专利名称：通过修饰、调节及抑制结缔组织生长因子来检查、预防和治疗肾脏疾病的方法
I发明领域本发明涉及结缔组织生长因子(CTGF)在细胞外基质产生中的作用。更具体地说，本发明涉及以CTGF为靶点检查、预防及治疗与细胞外基质过量产生相关的肾脏纤维化和其他疾病的方法。
II发明背景肾脏疾患和疾病肾脏的功能是分离血液中的废物、调节酸的浓度和保持水的平衡。肾脏控制着血液中各种化合物的水平，如氢、钠、钾和硅，并以尿液的形式排出废物。任何形式肾脏功能的下降会干扰人体充分清除血液中代谢产物的能力，而且可扰乱人体电解质平衡。在最严重的情况下，肾脏功能的下降或削弱可以是致命性的。
一些疾病可导致慢性肾脏衰竭，即随时间的延长肾脏功能的下降。例如高血压、糖尿病、充血性心力衰竭、狼疮和镰状细胞性贫血均可导致肾脏衰竭。急性疾病过程和损伤可促使肾脏功能急剧下降。
因此很容易理解，患有糖尿病、高血压、炎性和自身免疫性疾病及其它疾病的病人易发生肾脏功能改变和进行性肾脏功能损伤，其特征为，例如，肾小球滤过率下降、白蛋白尿、蛋白尿和进行性肾脏功能不全。半数以上的肾脏疾病引发肾脏纤维化。纤维化包括纤维组织形成和产生中的变化，并可以导致细胞外基质成分过量产生和积聚。
细胞外基质(ECM)是细胞分泌至胞外的各种糖蛋白、多糖和其他大分子物质组成的复杂的网状结构。ECM提供一支持性的支架，直接影响各种细胞特性，包括形状、能动性、强度、弹性和粘附性。在纤维化中，ECM物质的过量产生和积聚可使各种膜的和细胞的成分增厚和变形，减少受影响部位的局部弹性和表面积，削弱很多机体功能。
肾脏纤维化是各种形式的肾脏损伤过程的共同途径。肾脏纤维化一般通过延及原来的肾脏未损伤区域得以扩展。当正常的滤过功能下降时，肾脏的残存组织和各种区域系统性地受损。肾脏纤维化可表现为肾脏膜成分弥漫性增厚、(纤维化)积聚和扩展导致表面滤过面积的下降及相应的机体电解质组成紊乱和酸碱失衡。
肾脏纤维化可见于许多疾病，包括，例如，糖尿病性、自身免疫性和移植性肾病；高血压；和某些形式的肾小球损伤或疾病。糖尿病病症(糖尿病)是影响全世界数亿人口的一种复杂性疾病。糖尿病特征是高血糖或血液中葡萄糖水平升高。葡萄糖不能进入机体细胞得以利用，因此在血液中的浓度很高。当血糖水平超过肾小管的再吸收能力时，葡萄糖排到尿液中。糖尿病产生许多致衰弱和致命的并发症。
进行性肾病是糖尿病最常见和最严重的并发症。见，如，Hans-Henrik等人，1988，糖尿病肾病糖尿病研究新领域第二次国际研讨会。(1988，Diabetic NephropathyThe Second World Conferenceon Diabetie Reseach，New Frontiers.)国际青年糖尿病基金会，pp.28-33。糖尿病肾病和其他形式的肾脏损伤所致的肾脏硬化的特征为肾小球系膜的早期扩大，这主要由于如I和IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白等ECM蛋白质过多积聚所致。见，如，Maurer等人，1984，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)741143-55；Bruneval等人，1985，人类病理学(Human Pathol.)16477-484。该病理性沉积导致滤过功能下降，产生肾脏衰竭，一种需要移植或终生透析的疾病。现有的治疗方法可以延缓但不能抑制或逆转此类肾脏功能的进行性损伤。现在已明确的主要病因还包括高血糖、肾小球性高血压和异常的细胞因子环境。Tuttle等人，1991，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)，3241626-1632；糖尿病控制并发症试验研究组，1993，新英格兰医学杂志，329977-986；Hostetter等人，1981，国际肾脏病(Kidney Int.)，19410-415；Anderson等人，1985，临床研究杂志，76612-619；Border等人，1993，美国肾脏病杂志(Am.J.Kidney Dis.)，22105-113。
高血糖是有害的，这在很大程度上是由于高浓度的葡萄糖能刺激系膜细胞积聚ECM。见，如，Ayo等人，1990，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)1361339-1348；Heneda等人1991，糖尿病学(Diabetologia)34190-200；Nahman等人，1992，国际肾脏病，41396-402；Cortes等人，1997，国际肾脏病，5157-68。如Davies等人，1992，国际肾脏病，41671-678中所示，系膜细胞主要负责原位系膜基质的合成。另外已确定，葡萄糖在系膜细胞基质产生中的作用与葡萄糖的转运和利用增加有关。Helig等人，1995，临床研究杂志，961802-1814。此外，Ziyadeh等人，1994，临床研究杂志，93536-542，表明可溶性的分泌介质介入了系膜细胞基质的产生过程。
肾性高血压，可以是糖尿病病人肾脏疾病的继发表现，也可以由其他疾病或疾患，包括长期高血压引起。实际上，任何肾脏功能的削弱均可以导致继发性高血压。对高血压诱发ECM沉积的致病机制的理解正得以加深。例如，在糖尿病中，正常的血压衰减(能力)的早期削弱发生在肾小球入球小动脉，这就置肾小球毛细血管于随时间而发生巨大变化的系统性血压中。Hayashi等人，1992，美国肾脏病学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)21578-1586；Bidani等人，1993，美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)265F391-F398。由于肾小球的弹性，升高的毛细血管压使肾小球结构扩张，导致系膜细胞上的机械张力升高。Riser等人，1992，临床研究杂志，901932-1943；Kirz等人，国际肾脏病，38(增刊20)S2-S9。另外，将培养的系膜细胞置于周期性张力下时，该细胞I和IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白的合成和积聚反应性地增多。Riser等人，1992，见上。虽然肾小球压力升高多见于糖尿病，但并不仅限于此类疾病，在其他形式的进行性肾脏病中也存在，包括，例如，某些形式的肾小球肾炎和增生。见，如Cortes等人，1997，国际肾脏病，5157-68。
这样肾小球硬化和相关的肾脏功能下降存在于各种疾病和疾患过程中，包括糖尿病和高血压，这便大大增加了对肾脏纤维化治疗方法的需求。
转化生长因子β(TGF-β)迄今为止，对肾脏疾病和疾患尤其是与糖尿病有关的肾脏病变的生理指标的少数研究，已集中于转化生长因子β(TGF-β)在正得以发展的方法中的作用上，此类方法的靶点是细胞外基质成分的过度产生(合成和积聚增加)。实验性肾脏病研究探讨了包括TGF-β在内的细胞因子失衡在引发肾小球基质扩张和/或使之持续中的作用。见，如，Sharma等人，肾脏病研讨会(Seminars In Nephrology)，1116-129。在人和实验性糖尿病肾小球硬化中肾小球TGF-β活性升高。见，如，Yamamoto，1993，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci)，901814-1818；Sharma等人，1994，美国生理学杂志，267F1094-1101；Shankland等人，1994，国际肾脏病，46430-442。TGF-β使培养的系膜细胞或肾小球ECM产量增加。见，如，Bollineni等人，1993，糖尿病(Diabetes)，421673-1677。在如Isaka等人，临床研究杂志922597-2601的研究中表明，大鼠肾脏转染并过量表达TGF-β基因可以诱导体内肾小球基质的积聚。
另外，中和研究发现抗TGF-β抗体能减缓实验性肾小球肾炎和糖尿病中肾小球ECM基因的高表达。Border等人，1990，自然(Nature)346371-374；Sharma等人，1996，糖尿病45522-530。糖尿病中TGF-β的持续高表达可以是系膜细胞对升高的葡萄糖水平和高血压二者的反应所致。有报道认为培养基中葡萄糖浓度升高可以刺激系膜细胞合成和分泌TGF-β1，并使TGF-β与特定受体的结合能力增加。Ziyadeh等人，1994，临床研究杂志93536-542；Riser等人，1998，美国肾脏病学会杂志9827-836；Riser等人，1999，国际肾脏病56428-439。也有报道认为机械压力可以选择性地刺激TGF-β1产生、释放和活化，并提高TGF-β受体的表达。Riser等人，1996，美国病理学杂志1481915-1923。
对TGF-β的体外中和研究表明葡萄糖水平升高导致系膜细胞胶原合成能力明显下降。见，如Sharma等人，1996，见上；Ziyadeh等人，1994，见上。也有研究表明过量葡萄糖存在的情况下周期性张力所致的胶原积聚实际上可以完全消失。Riser等人，1997，见上。TGF-β在体内和体外刺激系膜细胞增殖，并能诱导这些复制细胞的ECM过量产生和过多沉积，后者是各种肾脏疾患包括增殖性疾病如肾小球肾炎的特征。见，如，Border.W.A.等人，1990，自然346371-374；Habershorh，U.G.等人1993，美国生理学杂志264F199-205。根据这些研究结果，人们致力于通过减少TGF-β的利用和结合来减缓基质积聚。然而，由于TGF-β的广泛特性和多种功能，包括肿瘤抑制和多水平调节，其长期抑制的可行性和安全性都应引起注意。见，如Brattain等人，1996，Curr.Opin.Oncol.49-53；Franklin，1997，国际细胞生物学生化杂志(Int.J.Biochem.CellBiol.)2979-89.
因此，需要治疗或预防ECM过量产生或过多沉积而不影响TGF-β的广泛功能的方法。
结缔组织生长因子(CTGF)CTGF是可能作用在TGF-β下游来调节基质积聚的一种肽。以前有报道描述过这种新的生长因子。见，如，美国专利号5,408,040；Bradham等人，1991，细胞生物学杂志1141285-1294。CTGF是一分子量约36到38KD的多肽，以单体形式存在。CTGF是CCN家族七种富半胱氨酸分泌蛋白质成员之一，该家族包括CTGF、CYR-61和NOV.Oemar等人，1997，动脉粥样硬化，血栓形成和血管生物学(Arteriosclerosis，Thrombosis andVascular Biology)17(8)1483-1489。CTGF是立即早期反应基因，编码由4个模块和一段信号肽组成的蛋白质。Oemar等人，1997，见上。该4个模块是1)类胰岛素生长因子(IGF)结合域，2)极可能参与寡聚化的C型Von Will ebrand因子重复序列，3)认为与ECM结合有关的1型血小板反应素重复序列，和4)可能参与受体结合的C-末端模块。近来的报道表明，整个CTGF蛋白质的某些片段具有CTGF活性。见，如，Brigstock等人，1997，生物化学杂志(J.Bio.Chem.)272(32)20275-282。人类、小鼠和大鼠CTGF具有高保守性，超过90％的氨基酸同源且分子量约为38kD。最近研究发现CTGF启动含有一新型TGF-β反应元件。Grotendorst等人，1996，细胞生长与分化(Cell Growth and Differentiation)，7469-480。
CTGF可能是皮肤纤维化和心脏动脉粥样硬化的重要的促硬化分子。例如，在系统性硬化、疤痕疙瘩、局部硬皮病病人损伤灶中的成纤维细胞表达CTGF mRNA，而邻近的正常皮肤无相应表达。见，如，Igarashi等人，1995，研究性皮肤病学杂志(The Journal ofInvestigative Dermatology)105280-284；Igarashi等人，1996，研究性皮肤病学杂志106729-733。TGF-β使培养的正常人类皮肤成纤维细胞CTGF mRNA和CTGF蛋白质水平反应性升高，而血小板来源的生长因子(PDGF)、上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)无上述作用。Igarashi等人，细胞分子生物学(MolecularBiology of the Cell)4637-645。硬皮病损伤灶中的成纤维细胞对TGF-β表现出更强的丝裂原活性并比正常成纤维细胞产生更多的CTGF。Kikuche等人，1995，研究性皮肤病学杂志105128-132。与TGF-β一样将人类重组CTGF注射到NIH Swiss小鼠皮下，同样可使连接性组织细胞和ECM迅速、大幅度升高，而PDGF和EGF对肉芽形成作用甚微或无作用。Frazier等人，1996，研究性皮肤病学杂志107404-411。TGF-β也能刺激培养的血管平滑肌细胞产生CTGF。在心脏病患者中，CTGFmRNA在动脉粥样硬化斑块中的表达水平较正常动脉要高50到100倍。Oemar等人，1997，循环(circulation)95(4)831-839。
尽管大量的证据表明CTGF是皮肤纤维化和心脏动脉粥样硬化的病因，对其在如肾脏硬化或糖尿病中的表达了解甚少。通过使用草酸钙肾石病体外模型，发现草酸钙可使猴肾上皮细胞CTGF基因和其它参与基质更新的基因上调。Hammes等人，1995，国际肾脏病48501-509。机械性损伤使培养的肾脏上皮细胞产生类似反应。Pawar等人，1995，细胞生理杂志(Journal of Cellular Physiology)165556-565。最近，在正常人的肾脏活检组织中发现有CTGFmRNA。定性评价表明，在有限数量的病例中，患有新月体肾小球肾炎、局灶和阶段性肾小球硬化及糖尿病性肾小球硬化(三例)、伴发严重系膜增殖性损伤的病人的组织中，CTGF的表达升高。Ito等人，1998，国际肾脏病53853-861。该项仅依赖于组织活检所得资料的研究没有定量的结果或者任何CTGF蛋白质水平的测定。而且没有将GTGF mRNA水平与ECM产生和沉积联系起来，没有为检查肾脏疾患或疾病，包括糖尿病，参与确定标本中CTGF水平的定量方法，未鉴定CTGF-表达细胞。
这样，CTGF在肾脏疾病中的作用并不明确，且目前没有研究发现CTGF与ECM过量产生和过多沉积及肾脏纤维化有因果关系。
诊断和早期检查肾脏衰竭是一种需要终末治疗如血液透析或移植的严重疾病。早期检查和/或预防任何非正常性肾脏病理与功能，可以减少受试者发生更严重疾病的风险。例如，患者早期的高血压可能不易察觉，但若不确定、检测和治疗的话其可以是致命性的。另外，有些疾病如糖尿病中，侵害性和破坏性小且更易承受的治疗方式，比如饮食限制，仅在早期阶段有效。因此，迫切需要有效并可靠的诊断方法对肾脏并发症作出早期检查和相应的预防。
例如，进行性肾小球硬化所致肾脏衰竭是I型或少年糖尿病发病率和死亡率的首因。见如，Dorman，J.S.等人，1984，糖尿病33271-276；Anderson，A.R.等人，1983，糖尿病学25496-501。现在用血管紧张素转化酶抑制剂这类所选药物，能有效减缓疾病进展。见如，Lewis，E.J.等人，1993，新英格兰医学杂志3291456-1462。但是此类治疗并不适用于所有新诊断为糖尿病的病人，因为只有约30-35％此类病人发生进行性肾病，且这些药物的长期副作用未知。见如，Parving，H.-H.和E.HommeL，1989，英国医学杂志(Brit.Med.J.)299230-233。另外，现在ACE抑制剂也用于治疗有高血压性肾脏衰竭的病人，包括那些非糖尿病性肾病病人。然而，不完全了解此类治疗的肾脏保护机制和如上所述的副作用。还有，已发现ACE抑制剂与非甾类抗炎药物作用相抵。见如，Whelton，A.，1999，美国医学杂志(Am.J.Med.)106(SB)13S-24S。
现有诊断方法中，糖尿病病人通过微量蛋白尿来监测。持续性微量蛋白尿是广泛性血管损伤的标志，提示1型和2型糖尿病出现了早期肾脏病。见如，Stehouwer，C.D等人，1992，Lancet340319-323；Bojestig，M.等人，1996，糖尿病治疗(Diabetes Care)19313-317；Mogensen，C.E.等人，1995，Lancet3461080-1084。但微量蛋白尿的实际水平不一定反映肾脏病的显著发展水平，尤其是在长期糖尿病病人中。Bojestig等人，见上。另外，由于在能够检查出微量蛋白尿时结构性肾脏损伤已经发生，延缓疾病进展的治疗效果基本上是降低的。Bangstad，H.-J.等人，1993，糖尿病学36523-529；Ruggenenti，P.等人，1998，美国肾脏学会杂志92157-2169；Fioretto，P.等人，1995，国际肾脏病481929-1935。极需要能对哪个1型糖尿病病人会发生肾脏病变作出预测并，大体上，发展一种可在明显的疾病发生之前检查出肾脏变化的方法。
总之，需要在本领域寻找有效方法来诊断、治疗和预防在各种疾患和疾病尤其是糖尿病和高血压中与肾脏功能削弱和下降相关的纤维化。目前没有研究注意过通过调节CTGF表达或活性来预防或治疗肾脏纤维化。
III发明概述本发明通过提供检查、治疗和预防与纤维化相关的肾脏疾患和疾病的方法满足了本领域需求。具体地，本发明提供了检查、预防和治疗与以细胞外基质过量产生和过多沉积为特征的肾脏疾病和疾患相关的病理变化和并发症的方法。
冶疗和预防方法本发明提供了多种用以改变致纤维化的细胞外基质过量产生的方法。具体地，本发明提供了调节与多种肾脏疾病和疾患中肾脏纤维化相关的细胞外基质积聚过多的方法。这些肾脏疾病和疾患包括但不局限于各种肾脏疾病，包括肾小球肾炎、肾小球硬化和肾小球损伤所致疾病；糖尿病肾病及其他并发症；肾炎；间质性疾病，急性和慢性移植排斥反应；肾性高血压，包括糖尿病伴发的肾性高血压；及其它纤维化潜在病因。更具体地，本发明提供了通过、改变和/或抑制CTGF表达和活性预防和治疗上面列举的肾脏疾病和疾患相关并发症的方法。在具体的实施方案中，本发明的方法用于诊断、预防和治疗糖尿病或高血压相关的肾脏疾病和疾患。
本发明中的方法是给予有效治疗剂量的可调节、修饰和/或抑制CTGF的ECM产生活性的试剂。具体地，本发明方法有助于治疗和预防哺乳动物，最优选人类的肾脏疾患。
一方面，本发明通过给予有效治疗剂量的与CTGF多肽或其片段反应的抗体，或与CTGF多肽或其片段起反应的抗体的抗原结合片段，提供了治疗以细胞外基质产生过多和积聚为特征的糖尿病相关并发症的方法。
另一方面，本发明提供了治疗和预防肾脏疾患尤其是糖尿病和高血压相关并发症的方法，其中应用与CTGFmRNA特异结合的反义寡聚核苷酸干扰蛋白质产物的表达。此反义寡聚核苷酸具有一能够与编码CTGF或其片段的任何多聚核苷酸序列特异结合的序列。
本发明另外的实施方案中，提供了应用小分子物质来抑制CTGF或其活性片段活性的方法，该分子作用方式是阻断CTGF与其受体结合、抑制CTGF活性并因此降低与肾脏疾患、包括糖尿病和高血压的发病和/或进展相关的细胞外基质产生过多。
本发明还提供了通过给予阻断CTGF结合或其信号传导途径中的酶的化合物来治疗和预防肾脏疾患的方法。
本发明还提供了通过给予胰岛素与CTGF活性改变和/或抑制剂来治疗和预防糖尿病的方法。更具体的是，本发明发现了通过根据本发明的方法给予胰岛素与CTGF活性改变、调节和/或抑制剂来治疗和预防糖尿病的方法。
也提供了通过检测因纤维化相关疾病和疾患接受治疗的受试者标本中的CTGF水平，来评价包括应用ACE抑制剂在内的抗纤维化治疗之有效性的方法。
诊断方法本发明还涉及预测哪些患有肾脏疾患相关疾病和疾患的病人将继发进行性肾脏疾病的方法。在一实施方案中，该发明提供了对具体疾病或疾患中的肾脏累及程度进行检查和/或分期(对疾病水平、部位和扩展程度进行分类)的方法。在一实施方案中，提供了预测患有糖尿病的病人是否会继发进行性肾脏疾病的方法，也提供了检查比如，与没有糖尿病的受试者相对的、患有糖尿病的受试者中当前肾脏累及程度的方法。
本发明还涉及检查以细胞外基质过多积聚为特征的组织病理学表现的方法。在一实施方案中，该方法包括例如，通过组织活检或者非侵入性方法如收集尿液标本，检测CTGF水平的方法。在具体的实施方案中，该方法包括确定标本中CTGF水平的方法，标本包括如采自患有糖尿病肾病譬如糖尿病性肾小球硬化的病人的尿液和其他体液。该方法还可包括通过检测尿液或其他体液标本中CTGF水平来检测患有进行性硬化的糖尿病和非糖尿病病人CTGF水平的方法。
更具体地，本发明包括诊断肾脏疾病或疾患的存在或易发素质的方法，包括检查和监测这些疾病和疾患发病机制的方法，或者检查和监测这些疾病和疾患发病标志物存在的方法。更具体地，本发明提供了通过测量病人标本，优选病人尿液标本中的CTGF水平诊断肾脏疾患的方法。
在本发明的一个实施方案中，提供了测量患有未知或可疑肾脏疾患的病人尿液标本中CTGF水平的方法。将已知患有一肾脏疾病或疾患的病人或已知未患有任何肾脏疾病或疾患的病人的尿液标本中的CTGF水平，与患有未知或可疑肾脏疾患的病人尿液标本CTGF水平进行比较，可预示肾脏疾病和疾患的存在。更具体地，该方法表明，患有肾脏疾患的病人标本中CTGF水平较无任何肾脏疾患的病人要高。因此，较高水平的CTGF水平预示肾脏纤维化相关疾病和疾患的发生。
在另一实施方案中，可通过检测标本中CTGFmRNA或蛋白质水平来测量CTGF的水平。还有一实施方案中，标本是组织标本并且CTGF的存在是通过组织中蛋白质染色或通过检测CTGFmRNA水平来测得。
本发明优选的方法是利用抗体，优选可与CTGF或其活性片段特异性结合的单克隆抗体。通过利用抗体测量CTGF水平的方法，可以对肾脏疾病的病理状态进行非侵入性诊断。在本发明优选实施方案中，抗体是人类的或人源化的。优选的抗体可用于例如标准放射免疫测定法或酶联免疫吸附测定法或其它应用抗体检测标本中CTGF水平的测定方法中。在具体的实施方案中，本发明的抗体用来检测和测量尿液标本中的CTGF水平。
诊断试剂盒本发明还涉及为检查受试者肾脏疾患或肾脏疾患易患素质检测和测量标本中CTGF水平的诊断试剂盒。在一实施方案中，该试剂盒含有CTGF特异性的抗体和用于检测和测量标本中CTGF水平的试剂。该标本可以是液态的，例如尿液，或者如组织标本。在本发明一实施方案中，该诊断试剂盒包括一特异识别CTGF的固定抗体和特异性针对CTGF且能够与不同于固定抗体的抗原成分结合的抗体。该CTGF抗体可进行酶标、放射性标记，或荧光标记。该诊断试剂盒还包括抗体检测必需的试剂，还可包括其他必需的试剂，例如，溶解剂、清洁剂及反应终止剂。
在该发明优选的实施方案中，将此诊断试剂盒包装在，例如，含有试剂盒所有必需元件并且还含有与该诊断试剂盒使用有关的说明书的盒中或容器中。
IV附图简述
图1A和图1B描述外源性CTGF对系膜细胞细胞外基质分泌的影响。图1A表示在温育结束时用ELISA方法测定的培养基纤连蛋白含量。图1B表示在温育结束时用ELISA方法测定的培养基1型胶原含量。
图2描述CTGF基因在大鼠组织和培养的肾脏细胞中的表达状况。从大鼠整个器官和培养的大鼠系膜细胞及肾脏成纤维细胞中提取总RNA进行Northern分析。MC代表系膜细胞；BT代表脑组织；HT代表心脏组织；KT代表肾脏组织；KFC代表肾脏成纤维细胞。
图3A、图3B和图3C描述外源性TGF-β和CTGF对CTGF和TGF-βmRNA水平的调节。图3A示代表性的实验结果。图3B示CTGF条带mRNA的量。图3C示TGF-β条带mRNA的量。
图4A和图4B描述培养的系膜细胞在外源性TGF-β作用下CTGF蛋白质的表达。图4A表示应用抗全长CTGF的抗体进行的免疫印迹。图4B表示应用抗CTGF特异的15个氨基酸序列的抗体进行的免疫印迹。
图5A和图5B描述CTGF蛋白质向系膜细胞培养基中的分泌和肝素的作用。图5A表示免疫印迹所用的经集中和肝素-琼脂糖凝胶处理的培养基的有关数据。图5B表示在集中前用ELISA分别检测CTGF含量的培养基的有关数据。
图6A和图6B描述系膜细胞CTGF蛋白质的诱导。图6A表示免疫印迹所用的经集中和肝素-琼脂糖凝胶处理的培养基的有关数据。图6B表示在集中前用ELISA分别检测CTGF含量的培养基的有关数据。
图7描述高葡萄糖浓度对系膜细胞CTGFmRNA表达的影响。图7表示在代表性实验中从6个不同的100mm培养盘中集中的RNA标本。
图8描述应用抗-TGF-β抗体对高葡萄糖诱导的CTGF产生过程中TGF-β的阻断。
图9A和图9B描述过度表达不同水平GLUT1的系膜细胞中的CTGF浓度。上清取自转导了GLUT1基因的MCGT1或转染了对照LaZ基因(MCLaZ)的双重培养细胞。
图10描述周期性牵张对系膜细胞CTGF转录表达的影响。在指定时间提取RNA并检测CTGF信使。每泳道代表从24个不同的培养孔中集中的标本结果。
图11描述应用抗-CTGF抗体对受刺激后I型胶原产生的阻断。
图12描述应用抗-CTGF抗体对受刺激后系膜细胞增殖的阻断。
图13A和图13B描述db/db小鼠中糖尿病相关的肾小球疾病。图13A表示5月龄时对照db/m小鼠的肾脏皮质切片。图13B表示5月龄时糖尿病db/db小鼠的肾脏皮质切片。图13A和图13B中的切片用PAS染色以作光镜检查，并且在糖尿病组中是所观察到的有最严重系膜扩张病变的肾小球的示例。
图14A、图14B和图14C描述5月龄db/db糖尿病小鼠整个肾脏中CTGF和纤连蛋白转录物的诱导情况。图14A和图14B表示从整个肾脏中提取总RNA并分别通过Northern分析检测CTGFmRNA和纤连蛋白mRNA。字母“C”代表非糖尿病小鼠，而字母“D”代表糖尿病小鼠。图14C表示通过对Northern分析结果的密度测定分析得出的定量结果。
图15A和图15B描述对取自糖尿病小鼠肾小球中的单一标本作GAPDH和CTGFmRNA的竞争性RT-PCR，PCR扩增后溴化乙啶染色凝胶。图15A和图15B的泳道中，含有恒量的测试cDNA和浓度以2倍递减的已知量的特异性模拟物。图15A表示对GAPDH的竞争性逆转录酶PCR(RT-PCR)。图15B表示对CTGF的竞争性RT-PCR。
图16描述用竞争性RT-PCR检测db/db小鼠中，糖尿病对肾小球CTGF和纤连蛋白转录物表达水平的影响。
图17描述在正常尿液中CTGF及其回收情况。4份是CTGF不同量的峰，第5份为对照组。通过应用CTGF特异性抗体进行免疫印迹。
图18描述病人或健康志愿者尿中CTGF蛋白质的测定。通过免疫印迹方法，对8位肾病患者或3位正常志愿者尿液标本进行CTGF测定。
V发明详述可以理解本发明并不限于此处所述的具体的方法学、实验步骤、细胞系和试剂等，这些都可以变化。也应理解在此所用的术语只用为了描述具体实施方案，本发明范围不仅限于此。应当指出，除非文中另明确表示，在此处和权利要求书中所用的单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数意义。因此，例如，“抗体”的意思是指一个或多个抗体及本领域技术人员所知的其任何等同物。
除非另外定义，此处所用的所有专业和科学术语与本发明所属领域内普通技术人员一般理解的意义相同。尽管描述了优选的方法、装置和材料，任何相似或相同方法可用于本发明的操作和检验中。所有的专利、出版物和其它此处引用的参考文献在此处全文引用作为参考。
定义此处所用的术语“细胞外基质”泛指非细胞基质，一般由蛋白质、糖蛋白、碳氢化合物和其它大分子物质构成。细胞外基质成分包括，例如，I型和IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和血小板反应素。
术语“纤维化”是指纤维组织非正常生长过程，或纤维素样或纤维性变性。多种损伤或疾病可导致纤维化，并且与多种器官移植有关的慢性移植物排斥经常可导致纤维化。纤维化一般包括细胞外基质成分的非正常产生、积聚或沉积，包括例如胶原和纤连蛋白的过度产生和过多沉积。
如此处所用的术语“肾脏纤维化”或“肾性纤维化”或“肾脏的纤维化”是指与细胞外基质成分，尤其是胶原过多或非正常沉积相关的疾病和疾患，导致肾脏功能的下降或损伤。术语“疾患”和“疾病”用来泛指任何偏离正常的情况。“疾病”和“疾患”包括，但不限于，急性和慢性同种异体移植和移植排斥(反应)和任何移植性肾病；急性和慢性肾功能衰竭；自身免疫性肾病；糖尿病肾病；肾小球肾炎，肾小球硬化和其它形式的肾小球异常或损伤；高血压；肥大；间质性病变；肾炎；硬化，由包括如疾病或损伤产生的炎症等病因导致的组织和/或脉管变硬或硬化；肾脏相关增殖性疾患；和其它原发或继发肾源性疾病。肾脏衰竭后和置管后透析的相关纤维化，例如，腹膜和血管通路纤维化也包括在内。
可以理解，尽管肾脏纤维化是本发明讨论的模型，纤维化的机制是通用的。因此，此处描述的方法、试剂盒和本发明其它方面也与用于其他形式的纤维化及与纤维化和增殖相关的疾病和疾患的诊断、预防和治疗，这些疾病包括，但不局限于心脏纤维化、肺纤维化、糖尿病视网膜病变、皮肤纤维化、硬皮病、动脉粥样硬化、动脉硬化、肥大性疤痕、疤痕疙瘩、关节炎、肝纤维化、炎性疾病、肿瘤生长转移，其它与细胞增殖和转移有关的疾病，包括那些血管内皮细胞，例如，血管生成和血管再生相关疾病等。
此处所用的术语“标本”一词具有其最广泛的含义。标本可为任何来源，例如取自体液、分泌物或组织，包括但不局限于唾液、血液、尿液和器官组织(例如活检组织)；取自染色体、细胞器或从细胞分离的其他的膜；取自基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA等；取自清除的细胞和组织或这些细胞或组织的印迹或痕迹。标本可以在溶液中或可以，例如，固定于或附着于底物上。标本可以指适于检测CTGF或适于筛选与CTGF或其片段结合的分子的任何物质。本领域内的技术人员知晓获取这些标本的方法。
“反义序列”是指可以特异地与靶序列杂交的任何序列。该反义序列可以是DNA、RNA或任何核酸模拟物或类似物。术语“反义技术”是指任何依据反义序列与靶序列特异杂交(原理)的技术。
与CTGF表达或活性有关的术语“改变”和“调节”是指与正常或与无变化的CTGF表达或活性相比，任何CTGF表达或活性的改变及对CTGF表达或活性的影响。
A. CTGF及其在纤维化和肾脏疾患中的作用本发明是建立在以下发现的基础上的，即CTGF在纤维性疾病，尤其在肾性疾患如糖尿病和肾小球性高血压相关的纤维性疾病中是细胞外(基质)积聚的重要介质。更具体地，本发明是建立在以下发现的基础上，即在肾脏疾病和疾患发病机制中肾小球细胞(尤其是系膜细胞)产生的CTGF是潜在的重要因子。人们发现CTGF水平增加诱导系膜细胞ECM产生和沉积增多。在对尿液标本的分析中，进一步发现健康受试者尿液中没有CTGF或CTGF水平很低，而糖尿病病人或患有其他肾脏疾患的病人的尿液中CTGF水平升高。
为了证实CTGF是肾脏中细胞外基质沉积的关键的决定因子，测定糖尿病和非糖尿病情况下系膜细胞、肾小球和整个肾脏CTGF的表达。在含有正常葡萄糖水平的培养基中培养的系膜细胞CTGFmRNA的表达水平很低而且全长CTGF蛋白质的分泌量几乎检测不到。但是在高浓度葡萄糖环境下，其中系膜细胞置于升高的葡萄糖水平中，发现CTGF表达上调、蛋白质产量增加。而且，作为例如肾小球硬化、肾小球性高血压和肾脏肥大的表现，系膜细胞的机械性张力可使系膜细胞CTGF表达和蛋白质产量上调。这样，本发明证明在比如高葡萄糖浓度、机械压力或TGF-β的条件下，CTGF的表达和蛋白质产量上调，这便建立起CTGF的存在与肾脏疾患，尤其是糖尿病和高血压之间的联系。即使没有高血压，造成比如肾小球肥大的疾病可导致毛细血管直径的增加，肾小球肥大常为肾脏损伤的结果。根据Laplace定律，血管壁紧张度相应增加，可能造成了系膜细胞牵张力的增加。见Cortes等人，1997，见上。
B改变和抑制CTGF活性的方法结缔组织生长因子(CTGF)在肾脏纤维化疾病中是细胞外基质沉积的关键决定因子。本发明优选通过调节、改变和/或抑制CTGF表达或活性提供了诊断、预防和治疗肾脏纤维化相关并发症的方法。更具体地，本发明提供了给予有效治疗剂量的CTGF细胞外基质产生活性的调节、改变和/或抑制剂的方法。
抗体在本发明的一个实施方案中，诊断、预防和治疗肾脏疾患和疾病的方法包括给予有效治疗剂量的与CTGF多肽或其片段特异反应的抗体。
可应用本领域熟知的方法制备CTGF抗体。这些抗体可包括，但不局限于多克隆、单克隆、嵌合的、单链抗体和Fab片段，包括F(ab’)2和Fv片段。片段可通过例如Fab表达文库产生。特别优选中和抗体，即那些抑制二聚体形成的抗体来用作治疗。
可评价并决定靶多肽如CTGF或CTGF活性和/或表达的改变剂的高度免疫原性区域。分析和表位选择方法是本领域熟知的。见，如，Ausubel等人，1988，当代分子生物学方法(Current Protoco1s inMolecular Biology)。也可以例如，应用多种软件包，如LASERGENENAVIGATOR软件进行分析和选择。(DNASTAR；Madison WI.)用于诱导抗体的多肽或片段应是具有抗原性的，但不必有生物学活性。优选地，抗原性片段或肽长度至少为5个氨基酸，更优选地，长度至少是10个氨基酸，并且最优选地，长度至少是15个氨基酸。优选抗体诱导性片段或多肽与靶多肽即CTGF至少有一段氨基酸序列相同。也可使至少与天然存在的靶多肽的一段序列相似的肽或片段与其他的蛋白质，例如，匙孔血蓝蛋白(KLH)融和，可产生抗该嵌合分子的抗体。
制备抗体的方法是本领域内熟知的。例如，可通过注射靶多肽或任何免疫原性片段或其多肽使多种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠、人和其他宿主产生免疫。根据宿主种类，可应用多种佐剂增加免疫反应。这些佐剂包括，但不限于，Freund佐剂、矿物凝胶例如氢氧化铝和表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、KLH和二硝基苯酚。人类中应用的佐剂，特别优选BCG(卡介苗)和小棒状杆菌。
应用任何通过连续细胞系培养制备抗体分子的技术来制备单克隆或多克隆抗体。体内和体外生产技术是本领域熟知的。见，如，Pound，J.D.，1998，免疫化学方法(Immunchemical Protocols)，Humana出版社，Totowa NJ；Harlow，E和D.LANE，1988，抗体，实验室手册(Antibody，A laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约。像单链抗体的产生一样，嵌合抗体的产生技术也是众所周知的。见，如，Morrison，S.L.等人，1984，美国国家科学院院报816851-6855；Neuberger，M.S.等人，1984，自然312604-608；Takeda，S.等人，1985，自然314452-454。例如从随机组合免疫球蛋白文库中通过链改组的方法可产生有相关特异性但独特型组成有别的抗体。见，如，Burton D.R.，1991，美国国家科学院院报8811120-11123。
也可以通过诱导淋巴细胞群体内生成或通过筛选免疫球蛋白文库或一系列高特异性结合剂来产生抗体。见，如，Orlandi，R.等人，1989，美国国家科学院院报863833-3837；Winter，G和C.Milstein，1991，自然349293-299。也可以产生含有靶多肽特异结合位点的抗体片段。这些抗体片段包括，但不局限于F(ab’)2片段和Fab片段，前者可通过用胃蛋白酶消化抗体产生，后者可通过还原F(ab’)2片段的二硫键来产生。或者，可构建Fab表达文库，以便快速和方便地识别具有所需特异性的单克隆Fab片段。见，如，Huse，W.D.等人，1989，科学2541275-1281。
可应用本领域熟知的多种方法检测抗体的抗靶多肽活性。可用多种技术筛选、识别具有所需特异性的抗体，包括多种免疫分析如酶联免疫吸附分析(ELISAs)，包括直接和配体-俘获ELISA法、放射免疫法(RIAs)、免疫印迹法和荧光激活细胞分选法(FACS)。应用特异性多克隆或单克隆抗体进行竞争结合或免疫放射分析的多种方法为本领域熟知。见，如，Harlow和Lane。该免疫分析法一般包括测量靶多肽和特异性抗体之间复杂的结构。优选利用可与靶多肽上两个非干扰表位反应的单克隆抗体进行双位点单克隆性免疫分析，也可以应用其他的分析，例如竞争性结合分析。见，如，Moddox，D.E.等人，1983，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1581211。
上述抗体也可用于识别如来自肾活检组织中的CTGF或其片段。CTGF的量可通过例如定量影象分析法来确定。CTGFmRNA水平可通过例如应用部分活检组织如肾小球进行逆转录酶聚合酶链反应(PCR)测定。具体地，本方法中，取自标本的、总的或CTGF或其片段特异性的mRNA可转录成DNA，然后运用CTGF特异性引物序列通过PCR扩增。CTGF或其片段的mRNA可通过例如使等量的病人标本与系列降低的已知浓度的如cDNA模拟或突变片段进行竞争性反应来测定。
本发明考虑使用与CTGF多肽或其片段特异性反应以中和CTGF生物活性的抗体。本方法中给予的抗体可以是完整抗体或其可结合表位决定簇的抗原结合片段，例如Fab、F(ab’)2和Fv片段。本方法所用的抗体可以是多克隆或，更优选地，单克隆抗体。通过本领域熟知的方法，从蛋白质含有抗原的片段中制备具有不同的表位特异性的单克隆抗体。见，如，Kohler等人，自然256494；Ausubel，等人，见上。
本发明中，治疗用途包括那些应用关于CTGF或其片段的“人”或“人源化”抗体(的用途)。人源化抗体是与母抗体(即一般源自小鼠)具有相同的结合特异性并且增加了人类特征的抗体或抗体片段。人源化抗体可例如通过链改组技术或通过应用噬菌体显示技术获得。例如，含有CTGF特异的非人类抗体重链或轻链可变区的多肽与人类互补(轻或重)链可变区的一部分结合。选择与感兴趣抗原特异性结合的杂交对。然后再使所选的杂交对中的人类链与人类的互补可变区(重或轻)的一部分相结合，并且可选择与抗原特异性结合的人源化抗体多肽二聚体。
可用于本发明方法中的人源化抗体的产生技术见，例如，美国专利号5,565,332；5,585,089；5,694,761，和5,693,762。而且，在转基因小鼠中制备人源化抗体的技术见于例如，美国专利号5,545,806和5,569,825。
在本发明另一实施方案中，方法包括给予有效治疗剂量的可与CTGF应答受体反应的抗体和，更具体地，可阻断CTGF与其细胞受体相结合的抗体。本发明的方法提供的CTGF反应性抗体，通过灭活不依赖于CTGF的受体、操纵和控制CTGF与其受体之间的相互作用，来改变/或抑制CTGF的生物活性。
反义寡核苷酸本发明提供直接干扰CTGF表达的治疗方法。具体地，可应用直接干扰CTGFmRNA翻译成蛋白质的治疗方法与CTGFmRNA结合或干扰CTGF表达。反义技术的原理是通过使反义序列与编码靶蛋白或指导其表达的靶序列特异结合来改变靶蛋白表达。见，如，Agrawal，S，ed，1996，反义治疗学(Antisense Therapeutics)，Humama Press Inc，Totawa NJ；Alama，A.等人，1997，药理学研究(Pharmacol.Res)36(3)171-178；Crooke，S.T.，1997，高级药理学(Adv Pharmacol)401-49；和Lavrosky，Y.等人，1997，分子生化医学(Biochem.Mol.Med.)62(1)11-12。反义序列是可以与至少一部分靶序列特异性杂交的核酸序列。反义序列可与细胞mRNA或基因组DNA结合，阻断翻译或转录并因此干扰靶蛋白产物的表达。反义序列可以是任何核酸物质，包括DNA、RNA或任何核酸模拟物或类似物。见，如，Rossi，J.J.等人，1991反义研究进展(Anti sense Res.Dev.)1(3)285-288；Pardrige，W.M.等人，1995，美国国家科学院院报92(12)5592-5596，生物化学(Biochemistry)37(3900-1010)。反义序列的转运可通过多种方法来完成，例如应用表达载体经细胞内转运。见讨论，下文。对外源性基因的位点-特异性转运也加以考虑，例如首先转染培养的细胞，再使稳定转染物转运至靶点这一技术。见，如，Kitamura，M.等人，1994，国际肾脏病43S55-S58。
一般优选含有大约15-25个核酸碱基的反义寡核苷酸，因为其易于合成并且可产生所需的抑制效应。反义寡核苷酸的分子类似物也可用于此种用途，且还有其他的在药物中有利的优点如稳定、分布或低毒。而且，化学反应基团，例如铁-结合乙二胺四乙酸(EDTA-Fe)，可与反义寡核苷酸结合，导致RNA在杂交位点断裂。体外抑制基因翻译的反义方法的这些和其他的用途为本领域所熟知。见，如，Marcus-Sakura，1988，分析生物化学(Anal.Bionchem)172289。
可通过使用重组表达载体例如嵌合病毒或胶体扩散系统在细胞内完成反义治疗转运和类似的情况，该载体转录时产生至少与编码靶蛋白的细胞序列的一部分互补的序列。见，如，Slater，J.E，1998，J.Allery Cli.Immunol。102(3)469-475。反义寡核苷酸也可以通过多种病毒载体转运，包括逆转录病毒和腺病毒相关载体。见，如，Miller，A.D.，1990，血液(Blood)76271；和Uckert，W和W.Walther，1994，药物治疗(Pharacol.Ther.)63(3)323-347。可用于此处所述的反义基因治疗的载体包括，但不局限于，腺病毒、疱疹病毒、疫苗，或，优选地，RNA病毒例如逆转录病毒。逆转录载体优选鼠或禽的逆转录病毒衍生物。通过插入例如编码一种或多种蛋白质的多聚核苷酸，可使逆转录病毒载体产生靶特异性，这样所需配体在该病毒载体表面表达。这些载体可以是糖脂碳氢化合物或者是天然蛋白质。优选的寻靶作用也可以通过应用以逆转录病毒载体为靶点的抗体来完成。本领域技术人员会明白，或不需过多的试验即可很快确定，可插入逆转录病毒基因组中以便完成含有反义寡核苷酸之逆转录病毒载体的靶点特异性转运的特异性多聚核苷酸序列。
重组逆转录病毒一般是复制缺陷性的，并且为产生感染性载体颗粒需要辅助因子。可通过，例如，应用辅助细胞系来提供辅助，该细胞系含有在LTR中调控序列的控制下编码所有逆转录病毒结构基因的质粒。这些质粒缺少使包装机制识别RNA转录物以便形成衣壳的核苷酸序列。可应用包装信号缺失的辅助细胞系。由于其内没有基因组，这些细胞系产生空病毒颗粒。若将逆转录病毒载体导入包装信号完整、但是结构基因由其他兴趣基因替代的这些细胞中，该载体可得到包装且载体病毒颗粒可以产生。
其他可用来将反义序列转运至靶细胞的基因转运机制包括胶体扩散和脂质体来源的系统、人工病毒包壳，和其他本领域技术人员可采用的系统。见，如，Rossi，J.J.，1995，英国医学简报(Br.Med.Bull.)51(1)217-225；Morris，M.S.等人，1997，核酸研究(Nucl.Acids Res.)25(14)2730-2736；和Baodo，R.J.等人，1998，药学学会杂志(J.Pharm.Sci.)87(11)1308-1315。例如，转运系统可应用大分子复合物、微胶囊、微球体、珠粒，和以脂质为基础的系统包括水包油乳浊液、胶粒、混合胶粒和脂质体。
在一实施方案中，本发明方法给予有效治疗剂量的反义寡核苷酸，其具有可与编码CTGF的mRNA分子的任何序列特异性结合的序列，从而阻止CTGFmRNA的翻译。
在本发明另一实施方案中，提供了给予有效治疗剂量反义寡核苷酸的方法，该反义寡核苷酸具有可与CTGFmRNA任何序列特异性结合的序列，从而阻止mRNA的翻译。
小分子抑制物本发明还提供应用小分子通过阻断反应性细胞因子与CTGF反应性受体结合来抑制CTGF活性的方法。例如，本发明提供利用可改变、调节和抑制CTGF活性的小分子物质来治疗和预防肾脏纤维化的方法。
为了鉴别通过改变CTGF活性和表达帮助在本方法中治疗或预防肾脏疾患的小分子和其他试剂，可在任一筛选技术中应用CTGF及其生物活性片段来筛选有治疗作用的化合物。用于此类筛选的片段可以游离于液体中、与固体支持物结合、在细胞表面生成或存在于细胞内。可应用本领域可行的方法测量生物活性的阻断或降低或CTGF与所检测试剂结合性复合物的形成。
其他的提供化合物高通量筛选的药物筛选技术为本领域所熟知，这些化合物对CTGF、或对有助于改变、调节或抑制CTGF表达和/或活性的其他靶多肽具有适宜的结合亲和力。例如，可应用本领域可行的方法准备、应用和分析携带检测化合物的微分析物。见，如，Shalon，D.等人，1995，PCT申请第WO95/35505号；Baldeschweiler等人，1995，PCT申请第WO95/251116号；Brennan，T.M.等人，1995，美国专利第5,474,796号；Heller，M.J.，等人，1997，美国专利第5,605,662号。
通过其他的多种检测技术也可对改变CTGF活性的小分子进行鉴别，该技术也可以用于鉴别与CTGF相互作用并且在本方法中可用作药物和治疗方法的抗体和其他化合物。见，如，Enna，S.J.等人，EDS.1998，当代药理学方法，John Wiley和Sons。分析方法一般提供与化合物和靶蛋白质或靶细胞结合相关的可检测信号。可通过例如，荧光结合、酶结合，和其他本领域熟知的可检测标记来检测结合。见，如，Enna等人。结果可以是定性或定量的。
为筛选特异结合的化合物，可用多种免疫分析方法检测例如，与细胞结合的人或灵长类抗体。这样，可用标记的抗-hIg，例如抗-hIgM、hIgG或其联合物来检测特异结合的具有半乳糖基表位的人类抗体。可用例如放射性核素、酶、荧光、化学发光剂、颗粒等多种标记方法。有很多市售试剂盒提供标记的抗-hIg，可依据制造商的方法使用。
为筛选有细胞毒性效应的化合物，可使用大量的方法来确保某化合物具有所需活性。一般会使用天然存在或经过修饰的细胞、细胞系或类似物。这些细胞可以是原核的或者是真核细胞。例如，如果对病原感兴趣，化合物与哪个表位结合并不重要，在抗体依赖的细胞毒系统中可以使致病细胞和每一化合物结合以确定细胞毒效应。可以在确定多种候选化合物对接受化合物之宿主细胞的效应之前或之后进行该分析。这样，依据于给药模式，对致病靶点的亲和力和对宿主细胞亲和力之间可能会出现差异性分析结果。
在一些情况下，会对特定的细胞状态感兴趣，例如，自身免疫性疾病、移植和类似情况中T细胞可能存在的活化状态。在这种情况下可以先筛选确定那些与静息细胞结合的化合物和与静息细胞不能结合的化合物，和筛选对活化的细胞具有细胞毒性的剩余候选化合物。然后可以筛选可能与其他宿主细胞相作用的化合物，确定它们的细胞毒性。或者，可以使用癌细胞和正常细胞，来确定是否任何化合物对癌细胞的亲和力要高于与正常细胞。同样的，可以筛选与正常细胞相结合的化合物文库并确定该效应。可筛选那些对正常细胞没有细胞毒性而对癌细胞有细胞毒性的化合物。即使(化合物)有些地方对正常细胞有一些毒性，但对肿瘤细胞有更大的毒性，人们会接受对正常细胞的低毒性，(因为)该化合物对肿瘤细胞是有效的。
除了应用天然的细胞，可以用通过重组技术改变的细胞。这样，可以应用可培养生长的、通过上调或下调某特定基因得以改变的细胞。通过这种方法，可以得到表面上单一蛋白质不同的细胞。然后可就文库成员对具有或缺少该特定蛋白质的细胞的效应对文库进行差异性分析。通过这种方法，可以确定该化合物是否与某特定膜表面蛋白质具有不同于任何膜表面蛋白质的特异的亲和力。
可以通过应用与特定膜表面蛋白质结合的抗体来区分细胞，该抗体不引起补体依赖性的细胞毒效应，例如，应用异种、同型或其联合体。通过向一部分细胞加上这些抗体、封闭抗血清或单克隆抗体，这些细胞将不再具有可与文库成员结合的靶蛋白质。通过这种方法可产生对比细胞，基于一组没有单一蛋白质，其反应是不同的。尽管抗体一般是最便于使用的试剂，可以应用具有相同功能的其他特异性结合的实体。
对确定结合的分析用途而言，可以应用抗体依赖的细胞毒系统。可以应用合成的混合成分，其中只含有那些细胞毒作用所需成分。这是合乎需要的，(因为)血液或血浆成分可以对分析结果造成不利影响。
而且，尽管细胞层是筛选大量候选物的非常便利的方法，也可使用其他技术。这些技术包括应用多孔板和多种制备组合文库的装置，例如大头针，茶叶袋等等。可以根据多种装置的性质单独培养细胞，再使该装置与细胞接触或使细胞在装置上生长。该装置可浸于适宜的培养物中、接种上细胞或不然的话使细胞与候选化合物接触。加入细胞毒药物后，然后可以通过多种方法分析裂解情况。例如，可应用FACS区分活和死细胞，可采用上请51Cr释放或通过测定上清液中细胞内的化合物来检测活性化合物。
另外，人们可能想知道化合物是否具有兴奋剂或拮抗剂活性。受试者分析技术提供快速确定文库中与靶蛋白者结合的化合物的方法。一旦化合物的数量基本缩小，可以应用更复杂的分析来检测化合物自身的活性。这样，可以为确定结合亲和力和特异性进行快速筛选，然后为确定活性进行更深入的筛选。检测活性的技术有多种，其中可以改变细胞，使标记基因活化，产生检测信号。方便地，该信号可与染料的生成、可用标记抗体检测的膜表面蛋白质的生成、或可通过任何技术检测的上清液中蛋白质的分泌有关。例如，表达的基因可以是具有前导序列以便分泌的荧光素酶基因，籍此方法，通过应用适宜的底物再对形成发光产物的上清进行筛选。
可采用多种方法筛选文库。这在某些程度上依赖于化合物的制备性质。例如，化合物可与个别颗粒、大头针、膜、或类似物结合，其中每个化合物是可分离的。而且，可得的化合物的量会依据用来产生文库的方法而发生变化。此外，依据化合物与支持物的结合性质，应能够释放数份化合物来进行一系列分析。另外，对化合物分析的方式受对有活性化合物的识别能力的影响。
可提供与格栅构成类似的细胞层，可将该细胞层与结合在固体表面上的化合物放在一起并作一登记，其中将化合物分别置于格栅表面，这样人们可以知道在格栅每一位点的组成是何物。一旦登记完细胞层和固体底物，依据化合物结合的方式可将化合物由表面释放。在化合物与细胞表面的蛋白质结合足够时间以后，可冲洗细胞层以去除非特异性结合的化合物。可进行一次或多次冲洗，其中依据所需亲和力的程度，冲洗可提供多种程度的严格性。冲洗完成之后，可再加入哺乳动物的血液或血浆，温育足够时间以产生细胞毒。然后可以去除血浆或血液并观察噬斑，其中化合物的性质可通过其在格栅上的位置来确定。血浆或血液可不含任何能够自然杀伤细胞层的成分。
因为准备过程可以是重复性的，可以准备多个固体底物，其中在可比较的位点准备相同的化合物，目的是用相同或不同细胞可重复进行筛选以确定每个化合物的活性。在一些示例中，可通过核酸标志来确定化合物的身份，应用聚合酶链反应来扩增此标志。见，如，PCT应用号WO93/20242。在这个示例中，通过提取裂解物和将裂解物导入含有该核酸标志特异性引物的聚合酶链反应介质中来测定活性化合物。扩增后，可以对核酸标志测序或通过其他方法测定其序列，这将指导选择该化合物的准备方法。
或者，可以使用有标志的颗粒，其中这些标志可以从颗粒中释放并且提供说明与颗粒结合的化合物合成过程的二元密码。见，如，Ohlmeyer等人，1993，PNAS9010922。这些标志可便利地是一系列同源的烯基化合物，该化合物可通过气相层析-电子俘获的方法检测。依据该结合组的性质，可以提供该颗粒的部分释放，这样在识别特定化合物之前该颗粒可应用2或3次。
尽管已讨论了绝大部分的文库，只要CTGF表位可连接至每个该化合物上，任何大组的化合物可用类似方法进行筛选。这样，也可以用类似方式筛选天然的和合成的不同来源的化合物，包括大环内酯、寡肽、核糖核酸、dendrimers等。
在分析中斑点的形成证实文库成分与细胞，一般是表面蛋白质的结合，并不影响CTGF表位与抗体的结合，该免疫复合体非常稳定，可以引发补体级联(反应)以及该成分具有对靶点的高度亲和力。
可将该实验方法学应用于任何具有待杀伤的细胞靶点、尤其那些CTGF表位很少或没有的细胞靶点的情况。这样，细胞靶点可以是病原性的原核生物。多种有机体包括，例如，微生物、耶尔森菌属、假单胞杆菌属、百日咳杆菌、梅毒螺旋体、淋球菌、链球菌属、流感嗜血杆菌等。其他的病原体，包括真核生物，尤其是真菌，例如念珠菌、组织胞浆菌属等，和原生动物，例如贾第鞭毛虫属。而且在感染细胞内产生膜表面蛋白质的病毒也可以是受试化合物的靶点，其中所筛选的细胞已发生致命的感染。
宿主细胞也可以成为靶点，其中细胞可以是非正常的、或与宿主或其治疗的作用方式相反。例如，与正常组织明显不同的癌组织可以成为受试化合物的靶点。自身免疫性疾病或GVHD或移植排斥反应相关的T或B细胞也可以是靶点。非正常细胞，不管其性质如何，只要它们与正常细胞明显不同，也可以成为靶点。这样牛皮癣损害、淋巴瘤细胞、细菌、真菌、寄生虫、病毒感染的细胞也可以是受试产物的靶点。还有，希望不去除所有细胞而只去除部分细胞，例如，表达分化标志物的细胞，例如T细胞亚群、激活的血小板、内皮细胞、激素或细胞因子受体表达细胞时，可以应用受试化合物。
获得改变CTGF活性的小分子的其他筛选方法可见例如PCT申请WO9813353号。
化合物/分子本发明提供通过改变、调节或抑制CTGF活性来治疗和预防肾脏纤维化相关疾患的方法。这些方法可包括给予有效治疗剂量的阻断结合作用或阻断参与CTGF信号传导通路的酶的化合物。更具体地，本发明提供通过给予阻断CTGF诱导的化合物来抑制CTGF活性的方法。
本发明方法中，改变CTGF基因表达和/或CTGF活性的化合物包括使细胞中环核苷酸升高的试剂。应用上述筛选方法可鉴别其他的依据本发明之方法可阻断CTGF诱导的化合物。
还有，在本发明其他的实施方案中，该方法提供给予干扰全长的CTGF翻译后修饰或阻断无活性CTGF前体激活的分子。正如这里讨论的，将系膜细胞置于TGF-β中导致28-30kDa的附加带明显出现，该带与CTGF全长分子的羧基和氨基半端的大小相对应。正如上面所示，TGF-β可导致蛋白酶或其他可以切割全长分子的因子产生。应用此处提供的筛选方法可鉴别抑制CTGF活性的分子。
本发明中的方法还可用于预防或治疗同种移植排斥反应相关的肾脏纤维化，该方法包括给予有效治疗剂量的上述任一试剂。
该发明还提供通过给予有效剂量的胰岛素和有效剂量的上述CTGF活性调节、改变或抑制剂，治疗或预防糖尿病的方法。
C.药物制剂和给药途径给药途径.可将在此所述的抗体、小分子和其他化合物本身给予病人，或在包括，适当的话，适宜的载体或赋形剂的药物组合物中给予病人。本发明考虑了治疗方法，其中以适宜治疗或预防与CTGF相关的ECM过度产生的剂量给予需要的病人CTGF或其片段的表达或活性的改变或调节剂。本治疗和预防的方法可包括将有效治疗剂量的试剂给予受试者，优选哺乳类受试者，最优选人。在一优选实施方案中，受试哺乳类和给予的药物源自同种。最优选地，受试者和给予的药物是人源的。
有效剂量可易于通过常规实验方法来确定，最有效和便利的给药途径和最适宜的配方也可以通过常规实验方法来确定。多种配方和药物输送系统在本领域可得。见，如，Gennaro，A.R.等人，Remington’药物科学(Remington’Pharmaceutical Science)，第18版，MACK出版社，Easton PA。适宜的给药途径可例如，包括口服、直肠、跨黏膜、或肠道给药和非肠道给药，包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。该组合物可通过局部而非系统方式给药。例如，可通过注射或在靶点药物输送系统中将包括CTGF活性改变、调节或抑制剂的组合物，输送到循环的CTGF过多或ECM产生过多的区域，或输送到需要抑制CTGF活性的区域，该组合物一般是存储或持续释放制剂。
可通过本领域任何一种熟知的方法生产本发明中的药物组合物，例如通过常规混合、溶解、颗粒化、糖衣-制造、磨粉、乳化、胶囊化、包装、或冻干的方法。如上面提到的，本发明的药物组合物可包括一或多种生理可接受的载体，例如促进活性分子进入药用制品的赋形剂或辅助物。适当的制剂依赖于所选的给药途径。
就注射而言，例如，可以在水溶液中配制该组合物，优选生理相容性缓冲液例如，Hank’s液、Ringer’s液或生理盐水缓冲液。就跨黏膜给药而言，在制剂中使用适于穿透障碍物的穿透剂。这些穿透剂一般是本领域熟知的。就口服而言，化合物易通过将该活性化合物与本领域熟知的药用载体联用来配制。为使受试者口服消化，这些载体可使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、胶体、糖浆、浆、悬浮液及类似物。也可以将该化合物配制成直肠组分，比如含有传统栓剂基质例如cocoa缓冲剂或其他甘油酯的栓剂或滞留灌肠剂。
为获得片剂或糖衣心，加入适宜的辅助物(需要的话)后，研磨(或不研磨)产生的混合物，再对颗粒混合物进行加工，可获得与固体赋形剂一样的口服用药物制品。适宜的赋形剂是，具体的，充填物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇，或山梨糖醇；纤维素制品比如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄耆树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲纤维素钠和或聚乙烯吡咯烷酮(PYP)。需要的话，可加入分解剂，如交接聚乙烯吡咯烷酮，琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。
给糖衣心提供适宜的外壳。为了这个目的，可应用浓缩的糖溶液，后者可选择性含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol gel、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液，和适宜的有机溶剂和溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或糖衣丸外壳中来识别或分辨以不同剂量组合的活性化合物。
用于口服给药的药物制品包括由明胶制成的推入契合胶囊以及由明胶和成型剂，例如甘油或山梨醇制成的软的、密封的胶囊。该推入契合胶囊可含有与充填剂如乳糖、结合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁和稳定剂(可加可不加)混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于适宜的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。所有口服给药配方的剂量应与该给药方式相配。
就吸入给药而言，应用适宜的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他的适宜气体，使根据本发明使用的化合物以气溶胶喷雾的形式由压缩包或喷雾器便利地输送。就压缩气溶胶而言，可通过提供输送定量(药物)的阀门来确定适宜的剂量单位。可配制在吸入器或吹入器中使用的，例如，明胶胶囊和药筒。这些一般含有化合物的粉剂混合物和适宜的粉剂基质，如乳糖或淀粉。
通过注射例如，通过团块注射或持续灌输进行非胃肠给药的组合物制剂，可以制成单位剂量的形式，例如，在安剖中或在多剂量容器中，并加入防腐剂。该组合物可采用如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳胶的形式并且可含有例如悬浮、稳定和/或分散剂的配制剂。用于非肠胃给药的制剂包括以水溶性形式存在的、影响CTGF或其片段活性的试剂的水溶液。
可将活性化合物的悬浮液制成适宜的油性注射悬液。适宜的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油例如芝麻油和合成脂肪酸酯，例如乙基油酸盐或甘油三酯，或脂质体。水注射悬浮液可以包含增加悬液粘附性的物质，如羧甲纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，该悬浮液也包含适宜的稳定剂或增加化合物溶解度的药物以便制备高浓度的溶液。或者，该活性成分可以是粉状，临用前用无致热原的无菌水溶解。
本发明的组合物也可以制成贮存制品。这些长效制剂可通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射。这样，例如可将该化合物与适宜的多聚或疏水的物质(例如，作为适宜的油中的乳浊液)或离子交换树脂，或作为少量的可溶性衍生物，例如，作为少量的可溶性盐的物质来配制。
该发明的疏水分子的药用载体可包括共-溶剂系统包括，例如，苄醇、非极性表面活性物质、水混合的有机聚合物和水相。该共-溶剂系统可以是VPD共-溶剂系统。VPD是3％w/v苄醇、8％w/v的非极性表面活性物质聚山梨酯80和65％w/v聚乙二醇300在纯乙醇中组成的溶液。VPD共-溶剂系统(VPD5W)由用5％右旋糖水溶液1∶1稀释的VPD组成。该共-溶剂系统对溶解疏水化合物很有效，系统性给药时毒性很小。自然地，在不损害其溶解性和毒性特点的前提下共-溶剂系统的比例可以变化。而且，该共-溶剂系统成分的身份可以变化。例如，可应用其他低-毒性非表面活性剂替代聚山梨酯80，聚乙二醇的组分比例可以变化，其他生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，如，聚乙烯吡咯烷酮，且其他的糖或多糖可替代右旋糖。
或者，可应用其他输送疏水分子的系统。脂质体和乳浊液是熟知的疏水性药物的输送媒介或载体例子。也可以应用某些有机溶剂如二甲亚砜，但其毒性较大。而且，可以通过持续-释放系统输送化合物，如含有有效剂量的给药组分的固体疏水聚合物的半-通透基质。多种持续-释放系统得以确立并且对本领域那些技术人员而言是方便易得的。根据其化学特性持续-释放胶囊可以连续数周甚至超过100天释放化合物。根据治疗试剂的化学特性和生物稳定性，可以应用其他的稳定蛋白质的措施。
有效剂量对于本治疗方法中应用的任何化合物而言，应用本领域熟知的多种技术可以初步估计有效治疗剂量。例如，在细胞培养分析中，可制定动物模型中的剂量以获得包括在细胞培养中确定的IC50的循环浓度范围。如果想达到抑制CTGF活性的目的，例如，可以确定达CTGF活性最大抑制程度的一半时试验化合物的浓度。利用从细胞培养和其他动物研究中获取的资料可确定适合于人类受试者的剂量范围。
有效治疗剂量是指可以缓解症状或延长受试者生存时间的分子的剂量。通过标准的药物方法，例如通过确定LD50(使50％群体死亡的剂量)和ED50(对半数有效的治疗剂量)，可获得这些分子对细胞培养物或实验动物的毒性和治疗功效。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，其可以表示为比值LD50/ED50。优选具有高治疗指数的分子。
优选剂量落在包括ED50、具有很少毒性或无毒性的循环浓度范围中。根据使用的剂量形式和利用的给药途径，剂量可以在此范围内发生变化。确切的制剂、给药途径和剂量会视受试者特定的状态进行选择。
剂量和间期可以进行个体化调整以便提供所需的足以改变或调节CTGF活性的活性组合物的血浆水平，即最低效应浓度(MEC)。每一化合物的MEC是不同的，但应用此处所述的分析方法，可以从例如体外数据，比如达到CTGF诱导骨生长活性的50％-90％时所需的浓度来估计。
达到MEC的所需剂量将依赖于个体特点和给药途径。应使用在大约10-90％治疗期间内，优选30-90％治疗时间，最优选50-90％之间保持血浆水平在MEC以上的方案来施用组合物。在局部给药或选择性摄取的情况中，药物的局部有效浓度可以与血浆浓度不相关。
当然，组合物的给药剂量将依赖于多种因素，包括，但不限于，特定受试者体重、疾病严重程度、给药方式和开处方的内科医生的判断。
包装如果需要的话，该组合物可以置于包装材料或分液器装置中，其可含有具有活性成分的一个或更多单位剂量形式。该包装材料可以，例如包括金属或塑料箔，例如发泡包装材料。该包装材料或分液器装置可配有给药说明。也可制备包括以相容性药用载体配制的本发明化合物的组合物，将其置于适当容器里并标记上治疗的适应症。标签上显示的适应症可包括需要软骨或骨诱导、伤口愈合、神经保护或类似情况的疾患或疾病的治疗。
受体-配体复合体作为上述筛选技术以及其他可用于本发明内容的已知的筛选技术的结果，可建立CTGF-配体复合体。这些复合体可包括其中配体是CTGF拮抗剂、CTGF激动剂或任何其他可以改变CTGF表达和活性的化合物的复合体。CTGF受体的部分激动剂或拮抗剂可用于治疗和诊断。在其自身用途中或在检测和定量标本中CTGF水平的方法中，CTGF-药剂复合体可用作治疗实体。例如，通过检测CTGF-配体复合体运用本领域提供的方法可完成对CTGF的测量和定量。见，如，Enna等人。
D.诊断本发明还指检测或诊断以细胞外基质成分、尤其是那些与肾脏疾患相关的细胞外基质成分过多沉积为特征的组织病理表现的方法。一种方法包括检测或诊断糖尿病，包括糖尿病肾病和糖尿病肾小球硬化。在优选的方法中，通过测量病人尿液标本中的CTGF水平来完成该检测和诊断。在一实施方案中，该方法包括确定首次尿(标本的CTGF水平并将此水平与正常尿液标本，即采自无肾脏疾患的受试者的标本中的CTGF水平进行比较。在首次标本中升高的CTGF水平提示可疑病理情况，例如，糖尿病或高血压。具体地，无任何肾脏疾患的个体，正常的CTGF水平为零或接近于零。在糖尿病患者或患有感染或其他外伤的病人中，CTGF水平可明显升高。这样，通过检测标本的CTGF水平能够鉴别肾脏纤维化的存在。在优选的方法中，该标本是非-创伤性标本例如尿液标本。CTGF水平的测定可通过例如，应用CTGF特异性抗体的ELISA方法来完成。CTGF水平的检测可在肾脏并发症起始前预示糖尿病性高血压或其他肾脏疾患的进展或加重，提供早期检测和诊断的方法。而且，CTGF水平可预测例如，哪种糖尿病患者易发展肾脏疾病和疾患。
更普遍地，通过免疫分析方法，例如ELISAs、RIAs或任何其他应用抗体去检测蛋白质标志存在的分析方法，可检测CTGF水平，包括独特形式或CTGF片段的水平。优选ELISA和RIA方法并且可以与，例如，本发明的检测CTGF水平的单克隆抗体一起使用。在本发明一优选方法中，尿液标本首先取自怀疑或已知患有肾脏疾病或疾患的病人。例如，通过免疫分析方法，测量此首次标本中的CTGF水平，并且与第二标本中的CTGF水平作比较，以确定肾脏疾病的存在及进展，第二标本取自已知患有肾脏疾患或已知不患有任何肾脏疾患的病人。可应用同样的方法来监测肾脏疾病的进展。
更普遍地，靶多肽的特异性抗体，如CTGF特异性抗体，在本发明中有助于诊断伴有CTGF异常表达的肾脏疾患和疾病。CTGF的诊断分析方法可包括应用该抗体和一种标记去检测怀疑患有肾脏疾患或疾病的病人标本中的CTGF水平。该标本包括，例如，体液、细胞、组织或此类组织的抽提物，包括例如自活检物质微分割的肾小球。用来筛选和鉴别具有所需特异性的抗体的方法也可以用于检测标本中的CTGF或靶多肽。
优选地，在本发明的诊断方法中，为了提供诊断肾脏疾病或疾患的存在或肾脏疾病或疾患易患体质的根据，建立CTGF的正常或标准值。在本发明的一种方法中，这是通过使取自正常受试者的体液或细胞提取物与CTGF抗体在适于复合体形成的条件下结合来完成的。这些条件在本领域是众所周知的。标准复合体形成量可通过使正常标本中的抗体-靶复合物水平与系列稀释的阳性对照进行比较来定量，在阳性对照中已知数量的抗体与已知浓度的纯化的CTGF结合。例如在一具体实施方案中，从正常标本中获取的标准值可与从怀疑患有与肾脏纤维化相关的肾脏疾病或疾患或肾脏疾病或疾患易患素质的受试者标本中获取的值进行比较。标准与受试者两组值的差别表明该疾病状态的存在或易患素质。本发明的诊断方法还可指对肾脏疾患的易患素质或易感性的检测。这可以例如，通过检测预示易患或易感某种特定疾患，例如，糖尿病的标志物来完成。该标志物可包括，例如，基因多态性。
单克隆抗体可以通过讨论的方法来检测，例如，见上。抗CTGF的单克隆抗体可与适宜的酶结合，例如辣根过氧化物酶、铁蛋白、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶等。在间接ELISA中这些酶联抗体制品可与例如含有未知数量CTGF的尿标本混合。也可应用相同抗体进行直接或夹心ELISA。
RIA技术也可以用于检测例如，尿液中的CTGF水平。例如，可对CTGF进行放射性标记，使之与CTGF特异性单克隆抗体和含有未知量的非标记CTGF的血清标本相混合。在标记和非标记CTGF与单克隆抗体之间发生结合竞争。通过检测反应混合物的放射活性，标本中CTGF的量可定量测定。见，如，美国专利号.4,438,209和4,591,573。也可进行非竞争性RIAs。
可用编码CTGF的多聚核苷酸序列来诊断与CTGF表达水平增加相关的病情或疾病。例如，编码CTGF的多聚核苷酸可用于体液或活检组织的杂交或PCR分析，以检测CTGF表达。这些定性或定量方法的形式可包括Southern或Northern分析、点印迹或其他以膜为基础的技术；PCR技术；dip stick、大头针、芯片和ELISA技术。所有的技术在本领域是众所周知的，并且是许多市售诊断试剂盒的基础。
本发明通过测量进行纤维化相关疾病和疾患的治疗的受试者标本中CTGF水平，还提供评价抗-纤维化治疗效果的方法，包括ACE抑制剂的应用。可在治疗前、中、后多时间点对取自受试者的标本例如尿液标本中的CTGF水平进行检测。可参照不同治疗阶段所取标本中CTGF水平的变化对治疗效果进行评价。
试剂盒。本发明提供检测标本中尤其是体液标本中的CTGF的试剂盒。在一优选实施方案中，本发明的诊断试剂盒含有测量尿液标本中CTGF水平的试剂。在具体的实施方案中，该试剂盒包括结合在支持物上的CTGF特异性的一种单克隆抗体和另一种CTGF表位特异性且标记有酶的第二单克隆抗体。该试剂盒还包括检测酶标单克隆抗体的试剂。该试剂盒采用免疫方法测量尿液标本中的CTGF，这样可以检测和监测肾脏疾患和疾病。在一具体实施方案中，该试剂盒可以检测和监测由例如糖尿病和高血压导致的纤维化和硬化疾患。在另一实施方案中，该试剂盒包括替代酶标抗体的放射-标记的或荧光标记的抗体。
在一实施方案中，本发明试剂盒包括运用免疫组化技术帮助检查组织标本中的CTGF的元件。该试剂盒可与，例如，可通过影象分析或其他比较技术对组织标本中的CTGF水平进行定量测定的软件程序联用。见如Riser等人，1996，美国病理学杂志，见上。另一实施方案提供的试剂盒可检查和测量组织标本中CTGF mRNA水平。在一实施方案中，试剂盒包括使CTGF mRNA逆转录成DNA的试剂。该试剂盒还包括扩增CTGF特异性DNA所需试剂，该特异性DNA包括与编码CTGF或其片段互补的引物。该试剂盒也可包括一竞争性的模拟或突变cDNA，用于标本中CTGF mRNA水平定量。
在一优选实施方案中，本发明的诊断试剂盒是在例如含有试剂盒必需元件以及含有诊断试剂盒使用说明和指导的盒子或容器中得以包装并标记。
以下实施例更详细地解释本发明。给出以下制备措施和实施例是为了使本领域技术人员更好地理解和实施本发明。但是本发明并不限于这些实施方案，后者仅为本发明的单一方面的示例，同样有效的方法在本发明范畴内。实际上，根据上述说明和附图，除此处所述外的各种修改本发明的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改属于附加的权利要求范围。
VI.实施例除非特别指出，下列材料和方法用于本发明的实施例。
细胞和组织培养系膜细胞是来自Fischer大鼠肾小球外生长物的克隆细胞系，经过系列传代后，这些系膜细胞仍表达主要的标志分子(见如Riser等人，1998，美国肾脏学会杂志9827-836)。培养基为含有青霉素和链霉素及，除非特别指出，5mM葡萄糖的RPMI1640。生长培养基含有20％Nu-Serum(CollaborativeResearch，Bedford，MA)。除非特别指出，系膜细胞在生长培养基中大约培养4天，汇合时，用无血清培养基洗两次，再在含0.5％FCS(胎牛血清)的去血清条件下培养24-48小时。然后在新鲜的培养基中(0.5％FCS)温育培养物一段指定时间。在这些研究所用的FCS浓度下，用高灵敏水貂肺生物分析法检测不到新鲜培养基中的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3的活性(见如Riser等人，1996，美国病理学杂志，见上)。Northern分析中使用的肾脏成纤维细胞是小鼠管间质成纤维细胞(TFB)(见如Alverez等人，1998，肾脏病研究4114-23)。
动物和标本收集雄性糖尿病db/db小鼠和其非糖尿病同窝幼崽db/m小鼠购自Jackson公司(Bar Harbor，ME)db/db小鼠体重控制激素Leptin的受体基因缺陷。(见如Hummel等人，1966，科学1531127-1128。)此类小鼠在3-4周龄时开始发胖并发展成高血糖。相关肾脏病包括蛋白尿和系膜扩增，5-7个月内系膜基质增多。(见如Cohen等人，1995，临床研究杂志952338-2345。)在本实验中，5月龄时处死小鼠。用建立在葡萄糖氧化酶-过氧化酶反应的基础上、以试剂盒形式(葡萄糖方法510号试剂盒，Sigma诊断试剂，圣路易斯，MO)提供的光度计法检测实验期间和处死时小鼠的血糖水平。经过24小时的代谢笼适应期，连续两个24小时收集尿样。收集结束时，用蒸馏水冲洗包括收集通道的较低的代谢笼并记录总尿量。根据利用蛋白质-染料结合对微克量的蛋白质进行定量的方法测量尿液中蛋白质的浓度。(见如Bradford，1976，分析生物化学72248-254。)用氧气和乙醚的混合物麻醉(动物)后，打开腹腔把23号针头插入主动脉，给肾脏灌注4ml含10mM氧钒核苷复合物(VRC)和4％BSA的冰冷的RPMI液，VRC是一种RNA酶抑制剂(Gibco/BRL，纽约长岛)。灌注时将预冷的0.9％的盐水倾倒在肾脏上。然后切除肾脏，将右肾冻在液氮中以便随后提取RNA和进行Northern分析。迅速获得左肾的矢状薄片。一部分固定在3.8％的多聚甲醛中，用石蜡包埋，然后用高碘酸希夫(PAS)染色法进行光镜评估。剩余薄片用来进行肾小球微分割以及所分离肾小球的逆转录和多聚酶链反应(RT-PCR)。所用的方法对已知的检测肾小球mRNA水平的方法作了修改。(见如Peten等人，1003，肾脏病研究39S55-S58。)将组织切片置于含10mM VRC的HBSS缓冲液中，然后在50分钟内从每个肾脏分割出50个肾小球。再把肾小球转移到PCR管中，管内有30μL洗液(含5mM DTT和50单位/ml人类胰腺核酸酶抑制剂(Boeringer Mannheim，印地安那波利斯，印地安那州))。离心后，去上清，显微镜下检查肾小球是否存在。加入7微升裂解液(含2％曲通X-100的洗液)，-70℃储存标本直到处理时为止。所有这些步骤在4℃下进行。
冰上解冻对照小鼠和糖尿病小鼠的实验标本，再使之另外冻融两次，以裂解肾小球。然后用cDNA合成试剂盒(Boeringer Mannheim)开始RT反应，引物是寡聚(dT)。含肾小球但不含逆转录酶或有逆转录酶但没有肾小球的反应体系作为阴性对照。42℃温育反应混合物60分钟，再冷却至4℃10分钟。然后用蒸馏水按1∶10稀释标本，冻存于-70℃直至PCR反应结束。
通过光学显微镜对肾脏组织进行评估对每个肾脏的5-6个非连续性切片进行PAS染色和镜检。在0-4范围内对肾小球硬化程度评分，其中零(0)是指没有损伤；一(1)指系膜扩张程度很小；二(2)指系膜扩张和/或基底膜增厚；三(3)指系膜明显增厚，有些管腔萎缩以及偶发小叶全部硬化；和四(4)指毛细血管腔弥漫性萎缩和有75％或更多的小簇硬化。每个肾脏总共有100-150个肾小球由不知道标本来源的观察者评分。仅对具有可明确评估的系膜区的肾小球断面进行评分。
竞争性PCR和Northern印迹所有的PCR用GeneAmp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)和9600热循环仪进行(Perkin Elmer)。为了定量，用模拟cDNA进行竞争性PCR反应。使用38个复制循环。每一标本设5个PCR管。每管含有定量的野生型cDNA和一系列下降浓度的模拟cDNA。通过琼脂糖凝胶电泳将产物分离开来，溴化乙锭染色观察。通过扫描密度计(Howtek，Scanmaster3＋密度计，Hudson，NH)将泳带转变成数字化图象，再通过影象分析(NIH影象，V.1.59自Twilight Clone BBS，银泉，MD)来定量。以野生/类似物的比值对所加突变物浓度的倒数(的关系)制图，根据产生的线性回归决定肾小球cDNA的数量。在含有液氮的不锈钢研钵中将标本研碎，在1ml RNA STAT-60试剂中使之匀浆化后，如前所述进行Northern分析。用Sigma引物-1试剂盒(Sigma化学公司)通过随机六聚体引物法将32P标记到个别mRNA和相应的cDNAs探针上。通过扫描密度计将放射自显影图象变成数字化图象，再如上所述进行定量。
引物、探针和CDNA模拟物根据人和小鼠CTGF的保守序列(fisp12)来设计和合成引物。引物，包括引物R和引物F，如下所列引物F5’-GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG G-3’，引物R5’-ATG TCT CCG TAC ATC TTC CTG TAG T-3’。扩增产物大小为558bp。通过克隆到PCR(转)录物(Invitrogen Corp.，Carlsbad.加利福尼亚)中来确定序列。对两个克隆测序发现二者相同。用PCR模拟构建试剂盒(K1700-1，Clontech)产生竞争性的cDNA模拟物。对每个模拟物而言，首先合成两个复合引物(3’和5’)，含有CTGF基因靶序列和与试剂盒提供的异源DNA片段的相对链杂交的20个核苷酸延伸段。再在PCR扩增过程中将所需引物序列掺入到该片段。然后仅用基因特异性序列来扩增起初的PCR反应稀释物。这确保所有的模拟分子都有完整的基因特异性序列。再使模拟物通过CHROMA SPINTE-100柱(Clontech)得以纯化。这样，能够通过选择属间DNA片段的合适序列作为复合引物对(产物)大小(200-650bp)进行调整。产生的cDNA可以与同一引物在同一反应过程中竞争。CTGF模拟物的扩增物为496bp大小。
大鼠纤连蛋白cDNA的引物是引物F5’-TGC CAC TGT TGT CCTACG TG3’和引物R5’-ATG CTT TGA CCC TTA CAC GG3’。纤连蛋白的竞争模拟物按上述方法构建。扩增产物约为312bps(标本)和474bps(模拟物)。GADPH(Clontech实验室，Palo Alto，加利福尼亚)的引物产生985bp的扩增片段。GADPH的竞争模拟物按上述方法构建，产生604bp的片段。用于Northern分析的cDNA探针来自人和大鼠、小鼠共有的CTGF序列。
重组CTGF和CTGF抗体的产生使用杆状病毒表达系统产生人重组CTGF蛋白质(rhCTGF)。用紧挨ATG起始密码子和TGA终止密码子两侧、带有BamH1酶切位点的引物扩增出1047bp的开放阅读框架(正义引物5’-GCT CCG CCC GCA GTG GGA TCC ATG ACC GCC GCC-3’；反义引物5’-GGA TCC GGA TCC TCA TGC CAT GTA TCC GTA-3’)。用称为DB60R32的克隆作模板，其含有完整的2075bp的CTGF cDNA。将扩增产物亚克隆到Gibco/BRL的pFastBac1中的BamH1位点，分析插入方向并通过DNA双链测序进行核实。按照Gibco/BRL的指导(pFastBac表达系统)产生含CTGF cDNA的杆状病毒。分离重组杆状病毒群落，使之扩大产生高病毒滴度并感染高五(High Five)昆虫细胞以表达CTGF。如前所述通过肝素琼脂糖亲和层析纯化重组CTGF。通过免疫印迹和十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色对含rhCTGF的峰组分进行检测。
使用两种抗-CTGF抗体。第一种抗CTGF的多克隆抗体称为pAb839，通过用匙孔血蓝蛋白偶联的合成肽免疫兔子来制备，该合成肽与CTGF羧基端特有的329-343氨基酸相对应。用ELISA检测抗体的产生，使该肽与BSA结合，再包被到塑料制品上。用标准步骤经CPG DND IFE SLY YRK-琼脂糖柱肽柱亲和纯化该抗CTGF抗体(见如1988，实验室手册，冷泉港，纽约)。肽阻断研究证明了pAb839在Western免疫印迹分析中对CTGF的单一特异性。Western免疫印迹分析还发现pAb839只识别还原型构象的CTGF。第二种抗体，pIgY3多克隆抗体，通过用纯化的源自杆状病毒的rhCTGF免疫鸡而制备，随后经rhCTGF琼脂糖柱亲和纯化。(见如Kothapalli等人，1997，细胞生长与分化861-68)。
ELISA应用本领域所述方法通过ELISA对分泌到培养介质中的特定细胞外基质成分进行定量。(见如Riser等人，1992，临床研究杂志901932-1943。)已确定在系膜细胞培养物中含0.5-1％FCS的培养基最适合回收纤连蛋白和胶原。(见如Riser等人，1992，临床研究杂志，见上。)培养介质的实验标本测三次。同样培养基稀释的纯化的基质成分作为标准品(0.5-500ng/ml)。使用前用细胞外基质标准品通过封闭和不封闭的免疫印迹测试所有抗血清的特异性。用Titertek Multiscan MCC/340(Flow Laboratories，McLean，VA)测量颜色强度，结果用曲线拟合计算机程序进行分析(Interactive软件，州学院，PA)。
用间接ELISA测量条件培养基中CTGF的水平。在96孔板中用培养基标本或rhCTGF标准品(50μL/孔)包被微滴度孔。小孔用Dulbecco’s磷酸缓冲盐(D-PBS)洗4次，然后在含1％BSA、0.05％吐温20的D-PBS封闭液中与1.25μg/ml的pIgGY3抗体温育60分钟(50μl/孔)。D-PBS彻底洗涤后，将结合HRP的兔抗鸡IgG(ZymedLaboratories Inc.南圣弗兰西斯科，加利福尼亚)加到所有的小孔内温育30分钟，该抗体用封闭液以16400稀释。加入TMB-ELISA底物(GibcoBRL)室温作用15分钟。1M硫酸终止反应，用ELISA多波长扫描分光光度计(分子设备，SUUNYVALE，加利福尼亚)在450nm测量光吸收。通过用rhCTGF标准抗原3pg到3ng/孔的系列稀释所得的对数标准曲线来计算标本中CTGF蛋白质的含量。
肝素琼脂糖沉淀和免疫印逆为分析CTGF的表达状况，收集条件培养基，与肝素琼脂糖CL-6B珠粒(Pharmacia Pisctaway，新泽西)彻底混匀后置于4℃下4小时使肝素结合蛋白沉淀下来。用冰冷的RIPA裂解液把珠粒洗3次，该裂解液包括150mM NaCl、50mMTris-HCL，PH7.5、1％曲通X-100、1％脱氧胆酸盐、0.1％SDS和2mM EDTA。然后在非还原或含5％巯基乙醇的还原条件下，通过在SDS样本缓冲液中煮沸5分钟来洗脱结合的蛋白质，该SDS缓冲液包括62mMTris-HCL，pH6.8、2.3％SDS、10％甘油和溴酚蓝。洗脱下的肝素结合蛋白在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中得以分辨，再以140mA(的电流)电泳2小时转移到硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。应用包括TTBS、150mM NaCl、50mM Tris、0.2％吐温-20、5％BSA，PH 7.4的封闭液将膜在室温下封闭2小时，然后在封闭液中与0.5μg/ml的抗CTGF抗体温育40分钟，检测CTGF。37℃下充分洗涤后，使膜与结合了HRP的猴抗兔IgG(Anersham，ArlingtonHeights，IL)或结合了HRP的兔抗鸡IgG(Zymed，南圣弗兰西斯科，加利福尼亚)温育，该抗体均在封闭液中以1∶12,000稀释。应用SuperSignal化学发光底物检测免疫反应性(Pierce，Rockford，IL)。
其他试剂用作标准品的经纯化的细胞外成分是大鼠I型胶原(Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid，NY)和纤连蛋白(Chemicon International Inc.，Temecula，CA)。相应的抗体，抗大鼠I型胶原和抗大鼠纤连蛋白的多克隆抗体用于ELISA。预实验中，抗大鼠I型胶原的多克隆抗体与纤连蛋白或层粘连蛋白无交叉反应，而抗大鼠纤连蛋白的抗体与工型胶原或层粘连蛋白无交叉反应。刺激实验中使用TGF-β的是人类TGF-β2(Celtrix Corporation，Santa Clara，CA)。该重组细胞因子由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)产生，然后用以前报道过的技术纯化(见如，1991，Ogawa等人，1991，酶学方法(Methods in Enzymology)198317-327)。如1.D 11.1所指的单克隆抗体可中和TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(GenzymeCorporation，Cambridge，MA)。
统计分析数据用平均值±SEM表示。除非特别指出，组织培养数据的组间差别用t检验进行评价。使用对称性检验是由于所研究的系膜细胞的克隆性质所致。在使结果与相应的对照值统一的情况下用单标本t检验来分析数据，假设平均值为100％进行实验组与对照组的比较。对称性双标本t检验用于检查3个实验组间的差别。在两种情况下再用Holm检验法调整多重比较(见如，Holm，1979，ScanJ.Statist.665-70)。对组织学数据而言，计算每个肾脏肾小球中的平均硬化分数，并用非对称性T检验决定糖尿病和对照组间的统计学差别。
ACTGF是包括糖尿病在内的肾脏疾病的重要致病因子本发明提供的实施例提供了首要的证据表明，CTGF蛋白质由系膜细胞产生并是糖尿病性肾病潜在的重要致病因子。已知高血糖和肾小球性高血压是糖尿病性肾小球硬化的两大病因。在本发明之前还未研究过CTGF在肾小球硬化发展中的作用。以下实施例表明CTGF刺激培养的系膜细胞产生、沉积和积聚细胞外基质成分。这些实施例还表明升高的葡萄糖浓度、外源性TGF-β和机械压力可诱导内源性CTGF产生。
如实施例2所示，CTGF在正常动物的整个肾脏中都有表达，且其水平高于心脏和脑，这提示内源性产生的CTGF可能与正常肾脏细胞外基质的更新有关。然而培养的系膜细胞中CTGF构成性mRNA的表达水平很低，提示该细胞类型存在一种与形成大部分肾脏组织的细胞，即管上皮细胞不同的控制CTGF形成的机制。非刺激条件下系膜细胞中CTGF mRNA的低表达与培养基中少量CTGF蛋白质的明显释放有关，见实施例3。CTGF是36和38kD的分子。较大的蛋白质与根据基因分析推算出的全长CTGF分子大小相当，而较小的肽可能表示CTGFN-半端的差异性N-糖基化。用抑制糖蛋白N-糖基化的衣霉素处理后，昆虫和哺乳类细胞内的较大的CTGF带迁移率降低到与较小的分子相同的位置。这些在系膜细胞中看到的分子大小上与血管内皮细胞和成纤维细胞分泌的分子类似(见如，Bradham等人，1991，见上；Kothaoalli等人，1997，见上；和Steffen等人，生长因子(GrowthFactor)15199-213)。在系膜培养物的条件培养基中检测到的CTGF很少，这不是由于其合成水平低，而是由于该蛋白质是控制性地释放到培养基中的。从肝素钠能显著升高培养基中CTGF蛋白质的水平也能显示出这一点(见实施例3)。这些结果提示系膜细胞合成的CTGF有多达80％是与细胞或基质结合到一起的。定量分析表明，肝素存在时每106个系膜细胞每24小时分泌约7ngCTGF(见实施例3)。
考虑到CTGF刺激细胞外基质积聚，对已知与糖尿病肾小球病变进展有关的因子是否影响CTGF mRNA的表达进行检查。高的细胞外葡萄糖浓度使系膜细胞CTGF mRNA水平以及蛋白质产量显著升高(见实施例4)。同样，TGF-β也上调CTGF mRNA和蛋白质的表达。如对TGF-β反应一样强烈上调的同时，明显诱导出一大小约18KD的小分子量的CTGF，该分子大约是CTGF全长分子的一半(见实施例2和图6)。回收自肝素-琼脂糖柱的该小分子量CTGF的大小和特性表明其含有血小板反应蛋白-1和CTGF的C-端模块。与整个分子相比，受刺激后的系膜细胞所产生的该小分子可能有不同的生物活性。由于系膜细胞周围升高的葡萄糖浓度可以刺激其分泌TGF-β，高浓度葡萄糖对CTGF的诱导可能是通过TGF-β的作用间接介导的。实施例5所述的中和研究证明了细胞因子在该过程中的直接作用，因为用TGF-β抗体温育可完全抑制对CTGF的刺激作用(见图8)。
作为一种可能的CTGF表达调节元件，周期性机械压力也得到检查。结果表明，牵拉是上调CTGF mRNA水平的一潜在刺激因素(见实施例7和图10)。牵拉可迅速诱导CTGF mRNA，提示机械压力的起始效应并不需要TGF-β的产生和/或活性来介导。周期性压力诱导TGF-β合成与活化，但是该效应在机械刺激后48-72小时才出现(见如Riser，等人，1996，美国病理学杂志，见上)。这些研究还表明TGF-β和CTGF能自身诱导本身在系膜细胞中的表达(见实施例3和图3)。对CTGF而言，CTGF的这种自身诱导作用是首次观察到。另外，由于外源性CTGF对TGF-β的转录水平没有影响，该作用似乎是选择性的(见图3)。这些发现提示，一旦受TGF-β刺激后，系膜细胞的CTGFmRNA可以在甚至没有更多TGF-β活性的情况下保持高水平，使细胞外基质的合成与沉积继续增加，这便解释了为甚麽普遍无法通过TGF-β中和作用完全阻止系膜细胞和血管系膜产生细胞外基质(见Border等人，1990，见上；Sharma等人，1996，见上；和Ziyadeh等人，1994，见上)。
CTGF mRNA在db/db小鼠肾小球中的定量表达(见实施例10)，表明CTGF的作用是糖尿病中肾小球细胞外基质沉积的起始因素。虽然正常肾小球表达CTGF mRNA，但在短期糖尿病后和明显的肾小球病变出现前，其水平急剧上调28倍(见实施例10)。如这些实施例所示，CTGF mRNA上调与肾小球纤连蛋白mRNA升高是同时发生的。但是肾小球系膜扩张程度很小，蛋白尿不明显。与肾小球相比，CTGF在整个肾脏的上调程度低得多，如实施例10所示，这说明CTGF至少在肾脏病早期主要与诱导肾小球改变有关。而在糖尿病肾病的更严重阶段CTGF可能是管间质性疾病的重要诱因。
总之，下列实施例基本上表明，除肾小球TGF-β表达升高外，CTGF上调是系膜细胞细胞外基质过量沉积的重要因素。该CTGF的上调由高葡萄糖和细胞机械压力经依赖和不依赖TGF-β刺激的两种途径联合驱动。
B证明CTGF与包括糖尿病在内的肾脏疾病的起始和进展有关的实验数据实施例1系膜细胞细胞外基质的产生能力在CTGF诱导下的变化为确定外源性CTGF对系膜细胞细胞外基质产生能力的影响，将去血清的细胞置于含20ng/ml rhCTGF的培养基中48小时。为进行对比，另在无外源性CTGF但含有2ng/ml TGF-β或20mM葡萄糖的培养基中温育培养物。正如料想的一样，外源性TGF-β和高的葡萄糖浓度分别使纤连蛋白的分泌量比对照提高23％和30％，如图1A所示。培养基中外源性的CTGF也能有效地刺激纤连蛋白升高45％。与纤连蛋白一样，I型胶原的分泌量也可由CTGF提高64％，由TGF-β提高50％或高浓度葡萄糖提高22％，见图1B。
实施例2肾脏和系膜细胞CTGF的表达TGF-β的调节确定培养的大鼠系膜细胞是否表达CTGF mRNA，结果与整个肾脏进行比较。Northern分析表明系膜细胞和整个肾脏有一条2.4kb的CTGF转录产物，但相反培养的肾脏成纤维细胞未发现明显的(CTGF)信使，见图2。与其他组织比较时，肾脏表达最丰，比脑高20倍。
为确定TGF-β是否是系膜细胞CTGF信使表达的调节因子，将细胞去血清，置于2ng/ml的TGF-β中24小时，然后检测mRNA。也监测TGF-β转录水平的变化。如图3所示，外源性TGF-β可使CTGF mRNA的表达量提高4倍多，而TGF-βmRNA提高80％(见图3A和图3C)。为确定CTGF是否能调节自身表达或TGF-β的表达，也将系膜细胞置于20ng/ml的CTGF中。如图3A和图3C所示，该处理没有改变TGF-βmRNA的水平，但相反其能强烈地自身诱导CTGF信使，见图3A和图3B。
为证明未受刺激的系膜细胞中CTGF mRNA的低表达是否与相应蛋白的检测产量有关，以及为确定TGF-β的效应，使细胞去血清，在含有或没有2ng/ml外源性TGF-β的新鲜维持培养基中再培养24小时。该条件培养基随后用硫酸肝素沉淀，并用两种不同的抗CTGF抗体进行免疫印迹分析。用抗全长rhCTGF的抗体pIgY3进行的免疫印迹表明，在基础的、非刺激的条件下系膜细胞分泌很少量的CTGF(见图4A)。但TGF-β存在时，CTGF蛋白质的分泌量显著受到刺激。在这些培养物中检测到的主要产物与重组标准品迁移位置相同。用抗CTGF特有的15个氨基酸的抗体pAb839对同一标本进行免疫印迹确定了所检测蛋白的同一性(见图4)。
实施例3检别系膜细胞中的CTGF上述系膜细胞培养物中检测到的CTGF蛋白质是指存在于培养基中的自由分子。CTGF内有一肝素结合结构域，提示此合成并分泌的蛋白质有一可结合细胞表面或细胞外基质中的蛋白聚糖或纤连蛋白的基本部分。为确认是否果真如此，并且为确定非刺激条件下细胞外环境中CTGF的出现时期，使系膜细胞培养物去血清，然后加入含50％肝素钠的新鲜维持培养基。一定温育时间后收集条件培养基，集中多数标本，用硫酸肝素沉淀。对4小时的标本进行免疫印迹，产生约36和39kD的微弱CTGF带(见图5A)。这些带的强度在24小时内迅速增加，并在72小时温育期间保持上升趋势。在48和72小时，全长CTGF带强度很高时，也可检测到另外一条弱带，迁移率约为20kD。如前所证明，没有肝素钠时培养基中很少能检测出CTGF，这提示多数CTGF蛋白结合到细胞和/或底物上。由于免疫印迹主要是定性分析，也可在集中和沉淀前用ELISA评价个别上清，结果以每个细胞为基础表达。该高度定量分析法表明CTGF呈时间依赖性升高趋势，在24小时分泌量约为7ng/106个细胞，见图5B。没有肝素时，整个72小时内CTGF在培养基中的分泌量下降20％。
随后的实验中，重新研究了肝素存在时TGF-β对分泌性CTGF的调节情况。一致地，使系膜细胞去血清，然后在含有50μg/ml肝素钠和2ng/ml TGF-β的维持培养基中温育48小时。对经过集中和沉淀的培养基标本进行免疫沉淀，发现TGF-β显著提高全长CTGF(约36-39kDa)的分泌，如图6A所示。但对18-20kDa分子的诱导甚至更明显。该小分子在大小上与全长CTGF分子的一半相对应。在集中和沉淀以便进行免疫印迹前用ELISA定量分析个别标本表明TGF-β处理使总CTGF的分泌性量提高2-5倍(见图6B)。
实施例4系膜细胞CTGF的表达葡萄糖浓度的调节为确定周围葡萄糖的浓度是否也改变CTGF的表达，使持续生长于5mM葡萄糖中的系膜细胞培养物在含有35mM葡萄糖的生长培养基中温育14天。选择这个时间是因为以前的实验表明该时期是充分诱导ECM蛋白产生所必需的(见如，1997，美国肾脏病学会杂志，见上)。如图7所示，在含5mM葡萄糖浓度的培养基中生长的系膜细胞中CTGF信使水平极低。但是长期置于高浓度葡萄糖中时CTGF转录物显著上调，通过定量分析可达对照的7倍，如图7所示。
为检查高浓度葡萄糖对CTGF蛋白质分泌的效应，使用去血清培养物，将作用时间缩短至48小时，并加入肝素钠。此方案可与TGF-β的效应作对比。对经过集中并沉淀的标本进行免疫印迹发现20mM的葡萄糖使CTGF的分泌量上升，如图6所示。但有意思的是，该刺激似乎仅限于全长分子。在集中和沉淀前用ELISA对分泌的CTGF蛋白质进行定量表明，细胞外高葡萄糖水平使之升高2倍，如图6B所示，这在所选的实验条件下与TGF-β诱导的升高效应类似。为确定所观察到的CTGF的升高是否是由于渗透压效应所致，用甘露醇重复实验。在这些条件下，通过ELISA测量，CTGF的释放量没有得到诱导(5mM葡萄糖，2.39±0.28ng/106细胞；5mM葡萄糖加15mM甘露醇，1.94±0.32)，免疫印迹未发现CTGF形式分布上的变化。
实施例5TGF-β阻断高葡萄糖对CTGF的诱导为确定TGF-β是否与系膜细胞在高葡萄糖浓度下产生的CTGF有关，在5mM或20mM葡萄糖中培养系膜细胞14天，使培养物去血清，一半加入20μg/ml可中和TGF-β1、2和3活性的抗体。每天加入新鲜抗体，在收集前更换培养基。用ELISA测量CTGF的分泌量，证明高浓度葡萄糖有刺激效应，见图8。但是中和培养物中TGF-β的活性阻断了高浓度葡萄糖对CTGF的诱导效应。不知为何，TGF-β抗体也似能减少正常葡萄糖浓度下CTGF构成性的分泌量，此种改变在统计学意义上不显著(P＝0.09)。TGF-β被中和时，正常浓度葡萄糖和高浓度葡萄糖处理的细胞内CTGF水平差异也不显著(见图8)。
实施例6葡萄糖转运蛋白质的表达和CTGF的产生与转导了细菌-β半乳糖苷酶基因、称作MCLacZ的对照系膜细胞系相比，转导了人类葡萄糖转运蛋白质(GLUT1)基因的、称作MCGT1的系膜细胞系中GLUT1蛋白质升高10倍、葡萄糖吸收能力升高5倍，I型和IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白的合成提高2-3倍。使用这些细胞系是为了证明升高的细胞内葡萄糖而非简单的细胞外葡萄糖浓度本身，是培养的系膜细胞扩大细胞外基质形成的主要决定因素。(见如，Helig等人，1995，见上)为确定CTGF是否也在这个糖尿病体外模型中升高，接种MCGT1和MCLacZ细胞，使之在含20％Nu-Serum、8mM葡萄糖的RPMI培养基中生长48小时。然后用无血清培养基洗2次，加入含1％FCS的新鲜RPMI。24小时后收集条件培养基，ELISA测定CTGF蛋白质水平。在对照MCLacZ培养物的培养基中测得的CTGF约为80ng/106细胞，而MCGT1培养物中的水平几乎是双倍(147ng/106细胞)，见图9。
实施例7系膜细胞CTGF的表达周期性压力的调节为确定周期性压力是否也是能改变系膜细胞CTGF表达的因子，把细胞接种到包被有胶原的带弹性底面的平盘中，再培养过夜后，使之受牵拉或仍保持静止。应用以前Riser等人在临床研究杂志1992,901932-1943和Riser等人在1996，美国病理杂志1481915-1923中所述的计算机控制系统，将牵拉设置为每分钟3个循环，最大延伸19％。选择这个程度的牵拉是为了模拟系膜细胞在体内所承受的机械压力(见如1997，Cartes等人，见上)。
在指定时间内裂解细胞，提取总RNA，用探针检测CTGF转录物。如图9所示，周期性牵拉可诱导CTGF信使迅速地、显著地升高。对Northern印迹进行定量影像分析发现4小时内CTGF mRNA水平提高了2倍多并且牵拉8小时后保持在该升高的水平。另外的实验证明甚至在牵拉48小时后，CTGF转录物明显上升。
实施例8抗CTGF抗体对刺激后胶原产生的阻断效应使系膜细胞在含20％Nu-Ser的RPMI培养基中生长4天，换成含1％FCS(去血清条件)和0或5ng/ml TGF-β2的培养基。一半培养物加入抗CTGF抗体(山羊亲和纯化，pGAP)，另一半加入非免疫性山羊IgG。每天加入新鲜抗体，收集前24小时更换培液。用ELISA检测个别细胞的培液。如图11所示抗CTGF抗体不影响基线胶原的产量，但完全阻断TGF-β引起的产量增加。非刺激培养物的胶原产量与由TGF-β刺激但经抗CTGF抗体处理的培养物的胶原产量无显著差别。
实施例9抗CTGF抗体对刺激后系膜细胞增殖的阻断效应使系膜细胞在含20％Nu-Ser的RPMI培养基中生长4天，替换成含有1％FCS(去血清条件)和0或5ng/mlTGF-β的培养基。一半培养物加入抗CTGF抗体(山羊亲和纯化的，pGAP)，另一半加入非免疫性的山羊IgG。每天加入新鲜抗体，在收集前24小时更换培液。用ELISA检测个别孔内的培液。如图12所示，TGF-β处理使系膜细胞增殖状态显著减少(87％)。抗CTGF抗体处理显著减少对细胞增殖的诱导(约50％)。同样的抗体对细胞基线增殖，即非刺激条件下的增殖无影响。
实施例10CTGF在实验性糖尿病肾病中的表达。为确定CTGF在早期糖尿病肾病中是否上调，在糖尿病性db/db小鼠中进行研究，并与同龄非糖尿病性db/m作一比较。在糖尿病起始约3.5个月后的5月龄测量动物的血糖水平、总重量、蛋白尿以及系膜细胞增生状况。至处死时，db/db小鼠中的平均血糖水平和体重都显著升高，如以下表1所示。
表1
如图13所示，用光学显微镜对肾脏组织进行观察表明糖尿病动物表现出可发现的但是很小的肾小球变化，这与早期糖尿病性肾小球硬化，即系膜基质些微扩张但没有明显的管间质性疾病相一致。另外，表1显示，与对照相比蛋白尿水平没有显著增加。对肾小球的变化进行半定量分析表明，在糖尿病动物中看到的系膜扩张确实是一致的，但程度很轻。0值表示多数肾小球没有损伤，1值表示系膜扩张程度很低，基底膜未见增厚。
对整个肾脏RNA进行Northern印迹发现80％小鼠中CTGF信使水平明显增加，见图1。该变化通过纤连蛋白转录物水平的平行变化得以反映。对结果进行定量发现CTGF的表达比对照增加了103％，而纤连蛋白增加了80％，见图14B和图14C。还有，如图15A和图15B所示，用RT-PCR检测糖尿病小鼠单个标本中CTGFmRNA转录水平并与对照GADPH标本进行比较。通过竞争性和定量PCR方法(如上所述)对多组动物(5个糖尿病组和5个对照组)的经过微分割的肾小球进行分析，发现在对照动物的肾小球中CTGF转录水平很低但可测得。(见图16)在糖尿病小鼠中，CTGF水平急剧提高27倍(见图16)。与CTGF上调相伴的是纤连蛋白mRNA的数量提高近5倍。这些变化并不是由于糖尿病性增生使肾小球大小发生变化所致，因为与对照相比糖尿病动物GADPH信使的水平没有明显增加(对照组，1.39±0.524×10-1attomoles/肾小球；糖尿病组，2.59±0.307；P＞0.05)。这样在肾脏变化很小时CTGF的表达已明显升高。
C.作为肾性糖尿病相关疾病的指征，检测标本中的CTGF。
实施例11尿液中CTGF的出现和稳定性为确定CTGF是否分泌到尿液以及分泌到尿液中后该分子的稳定性，收集健康供者的尿液，分成5份，每份25ml。将各种数量的CTGF，自25到750ng不等，加到5份中的4份内(“峰标本”)。第五份不加CTGF作为对照(“非峰标本”)。所有标本冻存于-70℃，然后解冻并通过离心澄清。对标本进行肝素琼脂糖定量抽取后，用CTGF特异性抗体进行免疫印迹，如图17所示。结果表明尿液的非峰标本中CTGF分泌水平很少能检测到。另外峰标本中CTGF持续性升高表明CTGF蛋白在尿液中是稳定的。比较标本道与新加入rhCTGF(35ng)的标本发现CTGF大部分，若非全部的话，得到保留。
实施例12肾脏病人尿液中的CTGF。研究了在已确定患有肾脏病，包括糖尿病相关肾脏病的病人尿液中可能发生改变的CTGF的数量和/或分子形式。常规出诊期间收集和冻存8位能步行的病人的尿样，这些病人正在因肾脏疾病接受治疗，其中3位有糖尿病史。同样也收集3位无肾脏病史的健康志愿者的标本。所有标本后来一块解冻，进行上述处理。在3位正常志愿者中的1位和所有的病人标本中检测CTGF，如图18所示。免疫反应性的CTGF有三种不同的分子形式。对照标本和50％的病人标本有CTGF带(双链体)。有意思的是每个病人标本中都有一大分子量的带，约200kDa，而单一对照标本中此带很弱。该大带可能是CTGF与另一未知尿液蛋白的复合体。更有趣的是一条CTGF小片段，约9-12kDa。该小分子似与CTGFC-端四分之一肝素结合片段相同，并且出现在所有病人的尿样中，非糖尿病病人和健康对照者中无此片段。有意思的是，该片段与受高浓度葡萄糖刺激后培养的系膜细胞产生的CTGF片段相当。
在另一实验中，用ELISA测定人尿样中的CTGF，结果见下面的表2。
表2对在健康志愿者、肾脏病病人(有些与糖尿病有关)或有5-10年糖尿病史但无肾脏疾病的病人中测得的CTGF数量进行了比较。每组有取自不同个体的4-7个标本。用ELISA确定每毫升CTGF的数量，将标本值与用已知数量的rhCTGF系列稀释所得的标准曲线进行比较。为使结果标准化(即为解决尿量的变化)，再使CTGF的量(CTGF/ml)除以同一病人同一尿液中的肌酐的量。
结果表明健康个体尿液CTGF水平一贯很低。然而，患有肾脏疾病的病人中平均CTGF水平提高了4倍。在无肾脏病的糖尿病病人中一样提高了4.4倍。由于仅有约40％的糖尿病患者可以发展成肾病，预期类似比例的病人回出现CTGF升高。有趣的是，所测试的6个病人中有3个或50％出现明显的CTGF升高。剩余病人与健康志愿者数值相似。
对本领域技术人员而言，在不偏离本发明的范围和核心的情况下，对本方法所述的方法和系统进行各种修饰和变化是显而易见的。尽管本发明是结合具体的优选实施方案来说明的，但应理解的是，要求权利的本发明不应仅仅不恰当地局限在该具体实施方案上。实际上，为实施本发明，对分子生物学或有关领域技术人员而言各种明显的修饰所述模式的方法也属于下列权利要求的范围。所有专利、出版物以及其他文献在此全部援引作为参考。
权利要求
1.一种治疗或预防纤维化的方法，该方法包括给予需要的受试者有效剂量的可改变、调节或抑制CTGF或其片段的表达或活性的药剂。
2.一种治疗或预防与细胞外基质过度产生相关的肾脏疾患的方法，该方法包括给予需要的受试者有效剂量的可改变、调节或抑制CTGF或其片段的表达或活性的药剂。
3.权利要求2的方法，其中该药剂是特异地与CTGF或其片段结合的抗体。
4.权利要求2的方法，其中该药剂是具有与编码CTGF或其片段序列结合之序列的反义寡核苷酸。
5.权利要求2的方法，其中该药剂是小分子。
6.权利要求2的方法，其中该药剂是阻断CTGF信号转导途径中的结合作用，以此改变或抑制CTGF活性的化合物。
7.权利要求2的方法，其中该药剂是干扰或阻断CTGF翻译后修饰的分子。
8.权利要求2的方法，其中该药剂是阻断CTGF前体激活的分子。
9.权利要求2的方法，其中该肾脏疾患是糖尿病。
10.权利要求2的方法，其中该肾脏疾患是高血压。
11.权利要求2的方法，其中该细胞外基质包括胶原。
12.一种治疗或预防糖尿病的方法，该方法包括给予需要的受试者有效治疗剂量的胰岛素和有效治疗剂量的可改变、调节或抑制CTGF或其片段表达或活性的药剂。
13.一种药物组合物，包括有效剂量的可以改变、调节或抑制CTGF表达或活性的药剂。
14.在受试者中诊断以细胞外基质过度产生为特征的肾脏疾患或识别以细胞外基质过度产生为特征的肾脏疾患倾向或易感性的方法，该方法包括(a)从受试者中获取标本。(b)检测标本中CTGF水平；(c)比较标本中CTGF水平和CTGF的标准水平。
15.权利要求14的方法，其中该肾脏疾患是糖尿病。
16.权利要求14的方法，其中该受试者的标本是尿标本。
17.用于诊断以细胞外基质过度产生为特征的肾脏疾患或识别以细胞外基质过度产生为特征的肾脏疾患倾向或易感性的诊断试剂盒包括(a)检测标本中CTGF水平的方法；和(b)测量标本中CTGF水平的方法。
18.权利要求17的诊断试剂盒，其中该标本是尿标本。
全文摘要
本发明涉及通过给予结缔组织生长因子(CTGF)的活性调节、抑制或修饰剂来检查、预防和治疗以细胞外基质组分积聚为特征的病理进程的方法。本发明中的方法用于肾脏纤维化及相关肾脏疾病,尤其是糖尿病和高血压相关并发症的治疗。
文档编号A61K48/00GK1326361SQ99812796
公开日2001年12月12日 申请日期1999年9月8日 优先权日1998年9月8日
发明者B·L·里泽尔, M·德尼奇罗 申请人:亨利福特保健系统公司, 菲布洛根有限公司