专利名称：1－氨基－3－(n,n－二甲基氨基)－亚丙基－1,1－双膦酸的应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸或其任一可溶性盐或其任一水合物的新应用。
化合物1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸或其任一可溶性盐或其任一水合物，属于双膦酸盐一族化合物，其含在一个碳原子上连接的两个膦酸盐基团，还分别含有另二个基团R1和R2，这些化合物可以与钙晶体紧密结合、抑制它们生长、妨碍骨的再吸收、并用于多种骨代谢紊乱的治疗。
1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸是欧珀酸(olpadronate)(OPD)的氨基取代形式，这里有时称为NH2-OPD。
双膦酸盐被认为是骨吸收的强力抑制剂，并成功用于常见骨病症的治疗，尤其是骨质疏松和肿瘤性骨病。在结构上，双膦酸盐是亚甲基双膦酸盐的衍生物，其中孪位碳原子上的二个氢原子分别被R1和R2取代，通常R1和R2是不同的。常见的R1是羟基，因为其可以与二个膦酸盐基团形成三齿结构，与骨骼中物质结合。
双膦酸盐对骨细胞的作用的研究进行得非常深入，尤其是它们的抗再吸收能力。但是，与这些作用相关的分子机理还不清楚。例如，抗再吸收活性与其治疗骨质疏松和相关骨病症的应用已有报导，并在下列专利中有描述Frances M.et al.，WO94/00129；Gueddes A.等WO93/11786；McOskar等，WO92/14474；Gall R.et a1.，USP4,942,157,和Schmidt-Dunker M.，USP3,962,432。
尽管双膦酸盐中的R2部分的特性决定其抗再吸收活性，一些双膦酸盐(如欧珀酸和帛米酸盐)中R1上的羟基被氨基取代仍然会明显降低它们的抗再吸收活性。这些氨基衍生物的抗再吸收功效的降低被认为是归因于化合物的细胞作用上的取代依赖性的改变，因为它们与骨矿物质的亲合力并没有明显改变。例如，vanBeek等发表在Journal ofBoneand Mineral Research(骨和矿物质研究)，1996年，11卷(No.10)，1492-1497页的文章和国际专利申请PCT/EP96/02981中公开了抗再吸收活性的缺损，后者公开了使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸治疗骨质疏松、关节炎和牙周疾病。
骨骼的结构和稳定性很大程度上受成骨细胞活性和破骨细胞活性之间的平衡的影响和支配，就是说，细胞分别对骨骼的矿化和再吸收负责。因此，骨骼不断进行重构，包括了合成代谢和分解代谢。当人年龄超过30岁后，分解代谢占优，这样骨骼中物质总量自然为净损失。因而骨组织的更新速度随年龄的增长而减缓。
本发明的目的是提供一些手段预防临床病理骨症状的发作。
本发明的另一目的是避免骨功能紊乱或骨病的倾向。
本发明的目的还有是优化接受治疗者生理性的骨功能。
以下描述的本发明的各个方面和实施方式解决了所有这些目的，并提供了其它优点。
简而言之，本发明提供1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的新应用、含有1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂，和涉及1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的筛选方法。
本发明的一个方面在于提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造可选择性调节成骨细胞的药剂。此外，还提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造维持正常骨结构的药剂。
还提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造用于健康的接受治疗者预防骨病的药剂。
还提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造对最近接受皮质类固醇治疗的接受治疗者进行治疗的药剂。
此外还提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造用于无需抗再吸收活性的骨病后治疗的药剂。
本发明还提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造药剂，用于治疗儿童的骨病。
本发明的另一方面是，提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造药剂，用于刺激信号级联和介导1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸作用的反应历程，其中1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的作用可以被钙离子通道阻断剂所阻断。
本发明的还有一方面是，提供使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造药剂，用于传送来自对IP3敏感的存储器的钙离子。
本发明的另一方面是，提供筛选钙离子通道阻断剂的方法，包括以下步骤-用假定的钙离子通道阻断剂处理含钙离子通道的细胞；-将细胞与1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸接触；-测量接触步骤之后的响应。
设想处理和接触步骤是连续发生的，也可以是同时进行。处理步骤可以先于接触步骤，反之亦可。
另一方面，本发明也提供筛选1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸功能类似物的方法，包括以下步骤-用钙离子通道阻断剂处理含钙离子通道的细胞；-在没有钙离子通道阻断剂存在下，将细胞与假定的功能类似物接触，这些功能类似物被认为会引起钙离子流入细胞；-测量接触步骤之后的响应。
设想处理和接触步骤是连续发生的，也可以是同时进行。处理步骤可以先于接触步骤，反之亦可。
本发明也公开一种含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸和至少一种生理学可接受的载体的药剂，用于选择性调节成骨细胞、用于维持正常的骨结构、用于预防骨病、或用于无需抗再吸收活性的骨病的后治疗。
本发明的一方面提供一种含1-氨基-3-(N，N二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂，可用于健康的接受治疗者或年龄在40岁或更大的接受治疗者。
本发明还公开一种方法，用于选择性调节成骨细胞、和/或维持正常的骨结构，和/或用于健康的接受治疗者预防骨病、和/或对最近接受皮质类固醇治疗的接受治疗者进行治疗、和/或用于无需抗再吸收活性的骨病的后治疗、和/或治疗儿童的骨病、和/或刺激信号级联和对1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸或其任一可溶性盐或其任一水合物的作用的反应历程进行介导，其中双膦酸化合物的作用可以被钙离子通道阻断剂所阻断；和/或传送来自对IP3敏感的存储器的钙离子，该方法包括对接受治疗者单独使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸或其任一可溶性盐或其任一水合物，或与药用载体一起使用，1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸或其任一可溶性盐或其任一水合物的剂量为口服每次0.1-1000毫克，注射用每次0.02-200毫克。
优选，术语“成骨细胞的选择性调节”包括刺激成骨细胞的细胞活性，更优选影响成骨细胞的钙离子动态平衡。“选择性调节”的优选实施方式包括成骨细胞中钙离子含量的短暂提高。成骨细胞的选择性调节还包括骨钙蛋白和/或骨桥蛋白、骨粘连蛋白、钙防卫蛋白、纤连蛋白、基体Gla蛋白和/或骨涎蛋白的合成和通过其来说明。
本发明中术语“维持正常骨结构”还包括预防临床病理症状或疾病。
本发明的一个方面中，使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造药剂用于维持正常骨结构，优选药剂用于健康的接受治疗者，更优选没有骨病的接受治疗者。术语“正常骨结构”意味包括合成代谢和分解代谢平衡稳定的任意骨结构，这种平衡导致该结构可以承受生物体活动时产生的机械应力；以及包括这样的结构，其可以通过上述平衡重塑自身、或通过除去衰弱的或破损的部分并塑造坚固的部分而能修复自身、并因此避免了微缝和易于骨折的部分。
发现，尤其是老年人，由于骨更新速度减缓，骨的坚固结构较少。此外，老年人由于久坐的生活习惯、肌肉软弱和营养缺乏，骨骼变得更为不牢固、更脆弱。事实上受影响的骨包括了“不适宜”的矿化结构，因此变得更脆和不稳定，通常伴随骨折的倾向。这些“不适宜”的结构作为临床上病理症状并没有被证实，但也不是空想。除年龄为40岁或更大的人之外，在最近接受皮质胆固醇治疗的人、或最近接受抗骨质疏松试剂治疗的人中也发现这些“不适宜”的结构。抗骨质疏松试剂有氟和常见的双膦酸，如羟乙二磷酸盐和chlodronate。
术语“接受治疗者”包括人和任意的脊椎动物，例如猫、狗、牛、马和其它家畜。
术语“骨病”表示任意骨的病理症状，会导致骨结构的脆弱或不规则或异常。本发明中使用“骨疾病”作为同义词。优选术语“骨病”表示临床病理症状，其选自骨质疏松、佩吉特氏病、关节炎、牙周骨质减少、青春期脊柱侧凸、骨折、缺乏锻炼引起的骨质减少、移植后骨质减少、与甲状旁腺功能亢进相关的骨质减少、药物引起的骨质减少、营养性骨质减少、代谢性骨疾病、早熟性骨质减少和骨化紊乱。
当术语“接受治疗者”指人时，一个实施方式中优选药剂使用于年龄为40岁或更大的人，另一实施方式中优选药剂使用于儿童。优选，术语“儿童”包括年龄在0-16岁之间的个体。
当使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造药剂，用于在健康的接受治疗者中预防骨病，或用于患骨病的儿童的治疗时，优选骨病选自骨质疏松。佩吉特氏病。关节炎。牙周骨质减少。青春期脊柱侧凸。骨折。缺乏锻炼引起的骨质减少。移植后骨质减少。与甲状旁腺功能亢进相关的骨质减少。药物引起的骨质减少。营养性骨质减少。代谢性骨疾病。早熟性骨质减少和骨化紊乱。
在一实施方式中，当接受治疗者使用药剂之后，优选细胞外1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的浓度在10-6和10-10M之间，更优选在10-7和10-9M之间，最优选细胞外的浓度在10-8M左右。
当实施方式中使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸制造药剂，用于刺激信号级联和对1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的作用的反应历程进行介导，其中双膦酸化合物的作用可以被钙离子通道阻断剂所阻断，在该实施方式中优选的钙离子通道阻断剂选自硝苯吡啶和戊脉安。
一实施方式优选使用1-氨基-3-(N，N--二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的剂量为口服每次0.01-1000毫克，更优选口服每次12.5-75毫克。术语“口服”包括固体或可溶液体的药物制剂、凝胶、软胶囊、药片、含固体制剂的胶囊、可溶液体或悬浮液和药丸。本发明的另一方面设想1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸局部施用于皮肤和/或粘膜。按此目的使用的剂型包括药膏、乳剂、喷剂、栓剂和凝胶。
本发明的另一实施方式中，优选使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的剂量为每次注射0.02-200毫克，更优选每次注射2.5-15毫克。术语“注射用”指使用时避开胃-肠道，例如通过皮下、肌肉或静脉注射或输液。
术语“对IP3敏感的存储器”指钙离子的细胞内存储器，其由于IP3(三磷酸肌醇)的存在迅速释放钙离子。这样的对IP3敏感的存储器包括内质网，和平滑肌细胞中的肌质网。
根据本发明，值得注意的是1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸对成骨细胞中的钙离子动态平衡的影响，尤其是提高成骨细胞中的钙离子含量，这至少能以两种不同的方式发生钙离子可以从内生的存储器中流出，例如那些对IP3敏感或对毒胡萝卜素敏感的存储器。
其次，钙离子可以从细胞外存储器流入。例如，可以通过电压依赖性的钙离子通道(VDCC)，但是其它的钙离子通道也可以，例如以配体为闸门的通道。
本发明的范围中，使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸筛选钙离子通道阻断剂。术语“假定的钙离子通道阻断剂”指用于测试其对钙离子通道的阻断能力的化合物。
术语1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的“假定的功能类似物”所指的化合物被认为当缺乏钙离子通道阻断剂时会引起钙离子流入细胞内，因而类似1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸对细胞钙离子动态平衡的影响。术语“测试响应”指测试或检测响应的存在与否。本发明中，术语“响应”优选指胞液中钙离子含量的变化。
本发明的范围还包括1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸在其新应用中与至少一种其它的化合物/物质结合使用，作为协同组合。术语“组合”指1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸和另一些物质组合在同一药剂中，和含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂与另一些物质一起对接受治疗者使用，就是说这(些)其它物质与药物以物理分开(即在空间或时间上分开)的形式使用。如果这(些)其它物质与含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂分开使用，优选含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂和其它物质以一步(同时摄取、输液、注射)、连续步骤(一步接另一步)或循环步骤的方式使用。一个实施方式中优选含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂在其它氨基取代双膦酸盐的治疗之前、中或之后使用。例如，可以将含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂和其它氨基取代双膦酸盐连续使用，因为其它氨基取代双膦酸盐会有部分抗再吸收作用。因此，接受治疗者可能会由于1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸对成骨细胞的选择性调节作用而需要使用含1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸的药剂；同时也可以根据他/她自身要求，为可调节对骨骼再吸收的抑制程度而使用其它氨基取代的双膦酸盐。
另一实施例中，通过生化、比重、X-射线或其它手段对每一个体的骨测试决定每个人不同的需要，根据个体要求，接受治疗者可能首先需要极大地抑制骨骼的再吸收，随后连续地较低地或不抑制骨骼的再吸收，然后再作其它改变。
因此，1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸是一种理想的选择，为骨变弱和/或脆的症状进行可个体化调节的治疗奠定基础。
以上协同组合的这物质/这些物质/化合物选自钙盐，柠檬酸钙和碳酸钙，其它氨基取代双膦酸盐，含氟有药理活性的盐，D类维生素和它们的代谢物，维生素D3、骨化二醇、钙三醇、维生素D2、PTH，合成代谢激素，如雌激素、骨骼中有雌激素活性的物质、孕激素、男性激素、生长激素、有生长激素活性的肽、雌激素受体的选择性调节物、雷洛昔芬等。术语“氨基取代的双膦酸盐”优选指在1-位有氨基的双膦酸盐化合物。但也可以在其它位置取代。这里提及的1-羟基双膦酸盐的“氨基衍生物”，其所指的分子的结构中羟基被氨基取代。
本发明中突出的优点是1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸可以避免形成上述的“不适宜”的骨结构，并且，因其对成骨细胞的选择性调节能力，有助于当“不适宜”的骨结构一形成就除掉它。
因此，骨骼中的不适宜的矿化结构可以分别预防和去除。例如，这些结构在老年人中会增多，但是临床病理症状中这些结构还没有被证实。另一重要的实施例中，在生长中的骨骼，如儿童的骨骼中也会有这些结构。这些儿童可以是健康的或有骨病的。本发明提供除去这些不适宜的结构或首先进行预防的手段，因此有助于形成正常的骨结构以有利于承受日常生活中所承受的机械应力。
下列实施例和
本发明这些和其它方面。此外，以下列出多种文献，它们详细描述特定过程或试验细节，引用于此以作参考。
图2说明在培养的成骨细胞中双膦酸盐诱导骨钙蛋白(OC)的合成在不含(对照)或含标明浓度的1α，25-二羟基维生素D3[1，25(OH)2D3]、EHDP、APD、OPD或NH2-OPD情况下，细胞生长72小时。随后释放到培养基中的骨钙蛋白(OC)按实施例4中的描述进行定量。数据为3次独立的平行试验结果的平均值±标准偏差。
图3显示双膦酸盐对成骨细胞中胞液钙离子的快速作用Fura-2负载的细胞与标明浓度的1α，25-二羟基维生素D3[1，25(OH)2D3]、EHDP或APD(A区)、OPD或NH2-OPD(B区)接触，胞液中钙离子含量按实施例3的描述进行监测。图形代表至少四次独立记录随时间变化的轨迹。
图4说明OPD和NH2-OPD对成骨细胞中胞液钙离子的快速作用的剂量依赖性Fura-2负载的细胞用媒介物(缓冲盐溶液，基本值)、或标明浓度的OPD或NH2-OPD处理，并按照描述测定细胞内钙离子的浓度([Ca2+]i)。收集处于BP引发的钙离子响应峰值处的[Ca2+]i值。数据是四次独立[Ca2+]i记录的平均值±标准偏差。概率值(p值)(*p＜0.01；**p＜0.01)给出相对于基础值的显著差异。
图5显示双膦酸依赖的胞液中钙离子变化相对于1，25(OH)2D3作用的动力学Fura-2负载的细胞与1，25(OH)2D3(10nM)，或10nM的EHDP，APD，OPD或NH2-OPD接触，按照描述检测胞液中的钙。A)记录最大峰值处的变化量和相应时间-峰值并与类固醇的结果相对比。图形表示四次独立试验的结果。B)监测响应于10nM的BP或1，25(OH)2D3的Ca2+i升高的初期阶段，并绘制Ca2+i相对于接触时间的变化。
图6显示Fura-2负载的细胞用(Thp-处理)或不用(对照)1μM毒胡萝卡素处理、再与OPD(10nM)或NH2-OPD(10nM)接触之后胞液中钙含量。按实施例3的描述监测胞液中钙含量。图形代表至少3次独立记录随时间变化的轨迹。
响应于欧珀酸和NH2-OPD的作用而合成与释放骨基质蛋白质骨钙蛋白首先检测欧珀酸(OPD)和NH2-OPD(参见图1的化学结构)对合成与释放骨基质蛋白质骨钙蛋白(OC)的作用，并与双膦酸盐帛米酸盐(APD)和羟乙二磷酸盐(EHDP)的结果对比，二者结果都在图1中表示。相对于未经处理的对照细胞，在含10-8M1，25(OH)2D3的介质中培养72小时的成骨细胞向培养介质所释放的OC提高100％(图2)。在相同培养条件下OPD和NH2-OPD以剂量依赖的方式明显刺激OC的合成，这与EHPD和APD一样。APD和OPD比类固醇激素有效，然而NH2-OPD的作用低于secosteroid，与EHDP相当。浓度为10-8M时，相对于1，25(OH)2D3的功效次序为OPD(1.9)＞APD(1.1)＞1，25(OH)2D3(1.0)＞EHDP＝NH2-OPD(0.85)。当浓度为10-7M时，对合成OC的诱导明显减少，但是双膦酸盐的的功效次序仍然相同。当细胞与浓度低于10-8M的BP相接触时，相对于基本的OC合成没有检测到显著性差异。至于其它合成代谢参数，为确定细胞内钙离子调节的短期变化是否有可能与这些双膦酸盐对OC合成的作用相关，用荧光光度计监测成骨细胞中Ca2+i含量的变化。Secosteroid 1，25(OH)2D3作为大鼠成骨细胞中传送钙离子的激素，在文章(Farach-Carson等，1998，Am.J.Kidney Dis.31，729-742)中很好记录并表征其响应。因此，类固醇可以用作评价BP对这些细胞中Ca2+i作用的阳性参照。在Fura-2负载的细胞中，双相时间-过程分布图说明了EHDP、APD和OPD类似于1，25(OH)2D3会引发Ca2+的快速(30-60秒)和持久(＞5分钟)的[Ca2+]i升高，原因被认为是内生存储器释放Ca2+和阳离子从外界流入的共同作用(图3)。NH2-OPD产生快速(60秒)但是短暂的[Ca2+]i升高，并在1-2分钟之内迅速从峰值下降到接近基本值水平(图3B)。对于OPD和它的氨基衍生物，从10-10M开始可以检测到[Ca2+]I的升高(1.1-1.2倍于基本水平，p＜0.05)，但是10-8M时与基本水平的差异最大(1.4-1.6倍刺激，p＜0.01；图4)。相对于1，25(OH)2D3，胞液中Ca2+的最大变化说明只有OPD与类固醇功效相当(图5A)，它们达到峰值的时间明显短于使用激素的情况(OPD 60秒对1，25(OH)2D390秒)。相对于类固醇，EHPD、APD和NH2-OPD提高细胞内Ca2+的功效较差。但是APD和NH2-OPD达到峰值的时间与激素相当(APD或NH2-OPD 80秒对1，25(OH)2D390秒)，然而EHPD具有明显延迟的动力学结果(达到峰值的时间＝120秒)。这些化合物引发的Ca2+升高的初始阶段的动力学分析说明，EHDP提高Ca2+的速度最慢(图5B)。
在ROS 17/2.8细胞中，钙离子对1，25(OH)2D3的快速的非基因组响应包括初始阶段从内生的对毒胡萝卡素敏感的存储器中由固醇引发的快速Ca2+释放，及随后从外界流入阳离子(参见Khoury等，1995，J.Nutr.125，1699S-1703S)。持续的Ca2+i阶段可以用阳离子进入路径解释，其是L-型电压依赖(VDCC)Ca2+通道作用的结果。根据本发明，由于当剂量维持在对骨细胞和成骨细胞有细胞作用时，NH2-OPD绝对没有抗再吸收特性(Van Beek E.等，1996，J.Bone Miner.Res.11，1492-1497)，因而NH2-OPD是成骨细胞的选择性调节物。因此，注意力主要集中在OPD和其氨基取代的衍生物，并进行试验用于确定类似Ca2+通道是否参与这里报导的这些化合物对[Ca2+]i的作用。至于类固醇，用VDCC阻断剂硝苯吡啶(2μM)或戊脉安(5μM)对细胞预处理只能部分(70％)抑制由OPD引起的[Ca2+]i升高，但几乎可以完全消除NH2-OPD的作用(参见实施例7)。对于OPD，VDCC阻断剂的作用在响应的流入阶段比较明显，而对初期的Ca2+i短暂升高没有受影响(未显示)。为评估BP引发的快速、初期的Ca2+响应是否涉及对磷酸肌醇专一的磷脂酶C(PLC)路径的激活，评价二个在结构和机理上不相关的酶抑制剂对BP引发的初期的Ca2+i升高的作用。OPD-和NH2-OPD依赖的胞液中Ca2+的快速(1分钟)升高可以用PLC抑制剂U73122(2μM)或新霉素(0.5mM)处理后完全阻断(参见实施例8)，但不能被缺少对PLC的作用的U73122类似物U73343(未显示)所阻断(Vazquez G.等，1998，J.Biol.Chem.273，33954-33960)。
当使用1μM的毒胡萝卡素抑制肌质网中Ca2+-ATP激酶而从药理上消耗细胞内的肌肉Ca2+存储器时，对OPD或NH2-OPD的响应被完全阻断(图6)。
表1硝苯吡啶和戊脉安对OPD和NH2-OPD引起的成骨细胞中Ca2+响应的作用[Ca2+]i(nM) Δ[Ca2+]I％抑制基本值 135±6OPD 205±10*70NH2-OPD150±3**15硝苯吡啶预处理OPD 156±8**2170NH2-OPD 137±6 2 90戊脉安预处理OPD 146±5 1185NH2-OPD 133±7 - 100
表2磷脂酶C对OPD和NH2-OPD引起的成骨细胞中Ca2+响应的抑制作用[Ca2+]i(nM) Δ[Ca2+]i％抑制基本值100 -OPD 164±9*64NH2-OPD137±3**37U73122(或新霉素+OPD)1分钟 105±3(98±2) -100(100)5分钟 100±5(100±8)-100(100)U73122(或新霉素+NH2-OPD)1分钟 101±5(99±1) -100(99)5分钟 100±11(100±5) -100(100)
所观测到的OPD Ca2+i响应图形与1，25(OH)2D3非常相似，包括在初期BP引发快速从对毒胡萝卜素敏感的内生存储器流出Ca2+，以及随后对应于持续Ca2+i阶段的从细胞外环境流入阳离子。从对IP3敏感的存储器流出阳离子而导致BP引发的快速的Ca2+i瞬时增加，类似于1，25(OH)2D3的结果。PLC抑制剂U73122和新霉素作用在不同的PLC活性位点而都能产生的阻断效应很好地支持这一概念。在ROS17/2.8细胞中，1，25(OH)2D3引发快速(30-60秒)且单阶段生成IP3(参见Lieberherr，M.，1987，J.Biol.Chem.262，13168-13173；Civitelli等，1990，Endocrinology，127，2253-2262)。尽管这些数据说明这两种相关BP具有类似的内生Ca2+流动机理，但是还需继续探讨OPD和NH2-OPD对这些细胞中磷脂代谢的作用。因为多磷酸肌醇的更新直接或间接与控制Ca2+从细胞外流入有关(参见Irvine，RF.，1992，FASEB J.6，3085-3091)，因此磷酸肌醇释放的程度差异可以解释这里报导的OPD和NH2-OPD较大地刺激Ca2+通过Ca2+通道的现象。
观测到OPD和NH2-OPD引起的Ca2+响应的Ca2+流入阶段，尽管程度不同，但都可以用VDCC阻断剂消除，这说明成骨细胞中二种BP的非基因组作用都与电压依赖性Ca2+通道的调节相关。
生理性骨重塑过程中BP的基因组作用(如引发OC合成)与非基因组作用(如快速活化钙信使)在时间上肯定是有间隔的，而在空间上有可能是分开的。许多研究，尤其是涉及在1，25(OH)2D3对骨的作用中膜引发路径和核受体介导路径的研究，清楚地说明诱导Ca2+信号对于成骨细胞中成核过程的活化并不总是必须的(参见Khoury等，1994，Endocrinology 135，2446-2453)。但是，Ca2+信号已经与骨钙蛋白和osteopontin的表达量的变化系统地关联起来(参见Farach-Carson等，Am.J.Kidney Dis.31，729-742，以及其它文献)。观测到相对于母体分子OPD，NH2-OPD引发OC合成的功效减弱，然而NH2-OPD引起的胞液中Ca2+变化的幅度要明显小于OPD所引起的，两者差异非常大。因此，这暗示在BP引发OC合成的效力与它们引起胞液中Ca2+快速变化的能力之间有直接的关联。这些观测与本研究中所有其它受测的BP都有效吻合。因此，对于secosteroid激素1，25(OH)2D3，BP对成骨细胞的Ca2+信号系统的快速非基因组作用有可能诱发BP的基因组作用，并因此对骨生成起作用。尽管OPD结构的改变会影响其与目标细胞的相互作用，但是所观察到的OPD和NH2-OPD对Ca2+调节的作用差异可能还是归结于不同的信号级联和/或介导每一种BP作用的机理。本研究中一定剂量的NH2-OPD可用作成骨细胞的选择性调节物。OPD和NH2-OPD对成骨细胞中Ca2+动态平衡的作用的差异有可能用于解释它们抗再吸收功效的差异。这些结果说明NH2-OPD是成骨细胞的选择性调节物，尤其在上述的新应用中。
以上描述、权利要求、表和附图中所公开的发明特点、无论单独还是随机组合使用，对于本发明中各实施方式的实施都是至关重要的。
权利要求
1.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于选择性调节成骨细胞的药剂中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中选择性调节包括刺激成骨细胞的细胞活性。
3.根据权利要求1或2的应用，其中选择性调节包括影响成骨细胞中Ca2+的动态平衡。
4.根据上述任一权利要求的应用，其中选择性调节包括成骨细胞中Ca2+含量的瞬时提高。
5.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于维持正常骨结构的药剂中的应用。
6.根据权利要求5的应用，其中药剂用于健康的接受治疗者。
7.根据权利要求5或6的应用，其中药剂用于没有骨病的接受治疗者。
8.根据权利要求5-7中任一权利要求的应用，其中药剂用于人或脊椎动物。
9.根据权利要求5-8中任一权利要求的应用，其中药剂用于年龄在40岁或更大的人。
10.根据权利要求5-8中任一权利要求的应用，其中药剂用于儿童。
11.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于健康的接受治疗者预防骨病的药剂中的应用。
12.根据权利要求11的应用，其中骨病选自骨质疏松、佩吉特氏病、关节炎、牙周骨质减少、青春期脊柱侧凸、骨折、缺乏锻炼引起的骨质减少、移植后骨质减少、与甲状旁腺功能亢进相关的骨质减少、药物引起的骨质减少、营养性骨质减少、代谢性骨疾病、早熟性骨质减少和骨化紊乱。
13.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于对最近接受皮质类固醇治疗的接受治疗者进行治疗的药剂中的应用。
14.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于无需抗再吸收活性的骨病后治疗的药剂中的应用。
15.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于对患骨病的儿童进行治疗的药剂中的应用。
16.根据权利要求15的应用，其中骨病选自骨质疏松、佩吉特氏病、关节炎、牙周骨质减少、青春期脊柱侧凸、骨折、缺乏锻炼引起的骨质减少、移植后骨质减少、与甲状旁腺功能亢进相关的骨质减少、药物引起的骨质减少、营养性骨质减少、代谢性骨疾病、早熟性骨质减少和骨化病症。
17.根据先前任一权利要求的应用，其中在对接受治疗者使用药剂之后，1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在细胞外的浓度在10-6和10-10M之间。
18.根据权利要求17的应用，其中在对接受治疗者使用药剂之后，1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在细胞外的浓度在10-7和10-9M之间。
19.根据权利要求17的应用，其中在对接受治疗者使用药剂之后，1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在细胞外的浓度在10-8M左右。
20.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的应用，用于制造药剂，该药剂刺激信号级联和对1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的作用的反应历程进行介导，其中双膦酸盐化合物的作用可以被Ca2+通道阻断剂所阻断。
21.根据权利要求20的应用，其中Ca2+通道阻断剂选自硝苯吡啶和戊脉安。
22.根据先前任一权利要求的应用，其中口服使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的剂量为0.01-1000毫克之间。
23.根据权利要求22的应用，其中口服使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的剂量为12.5-75毫克之间。
24.根据先前任一权利要求的应用，其中注射使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的剂量为0.02-200毫克之间。
25.根据权利要求24的应用，其中注射使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸或其任一可溶性盐、其任一水合物的剂量为2.5-15毫克之间。
26.1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物在制造用于传送来自对IP3敏感的存储器的钙离子的药剂中的应用。
27.根据先前任一权利要求的1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的应用，其中1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物和至少一种其它物质结合使用，该物质选自钙盐、柠檬酸钙和碳酸钙、其它氨基取代的双膦酸、含氟有药理活性的盐、D类维生素和它们的代谢物、维生素D3、骨化二醇、钙三醇、维生素D2、PTH、合成代谢激素、雌激素、骨骼中有雌激素活性的物质、孕激素、男性激素、生长激素、有生长激素活性的肽、雌激素受体的选择性调节物、雷洛昔芬。
28.根据先前任一权利要求的1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的应用，其中药剂在使用其它氨基取代的双膦酸盐治疗之前、之中或之后使用。
29.一种用于筛选Ca2+通道阻断剂的方法，包括以下步骤-用假定的钙离子通道阻断剂处理含钙离子通道的细胞；-将细胞与1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物接触；-测量接触步骤之后的响应。
30.一种筛选1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸功能类似物的方法，包括以下步骤-用钙离子通道阻断剂处理含钙离子通道的细胞；-在没有钙离子通道阻断剂存在下，将细胞与假定的功能类似物接触，这些功能类似物被认为会引起钙离子流入细胞；-测量接触步骤之后的响应。
31.一种方法，用于选择性调节成骨细胞、和/或维持正常的骨结构、和/或用于正常接受治疗者预防骨病、和/或对最近接受皮质类固醇治疗的接受治疗者进行治疗、和/或用于无需抗再吸收活性的骨病的后治疗、和/或治疗儿童的骨病、和/或刺激信号级联和对1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的作用的反应历程进行介导，其中双膦酸盐化合物的作用可以被钙离子通道阻断剂所阻断；和/或传送来自对IP3敏感的存储器的钙离子，该方法包括对接受治疗者单独使用1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物，或与药用载体一起使用，1-氨基-3-(N，N-二甲基氨基)-亚丙基-1，1-双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的剂量为口服每次0.1-1000毫克，注射每次0.02-200毫克。
全文摘要
本发明涉及1－氨基－3－(N,N－二甲基氨基)－亚丙基－1,1－双膦酸、其任一可溶性盐或其任一水合物的新应用,尤其是用于制造可选择性调节成骨细胞的药剂。
文档编号A61K31/4535GK1342083SQ99812911
公开日2002年3月27日 申请日期1999年10月29日 优先权日1998年10月30日
发明者埃米利奥·J·A·罗尔丹, 阿尼瓦尔·佩雷斯－略伦特, 吉列尔莫·巴斯克斯, 里卡多·博兰, 索克拉特斯·E·帕帕保罗斯 申请人:加多股份有限公司, 莱顿大学