γ计数器(ICN Biomedicals，型号+10/600)测量放射性。特异性结合是从总的结合中减去非特异性结合得到的。使用LIGAND计算机程序，运用斯卡查德分析所得的结合数据，结果列于图8中。
125I-rhUG(还原的)稳态结合的斯卡查德分析表明，用NIH 3T3细胞只出现一种类型且解离常数为(Kd)20nM的特异结合。比较125I-rhUG(还原的)与NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纤维肉瘤结合的解离常数，其数值范围为20-25nM。我们也检测了非还原的同源二聚体的125I-rhUG与这些细胞的结合，乳瘤、肉瘤和淋巴瘤细胞的Kd值为30-35nM，没有使用纤维肉瘤细胞检测还原的或非还原的125I-rhUG的结合。亲和交联试验为进一步描述这些细胞中的UG结合位点，在未标记的还原的rhUG存在或缺乏的条件下，用125I-rhUG(还原的)与二琥珀酰亚胺基辛二酸(DSS)进行了亲和交联研究。DSS交联剂与彼此紧密靠近的蛋白分子共价交联。当加入未标记的蛋白，它与标记蛋白竞争结合位点，表现出只有子宫珠蛋白才具有的结合特异性。
在六孔板上生长的细胞汇合(NIH 3T3、小鼠乳瘤、肉瘤、淋巴瘤和纤维肉瘤)，用PH7.4的PBS冲洗，在PH7.6的HBSS中，与还原的125I-rhUG(3.0nM)于室温下孵育2小时，HBSS中含有0.1％BSA，缺乏或存在未标记的还原的UG(1μM)。用PBS冲洗后，细胞在2mlPH7.6的HBSS中，与0.2mM DSS进一步孵育0分钟。加入50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液以终止反应，刮下细胞，10000×g离心15分钟收集细胞，在含有1mM PMSF,20μg/ml亮抑酶肽和20mM EDTA的60μl 1％Triton X-100溶液中分散细胞，10000×g离心15分钟，所得到的上清液悬浮于含有5％β巯基乙醇的样品缓冲液中，沸水浴5分钟后，在4-20％的十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺梯度凝胶上电泳(Bio-Rad)，接着用考马斯亮蓝对凝胶做短暂染色，然后在Bio-Rad凝胶干燥器上干燥，最后用Kodak X-Omat Ar X射线胶片放射自显影。
hUG结合蛋白在NIH 3T3(泳道1-3)细胞，乳瘤(泳道4-5)细胞，肉瘤(泳道6-7)细胞和淋巴瘤(泳道8-9)细胞中的亲和交联结果列于图9中(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS；泳道3:(+)未标记的hUG,(+)DSS；泳道4:(+)DSS；泳道5:(+)未标记的hUG,(+)DSS；泳道6:(+)DSS；泳道7:(+)未标记的还原的hUG,(+)DSS；泳道8:(+)DSS和泳道9:(+)未标记的还原的hUG,(+)DSS)。当把非放射性但还原的hUG加入到反应混合液中作竞争物时，记下出现的49Kda的蛋白条带及190Kda的蛋白带和两条带降低的强度。
简要的说，rhUG(还原的)在一定的肿瘤细胞系中介导非侵袭表型的丧失。对这种rhUG介导的行为变化敏感的肿瘤细胞拥有单一类型rhUG结合特性，其较低的解离常数约为20-30nM。rhUG的这种结合活性与分子量近于190Kda和49Kda的特异蛋白有关。缺乏rhUG结合活性的纤维肉瘤细胞，其侵染性不受rhUG的影响。总之，这些数据表明，在具有子宫珠蛋白受体的肿瘤细胞中，外源rhUG(还原的或非还原的)介导这些肿瘤细胞侵染型的丧失。实施例15．通过子宫珠蛋白亲和层析纯化子宫珠蛋白受体为纯化子宫珠蛋白受体，通过126I-rhUG结合实验分析了此受体在几种牛组织中的分布。在此过程中，首先在组织和细胞的膜碎片中发现了UG结合活性，表明子宫珠蛋白受体定位于细胞膜上。
从牛心、脾、气管、肺、肝脏和主动脉中制备膜。发现牛脾中富含UG，并将其作为进一步纯化用。将牛脾于10mM pH8.0的NaHCO3缓冲液中搅匀，匀浆液于4℃ 600×g离心10分钟。上清液24000×g再离心60分钟。所得沉淀于4℃搅拌6小时，溶于50mM PH7.4的Tris-HCl缓冲液中，该缓冲液中含有1％Triton X-100,10μg/ml亮抑酶肽，2mM EDTA和0.4mM PMSF。然后，24000×g离90分钟收集上清液，并加入到GNBr活化的琼脂糖4B偶联的UG亲和柱中。该亲和柱的制备按照制造商(Pharmacia)的指示进行。用0.1M pH3.0的甘氨酸-HCl缓冲液洗脱UG受体蛋白，并立即用2M PH8.0的Tris-HCl中和，甘氨酸-HCl缓冲液中含有1％Triton X-100,10μg/ml亮抑酶肽，2mM EDTA和0.4mM PMSF。含有UG结合蛋白的部分通过125I-UG结合及亲和交联检测进行鉴定。通过SDS-PAGE及随之的银染色(Bio-Rad)检测纯化受体的纯一性。
结果列于图10中。分别记下两条清晰可见的分子量为180Kda和40Kda的蛋白条带。此外，也可观察到第三条微弱的分子量为320Kda的蛋白带。这样，体外介导抑制肿瘤细胞侵染性的子宫珠蛋白受体就已通过子宫珠蛋白亲和层析得到纯化。实施例16．细胞因子对子宫珠蛋白受体表达的调控为了更好的理解子宫珠蛋白受体在炎症和免疫调节中的潜在作用，我们观测了子宫珠蛋白受体在NIH 3T3细胞中对炎症的几种介质作出反应时的表达情况。前人的研究表明，子宫珠蛋白介导人巨噬细胞和淋巴细胞对一定细胞因子的反应(Ddirynck et al.,1995；1996)，这意味着子宫珠蛋白是作为免疫抑制子起作用的。hUG的作用是抑制IL-2调控的转录活性和IFN-τ及IFN-α的从头合成。胞内调节过程的如此交替源于胞外hUG及其受体必须参与的信号转导途径。因此，在免疫和炎症反应中，通过操纵UG受体信号转导途径，有可能在细胞因子网络中产生有益的变化。
如所述的那样培养NIH 3T3细胞，并加入带有和没有rhUG的免疫调节因子。UG受体的量是通过125I-UG结合，亲和交联和SDS-PAGE分析确定的。结果列于图11。与对照相比，代表UG结合蛋白的放射性条带，其强度有相当的增强，所用细胞分别经LPS和IL-6处理。但是，当这些细胞PMA、PDGF、TNFα和IFNr处理时，这种差异就不明显了。这些结果初步证实了，UG受体是对细胞因子(IL-6)和炎症前调节因子(LPS)的出现起反应的。实施例17．UG可抑制的肿瘤细胞系自分泌和旁分泌环路的证明为确定UG在癌细胞胞外基质(ECM)侵染中的可能作用，研究了人的四个细胞系，其中之一来自于子宫腺癌和前列腺癌。之所以选择这些细胞是因为这些器官中正常的上皮细胞以相对较高的水平组成性表达UG基因。初步期望，分别通过RT-PCR、免疫沉淀及Western印迹确定癌细胞是否表达UG mRNA和UG蛋白。人UG真核表达载体的构建、细胞培养、转染和G418抗性克隆的选择用EcoRⅠ水解克隆在Pgem 4Z中的hUG cDNA(G.Mantile,L.Miele,E.Cordella-Miele,A.B.Mukherjee,J.Biol.Chem.268,20343(1993))。将一个全长的hUG-cDNA片断切断并亚克隆在TA载体(离体基因)的EcoRⅠ位点。hUG-cDNA片断的定位通过DNA测序核实。该片段通过HindⅢ和Xgal水解从TA载体上切下，然后连接到pRC/RSV表达载体上(离体基因)，该载体已预先用HindⅢ和Xgal水解并经琼脂糖凝胶电泳得到纯化。
在37℃和5％CO2条件下，将人的肺腺癌细胞系(HTB-174)培养在RPMI培养基中，该培养基补充有5％热灭活的胎牛血清，而其余来自于子宫腺癌(HEC-1A)和前列腺癌(HTB-81)的人肿瘤细胞系，在37℃和5％CO2条件下，保存于补充有1％FBS的McCoy’s 5A培养基中。这些肿瘤细胞系用pRC/RSV-hUG构成物或pRC/RSV质粒转染，以电穿孔处理的作为对照。24小时后，将G418加入培养基，其终浓度为400μg/ml。将单个G418抗性克隆分离并保存于含有200 ug/ml G418的培养基中，作进一步实验。RT-PCR检测UG-mRNA用RNAzol的方法从不同的细胞系中分离总RNAs(TEL-TEST,Inc)。本研究中使用的引物同Peri et al.1993描述的那样。简要的说，通过hUG-cDNA的特异引物进行逆转录，hUGr(5’T A C A C A GT G A G C T T T G G G C-3’)。RT-PCR产物用于进一步扩增，引物为hUGI(5’A T G A A A C T C G C T G T C A C C C-3’)和hUGr。然后将PCR产物印迹并进行杂交检测，所使用的hUG特异的寡核甘酸探针为hUGp(5’-T G A A G A A G C T G G T G G A C A C C-3’)。用于GAPDH mRNA检测的引物和探针如下hGAPDH-r:(5’-C A A A G T T G T C A T G G A T G A C C-3’)，hGAPDH-I:(5’C C A T G G A G A A G G C T G G G G-3’)和hGAPDH-p:(5’-T C C T G C A C C A C C A A C T G C T T-3’)。免疫沉淀和Western印迹分析UG cDNA转染的人子宫腺癌(HEC-1A)和前列腺癌(HTB-81)的细胞裂解物，按照G.Mantile et al.[J.Biol.Chem.268,20343(1993)]描述的方法进行免疫沉淀。简要的说，在细胞裂解缓冲液中清洗这些细胞，裂解后离心，所得上清液与hUG的兔抗体孵育1小时，然后与A-琼脂糖于4℃孵育过夜。结合生成的络合物通过离心，在沸浴的SDS样品缓冲液中冲洗和洗涤后收集。样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电印迹至硝酸纤维素膜上。为进行Western Blot分析，将含有UG的膜置于封闭液中封闭，冲洗后与羊抗UG的抗体(1∶250稀释)孵育，然后冲洗膜，与HRP结合的兔抗羊IgG(1∶2000稀释)进一步孵育，按照制造商(Amersham)的说明，用增强的化学发光的方法(ECL)进行检测。
总RNA的RT-PCR分析是从pRC/RSV转染的和野生型的子宫腺癌(HEC-1A)和前列腺癌(HTB-81)细胞中推断的。将PCR产物印迹后，用hUG特异的寡核甘酸探针杂交进行检测。人GAPDH基因的扩增产物用作RNA特性的内部对照，同时用于消除移液误差。
结果表明，这些细胞既不能表达可检测到的UG-mRNA水平也不能表达可检测到的UG蛋白水平(图12a&12b)。然后用人UG(hUG)-cDNA构成物，pRC-RSV-hUG转染这些细胞。非转染的和模拟转染的(只有载体)细胞作为对照。结果显示，在对照细胞中不能检测到UG-mRNA和UG蛋白，而在UG-cDNA转染的细胞中不仅高量表达UG-mRNA，而且高量表达UG蛋白，从而证实了目前所用的体系。实施例18．肿瘤细胞表型为确定这些腺癌细胞系中UG的增强表达，是否影响无贴壁依赖性生长和侵染ECM的能力这两种癌细胞最重要的特性，分别对它们在软琼脂上的生长和Matrigel(ECM)侵染进行检验。如图13所示，UG的增强表达导致在软琼脂上的无贴壁依赖性生长(图13.a)和ECM侵染(图13.b)的明显抑制，这是由用pRC-RSV-hUG转染的HEC-1A细胞引起的，而不是由对照或模拟转染的细胞引起的。在HEC-1A细胞中，由pRC/RSV/hUG转染引起的ECM侵染的抑制，与非转染对照相比，其抑制百分比约为79％。来自于肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌的其它细胞系，对软琼脂上的无贴壁依赖性生长或ECM侵染没有显示出任何抑制现象(数据未列出)。
为检验用纯化的hUG处理过的腺癌细胞系能否抑制软琼脂上的无贴壁依赖性生长和ECM侵染，同样的检测方法运用于以上提到的全部四个细胞系，不管是非转染的还是模拟转染的。结果显示，用纯化的重组的hUG预处理过的这些细胞明显抑制非转染的HEC-1A细胞在软琼脂上的无贴壁依赖性生长和ECM侵染。此ECM侵染的抑制百分比与检测pRC-RSV-hUG转染的HEC-1A细胞时的数据非常相似(图14)。以上结果引导我们进一步研究hUG介导的无贴壁依赖性生长的抑制机理和pRC-RSV-hUG转染的HEC-1A细胞的侵染机理。
将软琼脂检定法运用于非转染肿瘤细胞系和pRC/RSV-UG构建体或pRC/RSV质粒转染的子宫(HEC-1A)、前列腺(HTB-81)和肺(HTB-174)肿瘤细胞系中。细胞经胰蛋白酶消化后接种在60mm的接种盘中，作为接种层的底层是含有相同培养基的5ml 0.5％的琼脂，上层是含有相同培养基的2m1 0.3％的精制琼脂。含有200ug/ml G418的顶层琼脂/培养基用于培养pRC/RSV-UG构建体或pRC/RSV质粒转染的细胞。培养盘于37℃和5％CO2条件下孵育12-14天。用中性红染色菌落并人工计数。
体外Matrigel侵染检验按照Kundu等1996所述的那样进行。简单的说，当细胞生长至汇合80％时，经胰蛋白酶消化后，用含有0.1％BSA的PBS冲洗两遍。将细胞重新悬浮于含有0.1％BSA的DMEM中，并放入Matrigel侵染室的上层空间。侵染室的下层填满了成成纤维细胞条件培养基(FCM)，该培养基是一种细胞侵染用的化学引诱物，是在NIH 3T3成纤维细胞孵育24小时后，从其增殖培养物的上清液中制备而得的。于37℃孵育36小时后，用Giemsa对这些细胞进行染色，并立即用无水乙醇冲洗两遍，每次5分钟。用温棉签将非侵染细胞和Matrigel从滤器上表面刮去，并用水将侵染室冲洗三遍保留在滤器上的侵染细胞置于倒置显微镜下计数，通过转染细胞中的受侵染细胞数与对照细胞中的受侵染细胞数相比，计算细胞侵染的百分比。
在软琼脂上生长的对照细胞(pRC/RSV单独转染的子宫腺癌细胞)的形态显示于图14(a)HEC-1A，而在软琼脂上用hUG表达构建体转染的细胞的形态显示于图14(b)HEC-1A/UG。在rhUG存在时出现的较小菌落表明子宫珠蛋白不仅抑制人肿瘤细胞的侵染性，而且还抑制肿瘤细胞的生长。实施例19．UG受体结合的证实实施125I-hUG结合及亲和交联验定法，确定hUG是否通过它的受体介导途径发挥这种作用。125I-hUG结合分析UG的放射性碘化物和结合实验按照Kundu等1996所述的那样进行。简要的说，用125I钠碘化物(2mCi；无载体)和IODOBEADS对UG(20ug)进行放射性碘化。125I-UG通过葡聚糖凝胶G-25离心柱层析(1200×g,4分钟)进行纯化。纯化得到的125I-UG的特异活性是20UCi/μg。用pH7.4的PBS冲洗12孔盘中非转染的和人pRSV/hUG转染的汇合的HEC-1A细胞，在1ml pH7.6的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中与还原的125I-UG(1.5nM)于室温下孵育2小时，HBSS中含有0.1％的BSA，未标记的还原的重组hUG缺乏或以浓度递增(1pM-1μM)的形式存在。用pH7.6的PBS冲洗这些细胞，并溶于1N NaOH中，随之加入等体积的1N HCl。其放射性用γ-计数器测量。特异性结合是通过从总的结合中减去非特异性结合得到的。运用LIGAND计算机程序进行数据的斯卡查德分析。所得的这些结果与图8中显示的那些一致，表明这就是前面描述过的同一个UG受体。亲和交联实验非转染的和pRC/RSV/hUG转染的腺癌细胞在6孔盘中生长至汇合。用pH7.6的PBS冲洗，在2ml pH7.6的HBSS中与还原的重组人125I-UG(3nM)于室温下孵育2小时，HBSS中含有0.1％的BSA，存在或缺乏未标记的还原的hUG(250nM)。孵育后，冲洗细胞并在2mlpH7.6的HBSS中与0.2mM DSS进一步孵育20分钟。刮下细胞，离心(10000×g)15分钟收集细胞，然后溶于按40∶1配制的细胞溶解缓冲液(1％Triton X-100中含有1mM PMSF，亮抑酶肽(20μg/ml)和2mM EDTA)。上清液重新悬浮于含有5％β-巯基乙醇的样品缓冲液。通过SDS-PAGE和放射自显影分离样品。
本实验的结果表明125I-hUG只与HEC-1A细胞高度亲和且特异性结合(图15a&15b)，而其它腺癌细胞系没有这种结合(数据未列出)。UG受体被鉴定在HEC-1A(应答器)细胞上，而不是HTB-81(非应答器)细胞上。125I-hUG与其结合蛋白的亲和交联分别在非转染的和pRSV/hUG转染的HEC-1A细胞及HTB-81细胞中进行。在未标记的还原的hUG缺失和存在条件下，这些细胞与还原的125I-hUG孵育结合，然后与DSS交联(泳道1:(-)DSS；泳道2:(+)DSS和泳道3:(+)hUG+DSS)。用125I-hUG进行的亲和交联结果表明，在HEC-1A细胞(图15b)中出现了190Kda和49 Kda的UG结合蛋白，但在受试的其它三个腺癌细胞系中却没有出现蛋白。如此，增强的UG表达或纯化的hUG对这些细胞的处理抑制了只表达hUG结合蛋白的那些细胞的FCM侵染。实施例20:UG缺陷小鼠的肿瘤发生迄今为止，总数为16的UG-/-小鼠(患有后天发生疾病)，自出生存活一年以上后，不仅表现出了肾损伤，而且还患有肿瘤。也就是说，全部16只(100％)衰老的UG缺陷小鼠，至今，全都患上了肿瘤。这些肿瘤源于各种组织，代表了目前仍在鉴定中的各种类型的肿瘤。然而，这些结果不仅表现了UG缺陷在癌症发生中的意义，而且暗示了rhUG在治疗和/或预防癌症中的潜在作用。实施例21:UG作为HCG相关因子(HAF)的鉴定最近的一篇报道描述了一种HCG(人绒毛膜促性腺激素)相关因子，称之为HAF，是在妊娠早期妇女的尿中发现的，(1)能阻遏肿瘤发生和卡波济氏肉瘤的转移；(2)能阻遏HIV感染和(3)刺激血细胞生成(Lunardi-Iskandar et al,1995；1998)。HAF可从人尿中与HCG同步纯化并可与HCG形成复合物。人UG在妊娠早期妇女的尿中含量升高。UG和HAF都是低分子量蛋白(15-30KDa)并都能够抑制肿瘤细胞的侵染。初步的体外实验显示，125I-rhUG和HCG(由AyerstLabs,Inc.提供)事实上的确形成了一紧密结合的复合物，由此推测子宫珠蛋白和HAF是同一种蛋白。
在描述本发明时，联系到什么是目前认为最实用和最优选的实施方案，需要理解的是，本发明不局限于已公布的该实施方案，而是相反，意在涵盖各种修改方案及包含于所附的权利要求精神和范围内的等同方案。
参考文献1．Levin,S.W.et al.，生命科学(Life Sci.)38:1813-1819(1986)；2．Singh G.et al.，生物化学和生物物理杂志(Biochem.Biophys.Acta.)1039:348-355(1990)；3．Mantile,G.et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem)268:20343-20351(1993)；4．Singh G.et al.，组织化学杂志(J.Histochem.)36:73-80(1987)；5．Bernard,A.et al.，临床化学(Clin.Chem.)38:434-435(1992)；6．Dhanireddy,R.et al.，儿科学研究(Pediatric Res.)23:463A(1988)；7．Dhanireddy,R.et al.，儿科学研究(Pediatric Res.)33:323A(1993)；8．Piomelli,D.，细胞生物学评论(Op.In Cell Biol.)5:274-280(1993)；9．Krishnan,R.S.et al.，科学(Science)158:490-492(1967)；10．Beier,H.Verhandl Deut.Zool.Ges.Heidelberg(1968)；11．Umland,T.C.et al.，自然-结构生物学(Nature.Struct.Biol.)1:538-545(1994)；12．Hard,T.et al.，自然-结构生物学(Nature.Struct.Biol.)2:938-989(1995)；13．Umland,T.C.et al.，自然-结构生物学(Nature.Struct.Biol.)2:919-922(1995)；14．Stripp,B.R.et al.，美国生理学杂志(Am.T.Physio.)27115)(肺分子和细胞生物学)L656-L664(1996)；15．Lesur,O.et al.,Am.T.Respir.Crit.Care Med.152:290-297(1995)16．Glaser,K.B.，药理学进展(Adv.Pharmacol.)32:31-66(1995)；17．Tykka,H.T.et al.，斯勘得那维亚胃肠病学杂志(Scand.J.Gastroenterol.20:5-12(1985)；18．Sheuer,W.,Klin.Wochenschr.67:153-159(1989)；19．Barnes,H.J.et al.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),Feb.23,1996；20．Aoki,A.et al.，分子人类生殖学(Mol.Hum.Reprod.)2:419-497(1996)；21．Anderson and Kurkland，微生物学评论(MicrobiolgicalReviews)54:198-210(1990)；22．Miele,L.et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem)265:6427-6435(1990)；23．Coal son,J.J.et al.，实验分子病理学(Exp.Mol.Pathol.)37:355-360(1982)；24．Nagy,A.et al.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90:8424(1993)；25．Capecchi,M.R.，科学(Science),244:1288(1989)；26．Harlow,E.和Lane D.抗体；实验手册，第1版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1988；27．Mantile,G.et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem)267:20343(1993)；28．Ruoslahti,E.生物化学年鉴(Ann Rev.Biochem.)57:375(1988)；29．R.O.Hynes,Fibronectins,New York:Springer-Verlag(1990)；30．Chernousor,M.A.et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem)266:10857(1991)；31．Zhang,Q.et al.，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)127:1447(1994)；32．Wu,C.et al.，细胞(Cell)83:715(1995)；33．Zhang,Q.et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem)271:33284(1996)；34．Border,W.A.et al.，临床研究杂志(J.Clin.Invest).90:1(1992)；35．Peri,A.,et al.，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)92:2099(1993)；36．Peri,A.,et al.，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)96:343(1995)；37．Oh,E.et al.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)78:3218(1981)；38．Mosher,D.F.et al.，现代生物学(Curr,Biol.)4:810(1992)；39．R.S.Krishnan,J.C.Daniel Jr.，科学(Science)158,490(1967).
40．H.M.Beier，生物化学和生物物理杂志(BiochimBiophys.Acta)950,329(1988).
41．A.Peri,E.Cordell-Miele,L.Miele,A.B.Mukherjee，临床研究杂志(J.Clin Invest)92,2099(1993).
42．G.Singh et al.生物化学和生物物理杂志(BiochimBiophys.Acta)950,329(1988).
43．J.Jackson,R.Turner,J.N.Keen,R.A.Brooksbank andE.H.Cooper，色谱学杂志(J.Chromatogr).452,359(1989).
44．M.J.Beato，甾类生物化学(Steroid Biochem.)7,327(1976)；M.Gillener et al.甾类生物化学杂志(J.SteroidBiochem.)31,27(1988).
45．K.Diaz Gonzalez和A.Nieto，欧洲生物科学联合会通讯(FEBS Lett.)361,255(1995).
46．M.A.Watson and T.P.Fleming，癌症研究(Cancer Res.)56,860(1996).
47．M.A.Watson,C.Darrow,D.B.Zimonjic,N.C.Popescu,T.P.Fleming，癌基因(oncogene)16(2),817(1998).
48．L.Miele,E.Coedella-Miele,A.B.Mukherjee内分泌综述(Endocrine Reviews),8,474(1987).
49．L.Miele,E.Coedella-Miele,G.Mantile,A.Peri,A.B.Mukherjee内分泌学研究杂志(J.Endocrinol.Invest).,17,679(1994).
50．L.Miele,E.Coedella-Miele,A.Facchiano,A.B.Mukherjee，自然(Nature)335,726(1988).
51．L.Miele,E.Coedella-Miele，生物化学杂志(J.Biol.Chem)265:6427(1990)；52．G.Camussi,C.Tetta,F.Bussolino,C.Baglioni，实验医学杂志(J.Exp.Med.)171,913(1990).
53．S.Lloret,J.J.Moreno，生物化学和药理学(Biochem.Pharm.)50(3),347(1995).
54．G.Mantile,L.Miele,E.Coedella-Miele,G.Singh,S.L.Katyal,A.B.Mukherjee，生物化学杂志(J.Biol.Chem)268:20343(1993)；55．G.Vasanthakumar,R.Manjunath,A.B.Mukherjee,H.Warabi,E.Schiffman，生物化学和药理学(Biochem,Pharmacol).37(3),389(1988).
56．R.Manjunath,R.et al.Biochem.Pharmacol.36(5),741(1987).
57．J.G.Vostal,A.B.Mukherjee,L.Miele,N.R.Shulman，生物化学和生物物理研究通信(Biochem.Biophys.Res.Commun).165(1),27(1989).
58．A.Melchiori et al.Anticancer Res.10(1),37(1990).
59．G.C.Kundu,G.Mantile,E.Coedella-Miele,A.B.Mukherjee，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA).93:2915(1996).
60．K.Diaz Gonzalez,A.Nieto，欧洲生物科学联合会通讯(FEBSLett).361,255(1995).
61．Z.Zhang.et al.,DNA和细胞生物学(DNACell.Biol).16(1),73(1997).
62．B.C.Misra,E.S.Srivatan，美国人类遗传学杂志(AmJ.Hum.Genet).455,65(1989).
63．G.A.Lammie et al.，癌基因(Oncogene)6,439(1991).
64．G.A.Lammie,G.Peters，癌细胞Vol.3(11),413(1991)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。
65．S.Brookes,et al.，基因，染色体和癌症(GenesChromosomes&Cancer)4,290(1992).
66．R.A.Jesudasan,et al.，抗癌研究(AnticancerRes).14,LI727(1994)；67．G.M.Hampton,et al.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA).91:6953(1994).
68．R.A.J esudasan,et al.，美国人类遗传学杂志(AmJ.Hum.Genet).56,705(1995).
69．P.J.Saxon,E.S.Srivatan,E.J.Stanbridge，欧洲分子生物学杂志(EMBO J).5,3461(1986).
70．M.Koi,et al.，分子癌症发生(Mol.Carcinogenesis)2,12(1989).
71．I.Linnoila et al.，美国临床病理学杂志(Am J.ClinPath).97,235(1992).
72．J.L.Broers et al.，实验室和研究(Lab.Invest).66,337(1992).
73．A.Sandmoller et al.，细胞生长和分化(Cell GrowthDiffer).6,97(1995).
74．F.J.DeMayo et al.，美国生理学杂志(Am J.Physiol.)261,L70(1991).
75．A.Weerartna et al.，临床癌症研究(Clin.CancerRes).3,2295(1997).
76．A.B.Mukherjee,L.Murty,J.Y.Chou，分子细胞内分泌学(Mol.Cell.Endocrinol).94,R15(1993).
权利要求
1．一种预防或治疗原发癌细胞生长的方法，该方法包括给需要此预防或治疗的患者施用肿瘤抑制有效量的重组的人子宫珠蛋白(rhUG)或其片段或其衍生物。
2．权利要求1的方法，进一步包括通过施用肿瘤抑制有效量的rhUG以靶向子宫珠蛋白的受体。
3．一种药物组合物，包括肿瘤抑制有效量的rhUG和药学上可接受的载体或稀释剂。
4．权利要求3的药物组合物，其中所说的rhUG的纯度为大约75％～大约100％。
5．权利要求3的药物组合物，其中所说的rhUG的纯度为大约90％～大约100％。
6．权利要求3的药物组合物，其中所说的rhUG的纯度为至少95％。
7．权利要求3的药物组合物，其中rhUG是还原的和单体的rhUG。
8．一种通过抑制纤连蛋白聚集和/或沉淀而预防或治疗肿瘤转移的方法，包括给需要如此预防或治疗的患者施用抑制纤连蛋白有效量的rhUG或其片段或其衍生物。
9．权利要求8的方法，进一步包括通过施用上述纤连蛋白抑制有效量的rhUG以靶向子宫珠蛋白受体。
10．一种刺激血细胞生成的方法，包括给需要如此刺激的患者施用刺激血细胞生成有效量的rhUG或其片段或其衍生物。
11．权利要求10的方法，进一步包括通过施用刺激血细胞生成有效量的rhUG以靶向子宫珠蛋白受体。
12．一种药物组合物，包括刺激血细胞生成有效量的rhUG或其片段或其衍生物和药学上可接受的载体或稀释剂。
13．权利要求12的药物组合物，其中所说rhUG的纯度为大约75％到大约100％。
14．权利要求12的药物组合物，其中所说rhUG的纯度为大约90％到大约100％。
15．权利要求12的药物组合物，其中所说rhUG的纯度为至少95％。
16．一种从包含一或多种化合物，肽和/或蛋白质的样品中筛选子宫珠蛋白结构类似物和/或UG-受体配体的方法，该方法包括(a)用纯化的子宫珠蛋白受体接触所述的样品；和(b)检测在所述的受体和样品之间的结合相互作用，存在结合相互作用则表明，在所述的样品中存在子宫珠蛋白结构类似物和/或UG受体的配体。
17．一种筛选子宫珠蛋白结构类似物和/或UG受体的配基的试剂盒，包括纯化的子宫珠蛋白受体。
18．一种从样品中纯化子宫珠蛋白受体的方法，包括(a)用结合到固相支持物上的rhUG接触所述的样品；和(b)从固相支持物上洗脱纯化的子宫珠蛋白受体。
19．一种制备还原rhUG的方法，该方法包括用一种还原剂在一定时间和温度下接触氧化型rhUG，以充分还原rhUG。
20．权利要求19的方法，其中还原的rhUG是单体的。
21．一种产生抗子宫珠蛋白受体的抗体的方法，包括用纯化的子宫珠蛋白受体免疫动物，然后分离该受体的抗体。
全文摘要
本发明描述和要求了用于治疗原发癌细胞生长和肿瘤转移的组合物和方法,以及刺激造血生成的组合物和方法。本发明还涉及通过用重组人子宫珠蛋白(rhUG)靶向子宫珠蛋白受体来治疗癌症和子宫珠蛋白受体相关疾病的方法。本发明还公开和要求了纯化子宫珠蛋白学体的方法和应用所说受体鉴定子宫珠蛋白结构类似物和UG受体配基的方法。
文档编号A61P27/00GK1323216SQ99811164
公开日2001年11月21日 申请日期1999年7月19日 优先权日1998年7月21日
发明者A·皮隆, A·B·慕克吉, Z·张 申请人:克拉拉根有限公司, 国家健康学会