应用单克隆抗α－D－抗体抑制巨噬细胞浸润的方法

专利名称：应用单克隆抗α－D－抗体抑制巨噬细胞浸润的方法
本申请是于1998年11月16日申请的待审的美国专利申请序号09/193,043的继续，后者是于1997年10月3日申请的待审的美国专利申请序号08/943,363的部分继续，美国专利申请序号08/943,363是于1996年2月22日申请的美国专利申请序号08/605,672并于1998年10月6日被授予为美国专利5,817,515的部分继续，美国专利申请序号08/605,672是于1994年12月21日申请的美国专利申请序号08/362,652并于1998年6月16日被授予为美国专利5,766,850的部分继续，美国专利申请序号08/362,652是于1994年8月5日申请的美国专利申请序号08/286,889并于1995年11月28日被授予为美国专利5,470,953的部分继续，美国专利申请序号08/286,889又是于1993年12月23日申请的美国专利申请序号08/173,497并于1995年8月1日被授予为美国专利5,437,958的部分继续。
背景技术：
整联蛋白是一类积极参与细胞粘着的膜结合分子。整联蛋白是跨膜异二聚体，包含与一个β亚基非共价连接的一个α亚基。迄今为止，已经鉴定了至少14种α亚基和8种β亚基[综述参见Springer，Nature346425-434(1990)]。β亚基一般能够与一种以上的α亚基结合，共享一种共同β亚基的异二聚体已经被分类为整联蛋白群内的亚家族。
限于在白细胞中表达的一类人类整联蛋白的特征为一个共同的β2亚基。由于这种细胞特异性的表达，这些整联蛋白通常被称为白细胞整联蛋白、Leu-CaM或白细胞整联蛋白(leukointegrin)。因为有共同的β2亚基，该类的另一种名称是β2整联蛋白。β2亚基(CD18)先前与三种不同的α亚基CD11a、CD11b或CD11c中的一种结合在一起分离。编码人CD18的cDNA的分离描述于Kishimoto等，Cell 48681-690(1987)。在正式WHO命名法中，所述异二聚体称为CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18；在普通命名法中，它们分别称为LFA-1、Mac-1或Mol以及p150，95或LeuM5[Cobbold等，载于Leukocyte Typing III，McMichael(编辑)，Oxford Press，第788页(1987)]。已经证明人β2整联蛋白α亚基CD11a、CD11b和CD11c在电泳中在还原条件下迁移，它们的表观分子量分别为约180kD、155kD 150kD，并且已经克隆了编码这些亚基的DNA[CD11a，Larson等，J. Cell Biol. 108703-712(1989)；CD11b，Corbi等，J. Biol. Chem.26312403-12411(1988)和CD11c，Corbi等，EMBO J.64023-4028(1987)]。人类β2整联蛋白α和β链的推定同系物根据分子量相似性定义，所述同系物分别在包括猴和其它灵长类动物[Letvin等，Blood61408-410(1983)]、小鼠[Sanchez-Madrid等，J.Exp.Med.1541517(1981)]和狗[Moore等，Tissue Antigens 36211-220(1990)]的其它物种中鉴定出。
已经表明来自其它物种的假定同系物的绝对分子量变化显著[参见例如Danilenko等，Tissue Antigens 4013-21(1992)]，并且在没有序列信息的情况下，尚不可能建立人整联蛋白亚基和在其它物种鉴定的整联蛋白亚基之间的确定关系。而且，在不同物种之间已经观察到蛋白家族中成员数目的变化。例如，在兔中已经分离的IgA同种型多于在人类中分离的IgA同种型[Burnett等，EMBO J.84041-4047(1989)和Schneiderman等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)867561-7565(1989)]。同样，在人类中，先前已经鉴定出至少6种金属硫蛋白的变体[Karin和Richards，Nature 299797-802(1982)和Varshney等，Mol.Cell.Biol.626-37(1986)]，而在小鼠中，明显仅有两种这样的变体[Searle等，Mol.Cell.Biol.41221-1230(1984)]。因此，在一种物种中存在一个蛋白家族的多个成员不一定暗示在另一物种中存在相应的家族成员。
在β2整联蛋白的具体方面，在狗中已经观察到，人CD18的推定犬β2对应物能够与多达4种可能不同的α亚基形成二聚体[Danilenko等，参见上文]。通过用犬脾细胞免疫小鼠产生的抗体产生免疫沉淀蛋白的抗体，所述蛋白主要基于相似而不是相同分子量而被暂定为人CD18、CD11a、CD11b和CD11c的犬同系物。另一抗犬脾细胞抗体Ca11.8H2识别并免疫沉淀第四种α样犬亚基，所述亚基也能够与所述β2亚基结合，但具有特有的分子量并且其表达限于分化的组织巨噬细胞的一个亚群。
通过用鼠类树突细胞免疫仓鼠产生的抗体产生两种抗整联蛋白抗体[Metlay等，J.Exp.Med.1711753-1771(1990)]。一种抗体2E6除免疫沉淀分子量范围为150-160kD的次要条带外，还免疫沉淀一种主要异二聚体，所述异二聚体具有分子量约180kD和90kD的亚基。第二种抗体N418沉淀另一种明显的异二聚体，所述异二聚体具有分子量约150kD和90kD的亚基。基于细胞粘着阻断研究，假设抗体2E6识别人CD18的鼠类对应物。虽然N418抗原的分子量提示识别出人CD11c/CD18的鼠类同系物，但进一步的分析表明，所述鼠类抗原表现出的组织分布型与人CD11c/CD18观察到的组织分布型不一致。
由犬Ca11.8H2抗体和鼠类N418抗体识别的抗原可以代表一种先前鉴定的犬或鼠类α亚基的变体种类(例如糖基化变体或剪接变体)。或者，这些抗原可能代表特有的犬和鼠类整联蛋白α亚基。在缺乏关于一级结构的具体信息的情况下，可能不能区别这些可能的情况。
在人类中，CD11a/CD18在所有白细胞上表达。CD11b/CD18和CD11c/CD18基本上限于在单核细胞、粒细胞、神经细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达，但在某些B细胞类型上也检测到CD11c/CD18。一般而言，CD11a/CD18主要在淋巴细胞上，CD11b/CD18主要在粒细胞上，而CD11c/CD18主要在巨噬细胞上[参见综述，Arnaout，Blood751037-1050(1990)]。然而，α链的表达相对于各个细胞类型的活化和分化状态是可变的[参见综述，Larson和Springer，Immunol.Rev.114181-217(1990)]。
采用能够阻断β2整联蛋白相关的细胞粘着的单克隆抗体，已经证明β2整联蛋白参与人类免疫应答和炎症反应。例如，CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18积极参与天然杀伤(NK)细胞与淋巴瘤细胞和腺癌细胞的结合[Patarroyo等，Immunol.Rev.11467-108(1990)]、粒细胞积累[Nourshargh等，J.Immunol.1423193-3198(1989)]、不依赖于粒细胞的血浆渗漏[Arfors等，Blood 69338-340(1987)]、受刺激的白细胞的趋化反应[Arfors等，参见上文]和白细胞粘着于血管内皮[Price等，J.Immunol. 1394174-4177(1987)和Smith等，J.Clin.Invest.832008-2017(1989)]。β2整联蛋白在免疫应答和炎症反应中的基本作用在称为白细胞粘着缺乏(LAD)的临床综合征中是明显的，在所述综合征中临床表现包括复发和常常威胁生命的细菌感染。LAD由于β2亚基中的异种突变而产生[Kishimoto等，Cell 50193-202(1987)]，并且疾病状态的严重程度与β2亚基表达的缺陷程度成比例。所述β2突变消弱了完整的整联蛋白异二聚体的形成[Kishimoto等，参见上文]。有趣的是，至少一种CD18特异性抗体已经表现出在体外抑制1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)合胞体的形成，虽然不清楚这种抑制的准确机制[Hildreth和Orentas，Science 2441075-1078(1989)]。这种观察与下述发现一致CD11a/CD18的主要反受体ICAM-1也是鼻病毒血清型主要群的表面受体[Greve等，Cell 56839(1989)]。
β2整联蛋白结合活性在人类免疫应答和炎症反应中的重要性增强了发展对该类表面蛋白更全面的了解的必要性。该亚家族中仍未知的成员的鉴定、它们的反受体的鉴定和单克隆抗体或可以改变β2整联蛋白生物活性的其它可溶性因子的产生，将提供治疗干涉β2整联蛋白相关免疫应答和炎症反应的可行方法。
发明简述一方面，方面提供新型纯化和分离的多核苷酸(例如有义链和反义链的DNA和RNA转录物)，所述多核苷酸编码新型人β2整联蛋白α亚基αd以及具有αd固有结合特性和/或免疫学特性的αd变体(即缺失、添加或取代类似物)。本发明的优选DNA分子包括cDNA、基因组DNA以及全化学合成或部分化学合成的DNA分子。本发明优选的多核苷酸是SEQ ID NO1中叙述的DNA，其编码SEQ ID NO2的多肽。也提供包括αd编码序列的重组质粒和病毒DNA构建物(表达构成物)，其中所述αd编码序列有效连接于一种或多种同源或异源转录调节元件。
本发明也提供分离和纯化的小鼠和大鼠多核苷酸，所述多核苷酸表现出与编码人αd的多核苷酸的同源性。优选的小鼠多核苷酸叙述于SEQ ID NO52；优选的大鼠多核苷酸叙述于SEQ ID NO54。
作为本发明的另一方面，提供用本发明的DNA序列转化或转染的原核或真核宿主细胞，所述宿主细胞表达αd多肽或其变体。本发明的宿主细胞尤其可用于大规模生产αd多肽，可以从或者所述宿主细胞本身或者从所述宿主细胞生长的培养基中分离出所述多肽。在胞外膜表面上表达αd多肽的宿主细胞也可用作生产αd特异性抗体的免疫原。最好是，共转染用αd转染的宿主细胞，以表达αd整联蛋白亚基，以便提供所述异二聚体的表面表达。
本发明也提供纯化和分离的αd多肽、其片段和变体。优选的αd多肽叙述于SEQ ID NO2。本发明新型αd产物可以作为来自天然来源的分离物获得，但最好是由涉及本发明的宿主细胞的重组方法与αd变异产物一起产生。通过改变选择用于重组生产和/或分离后加工的宿主细胞，可以产生完全糖基化、部分糖基化和全去糖基化形式的所述αd多肽。本发明的变异αd多肽可以包括可溶性和不溶性αd多肽，包括类似物，其中一个或多个所述氨基酸缺失或被取代，而(1)没有损伤、并且最好是增强一种或多种αd特异性的活性或免疫学特征；或(2)特异性地使特定配体/受体不能结合或无信号功能。也提供融合多肽，其中αd氨基酸序列与来自其它多肽的氨基酸序列连续表达。这种融合多肽与野生型αd相比，可以具有修饰的生物特性、生化特性和/或免疫学特性。设想了包括促进多聚体形成的额外氨基酸(例如赖氨酸或半胱氨酸)残基的类似多肽。
本发明也包括特异性地结合αd的多肽和其它非肽分子。优选的结合分子包括抗体(例如单克隆抗体和多克隆抗体)、反受体(例如膜结合形式和可溶性形式)和其它配体(例如天然存在的分子或合成分子)，包括在αd单克隆抗体和/或特异性反受体存在下竞争结合αd的那些结合分子。结合分子可用于纯化αd多肽以及鉴定表达αd的细胞类型。结合分子也可用于调节(例如抑制、阻断或刺激)αd的体内结合和/或信号转导活性。
也提供鉴定αd结合分子的测定，包括体外测定，例如固定化配体结合测定、溶液结合测定和闪烁亲近测定以及基于细胞的测定，例如双杂种筛选测定、断裂杂种筛选测定(split hybrid assay)等。基于细胞的测定可供用于由于特异性结合相互作用或特异性结合相互作用的破坏产生的宿主细胞的表型改变，由此允许间接定量测定或测量某些特异性结合相互作用。
用于鉴定抗体或调节αd活性的其它化合物的体外测定可以包括例如将αd或αd结合的天然配体固定化，以可检测的方式标记所述非固定化结合配偶体，将所述结合配偶体一起温育，并测定试验化合物对结合标记的量的影响，其中与没有所述试验化合物时结合的标记量相比在存在所述试验化合物时结合的标记的减少，表明所述试验因子是αd结合的抑制剂。
用于鉴定调节αd和配体之间相互作用的化合物的另一种类型的体外测定，包括将αd或其片段固定于包被(或浸渍)荧光剂的固体支持体上，用能够激发所述荧光剂的化合物标记所述配体，在存在或缺乏推定的调节化合物的情况下使所述固定化αd与所述标记配体接触，检测所述荧光剂产生的光发射，并将调节化合物鉴定为与在缺乏调节化合物时所述荧光剂的光发射相比影响所述荧光剂的光发射的那些化合物。或者，可以将所述αd配体固定化，而在该测定中标记αd。
本发明设想的用于鉴定调节αd和配体之间相互作用的化合物的基于细胞的测定，包括用DNA构成物转化或转染合适的宿主细胞，所述DNA构成物包含在启动子控制下的报道基因，所述启动子受具有一个DNA结合结构域和一个活化结构域的转录因子调节；在所述宿主细胞中表达第一杂种DNA序列，所述第一杂种DNA序列编码部分或全部αd和所述转录因子的或者DNA结合结构域或者活化结构域的第一融合体；在所述宿主细胞中表达第二杂种DNA序列，所述第二杂种DNA序列编码部分或全部所述配体和不参与所述第一融合体的所述转录因子的或者DNA结合结构域或者活化结构域的第二融合体；通过在特定宿主细胞中，通过测量在存在或缺乏所述推定调节剂的情况下报道基因产物在所述宿主细胞中产生而检测所述配体与αd的结合，评价推定的调节化合物对αd和所述配体之间相互作用的影响；并将调节化合物鉴定为与在缺乏调节化合物时所述报道基因产物的产生相比改变报道基因产物产生的那些化合物。目前本发明优选用于该测定的是lexA启动子、lexA DNA结合结构域、GAL4反式激活结构域、lacZ报道基因和酵母宿主细胞。
上述测定的一种修饰形式可以用来通过以下步骤分离编码结合αd的蛋白的多核苷酸，所述步骤为用DNA构成物转化或转染合适的宿主细胞，所述DNA构成物包含在启动子控制下的报道基因，所述启动子受具有一个DNA结合结构域和一个活化结构域的转录因子调节；在所述宿主细胞中表达第一杂种DNA序列，所述第一杂种DNA序列编码部分或全部αd和所述转录因子的或者DNA结合结构域或者活化结构域的第一融合体；在所述宿主细胞中表达第二杂种DNA序列的文库，所述第二杂种DNA序列文库编码部分或全部推定αd结合蛋白和不参与所述第一融合体的所述转录因子的或者DNA结合结构域或者活化结构域的第二融合体；通过检测在特定宿主细胞中报道基因产物的产生而检测在所述宿主细胞中αd结合蛋白与αd的结合；并从所述特定宿主细胞分离出编码αd结合蛋白的第二杂种DNA序列。
在利用所述断裂杂种测定的一个优选实施方案中，本发明提供αd蛋白或其片段和αd结合蛋白或其结合片段之间结合的抑制剂的鉴定方法，所述方法包括以下步骤(a)用第一DNA表达构成物转化或转染宿主细胞，所述第一DNA表达构成物包含一个编码第一选择标记蛋白的第一选择标记基因和一个编码阻抑蛋白的阻抑蛋白基因，所述阻抑蛋白基因处于一个启动子的控制之下；(b)用第二DNA表达构成物转化或转染所述宿主细胞，所述第二DNA表达构成物包含一个编码第二选择标记蛋白的第二选择标记基因和一个编码第三选择标记蛋白的第三选择标记基因，所述第三选择标记基因处于一个操纵基因的转录控制之下，所述操纵基因受所述阻抑蛋白的特异性影响，以使所述阻抑蛋白与所述操纵基因之间的相互作用减少所述第三选择标记蛋白的表达；(c)用第三DNA表达构成物转化或转染所述宿主细胞，所述第三DNA表达构成物包含一个编码第四选择标记蛋白的第四选择标记基因和一个编码与或者转录激活蛋白的DNA结合结构域或者所述转录激活蛋白的反式激活结构域符合读框地融合的αd蛋白或其片段的αd融合蛋白基因；(d)用第四DNA表达构成物转化或转染所述宿主细胞，所述第四DNA表达构成物包含一个编码第五选择标记蛋白的第五选择标记基因和一个第二融合蛋白基因，所述第二融合蛋白基因编码与未包括在第一融合蛋白基因内的或者所述转录激活蛋白的DNA结合结构域或者所述转录激活蛋白的反式激活结构域符合读框地融合的αd结合蛋白或其结合片段；(e)在允许所述αd蛋白或其片段以及所述αd结合蛋白或其片段表达的条件下培养所述宿主细胞，以使所述αd蛋白或其片段和αd结合蛋白或其结合片段相互作用，引起靠近，导致所述DNA结合结构域和所述反式激活结构域重建所述转录激活蛋白；所述转录激活蛋白作用于所述启动子，以增加所述阻抑蛋白的表达；所述阻抑蛋白与所述操纵基因相互作用，以使所述第三选择标记蛋白不表达；(f)检测所述选择标记基因表达的缺乏；(g)在所述αd蛋白或其片段和所述αd结合蛋白或其片段之间结合的试验抑制剂存在下培养所述宿主细胞；和(h)比较在存在或缺乏所述试验抑制剂的情况下所述选择标记蛋白的表达，其中所述选择标记蛋白表达的降低表明所述试验抑制剂能够抑制所述αd蛋白或其片段和所述αd结合蛋白或其结合片段之间的结合，以使所述转录激活蛋白不重建，不增加所述阻抑蛋白的表达，因此所述操纵基因增加所述选择标记蛋白的表达。
本发明包括其中所述各种基因和调节序列在单一DNA分子上编码的宿主细胞；以及其中所述阻抑蛋白基因、所述选择标记基因、所述αd融合蛋白基因和所述αd结合蛋白基因中的一个或多个在不同DNA表达构成物上编码的宿主细胞。在一个优选实施方案中，用分别在不同表达构成物上编码的编码所述阻抑蛋白基因、所述选择标记基因、所述αd融合蛋白基因和所述αd融合结合蛋白基因的DNA转化或转染所述宿主细胞。无论所引入的DNA表达构成物的数目有多少，每种转化或转染的DNA表达构成物还包括一个选择标记基因序列，所述选择标记基因序列的表达用来确证事实上实现了转染或转化。在各个转化或转染的DNA表达构成物上编码的选择标记基因与在tet操纵基因转录调节下的所述选择标记的不同之处在于由tet操纵基因调节的选择标记基因的表达是所述优选实施方案的中心；即tet操纵基因对所述选择标记基因的调节表达提供了在所述宿主细胞中用来鉴定结合蛋白抑制剂可测量的表型变化。在各个转化或转染的DNA表达构成物上编码的选择标记基因作为所述各个DNA表达构成物成功转染或转化的决定因子提供。本发明的优选宿主细胞包括命名为YI596和YI584的转化酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株，所述菌株于1996年8月13日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，保藏号分别为ATCC 74384和ATCC74385。
本发明的宿主细胞包括能够表达根据以上所述所要求的αd和αd结合蛋白、并且能够用描述的调节所述异源蛋白表达的功能启动子和操纵基因序列转化或转染的任何细胞类型。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞来源于或者哺乳动物、昆虫或者酵母。目前，最优选的宿主细胞是酵母细胞。本发明的优选宿主细胞可以选自各种菌株，包括描述于表1中的酿酒酵母转化体。可选择的酵母样本包括S.pombe、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、卡尔酵母(S.carlsbergensis)和白假丝酵母(C.albicans)。本发明的优选宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、HeLa、3T3、CV1、LTK、293T3、Rat1、PC12细胞系或任何其它可转染的人类来源或啮齿动物来源的细胞系。优选的昆虫细胞系包括SF9细胞。
在一个优选实施方案中，所选择标记基因由操纵基因的调节，并且编码所述宿主细胞营养需求合成途径中的酶，以使所述选择标记蛋白的表达为所述宿主细胞在缺乏所述营养需求的培养基上的生长所需。因此，同在阻抑蛋白与所述操纵基因相互作用的一个优选实施方案中一样，所述选择标记基因的转录被向下调节，并且根据不能在缺乏所述营养需求的培养基上生长以及能够在含有所述营养需求的培养基上生长，鉴定出所述宿主细胞。在一个最优选的实施方案中，所述选择标记基因编码HIS3蛋白，并且在存在和缺乏组氨酸的培养基上培养后，选择出用HIS3编码DNA表达构成物转化或转染的宿主细胞。然而，本发明包括许多受操纵基因调节的可选择的选择标记基因中的任一种。其它可利用的基因包括例如URA3、LEU2、LYS2或可以确定地从所述生长培养基中排除的营养需求的各种生产途径中所需的多种酶中的任一种的编码基因。另外，常规的报道基因例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤火虫萤光素酶、β-半乳糖苷酶(β-gal)、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、绿荧光蛋白(GFP)、人生长激素(hGH)、β-葡糖醛酸糖苷酶、新霉素、潮霉素、胸苷激酶(TK)等可以用于本发明。
在所述优选实施方案中，所述宿主细胞包括一个阻抑蛋白基因，所述阻抑蛋白基因编码作用于tet操纵基因以降低所述选择标记基因表达的四环素抗性蛋白。然而，本发明也包括所述tet阻抑蛋白和操纵基因的替代物，例如大肠杆菌trp阻抑蛋白和操纵基因、his阻抑蛋白和操纵基因以及lac操纵子阻抑蛋白和操纵基因。
所述融合蛋白的DNA结合结构域和反式激活结构域可以来源于同一转录因子或不同转录因子，只要通过αd和αd结合蛋白之间相互作用导致的所述两种结构域接近，允许形成以高效率增加所述阻抑蛋白表达的功能性转录激活蛋白。高效率转录激活蛋白被定义为既具有一个表现出对所识别的启动子序列的高亲和性结合的DNA结合结构域，又具有一个对表达阻抑蛋白基因mRNA所需的转录机器蛋白具有高亲和结合的反式激活结构域。本发明融合蛋白的DNA结合结构域可以得自多种不同蛋白中的任一种，包括例如LexA或Gal4。同样，本发明的融合蛋白的反式激活组分可以得自多种不同的转录激活蛋白，包括例如Gal4或VP16。
本发明的调节所述阻抑蛋白转录的启动子序列可以是能够在选定宿主细胞中驱动转录的任何序列。所述启动子可以是被本发明的选定DNA结合结构域特异性识别的DNA序列、或是所述融合蛋白的DNA结合结构域能够与之高亲和性相互作用的任何其它DNA序列。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的启动子序列或者是HIS3启动子或者是乙醇脱氢酶(ADH)启动子。在本发明的一个最优选的实施方案中，在本发明中使用ADH启动子。然而，本发明包括多种可选择的启动子，包括例如得自编码HIS3、ADH、URA3、LEU2等的那些启动子。
本发明的方法包括如上所述的宿主细胞中的任何或所有变化。特别是，本发明包括这样一种方法，其中所述宿主细胞是酵母细菌；所述选择标记基因编码HIS3；所述选择标记基因的转录受tet操纵基因调节；所述阻抑蛋白基因编码四环素抗性蛋白；所述四环素抗性蛋白的转录受HIS3启动子调节；所述DNA结合结构域得自LexA；并且所述反式激活结构域得自VP16。在另一实施方案中，本发明包括一种方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞；所述选择标记基因编码HIS3；所述选择标记基因的转录受tet操纵基因调节；所述阻抑蛋白基因编码四环素抗性蛋白；所述四环素抗性蛋白的转录受乙醇脱氢酶启动子的调节；所述DNA结合结构域得自LexA；并且所述反式激活结构域得自VP16。
在其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞的本发明可选择的实施方案中，变化包括应用哺乳动物DNA表达构成物来编码所述αd和αd结合融合基因、所述阻抑蛋白基因和所述选择标记基因，并且应用编码抗生素或抗药性标记(即新霉素、潮霉素、胸苷激酶)的选择标记基因。
有至少三种不同类型的文库可用于鉴定小分子调节剂。这些包括(1)化学文库，(2)天然产物文库，和(3)包括随机肽、寡核苷酸或有机分子的组合文库。
化学文库包括已知化合物的结构类似物或通过天然产物筛选鉴定为“命中(hit)”的化合物。天然产物文库是可以用来通过以下方法产生筛选混合物的微生物、动物、植物或海洋生物的集合体，所述方法为(1)来自土壤、植物或海洋微生物的肉汤发酵和提取或(2)植物或海洋生物的提取。组合文库由作为混合物的大量肽、寡核苷酸或有机化合物组成。通过传统的自动合成方法、PCR、克隆或专利合成方法，相对容易地制备它们。特别值得关注的是肽和寡核苷酸组合文库。其它值得关注的文库包括肽文库、蛋白文库、肽模拟物(peptidomimetic)文库、多个平行的合成集合文库、重组文库和多肽文库。
本发明也包括产生αd特异性抗体的杂交瘤细胞系。用于产生分泌单克隆抗体的杂交瘤技术是本领域众所周知的。在用纯化的αd、αd的变体或在胞外膜表面上表达αd或其变体的细胞免疫动物后，可以产生杂交瘤细胞系。免疫原细胞类型包括体内表达αd的细胞、转染的通常不体内表达αd的原核或真核细胞系。本发明目前优选的抗体由名为以下的杂交瘤分泌169A、169B、170D、170F、170E、170X、170H、188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R、188T、195A、195C、195D、195E、195H、197A-1、197A-2、197A-3、197A-4、199A、199H、199M、205A、205C、205E、212A、212D、217G、217H、217I、217K、217L、217M、226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H、226I、236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、237L、236M、240F、240G、240H和236L。
通过公开αd的DNA序列和氨基酸序列而贡献的信息的价值是明显的。在一个系列的实施例中，所公开的αdcDNA序列使得有可能分离出人αd基因组DNA序列，包括所述基因组序列的转录控制元件。也包括αd等位基因变体和异源物种(例如大鼠或小鼠)DNA的鉴定。通过标准DNA/DNA杂交技术，在合适的严格条件下，采用全部或部分所述αdcDNA序列作为探针筛选合适的文库，可以完成人αd基因组DNA和异源物种DNA的分离。或者，采用基于所述已知cDNA序列设计的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应(PCR)，可以用来扩增和鉴定基因组αdDNA序列。编码αd多肽的合成DNA包括其片段和其它变体，可以通过常规合成方法来产生。
本发明的DNA序列信息也使得有可能通过同源重组或“剔除(knockout)”策略[参见例如Kapecchi，Science 2441288-1292(1989)]发展产生不能表达功能性αd多肽或表达变异αd多肽的啮齿动物。这样的啮齿动物可用作研究αd和αd调节剂体内活性的模型。
本发明的DNA序列和氨基酸序列也使得有可能分析积极参与反受体结合的表位以及可能调节结合而不是积极参与结合的表位。本发明也包括可能参与跨膜信号转导的表位的鉴定。
本发明的DNA也可用来表达αd多肽的细胞类型。利用αdDNA检测αdRNA的标准DNA/RNA杂交技术可以用来测定细胞内αd转录的组成型水平以及对内部或外部因子应答的转录水平改变。修饰αd转录和/或翻译的因子的鉴定也可以评估潜在的治疗价值或预防价值。本发明的DNA也使得有可能进行αdDNA与细胞RNA的原位杂交，以测定复杂细胞群体和组织内的αd特异性信息的细胞定位。
本发明的DNA也可用来鉴定表现出与人αd序列的同源性的非人类多核苷酸序列。拥有非人类αdDNA序列允许开发所述人系统的动物模型(包括例如转基因模型)。
作为本发明的另一方面，αd的特异性单克隆抗体或多克隆抗体可以用于免疫组织化学分析，以将αd定位至亚细胞区室或组织内的单个细胞。当与原位杂交以将αdmRNA和所述基因的αd多肽产物定位时，这种类型免疫组织化学分析特别有用。
表达αd的细胞类型的鉴定可能具有重要性的结果，用于研制治疗剂和预防剂。预期本发明涉及αd的产物可以用于治疗其中巨噬细胞是病程的基本因素的疾病。本领域已经描述了用于与巨噬细胞活性相关的许多病理病症的动物模型。例如，Jutila等，J.Leukocyte Biol.5430-39(1993)报道了在小鼠中神经细胞募集至慢性炎症和急性炎症位点。Adams等[Transplantation 531115-1119(1992)和Transplantation 56794-799(1993)]描述了，在大鼠中用于在异向腹部心脏同种移植后移植移植物动脉粥样硬化的模型。Rosenfeld等[Arteriosclerosis 79-23(1987)和Arteriosclerosis 724-34(1987)]描述了在喂食胆固醇补充饮食的兔中诱发的动脉粥样硬化。Hanenberg等[Diabetologia 32126-134(1989)]报道了在BB大鼠中自发发生的依赖胰岛素的糖尿病。Yamada等[Gastroenterology 104759-771(1993)]描述了在注射链球菌肽聚糖-多糖聚合物后在大鼠中的诱发的炎性肠病、慢性肉芽肿性结肠炎。Cromartie等[J.Exp.Med.1461585-1602(1977)]和Schwab等[Infection and Immunity 594436-4442(1991]报道了将链球菌细胞壁蛋白注射到大鼠中，导致特征为外周关节炎症和随后的关节破坏的关节炎。最后，Huitinga等[Eur.J.Immunol.23709-715(1993)]描述了Lewis大鼠中的试验性变应性脑脊髓炎，这是一种多发性硬化的模型。在这些模型的每个模型中，αd抗体、其它αd结合蛋白或可溶形式αd用来减轻所述疾病状态，推定是通过使巨噬细胞活性失活起作用。
本发明提供用于治疗这些和其它疾病状态的药用组合物。药用组合物设计用于抑制αd及其配体之间的相互作用，包括各种可溶形式和膜结合形式的αd(包括完整的αd多肽或积极参与αd结合的其片段)、可溶形式和膜结合形式的αd结合蛋白(包括抗体、配体等)、αd结合活性的胞内或胞外调节剂、和/或αd和/或αd配体多肽表达的调节剂，包括转录、翻译、翻译后加工和/或胞内转运的调节剂。
本发明也包括用于其中涉及αd结合或表达αd的细胞的局部积累的疾病状态的治疗方法，其中为患有所述疾病状态的患者提供本发明的药用组合物，所述药用组合物的量足以调节αd结合水平或调节表达αd的细胞类型的积累。本发明的治疗方法适用于多种疾病状态，例如但不限于I型糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化、哮喘、银屑病、肺炎、急性呼吸窘迫综合征和类风湿性关节炎。
本发明也提供在中枢神经系统损伤部分抑制巨噬细胞浸润的方法，所述方法包括给予个体有效量的抗αd单克隆抗体。一方面，所述方法包括应用阻断αd和结合配偶体之间结合的抗αd单克隆抗体。在一个实施方案中，所述结合配偶体是VCAM-1。在一个优选实施方案中，所述抗αd单克隆抗体选自杂交瘤226H分泌的单克隆抗体和杂交瘤236L分泌的单克隆抗体。在一个最优选的实施方案中，本发明的方法用于为脊髓损伤的中枢神经系统损伤。
本发明还提供用于减轻中枢神经系统损伤部分炎症的方法，所述方法包括给予个体有效量的抗αd单克隆抗体。一方面，所述方法包括应用阻断αd和结合配偶体之间结合的抗αd单克隆抗体。在一个实施方案中，所述结合配偶体是VCAM-1。在一个优选实施方案中，所述抗αd单克隆抗体选自杂交瘤226H分泌的单克隆抗体和杂交瘤236L分泌的单克隆抗体。在一个最优选的实施方案中，本发明的方法用于为脊髓损伤的中枢神经系统损伤。
根据布达佩斯条约的条款，杂交瘤226H和236L于1998年11月19日由美国典型培养物保藏中心(10801 University Boulevard，Masassas，VA 20110-2209)接受，保藏号分别为HB 12592和HB12593。
本发明也提供用于调节来自巨噬细胞或脾吞噬细胞的TNFα释放的方法，所述方法包括给予个体有效量的免疫特异性抗αd单克隆抗体。在一个优选方面，本发明的方法包括抑制TNFα释放的抗单克隆抗体。在一个优选实施方案中，本发明的方法包括应用选自杂交瘤205C分泌的单克隆抗体和杂交瘤205E分泌的单克隆抗体的免疫特异性抗αd单克隆抗体。
设想了多种本发明的方法，其中有用的抗体包括抗αd单克隆抗体的片段，包括例如Fab片段或F(ab’)2片段。本发明也包括利用修饰抗体的方法，修饰的抗体包括例如单链抗体、嵌合抗体和CDR移植抗体，包括包含特异性地识别本发明多肽的CDR序列的化合物、以及人源化抗体。也设想了包括应用人抗体的方法。以下公开了鉴定和分离人抗体的技术。
本发明也提供用于抑制中枢神经系统损伤部分巨噬细胞浸润的方法，所述方法包括给予个体有效量的抑制αd结合的小分子。特别是，本发明的方法包括为脊髓损伤的中枢神经系统损伤。从以上讨论的文库分离出对αd结合特异性的小分子。
本发明还提供减轻中枢神经系统损伤部位炎症的方法，所述方法包括给予个体有效量的抑制αd结合的小分子。特别是，本发明的方法包括为脊髓损伤的中枢神经系统损伤。从以上讨论的文库分离出对αd结合特异性的小分子。
本发明还包括检测和诊断局限性回肠炎的方法，所述方法包括以下步骤从患者获得组织样品；用抗αd单克隆抗体将所述样品染色；并将所述染色图型与得自已知正常供体的组织上的染色图型比较。在可以检测到所述两种组织样品之间染色差异的情况下，可以进一步测试所述患者以确诊可能的局限性回肠炎。
本发明也设想了应用αd作为除去在细胞表面上表达αd的致病细胞群体的靶。一方面，克隆单克隆抗体的高变区并将其在补体结合性人同种型的邻近序列(context)中表达。以该方式克隆高变区将提供αd的结合配偶体，该结合配偶体在体内结合时，将导致补体结合和随后的细胞死亡。或者，将所述抗αd单克隆抗体缀合于细胞毒性化合物，所述抗体与致病细胞类型上的αd结合导致细胞死亡。
附图简述参考附图并考虑以下其描述，本发明的许多其它方面和优点是显而易见的，在附图中

图1A至1D包括CD11b(SEQ ID NO3)、CD11c(SEQ ID NO4)和αd(SEQ ID NO2)的人类氨基酸序列的序列对比。
发明详述通过以下实施例描述本发明，所述实施例涉及从人脾cDNA文库分离编码αd的cDNA。更具体地讲，实施例1描述了应用抗犬αTM1抗体来尝试检测同源的人蛋白。实施例2详细描述了犬αTM1的纯化和所述多肽的N末端测序，以设计用于PCR扩增犬αTM1基因的寡核苷酸引物。实施例3说明了犬αTM1的大规模纯化，用于内部测序以便设计其它PCR引物。实施例4描述了应用PCR和内部序列引物以扩增犬αTM1基因的片段。实施例5描述了人αd编码cDNA序列的克隆。实施例6描述了对人组织和细胞进行蛋白质印迹分析，以分析αdmRNA的表达。实施例7详细描述了人αd表达质粒的构建以及用所产生的质粒转染COS细胞。实施例8说明了在转染的COS细胞中αd表达的ELISA分析。实施例9描述了用人αd表达质粒转染的COS细胞的FACS分析。实施例10说明了在共转染的COS细胞中CD18结合αd的免疫沉淀。实施例11涉及αd表达构成物在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定转染。实施例12说明了依赖于CD18的αd与胞间粘着分子ICAM-R、ICAM-R突变蛋白以及补体因子(complement fact)iC3b的结合。实施例13描述了用于鉴定αd配体/抗配体结合相互作用的抑制剂或增强剂(即调节剂)的闪烁亲近筛选测定。实施例14说明了编码可溶形式αd的表达质粒的构建、以及所述表达产物的结合分析。实施例15涉及αd特异性多克隆血清和单克隆抗体的产生。实施例16描述了采用αd单克隆抗体的流式细胞术分析。实施例17说明了αd在人单核细胞上的表达。实施例18描述了αd组织分布的分析、在外周血白细胞上αd的表达的分析、用抗αd多克隆血清分析在炎性和非炎性合胞体中的表达、在来自乳腺癌患者的患病肺和肝、人骨髓和PBMC中的表达的分析。实施例19说明了体外和体内表达的正调节。实施例20描述了表现出与人αd基因序列同源的大鼠cDNA序列的分离。实施例21说明了大鼠αdmRNA的组织特异性表达。实施例22涉及全长大鼠αd表达质粒、包括I结构域/IgG融合蛋白的大鼠αdI结构域表达质粒的构建、针对全长和I结构域融合蛋白的单克隆抗体的产生、以及针对融合于人IgG4的大鼠αdI结构域序列的多克隆抗血清的产生。实施例23描述了单克隆抗体199M的特异性。实施例24叙述了采用表达大鼠αd的巨噬细胞的T细胞增殖测定的结果。实施例25描述了来自骨髓的大鼠αd的免疫沉淀。实施例26描述了在各种动物模型中大鼠αd的表达。实施例27涉及采用αd单克隆抗体抑制NK-肿瘤细胞诱发的靶细胞裂解的分析。实施例28说明了表现出与人αd基因序列同源的小鼠cDNA序列的分离。实施例29描述了用来证实序列分析的另外的小鼠αdcDNA克隆的分离。实施例30涉及各种小鼠组织的原位杂交分析，以测定人αd的推定小鼠同系物的组织和细胞特异性表达。实施例31描述了编码人αd推定的小鼠同系物的表达构成物的产生。实施例32说明了“剔除”小鼠的设计，其中编码所述人αd推定的小鼠同系物的基因被破坏。实施例33描述了表现出与人αd编码序列同源的兔cDNA克隆的分离。实施例34描述了猴αd的分离。实施例35涉及由单克隆抗体217L识别的抗原的鉴定。实施例36描述了人疾病状态的动物模型，其中分析对αd调节的治疗能力。实施例37描述了在动物模型疾病状态中αd的表达。实施例38说明了αd在脊髓损伤中的作用。实施例39描述了在局限性回肠炎中αd的表达。实施例40涉及来自表达αd的大鼠脾细胞的TNF释放。实施例41涉及采用αd单克隆抗体调节来自脾细胞的TNFα释放的方法。实施例42表征了嗜酸性粒细胞上αd的表达。实施例43涉及αd与VCAM-1结合的进一步表征。实施例44描述了应用αd作为去除致病性细胞群体的靶。
实施例1尝试检测犬αTM1的人同系物在一项鉴定犬αTM1的人同系物的尝试中，测试对犬αTM1特异性的单克隆抗体Ca11.8H2[Moore等，参见上文]在人外周血白细胞上的交叉反应性。在0.1％叠氮化钠存在下，细胞制备物(通常为1×106细胞)与未稀释的杂交瘤上清液或纯化的小鼠IgG阴性对照抗体(10μg/ml)在冰上温育。通过随后与6μg/ml FITC-缀合的马抗小鼠IgG(VectorLaboratories，Burlingame，CA)温育，检测单克隆抗体的结合。用2％w/v低聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液(PBS)固定染色的细胞，并用Facstar Plus荧光激活细胞分类器(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析。通常，用荧光强度的对数放大倍数(logarithmic amplification)分析10,000个细胞。
结果表明，Ca11.8H2不与人外周血白细胞上表达的表面蛋白交叉反应，而对照细胞肿瘤性犬外周血淋巴细胞基本上全部是αTM1阳性。
因为对犬α亚基特异性的单克隆抗体Ca11.8H2不与人同系物交叉反应，如果存在对应的人基因，则认为分离犬αTM1DNA是分离对应的人基因(如果存在的话)的必要先决条件。
实施例2亲和纯化犬αTM1用于N末端测序亲和纯化犬αTM1以测定N末端氨基酸序列，用于寡核苷酸探针/引物的设计。简而言之，将抗αTM1单克隆抗体Ca11.8H2与Affigel10层析树脂(BioRad，Hercules，CA)偶联，通过特异性抗体-蛋白相互作用分离蛋白。按照BioRad建议的方案，以大约5mg抗体/ml树脂的浓度将抗体缀合于所述树脂。在缀合反应后，除去过量的抗体，用三倍体积的0.1M乙醇胺封闭树脂。然后用30倍柱体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤树脂。
从单个狗脾取25克在含有0.32M蔗糖与蛋白酶抑制剂的250ml25mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液中将23克单个狗脾匀浆。以1000g离心15分钟沉淀核酸和细胞碎片。以100,000g离心30分钟，从上清液中沉淀膜。将膜沉淀重新悬浮于200ml裂解缓冲液(50mM NaCl，50mM硼酸盐，pH 8.0和2％NP-40)中，在冰上孵育1小时。通过以100,000g离心60分钟沉淀不溶性物质。将10毫升已澄清的裂解液转移至具有0.5ml Ca11.8H2缀合的Affigel10树脂的15ml聚丙烯试管中。将试管于4℃在旋转下温育，随后用50倍柱体积的D-PBS洗涤树脂。然后将树脂转移至微量离心管，并在含有0.1M Tris-HCl，pH 6.8、2％SDS、20％甘油和0.002％溴酚蓝的1ml Laemmli(非还原性)样品缓冲液中煮沸10分钟。通过离心沉淀树脂并将其弃去；上清液用1/15倍体积的β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)处理，并在7％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。如下将分离的蛋白转移至Immobilon PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。
凝胶在去离子并且用Millipore-过滤的水中洗涤1次，在具有10％甲醇的10mM 3-[环己基氨基]-1-丙磺酸(CAPS)转移缓冲液pH 10.5中平衡10-45分钟。Immobilon膜用甲醇润湿，用过滤水冲洗，在CAPS转移缓冲液平衡15-30分钟。初始转移采用BioRad转移装置以70伏进行3小时。在转移后取出Immobilon膜，在过滤的0.1％R250考马斯染液中染色10分钟。在50％甲醇/10％乙酸中将膜脱色3次，每次l0分钟。脱色后，将膜在过滤水中洗涤并风干。
检测到约150kD、95kD、50kD和30kD的蛋白条带。推定50kD和30kD的条带产生于抗体污染。然后尝试在150kD和95kD条带上进行N末端测序，但将95kD蛋白封闭，阻止测序。从膜上切下150kD的蛋白条带，用Applied Biosystems(Foster City，CA)473型蛋白测序仪，按照生产商的说明直接测序。所产生的氨基酸序列叙述于SEQ ID NO5中，采用单字母氨基酸命名。
FNLDVEEPMVFQ(SEQ ID NO5)所述鉴定的序列包括整联蛋白家族α亚基特征性的FNLD序列[Tamura等，J.Cell Biol.1111593-1604(1990)]。引物设计和尝试扩增犬αTM1序列根据所述N末端序列信息，设计三种寡核苷酸探针用于杂交a)“Tommer”，一种全简并的寡核苷酸；b)“Patmer”，一种部分简并寡核苷酸；和c)“Guessmer”，一种基于哺乳动物密码子选择的非简并寡核苷酸。这些探针在以下分别叙述为SEQ ID NO6、7和8。核酸符号根据37 C.F.R.§1.882，用于这些核苷酸序列和本文所用的其它核苷酸序列。5′-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3′(SEQ ID NO6)5′-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3′(SEQ ID NO7)5′-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3′(SEQ ID NO8)根据序列分析数据，在与克隆到λZAP(Stratagene，La Jolla，CA)中的犬脾/外周血巨噬细胞cDNA克隆文库的几种低严格性杂交中，采用这些寡核苷酸没有检测出相关克隆。
随后根据推导的N末端序列设计了四种其它寡核苷酸引物，命名为5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec(分别叙述于SEQ ID NO9、10、11和12中，其中Deg表示简并，而Spec表示非简并)，用于通过PCR从纯化自上述Stratagene文库的平板裂解液的噬菌体文库DNA中扩增犬αTM1序列。5′-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3′ (SEQ ID NO9)5′-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3′ (SEQ ID NO10)5′-TGRAANACCATNGGYTC-3′ (SEQ ID NO11)5′-TTGGAAGACCATNGGYTC-3′(SEQ ID NO12)所述寡核苷酸引物与分别在SEQ ID NO13和14中叙述的T3或T7载体引物配对，所述T3或T7载体引物杂交于在λZAP发现的邻接Bluescript噬菌粒中多接头区的序列。5′-ATTAACCCTCACTAAAG-3′ (SEQ ID NO13)5′-AATACGACTCACTATAG-3′ (SEQ ID NO14)在含有镁和150ng文库DNA、每种引物各1μg、200μM dNTPs和2.5单位Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的Taq缓冲液(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)中进行所述PCR扩增，产物通过在1％琼脂糖凝胶上，在含有0.25μg/ml溴化乙锭的Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液进行分离。通过在10XSSPE中吸印(wicking)，将DNA转移至Hybond(Amersham，Arlington Heights，IL)膜上。转移后，用0.5MNaOH与0.6M NaCl将固定的DNA变性，用1.0M Tris-HCl，pH 8.0的1.5M NaCl溶液中和，用2X SSPE洗涤，然后用Stratalinker(Stratagene)交联装置进行UV交联。将膜在预杂交缓冲液(5X SSPE，4XDenhardts，0.8％SDS，30％甲酰胺)中于50℃搅拌下温育2小时。
采用具有100-300μCiγP32-dATP和1-3单位多核苷酸激酶的Boehringer Mannheim激酶缓冲液，将寡核苷酸探针5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec(分别为SEQ ID NO9、10、11和12)于37℃标记1-3小时。用SephadexG-25 fine(Pharmacia，Piscataway，NJ)层析，采用10mM Tris-HCl，pH 8.0、1mM EDTA(TE)缓冲液除去未掺入的标记，将流过物(flow-through)直接加入预杂交溶液中。在搅拌下于42℃探测所述膜16小时并且重复洗涤，于50℃下用1X SSPE/0.1％SDS进行15分钟的最终严格性洗涤。然后将所述印迹于-80℃曝光于KodakX-Omat AR胶片1-4小时。
寡核苷酸探针5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec仅杂交于来自其中将其用作引物的反应的PCR产物，而不能如预期地杂交于来自将其不用作引物的反应的PCR产物。因此，推断所述PCR产物中没有一种是αTM1特异性的，因为没有一种产物与所有所述合适探针杂交。
实施例3大规模亲和纯化犬αTM1用于内部测序为了提供另外的氨基酸序列用于引物设计，纯化犬αTM1用于内部测序。用来自成年狗的三个冷冻脾切片(每个约50g)和两个部分脾的冷冻细胞来产生用于内部测序的蛋白。50克脾在200-300ml硼酸缓冲液中用韦林氏搅切机匀浆。匀浆材料用1倍体积的含4％NP-40的缓冲液稀释，然后温和搅拌所述混合物至少1小时。通过以2000g离心20分钟除去所产生的裂解液中的大碎片，然后通过或者Corning(Corning，NY)预过滤器或Corning 0.8微米滤器过滤。裂解液通过Corning 0.4微米滤器系统进一步澄清。
脾裂解液和实施例2中描述的抗体缀合的Affigel10树脂以150∶1的体积比混合于100ml的等份，并于4℃震摇过夜。以1000g离心5分钟取出裂解液，与更多的抗体缀合的Affigel10树脂混合并如上所述温育过夜。然后混合吸附的树脂等分样品，并用50倍体积的D-PBS/0.1％Twee20洗涤，将树脂转移至50ml BioRad柱。用3-5倍体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)从树脂上洗脱出吸附的蛋白；收集约900μl的流分，并用100μl 1M Tris缓冲液pH 8.0中和。将从每个流分取出15μl等分样品，在等体积的含有1/15体积1M二硫苏糖醇(DTT)的2X Laemmli样品缓冲液中煮沸。这些样品在8％Novex(SanDiego，CA)聚丙烯酰胺凝胶上电泳，或者用考马斯染色或者通过用Daiichi试剂盒(Enprotech，Natick，MA)按照生产商建议的方案进行银染来显现。混合含有最大量蛋白的流分并通过真空浓缩。剩余的溶液用还原性Laemmli样品缓冲液以50％稀释，并在1.5mm 7％聚丙烯酰胺凝胶上在Tris-甘氨酸/SDS缓冲液中电泳。采用实施例2中描述的方法，用Hoefer转移装置将蛋白从凝胶转移至Immobilon膜上。
将对应于犬αTM1的蛋白条带从10张PVDF膜上切下，产生约47μg总蛋白。将所述条带在4ml 50％甲醇中脱色5分钟，风干并切成1×2mm的小片。于4℃间歇涡旋搅拌下，将膜片浸入2ml 95％丙酮中30分钟，然后风干。
在蛋白水解酶切膜结合的蛋白之前，将3ml溴化氰(CNBr)(Pierce，Rockford，IL)溶于1.25ml 70％甲酸中。然后将该溶液加入含有PVDF膜片的试管中，将试管在黑暗中室温下温育24小时。然后将上清液(S1)移至另一试管，膜片用0.25ml 70％甲酸洗涤。取出该上清液(S2)，将其加入先前的上清液(S1)中。将2毫升Milli Q水加入混合的上清液(S1和S2)中并将溶液冻干。PVDF膜片在氮气下干燥，用1.25ml 60％乙腈、0.1％四氟乙酸(TFA)于42℃再提取17小时。取出该上清液(S3)，用1.0ml 80％乙腈与0.08％TFA于42℃再提取所述膜片1小时。将该上清液(S4)与先前的上清液(S1、S2和S3)混合并真空干燥。
然后将干燥的CNBr片段溶于63μl 8M尿素、0.4M NH4HCO3中。所述片段在5μl 45mM二硫苏糖醇(DTT)中还原，随后于50℃温育15分钟。然后将溶液冷却至室温，通过加入5μl 100mM碘乙酰胺(Sigma，St.Louis，MO)将片段烷基化。在室温温育15分钟后，样品用187μl Milli Q水稀释至尿素终浓度为2.0M。然后以1∶25(w∶w)的酶与蛋白之比加入胰蛋白酶(Worthington，Freehold，NJ)，将蛋白于37℃消化24小时。通过加入30μl TFA终止消化。
然后用高效液相色谱(HPLC)在Waters 625 LC系统(Millipore，Milford，MA)上，采用在0.05％TFA和HPLC水(缓冲液A)中平衡的2.1×250mm、5微米Vydac C-18柱(Vydac，Hesperia，CA)分离所述蛋白片段。通过不断增加80％乙腈的0.04％TFA溶液(缓冲液B)的浓度，以38-75％缓冲液B的梯度洗脱65-95分钟，用75-98％缓冲液B的梯度洗脱95-105分钟，将肽洗脱出。以0.2ml/分钟的流速分部收集肽流分，并于210nm下检测。
在分部收集后，通过在Applied Biosystems 437A型蛋白测序仪上进行的自动Edman降解法，采用生产商的标准循环和610A型数据分析软件程序1.2.1版本，分析所述肽的氨基酸序列。所有的测序试剂均由Applied Biosystems供应。以下叙述了所述8个内部片段中的7个片段的氨基酸序列，其中“X”表示未确定所述氨基酸的身份。VFQEXGAGFGQ (SEQ ID NO15)LYDXVAATGLXQPI (SEQ ID NO16)PLEYXDVIPQAE (SEQ ID NO17)FQEGFSXVLX (SEQ ID NO18)TSPTFIXMSQENVD (SEQ ID NO19)LVVGAPLEVVAVXQTGR(SEQ ID NO20)LDXKPXDTA(SEQ ID NO21)引物设计然后用获得的一个内部氨基酸序列(在SEQ ID NO22中叙述)来设计全简并寡核苷酸引物，命名为SEQ ID NO23中叙述的p4(R)。FGEQFSE (SEQ ID NO22)5′-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3′(SEQ ID NO23)实施例4犬αTM1片段的PCR克隆通过PCR，从双链犬脾cDNA中扩增犬αTM1基因的5’部分。双链犬脾cDNA的产生于干冰上在液氮中研磨年轻狗脾的1克冷冻材料，并在20mlRNA-Stat 60缓冲液(Tel-Test B，Inc，Friendswood，TX)中匀浆。加入4ml氯仿，通过以12,000g离心15分钟提取溶液。用10ml乙醇从水层中沉淀RNA。然后在Dynal寡聚dT Dynabeads(Dynal，Oslo，挪威)上选择poly A+RNA。混合5等份的100μg总RNA并用等体积的2X结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，1.0M LiCl，1mM EDTA，0.1％SDS)稀释。然后将RNA与寡聚dT Dynabeads(对于所有均为1.0ml或5mg珠粒)一起温育5分钟。用含有10mM Tris-HCl，pH 7.5、0.15M LiCl、1mM EDTA和0.1％SDS的缓冲液，按照生产商建议的方案洗涤珠粒，然后用2mM EDTA pH 7.5洗脱poly A+mRNA。然后采用洗脱的poly A+mRNA和Boehringer Mannheim cDNA合成试剂盒，按照生产商建议的方案，产生双链cDNA。部分犬αTM1cDNA的分离寡核苷酸引物5’Deg(SEQ ID NO9)和p4(R)(SEQ ID NO23)用于标准PCR反应中，该PCR反应采用150ng双链cDNA、每种引物各500ng、200μM dNTPs和1.5单位Taq聚合酶(BoehringerMannheim)的具有镁的Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)。所产生的产物(1μl原始反应物)用相同的引物进行第二轮PCR，以增加产物收率。从Schleicher和Schuell(Keene，NH)NA45纸上的1％琼脂糖凝胶上，在含有10mM Tris-HCl，pH 8、1mM EDTA、1.5M NaCl的缓冲液于65℃洗脱该条带，将其沉淀，并采用TA克隆试剂盒(Invitrogen)和生产商建议的方案，将其连接到pCRtmII载体(Invireogen，San Diego，CA)中。连接混合物通过电穿孔进入XL-1 Blue细菌(Stratagene)中进行转化。确定一个克隆2.7含有对应于未用于所述引物设计中的αTM1肽序列的序列。
用Applied Biosystems 373A DNA测序仪(Foster City，CA)，用染料脱氧终止循环测序试剂盒(ABI)，其中在非对称PCR反应中掺入荧光标记的dNTP[McCabe，“通过非对称PCR产生单链DNA”PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，Innis等(编辑)第76-83页Academic PressNew York(1990)]，如下进行测序。将样品于96℃保持4分钟，然后进行以下步骤序列的25个循环96℃15秒；50℃1秒；60℃4分钟。序列数据自动下载到计算机的样品文件中，包括色谱图和文本文件。克隆2.7的完整插入片段的序列叙述于SEQID NO24中。
从Stratagene文库(如实施例2中所述)分离全长犬αTM1cDNA的工作未成功。通过采用30％甲酰胺并用克隆2.7作为探针，在低严格条件下进行杂交，筛选了约1×106个噬斑，但未产生阳性克隆。采用得自克隆2.7的特异性寡核苷酸或简并引物与基于保守α亚基氨基酸基序GFFKR[Tamura等，参见上文]的简并寡核苷酸成对使用，扩增克隆2.7中存在的序列下游的相关序列的工作也未成功，其中所述简并引物基于来自与其它肽片段的氨基酸序列。
实施例5犬αTM1的推定人同系物的克隆为了试图分离犬αTM1的人序列同系物，用来自克隆2.7的约1kb犬αTM1片段作为探针。在实施例2中所述的条件下，用NT2(如SEQ IDNO25中所述)和p4(R)(SEQ ID NO23)作为引物，通过PCR产生所述探针。5′-GTNTTYCARGARGAYGG-3′ (SEQ ID NO25)用Qiagen(Chatsworth，GA)Quick Spin试剂盒和生产商建议的方案，纯化PCR产物。采用Boehringer Mannheim的随机引发标记试剂盒和生产商建议的方案，用200μCiα32PdCTP标记纯化的DNA(200ng)。用SephadexG25(细)重力层析除去未掺入的放射性同位素。在使用之前，探针用0.2N NaOH变性并用0.4M Tris-HCl，pH 8.0中和。
制备pCDNA/Amp(Invitrogen，San Diego，CA)中的人脾cDNA文库在Hybond滤膜(Amersham)上的菌落复制物。如实施例2所述最初将滤膜变性并中和，随后于50℃在温和搅拌下，在含有30％甲酰胺的预杂交溶液(8ml/滤膜)中温育2小时。将如上所述标记的探针加入该溶液中，并与滤膜一起于42℃温育14小时。滤膜在2X SSC/0.1％SDS中于37℃洗涤2次，在2X SSC/0.1％SDS中于50℃洗涤2次。最后的严格性洗涤是1X DDC/0.1％SDS；于65℃洗涤2次(1X SSC是150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)。将滤膜曝光于Kodak X-Omat AR胶片6小时，并使用增感屏。在双份的复制物上产生信号的菌落在含有镁的LB培养基(LBM)/羧苄青霉素平板上划线接种，并于37℃培养过夜。所产生的划线接种菌落用Hybond滤膜制备复制物，并如上所述测试这些复制物。滤膜在严格性更强的条件下与来自克隆2.7并如上所述标记的1kb探针在50％甲酰胺杂交溶液中于50℃杂交3小时。洗涤探测过的滤膜，用最终的严格性为0.1X SSC/0.1％SDS，65℃，并于-80℃使用增感屏曝光于Kodak X-Omat AR胶片。鉴定出阳性菌落，并将其在LBM/羧苄青霉素培养基上培养过夜。采用PromegaWizard小量制备试剂盒，按照生产商建议的方法制备来自所述培养物的DNA，并对所产生的DNA测序。
初始筛选产生18个阳性克隆，而在更严格的杂交条件下的第二次筛选产生一个阳性克隆，将其命名为19A2。人αd克隆19A2的DNA序列和推导的氨基酸序列分别叙述于SEQ ID NO1和2。人αdcDNA和预测的多肽的特征克隆19A2包括所述成熟蛋白的完整编码区，再加上5’上游信号序列的48个碱基(16个氨基酸残基)和在聚腺苷酸化序列中不终止的3’非翻译序列的241个碱基。所述成熟蛋白的核心分子量预测约为125kD。胞外结构域预测包括SEQ ID NO2的约氨基酸残基17至1108。该胞外区邻接与人CD11c跨膜区同源的20个氨基酸的区域(SEQ IDNO2的残基1109至1128)。胞质结构域包括约30个氨基酸(SEQ IDNO2的约残基1129至1161)。该蛋白也含有一个与I(插入)结构域同源的约202个氨基酸的区域(约残基150至352)，I结构域是CD11a、CD11b和CD11c[Larson和Springer，参见上文]、αE[Shaw等，J.Biol.Chem.2696016-6025(1994)]共有的，并且出现在VLA-1和VLA-2中[Tamura等，参见上文]。已经表明，其它整联蛋白中的I结构域参与ICAM结合[Landis等，J.Cell.Biol.1201519-1527(1993)；Diamond等，J.Cell.Biol.1201031-1043(1993)]，提示αd也可能结合表面分子ICAM家族的成员。尚未证明该区存在于任何其它整联蛋白亚基中。
αd的推定氨基酸序列表明与CD11a的序列同一性约为36％，与CD11b的序列同一性约为60％，而与CD11c的序列同一性约为66％。CD11b(SQE ID NO3)、CD11c(SEQ ID NO4)和αd(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的序列对比示于图1。
在同一物种中β2整联蛋白中α的胞质结构域通常相互不同，而各个α亚基表现出跨物种的高度同源性。与这些观察一致的是，除已经表明在所有α整联蛋白中保守的一个膜近侧GFFKR氨基酸序列[Rojiani等，Biochemistry 309859-9866(1991)]外，αd的胞质区明显不同于CD11a、CD11b和CD11c。由于整联蛋白的胞质尾区涉及“膜内侧翻外”信号和亲和力调节[Landis等，参见上文]，因此有可能αd与不同于与CD11a、CD11b和CD11c相互作用的的胞质分子相互作用，并因此参与不同于涉及其它β2整联蛋白的信号途径。
αd的胞外结构域含有一个与I结构域相邻的保守的DGSGS氨基酸序列；在CD11b中，DGSGS序列是一个配体相互作用所需的金属结合区[Michishita等，Cell 72857-867(1993)]。在CD11b和CD11c中的另外三个推定的阳离子结合位点在克隆19A2中的αd序列(SEQ IDNO1)的氨基酸465-474、518-527和592-600中是保守的。αdI结构域与CD11a、CD11b和CD11c中相应区分别有36％、62％和57％相同，在该区中的相对低的序列同源性提示，αd可能与不同于其它已知β2整联蛋白与之相互作用的蛋白的一组胞外蛋白相互作用。或者，αd对已知β2整联蛋白配体(例如ICAM-1、ICAM-2和/或ICAM-R)的亲和性可能不同于其它β2整联蛋白/ICAM相互作用所证明的亲和性[参见实施例12]。分离另外的人αdcDNA克隆用于序列证实为了证实编码人αd的DNA序列，通过杂交从pcDNA/Amp中的人脾脏寡聚dt引发的cDNA文库(Invitrogen)(描述于实施例5)分离出另外的人cDNA，起诉通过琼脂糖凝胶电泳对所述文库进行大小选择而选择长度大于3kb的cDNA。用于杂交的探针衍生自如下所述的αd的5’区。杂交条件与上述用于分离原始人αd克隆相同的条件，只是在杂交后，滤膜在2X SSC/0.1％SDS中于室温下洗涤2次，在2XSSC/0.1％SDS中于42℃洗涤1次。将滤膜过夜曝光于Kodak X-OmatAR胶片。
采用引物CD11c 5’For(SEQ ID NO94)和CD11c 5’Rev(SEQ IDNO95)，在以下条件下通过PCR从19A2克隆中产生5’αd杂交探针。样品于94℃保持4分钟，并在Perkin-Elmer 9600热循环仪中进行以下温度步骤顺序的30个循环i)94℃15秒；ii)5℃30秒；和iii)72℃1分钟。CD11c 5′For(5′)CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3′)(SEQ ID NO94)CD11c 5′Rev(5′)CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3′) (SEQ ID NO95)用BioRad(Hercules，CA)的Prep-A-Gene试剂盒，按照生产商建议的方案纯化扩增产物。所产生的5’αd探针长约720个碱基，对应于SEQ ID NO1中的核苷酸1121至核苷酸1839的区域。采用BoehringerMannheim(Indianapolis，Indiana)随机引物标记试剂盒，按照生产商建议的方法，用32P-dCTP标记纯化的DNA(约50ng)。采用Centrisep离心柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)，按照生产商建议的方案除去未掺入的放射性同位素。将标记的探针加入含有45％甲酰胺的预杂交溶液中的滤膜中，温育于50℃过夜。温育后，滤膜如上所述进行洗涤。
13个菌落在双份的复制物上产生信号。从主平板上挑出阳性菌落，在LBM和羧苄青霉素(100μg/ml)中稀释，并以不同的稀释液接种至Hybond(Amersham)滤膜上。双份的复制物与来自初次杂交的同一溶液杂交，杂交后滤膜以最终严格性2X SSC/0.1％SDS于42℃洗涤，并曝光于胶片。
在第二次筛选中证实了初始鉴定的13个阳性菌落中的10个菌落。在这10个克隆中，对两个克隆(命名为A7.Q和A8.Q)测序并确定它们编码人αd。发现克隆A7.Q长度约2.5kb，包括5’前导序列、部分编码区和一个额外的60个碱基的5’非翻译区。确定不完整的编码区产生于在SEQ ID NO1的相应核苷酸2152的异常剪接的内含子区。确定克隆A8.Q长度为4kb，跨越整个αd编码区，也包括一个位于SEQID NO1的对应碱基305的内含子序列。在与初始分离的αd克隆(SEQID NO1)的比较中，观察到的一个差异是，确定A7.Q和A8.Q克隆均具有一个发生在残基1495的三碱基CAG密码子插入。克隆A7.Q和A8.Q的序列分别叙述于SEQ ID NO96和97，得自克隆A7.Q和A8.Q的合成人序列及其对应的推定氨基酸序列分别叙述于SEQ ID NO98和99。
实施例6人组织中人αd的RNA印迹分析为了测定αd的相对表达水平和组织特异性，采用来自克隆19A2的片段作为探针进行RNA印迹分析。将来自几种人组织或培养的细胞系的每种约10μg总RNA加样至1μg溴化乙锭存在下的琼脂糖凝胶上。以100V电泳4小时后，通过在10X SSC中吸印过夜，将RNA转移至硝化纤维素膜(Schleicher & Schuell)上。将膜在真空下于80℃烘烤1.5小时。含有3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液中的50％甲酰胺的预杂交溶液用来于42℃封闭所述膜3小时。用包含αP32dCTP和αP32dTTP的Boehringer Mannheim随机引发试剂盒，按照生产商的说明标记克隆19A2的片段。在SephadeG25柱上，在TE缓冲液中除去未掺入的标记。用1.5×106计数/ml预杂交溶液探测所述膜。然后所述印迹以2X SSC/0.1％SDS于室温下、2X SSC/0.1％SDS于42℃、2X SSC/0.1％SDS于50℃、1X SSC/0.1％SDS于50℃、0.5XSSC/0.1％SDS于50℃和0.1X SSC/0.1％SDS于50℃下顺序洗涤。然后将所述印迹曝光于胶片19小时。
采用来自克隆19A2的BstXI片段(对应于SEQ ID NO1中的核苷酸2011-3388)的杂交揭示出在肝脏、胎盘、胸腺和扁桃体总RNA中的一个约5kb的弱带。在肾、大脑或心脏样品中没有检测到信号。用溴化乙锭染色测定，代表肾的泳道中存在的RNA量最少。
当采用克隆19A2的第二种片段(包括来自SEQ ID NO1中的碱基500-2100的区域)时，采用polyA+RNA(Clontech)在人多个组织蛋白质(MTN)印迹中检测到两种不同大小的RNA转录物。在脾脏和骨骼肌中观察到一个约6.5kb的条带，而在肺和外周血白细胞中检测到一个4.5kb的条带。观察到的大小变异可能是由组织特异性聚腺苷酸化、探针与其它整联蛋白家族成员的交叉反应性、或与可变剪接mRNA杂交引起的。
采用来自克隆19A2的跨越SEQ ID NO1中核苷酸2000-3100的第三种片段进行的RNA印迹分析所产生的结果与采用其它克隆19A2片段所得结果一致。
也采用对应于SEQ ID NO1中的核苷酸500-2100和2000-3100的片段，探测了来自三个骨髓谱系细胞系的RNA。预先用PMA刺激的THP-1细胞系产生同一大小范围内(约5.0kb)的扩散信号，强度比所述组织信号略强。来自未刺激的和DMSO刺激的HL-60细胞的RNA与αd探针杂交，其强度与所述组织样品相同，然而，PMA处理似乎增强信号强度。由于PMA和DMSO驱动HL-60细胞分别向单核细胞/巨噬细胞和粒细胞分化，因此该结果提示在单核细胞/巨噬细胞细胞类型中的αd表达增强。U937细胞表达所述αd信息，该信号不随PMA刺激而增强。在Molt、Daudi、H9、JY或Jurkat细胞中未检测到条带。
实施例7人αd构成物的瞬时表达人克隆19A2缺失起始甲硫氨酸密码子并且可能缺乏某些5’信号序列。因此，为了产生含19A2序列的人表达质粒，使用两种不同的策略。在第一种策略中，构建了两种质粒，其中将得自编码或者CD11b或者CD11c的基因的信号肽序列剪接到克隆19A2中，以产生嵌合αd序列。在第二种方法中，构建第三种质粒，其中在克隆19A2中的位置0加入一个腺苷碱基，以编码起始甲硫氨酸。
这三种质粒含有编码αd序列的5’部分或嵌合αd序列的不同区域。所述αd区用特异性3’引物BamRev(叙述于SEQ ID NO26)和三种5’引物之一进行PCR扩增。这三种5’引物在序列中含有(1)在位置1-6的相同的非特异性碱基用于消化，一种来自位置7-12的EcoRI位点和一个来自位置13-18的共有Kozak序列；(2)CD11b(引物ER1B)或CD11c(引物ER1C)信号序列的一部分，或一个腺苷(引物ER1D)；和(3)一个另外的特异性重叠来自克隆19A2的5’序列的15-17个碱基，以允许引物退火。引物ER1B、ER1C或ER1D分别叙述于SEQ ID NO27、28或29，其中在起始甲硫氨酸下划线，并在EcoRI位点下双划线。5′-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3′(SEQ ID NO26)5′-AGTTACGAATTCGCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3′(SEQ ID NO27)5′-AGTTACGAATTCGCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3′(SEQ ID NO28)5′-AGTTACGAATTCGCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3′(SEQ ID NO29)所产生的PCR产物用EcoRI和BamHI消化。
所有三种质粒均含有共同的第二αd区(以紧接前一段落描述的5’区下游插入)，包括所述αd克隆的3’端。第二αd区从核苷酸625延伸到克隆19A2的载体3’多接头区中的XbaI位点中，该αd区通过用BamHI和XbaI消化克隆19A2而分离。
制备三种连接反应物，其中采用Boehringer Mannheim的连接酶缓冲液和T4连接酶(1单位/反应)，将3’αdBamHI/XbαI片段连接至所述三种5’αdEcoRI/BamHI片段之一。于14℃温育4小时后，将用EcoRI和XbαI消化的适量载体pcDNA.3(Invitrogen)与另一单位连接酶加入每种反应中。让反应再继续进行14小时。然后将1/10的反应混合物转化到感受态XL-1 Blue细胞中。培养所产生的菌落，并如实施例5所述分离DNA。用EcoRI消化鉴定出在该限制位点为阳性也因此对于工程的信号序列为阳性的三个克隆。所述克隆被命名为pATM.B1(CD11b/αd，来自引物ER1B)、pATM.C10(CD11c/αd，来自引物ER1C)和pATM.D12(腺苷/αd，来自引物ER1d)。通过核酸测序确证在每个克隆中存在合适的信号序列。
通过用所述各个质粒和CD18表达质粒pRC.CD18共转染COS细胞，实现了来自上述αd质粒的表达。作为阳性对照，也用质粒pRC.CD18和CD11a表达质粒pDC.CD11A共转染COS细胞。
细胞在10cm Corning组织培养物处理的培养皿中的培养基(DMEM/10％FBS/pen-strep)中传代，在转染前16小时50％汇合。在所有步骤中用无胰蛋白酶的Versene缓冲液(0.5mM NaEDTA的PBS溶液)将细胞从平板中取出。在转染之前，平板用无血清DMEM洗涤1次。将每种质粒15微克加入每个平板上的5ml转染缓冲液(含有20μg/ml DEAE-葡聚糖和0.5mM氯喹的DMEM)中。于37℃温育1.5小时后，用5ml DMEM/10％DMSO震摇所述细胞。该DMSO溶液然后用10ml培养基/平板取代。
通过实施例8、9和10中所述的ELISA、FACS和免疫沉淀分析得到的转染子。
实施例8COS转染子的ELISA分析为了确定用CD18表达质粒pRC.CD18和αd表达质粒共转染的COS细胞是否在细胞表面上表达结合CD18的αd，采用针对CD18产生的第一抗体(例如从ATCC HB203纯化的TS1/18)进行ELISA。作为阳性对照，也在用所述CD18表达质粒和CD11a表达质粒pDC.CD11A共转染的细胞上进行ELISA。在该对照中的第一抗体包括CD18抗体和抗CD11a抗体(例如从ATCC HB202中纯化的TS1/22)。
关于ELISA，用Versene缓冲液取出来自每个平板的细胞，将其转移至单个96孔平底Corning组织培养板中。让细胞在培养基中温育2天，然后进行测定。然后用150μl/孔D-PBS/0.5％硬骨鱼皮明胶(Sigma)溶液将平板洗涤2次。该缓冲液用于除显色之外的所有步骤中。所有洗涤和温育均于室温下进行。用明胶溶液封闭各孔1小时。将第一抗体在明胶溶液中稀释至10μg/ml，然后每孔加入50μl所述溶液。每种第一抗体建立三份平行孔。温育1小时后，用150μl/孔明胶溶液洗涤平板3次。稀释度为1∶3500的第二抗体(山羊抗小鼠Ig/HRP-Fc特异性[Jackson，West Grove，PA)]以50μl/孔加入，并将平板温育1小时。在3次洗涤后，平板用100μl/孔邻苯二胺(OPD)(Sigma)溶液(1mg/ml OPD的柠檬酸缓冲液)显色20分钟，然后加入50μl/孔15％硫酸。
用抗CD18特异性抗体对转染子进行ELISA形式的分析，在仅用编码CD18的质粒转染的细胞中没有显示出高于背景的显著表达。当用CD18特异性抗体或用CD11a特异性试剂分析时，用含CD11a和CD18的质粒共转染的细胞表现出高于背景的表达增加。对用编码CD18的质粒和所述αd表达构成物(pATM.C10或pATM.D12)之一共转染的细胞进行的进一步分析表明，CD18的细胞表面表达由于同时表达αd而得到拯救。在用pATM.C10或pATM.D12转染的COS细胞中可检测的CD18表达的增加与在共转染CD11a/CD18阳性对照细胞中观察到的增加相当。
实施例9COS转染子的FACS分析关于FACS分析，培养皿中的细胞在转染后用新鲜培养基饲喂，并让其在测定之前温育2天。从平板中用3ml Versene取出转染子细胞，用5ml FACS缓冲液(DMEM/2％FBS/0.2％叠氮化钠)洗涤1次，并在0.1ml FACS缓冲液中稀释至500,000细胞/样品。将1mg/ml FITC缀合的CD18、CD11a或CD11b特异性抗体(Becton Dickinson)或800μg/ml CFSE缀合的鼠类23F2G(抗CD18)(ATCC HB11081)以10微升加入每种样品中。然后将样品在冰上孵育45分钟，用5ml/洗涤FACS缓冲液洗涤3次，再悬浮于0.2ml FACS缓冲液中。样品在BectonDickonson FACscan加工，并采用Lysys II软件(Becton Dickinson)分析数据。
仅用CD18转染的COS细胞用CD18、CD11a或CD11b不染色。当用CD11a/CD18共转染时，约15％的所述细胞用抗CD11a或CD18的抗体染色。用CD18和任一αd构成物转染的所有细胞用CD11a和CD11b均不产生可检测的染色。pATM.B1、pATM.C10和pATM.D12组对于CD18染色分别为4％、13％和8％阳性。CD11a/CD18组中阳性群体的荧光高于背景4倍。相比之下，αd构成物与CD18构成物共转染产生的阳性群体表现出荧光强度高于背景4-7倍。
实施例10来自共转染COS细胞的人αd/CD18复合体的生物素标记的免疫沉淀在用CD18和实施例7中分别描述的αd表达质粒中的每一种共转染的细胞上进行免疫沉淀，以确定αd是否可以作为整联蛋白特征性的αβ异二聚体复合体的一部分分离。
用Versene缓冲液从培养皿中取出转染的细胞(1-3×108细胞/组)，并在50ml/组D-PBS中洗涤3次。每种样品用2mg Sulpho-NHS生物素(Pierce，Rockford，IL)于室温下标记15分钟。通过在50ml/样品冷D-PBS中洗涤3次将反应猝灭。经洗涤的细胞再悬浮于1ml裂解缓冲液(1％NP40，50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2M NaCl，2mM Ca++，2mM Mg++和蛋白酶抑制剂)中，并在冰上孵育15分钟。通过以10,000g离心5分钟沉淀不溶性物质，将上清液取出转移至新鲜试管中。为了除去与小鼠免疫球蛋白非特异性反应的物质，最初进行预清除步骤。将25微克小鼠免疫球蛋白(Cappel，West Chester，PA)与上清液于4℃温育。2.5小时后，在每种样品中加入100μl(25μg)兔抗小鼠Ig缀合的Sepharose(由A蛋白Sepharose4B和兔抗小鼠IgG制备，A蛋白Sepharose4B和兔抗小鼠IgG均得自Zymed，San Francisco，CA)；在震摇下于4℃继续温育16小时。通过离心从上清液中除去Sepharose珠粒。预清除后，用20μg抗CD18抗体(TS1.18)于4℃处理上清液2小时。通过与100μl/样品上述兔抗小鼠/A蛋白-Sepharose制备物温育，从上清液中分离出抗体/抗原复合体。珠粒用10mM HEPES、0.2M NaCl和1％Triton-X 100洗涤4次。将经洗涤的珠粒沉淀并在含有2％β-巯基乙醇的20μl 2X Laemmli样品缓冲液中煮沸10分钟。将样品离心并在8％预制Novex聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上以100V电泳30分钟。将蛋白在TBS-T缓冲液中以200mAmp1小时转移至硝化纤维素膜(Schleicher & Schuell)。膜用3％BSA的TBS-T封闭2小时。膜用链霉抗生物素辣根过氧化物酶(POD)(Boehringer Mannheim)的1∶6000稀释液处理1小时，然后在TBS-T中洗涤3次。然后按照生产商的说明，用Amersham增强的化学发光试剂盒将所述印迹显色。将所述膜曝光于HyperfilmMP(Amersham)0.5至2分钟。
来自用pRC.CD18和pATM.B1、pATM.C10或pATM.D12中任一种转染的细胞的CD18复合体的免疫沉淀，揭示出由约100kDβ链和一个约150kD的α链组成的异二聚体种类的表面表达，100kD与CD18的预测大小一致，而约150kD相应于αd。
实施例11人αd在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定转染为了确定αd是否在细胞表面上结合CD18作为异二聚体表达，将编码每条链的cDNA瞬时转染和稳定转染到缺乏αd和CD18两者的细胞系中。
关于这些实验，如实施例7中所述，为αdcDNA增加额外的前导序列和一个Kozak共有序列，并将其亚克隆到表达载体pcDNA3中。最后的构成物命名为pATM.D12，与编码人CD18的修饰的市售载体pDC1.CD18一起共转染到二氢叶酸还原酶(DFHR)-中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。质粒pDC1.CD18编码DFHR+标记，因此采用缺乏适当核苷的培养基可以选择出转染子。产生pDC1.CD18的修饰如下。
质粒pRC/CMV(Invitrogen)是一种哺乳动物表达载体，具有巨细胞病毒启动子和氨苄青霉素抗性标记基因。将来自质粒pSC1190-DHFR的DHFR基因插入pRC/CMV的SV40复制起点的5’中。另外，将来自质粒pHF2G-DHF 5’区的多接头连接到pRC/CMV/DHFR构成物中，位于DHF基因的3’。随后将CD18编码序列克隆到所产生的质粒中，位于5’侧翼多接头区和牛生长激素polyA编码区之间。
采用单克隆抗体TS1/18，通过流式细胞术分析CD18的表面表达。该细胞系中检测到的在αd和CD18之间异二聚体的形成与实施例10中所述在COS细胞中的瞬时表达随后进行的免疫沉淀一致。
实施例12人αd以CD18依赖性方式结合ICAM-R鉴于证明白细胞整联蛋白和介导细胞-细胞接触的胞间粘着分子(ICAM)之间相互作用的报道[Hynes，Cell 6911-25(1992)]，通过两种方法评价表达αd/CD18的CHO细胞结合ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1的能力。
在平行测定分析中，将可溶性ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1IgG1融合蛋白固定于塑料上，并测定αd/CD18 CHO转染细胞结合所述固定化配体的能力。转染的细胞用钙黄绿素内部标记，在结合缓冲液(含有1％BSA的RPMI)中洗涤，并在或者单独的缓冲液(含有或不含10ng/ml PMA)或者含有10μg/ml抗CD18单克隆抗体的缓冲液中温育。将转染的细胞加入预先包被有可溶性ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白或包被有作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)的96孔Immulon4微量滴定板中。在于1993年8月5日申请的共同待审和共同拥有的美国专利申请序号08/102,852中，描述并全面公开了这些粘着分子可溶形式的设计。在加入标记细胞之前，用含1％BSA的PBS封闭各孔。通过在含有0.1％BSA的PBS中浸没20分钟洗涤所述板后，用Cytofluor2300(Millipore，Milford，MA)测量各孔中剩余的总荧光。
在用固定化ICAM进行的实验中，αd/CD18共转染子一致表现出在与ICAM-R/IgG1孔中的结合增加到BSA包被板上结合的3-5倍。通过抗CD18抗体TS1/18的抑制效应，证明了这种结合的特异性和CD18依赖性。用CD11a/CD18转染的细胞与ICAM-1/IgG1孔的结合与用BSA包被孔观察到的结合相当。CD11a/CD18转染的细胞表现出仅在用PMA预处理后与ICAM-1/IgG1孔结合增加2-3倍。对αd/CD18转染子的PMA处理不影响与ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1孔的结合。没有观察到αd/CD18转染子与VCAM-1/IgG1孔的可检测的结合。
通过流式细胞术，测定αd/CD18转染的细胞与可溶性ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白的结合。将每次测量约1×106αd/CD18转染的CHO细胞(在旋转烧瓶中培养以进行更高的表达)悬浮于含有或不含有10μg/ml抗CD18抗体的100μl结合缓冲液(RPMI和1％BSA)中。于室温下温育20分钟后，将细胞在结合缓冲液中洗涤，并加入可溶性ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1融合蛋白至终浓度5μg/ml。让结合于37℃进行30分钟，此后将细胞洗涤3次，并悬浮于含有以1∶100稀释的FITC缀合的绵羊抗人IgG1的100μl结合缓冲液中。温育30分钟后，将样品洗涤3次，并重悬浮于200μl结合缓冲液中以用Becton Dickinson FACScan进行分析。
约40-50％的αd/CD18转染子表明与ICAM-R/IgG1蛋白结合，但不与ICAM-1/IgG1或VCAM-1/IgG1蛋白结合。用PMA预处理转染的细胞对αd/CD18与ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCMA-1/IgG1的结合没有影响，这与所述固定化粘着测定一致。在用抗CD18抗体TS1/18处理αd/CD18转染子后，ICAM-R的结合降至背景水平。
来自这两个结合测定的综合数据说明，αd/CD18结合ICAM-R，并且与ICAM-1和VCAM-1相比优先结合ICAM-R。αd/CD18对ICAM-R的结合比对ICAM-1结合优先与用CD11a/CD18和CD11b/CD18观察到的情况相反。因此，可以预期αd/CD18结合的调节选择性地影响其中ICAM-R起主要作用的正常免疫功能和病理免疫功能。此外，其中对ICAM-R的各种胞外结构域有免疫特异性的抗体测试其抑制ICAM-R与αd/CD18转染子结合的能力的相似分析的结果，表明αd/CD18和CD11a/CD18与ICAM-R的不同结构域相互作用。
CD11a/CD18在溶液中不能与ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1结合，提示CD11a/CD18和ICAM-1或ICAM-R之间结合的亲和性太低，以致于不允许在溶液中结合。然而，检测出αd/CD18与ICAM-R/IgG1结合，提示异常高的结合亲和性。
在上述分析中，VCAM-1/Ig融合蛋白包含七胞外免疫球蛋白样结构域。该融合蛋白在转染的CHO细胞中产生，并且通过夹层ELISA检测出所产生的蛋白。来自CHO细胞上清液的所述七结构域VCAM-1融合蛋白不经纯化而使用，发现蛋白产量非常低。因为在VCAM-1制备物中蛋白产生非常低，所以采用市售的VCAM-1制剂(&D Systems，Minneapolis，MN)重新检查αd/CD18与VCAM-1的结合，以确定是否低VCAM-1浓度导致无法检测到的αd结合。
如上所述，在采用固定化重组粘着分子的粘着测定中，利用表达αd和CD18的CHO细胞。采用流式细胞术，表明αd转染的CHO细胞既表达αd，又表达CD18，但不表达其它β2整联蛋白。也显示所述转染的CHO细胞不表达两种已知的VCAM-1结合配偶体蛋白α4β1和α4β7。表明亲代CHO细胞系不表达α4或β2整联蛋白。基本上如上所述进行结合实验。
结果表明，与αd转染的CHO细胞以7.5％的比率结合固定化BSA和2.8％的比率结合固定化E-选择蛋白相比，αd转染的CHO细胞以约14.2％的比率结合固定化VCAM-1。另外，在对VCAM-1的第一结构域特异性的单克隆抗体存在下，与固定化VCAM-1的结合基本上被阻断(3.0％结合)。亲代CHO细胞既不结合VCAM-1、E-选择蛋白，又不结合BSA(所有结合率均低于2％)。所述αd转染的CHO细胞的结合也随着所述细胞的传代而降低，这于在同一时期内观察到的αd表面表达的降低一致。
为了确定天然表达αd/CD18的细胞是否利用VCAM-1作为结合配偶体，分离出外周血嗜酸性粒细胞，并在10ng/ml IL-5存在下培养5-7天，以便增加αd表达。流式细胞术表明，IL-5温育将αd表达增加2-4倍，但不影响α4的表达。
结果表明，培养的嗜酸性粒细胞以约28.8％的比率结合固定化VCAM-1，并且所述结合受抗CD18单克隆抗体(结合率为17.1％)和抗α4的单克隆抗体(结合率为18.1％)部分抑制。与上述用低水平和/或不纯的VCAM-1得到的初步结果相反，这些数据提示αdβ2是VCAM-1的配体。
采用上述FACS粘着测定来测试ICAM-R突变体E37A/Ig与表达αd/CD18的CHO细胞的结合。已经表明E37A/Ig消除了与LFA-1/Ig嵌合体的结合[Sadhu等，Cell Adhesion and Communication 2429-440(1994)]。所述突变蛋白以可溶形式从稳定转染的CHO细胞系表达，并在ProsepA柱上如Sadhu等所述(参见上文)进行纯化。
在重复测定中没有检测到E37A/Ig与αd/CD18转染子的结合。通过FITC缀合的抗人抗体检测到的E37A/Ig嵌合体的平均荧光强度(MFI)与单独的检测抗体的MFI相同，表明在该测定中采用E37A/Ig突变蛋白没有可检测的高于背景的信号。同样，在如实施例14中所述进行的ELISA中，E37A/Ig突变体看来不结合固定化αd/CD18。αd与iC3b的结合补体成分C3可以被蛋白水解裂解形成复合物iC3b，iC3b启动补体激活的替代途径，并最终导致对靶的细胞介导的破坏。CD11b和CD11c均涉及iC3b结合和随后的iC3b包被颗粒的吞噬。最近已经将CD11b I结构域中的肽片段鉴定为iC3b相互作用的位点[Ueda等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9110680-10684(1994)]。iC3b结合区在CD11b、CD11c和αd中高度保守，提示存在αd/iC3b结合相互作用。
在花结测定中，采用转染子或天然表达αd(例如PMA刺激的HL60细胞)和外被iC3b的绵羊红细胞(sRBC)进行αd与iC3b的结合[Dana等，J.Clin.Invest.73153-159(1984)]。在存在和缺乏抗CD18单克隆抗体(例如TS1/18.1)的情况下，比较αd/CD18 CHO转染子、VLA4-CHO转染子(阴性对照)和PMA刺激的HL60细胞(阳性对照)形成花结的能力。
实施例13根据αd结合的调节剂的闪烁亲近测定ID进行筛选通过各种方法，例如如美国专利第4,271,139号，Hart和Greenwald，Mol.Immunol.12265-267(1979)以及Hart和Greenwald，J.Nuc.Med.201062-1065(1979)(每个参考文献均通过引用结合到本文中)中一般描述的闪烁亲近测定技术，可以确定本发明的αd配体及其结合配偶体之间结合(αd配体/抗配体对)的特异性抑制剂。
简而言之，将所述αd配体/抗配体对的一个成员直接或者间接地结合于一种固相支持体上。间接捕获可能涉及直接结合于所述支持体的单克隆抗体，所述单克隆抗体识别所述可溶性整联蛋白β链蛋白C末端的一个特异性表位。该表位可能是或者血凝素蛋白表位或者是分枝杆菌IIIE9表位[Anderson等，J.Immunol.141607-613(1988)]。也将荧光剂结合于该支持体上。或者，可以如美国专利第4,568,649号(其通过引用结合到本文中)中所述，将所述荧光剂整合到该固相支持体上。αd配体/抗配体对的非支持体结合的成员用放射性化合物标记，所述放射性化合物发射能够激发所述荧光剂的辐射。当所述配体结合所述放射性标记的抗配体时，使所述标记足够接近所述支持体结合的荧光剂，以激发所述荧光剂，并引起光发射。当不结合时，所述标记一般距离固相支持体太远，以致于不能激发所述荧光剂，因此光发射低。测定发射光，所述发射光与所述配体与所述抗配体之间结合相关。将结合抑制剂加入样品中，将通过使放射性标记不能被捕获在所固相支持体附近，而降低荧光发射。因此，根据其对来自样品的荧光发射的影响，可以鉴定出结合抑制剂。也可以用相似的方法鉴定αd的可能配体。
在闪烁亲近测定中使用可溶性重组αd/CD18亮氨酸拉链构成物(参见实施例14)，以通过以下方法筛选CAM结合的调节剂。将所述重组整联蛋白用预先包被在闪烁体包埋板上的非阻断性抗α亚基或抗β亚基的抗体固定。将化学文库化合物和一种特异性生物素化CAM/Ig嵌合体同时加入所述板中。通过标记的链霉抗生物素检测所述CAM/Ig嵌合体的结合。在该测定中，用NHS-Sulfo生物素LC(长链，Pierce)按照生产商建议的方案将ICAM-1/Ig和ICAM-R/Ig生物素化。标记的蛋白仍与CAM特异性抗体反应，并且在用链霉抗生物素-HRP检测、随后用OPD显色的ELISA中，可以表现出与固定化LFA-1反应。
或者，将所述重组亮氨酸拉链蛋白纯化或部分纯化，并直接包被在闪烁体包埋板上。同时加入未标记的CAM-Ig嵌合体和化学文库化合物。用125I标记的抗人Ig检测结合的CAM/Ig。
作为再一替代方法，将纯化的CAM/Ig蛋白固定在闪烁体板上。将化学文库化合物和来自表达重组亮氨酸拉链整联蛋白的浓缩上清液加入所述板中。用标记的非阻断性α或β亚基抗体检测所述重组整联蛋白的结合。小分子调节剂的筛选作为闪烁亲近测定的一个替代方法，采用如下所述的ELISA样测定，可以鉴定αd结合配偶体及其抑制剂。
用抗αd抗体212D(参见实施例15)，从组织培养上清液中捕获可溶性αd/CD18亮氨酸拉链(LZ)构成物(参见实施例14)。将212D抗体在碳酸氢盐包被缓冲液(pH 9.5)中于4℃过夜固定到96孔ImmulonIV板(Costar)上。采用同一方案将抗CD11a抗体TS2/4.1固定，以固定LFA-1亮氨酸拉链(LFA-1LZ)融合蛋白；LFA-1用作VCAM-1结合的阴性对照以及ICAM-1结合的阳性对照。所述板用300μl/孔3％牛血清白蛋白封闭1小时，并在D-PBS中洗涤。以100μl/孔加入来自表达或者αd/CD18LZ或者LFA-1LZ的稳定CHO转染子的组织培养上清液，让其于4℃温育6-8小时。所述板用含有Twee20的Tris缓冲盐溶液(TBS-T)洗涤2次，然后用含有氯化钙、氯化镁和氯化锰各2mM的TBS(无Tween)洗涤1次。后者在该测定的其余步骤中用作测定缓冲液和洗涤缓冲液。
在整联蛋白捕获后，所述板用250μl/孔TBS洗涤3次。将纯化的CAM/Ig(参见实施例12)在以10-20μg/ml的浓度开始的连续2∶3稀释后加入各孔中。让CAM/Ig于室温下结合2小时，然后板如上所述进行洗涤。使用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人Ig抗体(JacksonLabs)，然后用邻苯二胺(OPD)显色，检测结合的融合蛋白。
结果表明，虽然当与LFA-1LZ结合时ICAM-1/Ig引起信号增加5-7倍，但它不能结合αd/CD18LZ。相反，VCAM-1/Ig表现出在含有αd/CD18LZ的孔中高于背景的信号增强5倍，但在具有LFA-1LZ的孔中不增强。ICAM-R突变体E37A/Ig(参见实施例12)不结合这两种整联蛋白。
测试αd特异性单克隆抗体212D、217L、217I、217H、217G、217K和217M抑制VCAM-1结合固定化αd/CD18的能力。另外，抗VCAM-1单克隆抗体130K、130P和IG11B1(Caltag)用来测定反应的特异性。所述抗αd单克隆抗体以5μg/ml使用，而抗VCAM-1抗体以25μg/ml使用；鉴于在该测定系统中VCAM-1在溶液中的事实，使用较高的抗VCAM-1抗体浓度。
在或者用217I处理或者用130K和130P一起使用进行处理的孔中，产生部分阻断(50％)。130K/130P的组合也完全抑制VLA-4和VCAM-1的相互作用，这提示αd和VLA-4结合于VCAM-1上的不同位点，并且有可能开发选择性地干扰αd/VCAM-1结合的拮抗剂。
该测定可以如下修改，以进行αd结合抑制剂的高通量筛选测定。将VCAM-1/Ig生物素化，并如上在预先溶于DMSO中的合并的化学化合物存在下使用；然后用链霉抗生物素-铕(Eu)复合物检测结合的VCAM-1/Ig。链霉抗生物素-Eu复合物通过螯合而被激活，导致可测量的光发射。发射的改变，或更尤其是发射的减少，是VCAM-1/Ig结合受抑制的指示，推定是由于小分子合并物中的一种或多种化合物的作用所致，然后可以对其进行单独分析或以更小的分组分析。
实施例14可溶性人αd表达构成物全长可溶性人αd/CD18异二聚体蛋白的表达为固定化和结合测定提供容易纯化的材料。产生可溶性蛋白的优点是，它可以从上清液中纯化，而不从细胞裂解液中纯化(关于全长膜结合αd/CD18)；收率因此得到提高并且杂质减少。
如下构建可溶性αd表达质粒。通过用HindIII和AatII消化，分离出克隆到质粒pATM.D12中、对应于SEQ ID NO1中残基0-3161的区的核苷酸片段。用分别叙述于SEQ ID NO30和31的引物sHAD.5和sHAD.3，从pATM.D12中扩增重叠HindIII/AatII片段、对应于SEQID NO1中残基3130-3390并在3’末端含有一个加入的MluI限制位点的PCR片段。5′-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3′(SEQ ID NO30)5′-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3′(SEQ ID NO31)该PCR扩增产物用AatII和MluI消化，并连接至HindIII/AatII片段。将所产生的产物连接到HindIII/MluI消化的质粒pDC1.s中。
该构成物与可溶性CD18在稳定转染的CHO细胞中共表达，通过得自35S-甲硫氨酸标记细胞的免疫沉淀的CD18复合物的放射自显影显现来检测表达。所述构成物也与CD18一起在293细胞中共表达[Berman等，J.Cell.Biochem.52183-195(1993)]。可溶性全长αd构成物本发明也设想替代的αd表达构成物。为了促进完整αd/CD18异二聚体的表达和纯化，将构建可溶性的αd和CD18表达质粒，以包括“亮氨酸拉链”融合序列，所述融合序列应该在纯化期间稳定所述异二聚体[Chang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，9111408-11412(1994)]。简而言之，通过采用Change等所述的寡核苷酸进行引物退火，已经产生了编码所述拉链的酸性氨基酸链和碱性氨基酸链的DNA。已经对所述DNA序列进行了进一步修饰，以分别在所述DNA的5’端和3’端包括额外的Mlu1和Xba1限制位点，以有助于亚克隆到先前描述的αd或CD18表达构成物中。另外，已经加入了代表或者血凝素蛋白或者聚组氨酸序列的序列以及一个在Xba1位点之后插入的终止密码子。加入所述血凝素或聚组氨酸序列有利于所表达蛋白的亲和纯化。在表达CD18的质粒载体上掺入编码所述拉链的碱性链的序列；所述酸性序列段在所述α链构成物上插入。当修饰的αd和CD18蛋白在宿主细胞中表达时，推定所述拉链结构的酸性链和碱性链将稳定所述异二聚体，并且允许通过如上所述的亲和纯化来分离完整的αd/CD18分子。
构建质粒以表达具有酸性和碱性“亮氨酸拉链”序列的可溶性αd和CD18，通过实施例7中所述的DEAE/葡聚糖法将所述质粒转染到COS细胞中。所产生的蛋白称为αd/CD18LZ。血凝素标记和聚组氨酸标记未掺入αd/CD18LZ中。转染的细胞在减少血清(2％)的条件下生长14天。通过实施例8中所述的ELISA，分析每5天从转染的细胞收获的上清液的蛋白产生。简而言之，将αd/CD18LZ异二聚体固定于包被有抗αd单克隆抗体169B(参见实施例15)的板上。通过加入生物素化抗CD18单克隆抗体TS1/18.1(参见实施例8)，然后加入链霉抗生物素/辣根过氧化物酶(HRP)缀合物和邻苯二胺(OPD)，检测αd/CD18LZ复合物。在所述上清液中可清楚地检测到蛋白。采用可溶性全长αd表达产物的结合测定通过将上述可溶性全长αd/CD18LZ异二聚体固定于包被有单克隆抗体169B或非阻断性抗CD18单克隆抗体(参见实施例15)的板上，进行所述异二聚体的功能结合测定。在以10μg/ml的起始浓度加入CAM/Ig嵌合体(参见实施例12)之前，用鱼皮明胶封闭各孔以防止非特异性结合。用山羊抗人Ig HRP缀合物(Jackson Labs)随后用OPD显色，检测所述嵌合体与αd/CD18的结合。
观察到VCAM-1/Ig结合捕获的αd/CD18LZ，其结合水平高于与捕获的CD11a/CD18的结合3-5倍。ICAM-1/Ig和ICAM-2/Ig与可溶性CD11a/CD18异二聚体的结合分别高于背景15倍和10倍，但不结合αd/CD18。在组合使用的VCAM-1特异性抗体130K和130P存在下，VCAM-1结合降低约50％。
也通过将ICAM/Ig蛋白固定于96孔板，然后加入细胞上清液中的重组可溶性整联蛋白，进行结合测定。加入未标记的非阻断性α或β亚基特异性鼠类抗体，然后与HRP-缀合的山羊抗小鼠抗体温育，并用OPD显色，检测所述可溶性整联蛋白的结合。
结果表明，非阻断性抗体检测出的αd/CD18LZ与ICAM-R/Ig的结合比在不含抗体的对照孔中检测到的结合高10倍。用固定化ICAM-1/Ig没有检测到可溶性αd/CD18的结合，然而，在αd/CD18和固定化的CD11b/CD18以及CD11a/CD18之间的结合比背景结合分别高15倍和5倍。
因为先前的研究已经证明，CD11b和CD11c结合脂多糖(LPS)[Wright，Curr.Opin.Immunol 383-90(1991)；Ingalls和Golenbock，J.Exp.Med.1811473-1479(1995)]，所以也采用流式细胞术和基于平板的测定评估了LPS与αd/CD18的结合。结果表明，从明尼苏达沙门氏菌(S.minnesota)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhosa)分离的FITC标记的LPS(均得自Sigma)在20μg/ml下能够弱结合αd/CD18转染的CHO细胞。用未转染的对照CHO细胞没有观察到结合。在ELISA形式的测定中，生物素化LPS[Luk等，Alan.Biochem.232217-224(1995)]在0.5-3.0μg下结合固定化αd/CD18LZ，其信号比单独的捕获抗体和阻断剂高4倍。通过从每个实验数值中减去与抗CD11a抗体TS2/4的背景结合，扣除排除LPS与CD11a/CD18的表观结合。
为了鉴定αd/CD18的其它配体，在两层研究中使用所述重组αd/CD18LZ蛋白。各种细胞类型与固定化蛋白的结合用来确定哪些细胞在细胞表面上表达αd配体。然后用抗体抑制来确定所观察到的细胞结合是否产生于与已知表面粘着分子的相互作用。如果没有抑制产生，则与结合于可结合αd的细胞的裂解液中蛋白的αd/CD18LZ的共免疫沉淀，用来尝试鉴定所述配体，可溶性人αdI结构域表达构成物先前已经报道了，CD11a中的I结构域可以作为保持配体结合能力和抗体识别的独立结构单位而表达[Randi和Hogg，J.Biol.Chem.26912395-12398(1994)；Zhout等，J.Biol.Chem.26917075-17079(1994)；Michishita等，Cell 72857-867(1993)]。为了产生包含所述αdI结构域和人IgG4的可溶性融合蛋白，采用设计加入侧翼BamHI和XhoI限制位点以便于亚克隆的引物，通过PCR扩增所述αdI结构域。这些引物叙述于SEQ ID NO32和33，在限制位点下划线。5′-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3′(SEQ ID NO32)5′ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3′(SEQ ID NO33)SEQ ID NO32中紧接BamHI位点3’的C核苷酸对应于SEQ IDNO1中的核苷酸435；SEQ ID NO33中XhoI位点3’的G核苷酸互补于SEQ ID NO1中的核苷酸1067。扩增的I结构域用所述合适的酶消化，将纯化的片段连接到哺乳动物表达载体pDCs和原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)中，并对所述I结构域片段测序。然后使所述融合蛋白在用合适表达构成物转染或转化的COS、CHO或大肠杆菌细胞中表达。
已知αd对于ICAM-R的亲和性，所述αdI结构域的表达可能具有足够的亲和性，以成为αd参与的细胞粘着的有用的抑制剂。人αdI结构域/IgG4融合蛋白的分析在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE分离蛋白，并通过或者银染或者考马斯染色来显现。然后将蛋白转移至Immobilon PVDF膜上，采用抗人IgG单克隆抗体或抗牛Ig单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。
测定所检测到的蛋白在非还原条件下以约120kD迁移，而在还原条件下以约45kD迁移。在非还原性凝胶上，也检测到约40-50kD的次要条带，它们与抗人抗体反应，但不与抗牛抗体反应。通过蛋白质印迹分析，确定200kD次要条带为牛Ig。采用I结构域表达产物进行的结合测定以ELISA形式，测试所述I结构域特异性地识别ICAM-R/IgG嵌合蛋白的能力。将αdI结构域IgG4融合蛋白(Iαd/IgG4)在TBS中的连续稀释液与固定在ImmulonIV RIA/EIA板上的ICAM-1/IgG、ICAM-R/IgG、VCAM-1/IgG或不相关性IgG1骨髓瘤蛋白一起温育。CD11a I结构域/IgG嵌合蛋白和人IgG4/κ骨髓瘤蛋白用作阴性对照。采用生物素化抗IgG4单克隆抗体HP6023，然后加入链霉抗生物素-过氧化物酶缀合物，并用底物邻苯二胺显色，检测结合的IgG4。
在重复测定中，用任一所述固定化蛋白，均没有检测到CD11a/IgG4蛋白或IgG4骨髓瘤蛋白的结合。Iαd/IgG4蛋白不结合鱼皮明胶或牛血清白蛋白封闭剂、人IgG1或ICAM-1/IgG。用1-5μg/ml浓度的Iαd/IgG4蛋白，在ICAM-R/IgG蛋白包被孔中检测到高于背景2-3倍的结合信号。在VCAM-1/IgG包被孔中的信号高于背景7-10倍。在先前的测定中，αd/CD18转染的CHO细胞不结合VCAM-1/IgG蛋白，提示VCAM-1结合可能是分离的I结构域氨基酸序列的特征。其它αdI结构域构成物以同先前构成物相同的方式产生其它αdI结构域构成物，但在所述αdI结构域周围加入更多氨基酸。具体的构成物包括i)来自外显子5的序列(SEQ ID NO2中的氨基酸127-353)，位于当前构成物之前，ii)EF手重复序列(SEQ ID NO2中的氨基酸17-603)，位于所述I结构域之后，和iii)于跨膜区截短的α链(SEQ ID NO2中的氨基酸17-1029)；以及IgG4尾，用于纯化和检测。将这些构成物连接到或者哺乳动物表达载体pDCS1或者原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)中，并对所述I结构域测序。然后使所述融合蛋白在用合适表达构成物转化或转染的COS、CHO或大肠杆菌细胞中表达。在ProSepA柱(Bioprocessing Limited，Durham，英国)上纯化蛋白，并测试其与抗IgG4单克隆抗体HP6023的反应性，并用考马斯染色在聚丙烯酰胺凝胶上显现。
为了构建完整的αd多肽的表达质粒，采用以下方法修饰上述pATM.D12以表达αd-IgG4融合蛋白。采用掺入一个5’AatII限制位点的引物(SEQ ID NO89)和掺入一个3’XbaI限制位点的引物(SEQ IDNO90)，通过PCR从载体pDCS1中分离出IgG4编码DNA。5′-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3′(SEQ ID NO89)5′-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3′(SEQ ID NO90)质粒pATM.D12用AatII和XbaI消化，将适当消化和纯化的IgG4 PCR产物连接到所述线性载体中。
实施例15人αd特异性单克隆抗体的产生1.将来自实施例7的瞬时转染的细胞在Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液(D-PBS)中洗涤3次，并以5×106细胞/小鼠与50μg/小鼠的胞壁酰二肽酶(Sigma)的PBS溶液一起注射到Balb/c小鼠体内。以2周间隔，以同一方式再给小鼠注射2次。通过实施例9概述的FACS分析，筛选来自所述小鼠的预放血(pre-bleed)血清和免疫血清，并融合对用αd/CD18转染的细胞具有最高反应性的小鼠的脾。然后分别根据对用CD11a/CD18转染的COS细胞反应性的缺乏以及与用αd表达质粒和CD18共转染的细胞的反应性，筛选杂交瘤培养上清液。
该方法没有产生单克隆抗体。
2.作为生产单克隆抗体的一个替代方法，从稳定转染的CHO细胞的上清液亲和纯化可溶性αdI结构域/IgG4融合蛋白，并将其用来如上所述免疫Balb/c小鼠。建立杂交瘤，并通过ELISA根据对αdI结构域融合蛋白的反应性来筛选这些杂交瘤的上清液。然后分析阳性培养物与CHO转染子上表达的全长αd/CD18复合物的反应性。
小鼠1908接受3次αd/CD18转染的CHO细胞的初次免疫以及用可溶性αd/CD18异二聚体的两次随后的加强。最后两次免疫包括50μg/小鼠αdI结构域/IgG4融合蛋白。所述融合体产生270个IgG生产孔。通过ELISA，来自45个孔的上清液表现出与αd/IgG4融合蛋白的结合高于人IgG4的结合至少7倍。通过FACS分析测定，所述上清液中没有一种与αd/CD18转染的CHO细胞反应。
为了确定所述上清液是否能够识别其它背景(context)下的整联蛋白α亚基蛋白，用来自所述45个孔中的24个孔的上清液将新鲜冷冻的脾切片染色。确定3种上清液为阳性一种染色红髓中的大细胞，而其它两种染色红髓以及小梁中的分散细胞。
进一步分析这些上清液免疫沉淀来自或者αd/CD18转染的CHO细胞或者PMA刺激的HL60细胞的生物素化CD18复合物的能力。选择具有识别去垢剂裂解液(这不应该与作为异二聚体表达的蛋白一样受到构象限制)中的蛋白的上清液的融合孔，用于进一步的亚克隆。识别去垢剂中的蛋白的单克隆抗体在免疫沉淀来自转染子、组织和细胞系的异二聚体复合物方面可能更有用。
3.作为单克隆抗体生产的另一替代方法，在预清除CD11a/CD18(用单克隆抗体TS2/4)和CD11b/CD18(用单克隆抗体Mo-1)后，用抗CD18单克隆抗体23F2G从人脾脏裂解液中免疫沉淀CD18复合物。通过在第0天皮下注射约30μg完全弗氏佐剂中的所产生的蛋白，然后在第28天和第43天用不完全弗氏佐剂中的30μg免疫原/小鼠加强3次，来免疫5只10-12周龄Balb/c小鼠。在最后一次加强后10天抽取试验血清，通过采用每种血清的1∶500稀释液以检测蛋白质印迹中的1μg/道免疫原，来评估反应性。来自3只小鼠的血清检测到约95kD和150kD的条带；在用免疫前血清的1∶50稀释液处理的泳道中没有观察到信号。假定150kD的条带代表体内糖基化状态的αd。另外，所有免疫后血清均免疫沉淀来自生物素化αd/CD18 CHO细胞的裂解液的蛋白，所述蛋白在SDS-PAGE上以适当的分子量迁移，代表所述异二聚体。根据这些结果，选择小鼠#2212，通过在第64天用30μg免疫原的PBS溶液腹膜内注射来进一步免疫。4天后处死所述小鼠，然后无菌操作，取出脾脏。
通过在浸入无血清RPMI 1640中的两片显微镜玻片磨砂端之间研磨脾脏，形成单细胞悬浮液，其中所述无血清RPMI 1640补充有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，加拿大)。将细胞悬浮液通过无菌70目Nitex细胞滤过器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)过滤，然后通过以200xg离心5分钟将滤过物洗涤2次。将产生的沉淀再悬浮于20ml无血清RPMI中。以相似方式制备取自三只初次用于实验的Balb/c小鼠的胸腺细胞。
在融合之前，将在融合之前在含有10％Fetalclone血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中保持对数期3天的NS-1骨髓瘤细胞经以200xg离心5分钟沉淀，如前述段落中所述洗涤2次并计数。将约2×108脾细胞与4×107NS-1细胞混合，通过以200xg离心沉淀所产生的混合物。弃去上清液。通过轻敲试管使细胞沉淀离壁，在1分钟过程中在搅拌的同时加入2ml 75mM Hepes(pH8.0，37℃)(Boehringer Mannheim)中的50％PEG 1500。随后在接下来的7分钟内再加入14ml无血清RPMI，然后立即加入16ml RPMI。将所产生的混合物以200xg离心10分钟并弃去上清液。将沉淀重悬浮于含有15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸苷(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的200ml RPMI中，并以200μl/孔分配到10块96孔平底组织培养板(Corning，英国)中。通过在融合后第2、4和6天用18G针头(Becton Dickinson)从每孔抽吸约100μl，并加入100μl/孔上述的铺平板培养基，只是所述培养基含有10单位/ml IL-6且缺乏胸腺细胞，来饲喂细胞。
融合后第7-10天，通过抗体捕获ELISA筛选来自每孔的上清液，测试小鼠IgG的存在。用50μl/孔在50mM pH 9.6碳酸缓冲液中以1∶5000稀释的山羊抗小鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)于4℃包被Immulon4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)。用含有0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤板3次，并加入50μl来自每孔的上清液。于37℃温育30分钟后，用PBST如上所述洗涤各孔，每孔加入50μl在PBST中以1∶3500稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。如上所述将板温育，用PBST洗涤4次，并加入100μl底物，底物由1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2的100mM柠檬酸盐pH 4.5组成。5分钟后加入50μl 15％H2SO4，随处所述颜色反应。用酶标仪(plate reader)(Dynatech)测定每孔490nm下的吸光度。
如下进一步鉴定杂交瘤。通过流式细胞术，分析与αd/CD18转化的CHO细胞的反应性，但与JY细胞(LFA-1阳性B细胞系，但对先前的室内(in-house)染色实验中观察到其它β2整联蛋白不是阳性)无反应性的IgG生产培养物上清液。简而言之，将5×105αd/CD18转化CHO或αd/CD18-JY细胞悬浮于50μl含有2％FBS和10mM NaN3的RPMI(FACS缓冲液)中。将各个细胞悬浮液加入96孔圆底板(Corning)各孔中的50μl IgG阳性杂交瘤培养上清液中。于冰上孵育30分钟后，通过将细胞在临床用离心机中离心将细胞洗涤2次，弃去来自各孔的上清液，将沉淀再悬浮于200-300μl FACS缓冲液中。最后一次洗涤用50μl/孔的在FACS缓冲液中制备的绵羊抗小鼠IgG(H+L)-FITC缀合物(Sigma，St，Louis，Missouri)的F(ab’)2片段的1∶100稀释液取代。如上所述孵育后，细胞用补充10mM NaN3的Dulbecco氏PBS(D-PBS)洗涤2次，最后再悬浮于含有1％低聚甲醛的D-PBS中。然后将样品转移至聚苯乙烯试管中，用Becton Dickinson FACscan分析仪进行流式细胞术分析(FACS)。
根据两种标准，融合产生的四种培养物被认为是阳性。当在4天后扩增的上清液上重复第二次筛选时，所述四种培养物中的三种仍为阳性。这三个孔命名为169A、169B、169D，连续通过在RPMI、15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、16mM胸苷和10单位/ml IL-6中双倍稀释，将这三个孔克隆2-3次。4天后对克隆板的各孔目测计分，并记录密度最小孔中的菌落数。7-10天后通过FACS分析每次克隆的选定孔。在所述培养物中的两种培养物169A和169B中发现活性。在最后一次克隆后，在含有11％ FBS的RPMI中扩增含单菌落的阳性孔。采用IsoStrip试剂盒(Boehringer Mannheim)按照生产商的说明，确定来自169A和169B的克隆上清液的抗体的同种型，发现属于IgG1同种型。
来自CHO转染子和PMA刺激的HL60细胞的αd/CD18复合物的免疫沉淀用作研究特异性的第三次筛选。根据SDS-PAGE分析，杂交瘤169A和169B沉淀来自CHO系的合适条带和一种来自HL60的150-160kD单一α链种类。杂交瘤169A和169B于1995年5月3l日保藏于美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852)，保藏号分别为HB11907和HB11906。
为了更全面的表征169A和169B的结合特性，测试了每种抗体抑制另一种抗体结合或抑制抗CD18抗体TS1/18.1与可溶性全长αd/CD18结合的能力。用每种未标记抗体分别在96孔板形式中固定可溶性αd/CD18，并用生物素化抗体检测所述相同或不同的未标记抗体结合的蛋白。用山羊抗小鼠Ig/HRP缀合物，随后加入OPD底物，检测结合。结果表明，抗体169A能够阻断生物素化169A和TS1/18.1的结合，而抗体169B仅阻断其自身的结合。
4.选择通过用与小鼠#2212相同的方案免疫的另一只小鼠(#2214)，并通过在第70天用30μg从PBS中的脾裂解液纯化的αd进行融合前加强来进一步免疫。4天后处死所述小鼠，并无菌取出脾脏。
如上所述进行融合和阳性细胞的克隆。所述融合产生5个抗αd单克隆杂交瘤，命名为170D、170F、170E、170X和170H，用IsoStrip试剂盒(Boehringer Mannheim)按照生产商的说明，将它们确定为IgG1同种型。
5.选择通过用与小鼠#2212和小鼠#2214相同的方案免疫的再一只小鼠#2211，并通过在第88天用30μg免疫原并于第203天用30μg免疫原进行融合前加强来进一步免疫。4天后处死所述小鼠，取出脾脏，并如上所述进行融合。通过上述段落中详细描述的抗体捕获ELISA和通过流式细胞术筛选杂交瘤上清液。
鉴定出15个阳性杂交瘤，命名为188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188P和188T，并在ELISA测定中确定同种型。简而言之，用50μl/孔在50mM pH 9.6碳酸缓冲液中以1∶5000稀释的山羊抗小鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)于4℃包被Immulon4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)。用含1％BSA的PBS于37℃将板封闭30分钟，用PBS/0.05％Tween20(PBST)洗涤板3次，并加入50μl培养上清液(在PBST中以1∶10稀释)。如上所述温育和洗涤后，加入50μl在含有1％正常山羊血清的PBST中以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG1、G2a或G3(Zymed，San Francisco，California)。如上所述将板温育，用PBST洗涤4次，此后加入100μl底物，底物由1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2的100mM柠檬酸盐pH 4.5组成。在5分钟内加入50μl 15％H2SO4终止颜色反应。用酶标仪(Dynatech)测定A490，所有15种抗体均确定为IgG1。
将过量的来自小鼠#2211的脾细胞在冷冻管中冷冻并贮存在液氮中。通过将冷冻管置于37℃水浴中并使其进行环形运动直至内容物融化，将冷冻管快速解冻。将细胞转移至15ml离心管中，其中每次缓慢加入1ml含有11％FBS的温热RPMI，每次加入之间间隔3-5分钟。加入另外5ml温热RPMI，等待5分钟后，将离心管以200xg离心5分钟，并抽取上清液。将细胞再悬浮于RPMI中，如上所述进行融合。如上所述通过抗体捕获和和流式细胞术筛选杂交瘤上清液。
所述融合产生5个克隆，命名为195A、195C、195D、195E和195H。通过如上所述的ELISA方法测定所述克隆的同种型；单克隆抗体195A、195C、195D和195E确定为IgG1，而195H确定为IgG2a。
6.在产生抗αd单克隆抗体的另一研究中，采用与小鼠2214、2211和2212相同的方案免疫小鼠#2213，但也在第414天和441天用30μg结合于Sepharose珠粒的人αd/CD18亮氨酸拉链(LZ)进一步免疫。通过用抗CD18单克隆抗体和A蛋白Sepharose免疫沉淀人αd/CD18LZ(实施例14)，制备小鼠#2213的免疫原。在注射之前，将沉淀的复合物以1∶1的比例与PBS再悬浮为浆液。加强免疫后4天处死所述小鼠。取出脾脏并如先前所述进行融合。
采用用非阻断性抗CD18抗体的F(ab’)2片段固定的人αd/CD18LZ，通过ELISA鉴定阳性杂交瘤。简而言之，将所述F(ab)’2片段以100ng/孔于4℃过夜包被到Immulon4 ELISA板上。抽取缓冲液后，用0.5％鱼皮明胶(Sigma)于37℃将各孔封闭30分钟。在PBST中洗涤3次后，加入50μl/孔先前用编码可溶性αd/CD18LZ的质粒转化的CHO细胞的上清液，并将板于37℃温育30分钟。重复洗涤步骤，并加入50μl/孔杂交瘤上清液。如上所述进行单克隆抗体的检测。采用如上所述用αd/CD18编码DNA转化的CHO细胞，通过流式细胞术分析阳性细胞，鉴定出命名为212A和212D的两个阳性杂交瘤。采用上述同种型ELISA方法，确定由所述杂交瘤分泌的抗体为IgG1。
7.在产生抗人αd单克隆抗体的再一方法中，用如上所述制备的αd/CD18LZ Sepharose珠粒免疫小鼠，每只小鼠于第0天、第36天和第66天接受30μg免疫原。通过如上所述的重组蛋白ELISA形式筛选所述小鼠血清后，选择小鼠#2477用于融合。采用上述用于融合212的方法进行融合、选择和克隆步骤。鉴定出7个阳性杂交瘤，命名为217F、217G、217H、217I、217K、217L和217M，但根据流式细胞术测定，在最后一轮克隆期间，杂交瘤217F丧失了反应性。如先前所述测定来自其余6个杂交瘤系的抗体，发现均为IgG1。
8.在产生αd单克隆抗体的另一方法中，用与小鼠#2477相同方案免疫小鼠#2480，但在第217天和第218天用30μgαd/CD18LZ腹膜内注射进一步免疫。在第221天处死所述小鼠，取出脾脏并如上所述进行融合。通过如上所述的ELISA和流式细胞术筛选杂交瘤上清液，以确定与先前用编码αd/CD18的DNA转染的JY细胞的反应性。如上所述进行筛选步骤。融合产生3个阳性杂交瘤240F、240G和240H，其分泌的抗体通过所述ELISA法确定同种型均为IgG1。其后第4个杂交瘤240I鉴定也为IgG1同种型。
9.为了鉴定能够抑制功能性αd结合的抗体，用可溶性αd/CD18LZ(参见实施例14)进行免疫。在亲和层析柱上从瞬时转染的COS细胞上清液中分离所述蛋白，并用所述树脂结合的αd用作免疫原。选择的小鼠如上所述进行免疫，并在初次免疫后2周给予最后一次加强。通过该技术免疫防止与去垢剂裂解细胞相关的蛋白构象的可能改变。另外的小鼠用也是树脂结合的重组蛋白，但不用从细胞裂解液纯化的蛋白进行初始免疫。
采用非阻断性抗体的Fab片段固定来自细胞上清液的所述重组蛋白上通过ELISA筛选如上制备的由所述免疫产生的杂交瘤。或者，用流式细胞术分析与先前用αdcDNA转染的JY细胞的反应性。
10.作为另一替代方案，如下产生单克隆抗体。从稳定转染的CHO细胞的去垢剂裂解液亲和纯化的αd/CD18异二聚体蛋白与50μg/ml胞壁酰二肽酶一起使用，如上所述免疫Balb/c小鼠。小鼠接受3次免疫，然后通过免疫沉淀所述CHO转染子中的生物素化复合物，测定血清对αd/CD18的反应性。按照标准方案建立来自阳性动物的杂交瘤，此后采用αd/CD18转染子通过流式细胞术选择杂交瘤培养物。用CD11a/CD18转染子作为仅对CD18反应性的对照。
11. 作为单克隆抗体产生的另一替代方法，Balb/c小鼠经历设计用于减低对用于免疫的转染子上CHO细胞决定簇的反应性的免疫/免疫抑制方案。该方案设计用未转染的CHO细胞免疫，和随后用环磷酰胺处理杀伤CHO反应性B细胞未成熟细胞(blast)。进行3轮免疫和环磷酰胺处理后，如上所述用αd/CD18 CHO转染子细胞免疫所述小鼠。
12.作为另一替代方法，通过如上所述预清除来富集来自PMA刺激的HL60细胞去垢剂裂解液的CD18复合物。在相同的柱上清除其它β2整联蛋白。如上所述进行用所产生的复合物免疫、杂交瘤产生和筛选方案。多克隆血清的生产用纯化的αdI结构域/IgG4嵌合体(实施例14)来在兔中产生多克隆抗血清。最初以100μg/兔注射在完全弗氏佐剂中αdI结构域/IgG4抗原，然后用不完全弗氏佐剂中的等量蛋白进行3次加强。在第3次和第4次注射后分析试验放血物。在A蛋白-Sepharose柱上从血清中纯化兔免疫球蛋白(Ig)，并在人IgG/Affigel10柱上预清除抗人IgG反应性。通过ELISA测定对I结构域嵌合物有反应性但对人IgG无反应性，确证已做到完全清除。
用预清除的多克隆血清来免疫沉淀来自预先用αd和CD18表达载体转染的表面生物素化的CHO细胞的去垢剂裂解液的蛋白。采用先前施例10中描述的方法进行免疫沉淀。所述预清除的血清识别分子量与抗CD18单克隆抗体TS1.18所沉淀蛋白的分子量相同的蛋白复合物。另外，在来自αd/CD18转染的CHO细胞的CD18复合物的蛋白质印迹中，所述血清识别一条合适大小的条带。从人脾脏中亲和纯化的整联蛋白CD11a/CD18、CD11b/CD18和VLA4不被所述兔多克隆血清所识别。通过流式细胞术测定，所述血清不能与溶液中αd转染的CHO细胞反应。因此推断所述多克隆兔血清仅能够识别变性的αdI结构域/IgG4蛋白。
在产生对αd/CD18的多克隆抗血清的研究中，用αd转染的CHO细胞(D6.CHO，αd/CD18)与佐剂肽将小鼠免疫3次，用纯化的αd/CD18异二聚体免疫1次。最后的加强仅包括αd/CD18异二聚体。通过于4℃加入约108LFA-1转染CHO细胞达2小时，对约100μl免疫血清进行预清除。以1/5000、1/10000、1/20000和1/40000的稀释度，在正常人脾脏上分析所产生血清的αd反应性。所述多克隆抗体在1/20000的稀释度下具有反应性，而1/40000稀释液染色非常弱。
实施例16采用抗αd单克隆抗体的流式细胞术分析在用抗αd单克隆抗体212D、217K和217L的研究中，使用几种原代细胞系和无限增殖化细胞系。按照实施例17中描述的方法进行细胞染色和分析。对MAGE-3(骨髓瘤相关蛋白)肽特异性的原代CD8+/CD56-和CD4-/CD56+细胞系对于CD11b和CD11c为强阳性，但不被任何所述αd抗体所染色。用负载肽的抗原呈递细胞(APC，或者为树突细胞或者为单核细胞)，从外周血单核细胞群体中扩增MAGE-3肽特异性细胞。在有限稀释条件下重复刺激结合表型选择，产生克隆溶细胞系，所述溶细胞系将特异性地杀伤带有衍生所述肽的天然蛋白的靶细胞。
在细胞因子IL-4和GM-CSF存在下培养7天的来自外周血的树突细胞被抗CD11a、CD11b和CD11c的抗体以及217L抗αd抗体强染色。在重复实验中，抗体212D、217K、217I、217H和217M不与这些细胞反应，也不与得自多种供体的树突细胞反应。到培养的第14天为止，217L抗原的表面表达已经减弱，到第21天为止所述染色完全消失。在所述培养期间，CD11b和CD11c表达保持高水平(高于背景染色20-30倍)。
实施例17αd的人单核细胞表达从外周血纯化人单核细胞从志愿供者将约300ml血液抽取到3.8％柠檬酸钠缓冲液(Sigma)中。用无内毒素的PBS(Sigma)将血液稀释至480ml，将30ml稀释的血液小心铺到50ml离心管中的17ml Histopaque上。BeckmanTabletop离心机中，将所述梯度以1500rpm离心30分钟。从每个梯度收集代表单核细胞的细胞层，并转移至新的50ml离心管中。用无内毒素的PBS、0.1％BSA(无内毒素)将体积增至50ml，将离心管在Beckman Tabletop离心机中以1500rpm离心15分钟。弃去上清液，将细胞再悬浮于小体积的PBS/BSA中并且随后合并。
需要第二个梯度(该梯度采用Percoll[Denholm和Wolber，J.Immunol.Meth.144247-251(1991)]来从如上所述获得的混合细胞群体中纯化单核细胞。简而言之，将10ml 10X Hanks缓冲液(Gibco)与600μl 1.0N HCl混合。向该混合物中加入60ml Percoll(Pharmacia，Piscataway，NJ)，将混合物缓慢搅拌直至所有Percoll溶于溶液中。将所述Percoll溶液的pH调至7.0，此后将8.0ml梯度混合物加入6个15ml圆底聚苯乙烯管中。准确地将4.0ml细胞悬浮液加至每个梯度，将所述管倒转数次以充分混合。于室温下将梯度在定角转子中以1690rpm离心25分钟。收集在梯度中作为薄白带出现的单核细胞部分，将其转移至新的50ml离心管中。用PBS/0.1％BSA将体积调至50ml，并通过离心沉淀细胞。将细胞沉淀再悬浮于小体积中并将其汇集，采用血细胞计数器测定细胞数目。将细胞再悬浮于FACS缓冲液(RPI1640，2.0％FBS，0.2％叠氮化钠)并调至1×106细胞/条件，即各FACS染色条件使用1×106细胞来分析各种细胞标记。FACS染色和分析采用对直接与荧光标记可检测标记缀合的αd或细胞标记具有特异性的抗体，进行单一抗体细胞染色。将小鼠抗人αd抗体212D或217L以10μg/ml加入细胞中，此后将混合物在冰上孵育30分钟，并洗涤3次。10微升直接缀合的细胞标记CD3-FITC(Becton-Dickinson)(T细胞特异性的)或CD33-FITC(Becton-Dickinson)(单核细胞特异性的)加入另外的细胞样品中，而将10μl第二抗体抗小鼠FITC(Sigma)加入212D和217L染色细胞中。将所有样品于冰上在黑暗中孵育30分钟，洗涤3次，并再悬浮于300μl 2.0％低聚甲醛中。样品在BectonDickinson FACScan上加工，并采用Lysys II软件(Becton Dickinson)分析数据。
在第一个实验中，单核细胞占采用双梯度法纯化的总细胞的68％，而T细胞占18％。在两种细胞类型上用212D和217L均有显著量的αd染色，分别为55％和65％的细胞染色。根据后面的实验，在新鲜分离的人单核细胞上αd染色的相对量方面看来有某些供体对供体变异，尽管所述分离的单核细胞总是染色阳性。当将人IgG(在加入第一抗体之前，以1mg/ml在冰上使用10分钟)加入所述细胞中，以阻断任何潜在的Fc受体结合问题时，在所述αd染色方面没有改变。当采用Hydron包被平皿(Interferon Sciences)以10％FBS/RPM-1640悬浮培养这些细胞并分析αd表达时，在24小时内表面表达减少，表达在7天过程中继续减少。相对于新鲜分离的人单核细胞上其它整联蛋白包括CD11a、CD11b和CD11c的表达而言，所述αd染色较低。人单核细胞αd的双色FACS染色对于双色FACS染色，采用NHS-LC-生物素(Pierce)按照生产商的说明，将212D和217L生物素化。在一个单独的实验中，如上所述分离细胞，并用生物素化212D和217L抗体和一种生物素化对照IgG1抗体以10μg/ml在冰上染色30分钟。将细胞在FACS缓冲液(修改以包括D-PBS，2％FBS和0.2％叠氮化钠)中洗涤3次，并再悬浮于1.0mlFACS缓冲液中。将10μl FITC-缀合的CD33(单核细胞特异性的)和5μl链霉抗生物素PE(PharMingen)均加入细胞悬浮液中。将样品在黑暗中于冰上孵育30分钟，在FACS缓冲液中洗涤3次，并再悬浮于300μl 1％低聚甲醛中。样品如上所述经过FACS加工。
在所述两种抗体中，与对照相比，217L表现出在CD33+细胞上显著染色。抗体212D也将该细胞类型染色，但CD33+细胞染色数显著低于用抗体217L观察到的。该结果在两个单独的实验中是一致的。在采用生物素化抗体212D和217L的相关实验中，217L-生物素一致地比212D-生物素染色更多细胞。
通过上述双色分析，也检查了代表在Percoll梯度分离之前获得的代表淋巴细胞和单核细胞混合物的单核细胞，并结合对CD3(T细胞)、CD4(辅助T细胞)、CD5(胸腺细胞、成熟T细胞、B细胞亚群)、CD8(细胞毒性/抑制T细胞)、CD14(单核细胞、嗜中性粒细胞、小结树突网状细胞(follicular dendritic reticulum cells))、CD20(B细胞)和CD56(NK细胞、T细胞亚群)(Becton Dickinson)免疫特异性的FITC-缀合的抗体对212D和217L-生物素进行双染色。没有可辨别的αd阳性细胞群体与这些细胞标记共表达。
实施例18αd分布的分析采用如实施例15所述产生的多克隆抗血清测定αd/CD18的组织分布。
以120ng/ml-60μg/ml的浓度范围使用纯化的兔多克隆抗体，用于冷冻人脾切片的免疫细胞化学分析。将6微米厚度的切片铺在Superfrost Plus Slides(VWR)上，并于-70℃贮存。使用之前，从-70℃取出玻片并于55℃放置5分钟。然后将切片在冷丙酮中固定2分钟并风干。切片在含有1％BSA、30％正常人血清和5％正常兔血清的溶液中于室温下封闭30分钟。将第一抗体于室温下用于每个切片1小时。通过将玻片在TBS缓冲液中洗涤3次，每次5分钟，除去未结合的抗体。接着，将兔抗小鼠IgG连接抗体在相同的TBS缓冲液中应用于每个切片上。于室温下温育30分钟的小鼠碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)抗体用于检测所述第二抗体。然后将玻片在TBS缓冲液中洗涤3次。应用坚牢蓝底物(Vector Labs)，通过浸入水中终止显色。将玻片在核固红(Nuclear Fast Red)(Sigma)中复染，并在水中冲洗，然后用Aqua Mount(Baxer)固定。在脾红髓中用该试剂检测到染色，但用不相关兔多克隆Ig制剂或来自同一动物的未纯化的免疫前血清没有检测到染色。
一旦确定小鼠血清具有特异性αd反应性，则用其将各种淋巴组织和非淋巴组织染色。识别CD18、CD11a、CD11b和CD11c的单克隆抗体作为对照用于同一实验中。用αd多克隆血清以及针对CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体对正常脾切片的染色揭示出以下结果。用αd多克隆血清观察到的图式与CD11a、CD11b、CD11c或CD18的标记图式不同。对于位于白髓中边缘区中的某些细胞有不同的标记图式，对于边缘区外周的细胞也有不同的标记。用所述其它抗体观察不到这种图式。也标记了分散在整个红髓的单个细胞，它们可能是或不是针对CD11a和CD18观察到的同一群体或亚群(subset)。
用CD11c标记的确表现出在所述变边缘区将某些细胞染色，但当与αd多克隆血清相比时该抗体在白髓周围没有表现出所述不同的环图式，在红髓中的标记也没有给出与αd多克隆血清相同的染色图式。
因此，与用针对所述其它β2整联蛋白(CD11a、CD11b、CD11c和CD18)观察到的标记图式相比，用αd多克隆血清观察到的标记图式是独特的，提示αd在人类中的体内分布不同于其它β2整联蛋白的分布。用单克隆抗体特征鉴定人αd表达由杂交瘤169A和169B分泌的抗体用来通过免疫细胞化学分析冷冻组织切片中的人αd表达，通过流式细胞术分析细胞系和外周血白细胞上的人αd表达。用于两组实验中的杂交瘤上清液是未稀释的。组织染色所有染色均如上所述进行，只是肝脏切片按以下方式染色。在丙酮固定后，于室温下将切片在1％H2O2和1％叠氮化钠的TBS溶液中猝灭15分钟。在第一抗体染色后，于室温下应用直接缀合于过氧化物酶的兔抗小鼠抗体。玻片在TBS缓冲液中洗涤3次。将直接缀合于过氧化物酶的猪抗兔抗体于室温下温育30分钟，以检测所述第二抗体。然后将玻片在TBS缓冲液中洗涤3次，然后应用AEC底物(Vector Labs)以进行显色。玻片用苏木精Gill’s No.2(Sigma)复染，随后在水中冲洗，然后进行脱水和固定。
在脾脏切片中，大多数表达定位于脾红髓的根据形态学鉴定为粒细胞和巨噬细胞的细胞上。大量的粒细胞被染色，而仅一个亚群的巨噬细胞给出信号。白髓中少量小结树突细胞也被所述抗αd抗体弱染色。在整个红髓和白髓中检测到CD11a和CD18染色。CD11c染色在脾白髓和所述白髓边缘区中假定为巨噬细胞的大细胞中更为显著；也注意到在所述红髓中的弥散染色。CD11b看来其分布与所述红髓中αd的分布重叠，但不相同，而且不涉及白髓。
比较了在正常的和(类风湿性)关节炎的滑膜组织中的整联蛋白表达。在正常组织中注意到用所有抗整联蛋白抗体(包括与CD11a、CD11b、CD11c、CD18以及αd免疫特异性反应的抗体)的最低染色，在推定为巨噬细胞的居留细胞上广泛分布。在发炎滑膜中，所有整联蛋白的表达更多位于淋巴管周围成簇的细胞上。虽然αd和CD11b的表达图式相似，但CD11c看来不是强表达的，并且限于一个白细胞亚群。
在狗中，在肝巨噬细胞或枯否细胞上观察到CD11b表达，而没有αd表达。正常人肝切片的染色(如先前对于狗肝切片所述，参见上文)证实了在人类中保存(conservation)这种染色图式。另外，检测到低水平的CD11c。在来自肝炎患者的切片中，所有白细胞整联蛋白染色均高于在正常肝脏上观察到的染色，而在这些样品中的巨噬细胞和粒细胞上检测到αd表达。
用抗αd抗体观察到正常人结肠切片的最低染色；观察到微弱的平滑肌染色和白细胞染色。在来自局限性回肠炎患者的切片中以较高水平检测到所有白细胞整联蛋白。
正常的肺表现出有限数目的弱αd阳性细胞；这些细胞根据形态学确定为巨噬细胞和嗜中性粒细胞。在来自肺气肿患者的肺组织中在含有血铁黄素(一种含铁色素)的嗜中性粒细胞和巨噬细胞上观察到染色，表明这些细胞吞入红细胞。
检查了正常脑和来自多发性硬化(MS)患者的斑块损伤(plaquelesion)的切片的整联蛋白表达。在正常脑中，αd染色强度低于CD11a、CD11b和CD11c的染色强度，并且限于通过形态学和CD68染色分型为小神经胶质细胞的细胞。CD11b阳性细胞定位于周围血管和整个所述组织中。CD11c+细胞看来位于血管内，而αd+细胞在所述血管周围。在MS组织切片中，在小神经胶质细胞和非巨噬细胞白细胞亚群上均发现αd表达；αd+细胞位于斑块损伤内以及整个皮质中。αd信号的强度与CD11c相等，但低于CD11b的强度。
用抗白细胞整联蛋白抗体和抗CAM抗体，分析了来自PDAY(青春时期动脉粥样硬化的病理生物学决定因子，LSU Medical Center)组织样品的胸主动脉和腹主动脉切片。所检查的损伤与主动脉脂肪斑纹一致，所述脂肪斑纹由大泡沫细胞(大多数是具有所摄入脂质的巨噬细胞)的内膜下聚集物以及较小白细胞的浸润物组成。采用对αd和其它β2整联蛋白α链(CD11a、CD11b和CD11c)特异性的抗体加上巨噬细胞标记(CD68)的单一标记研究揭示，大多数负载脂质的巨噬细胞表达中等水平的αd和CD18，而分别以弱水平或弱水平至中等水平表达CD11a和CD11c。CD11b微弱表达，然后仅由一个亚群的巨噬细胞微弱表达。
进行双标记研究，以确定所述主动脉切片中αd和ICAM-R抗原的相对定位。由于这些切片中的泡沫细胞被对巨噬细胞标记特异性的抗体Ham 56染色，但不被抗平滑肌肌动蛋白的抗体染色，因此确定所述泡沫细胞不是衍生自内膜下平滑肌细胞。表达αd的CD68阳性巨噬细胞被小ICAM-R阳性白细胞围绕并散布于所述阳性白细胞。看来有有限数目的小白细胞是CD68阴性的，但被αd抗体和ICAM-R抗体染色。
αd在正常组织中的分布看来分布在居留白细胞上，其分布图式与CD11b和CD11c的分布图式有重叠，但不相同，CD11b和CD11c是两种其它白细胞整联蛋白α链，先前已经被鉴定为具有有限的白细胞分布。细胞形态学表明，染色主要限于巨噬细胞和粒细胞，而淋巴细胞的染色有限。一般而言，组织炎症看来增加了在特定组织中观察到的白细胞数目和类型，以及白细胞整联蛋白包括αd的染色增加。由于在病理组织中白细胞整联蛋白的细胞分布和空间分布不同，推定每个家族成员包括αd在特定环境中存在不同的功能和配体。
有趣的是，αd在早期动脉粥样硬化损伤中的表达看来比CD11a、CD11b和CD11c的表达更为显著，提示αd可以在建立这些损伤中起中心作用。表明αd和ICAM-R之间相互作用的证据支持αd阳性细胞和ICAM-R阳性细胞的并列分布，这种并列分布提示在这些损伤的早期αd可能参与白细胞募集或激活。细胞系和外周血白细胞的染色根据FACS测定，抗体169A和169B将前髓单核细胞细胞系HL60染色。αd在这些细胞中的表面表达受PMA刺激的负影响，据报道PMA刺激诱导沿巨噬细胞途径的分化，但所述αd表达不受DMSO影响，DMSO诱导粒细胞分化[Collins等，Blood 701233-1244(1987)]。用PMA刺激获得的169A和169B的FACS分布型与用抗CD11b和抗CD11c单克隆抗体观察到的FACS分布型相反。单核细胞细胞系THP-1也表现出被169A和169B弱染色。另外，通过FACS测定，在外周血白细胞的淋巴细胞和单核细胞门(gate)中的一个细胞亚群看来是弱阳性的。一个亚群的外周血单核细胞被169A和169B弱染色，而发现B淋巴细胞没有αd的表面表达。T淋巴细胞的CD8+亚群是αd+的。另外，抗体169A和169B不能检测到B细胞系JY、Ramos、嗜碱性系KU812和T细胞系Jurkat、SKW和Molt 16上的抗原。
根据采用HL60细胞的结果，通过Ficoll/hypaque梯度离心和随后的红细胞裂解，从外周血中分离出粒细胞。通过用乙酸显现细胞核形态，发现所有制备物均为＞90％PMN。用50ng/ml PMA或10-8M甲酰肽(fMLP)将分离的群体刺激30分钟，以释放先前的胞内整联蛋白贮藏。未刺激的群体表现出低但显著的高于IgG1对照的169A和169B抗原表达，而在刺激时观察到可检测的增加。在PMN上，αd和CD11c的表面表达水平比在HL60细胞上观察到的更为相似。抗体169B随后用来从生物素化PMN的去垢剂裂解液中沉淀一种异二聚体，其亚基大小为约150kD和95kD，分布适合于αd和CD18。
根据已知关于犬αd表达的信息，不可能预期在PMN上存在αd.犬嗜中性粒细胞同其人对应物不同，表达T辅助细胞标记CD4，也表达整联蛋白VLA-4，因此可能在狗中具有不同于在人类中的配体和功能。PBL亚组的染色进行本研究，以确定该β2整联蛋白在人外周血白细胞中的分布。另外，比较相对于其它β2整联蛋白而言αd的细胞表面密度。最后，也评估在纯化的人嗜酸性粒细胞中αd表达的急性调节。
通过密度梯度离心，将人外周血白细胞分离为单核细胞部分(含有单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞)和粒细胞(嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)[Warner等，J.Immunol.Meth.105107-110(1987)]。对于某些实验，用CD16免疫磁选择(immunomagnetic selection)，将嗜酸性粒细胞纯化至纯度高于95％[Hansel等，J.Immunol.Meth.12297-103(1989)]。如以前所述从人皮肤中用酶法分散出皮肤肥大细胞，并进行富集[Lawrence等，J.Immunol.1393062-3069(1987)]。
用对CD11a(MHM24)、CD11b(H5A4)、CD11c(BU-15)或αd(169A)特异性的单克隆抗体的合适稀释液标记细胞。也使用鼠类对照IgG1。将细胞洗涤，然后与藻红蛋白缀合的山羊抗小鼠IgG一起温育。在某些实验中，细胞与过量的鼠类IgG和FITC标记的对特定细胞(例如对于T细胞为CD3、CD4或CD6；对于NK细胞为CD16+淋巴细胞；对于碱性性粒细胞为抗IgE[Bochner等，J.Immunol.Meth.125265-271(1989)]特异性的鼠类单克隆抗体或山羊多克隆抗体一起温育。然后采用合适的鉴定细胞亚群的门，通过流式细胞术(CoulterEPICS Profile)检查样品。
对于检查αd表达急性正调节的使用人类嗜酸性粒细胞的研究中，在用如上所述的各种单克隆抗体标记之前，用佛波醇酯(10ng/ml)、RANTES(100ng/ml)[Schall，Cytokine 3165-183(1991)]或IL-5(10ng/ml)于37℃刺激细胞15分钟。
结果表明，αd存在于所有外周血嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和NK细胞上。也发现一个小亚群(约30％)的CD8+淋巴细胞表达αd。皮肤肥大细胞和CD4-淋巴细胞不表达αd。一般而言，CD11a和CD11b与αd相比，以较高密度存在于白细胞上，αd以类似于CD11c的相对低水平表达。在白细胞中，单核细胞和CD8+细胞具有最高密度的αd，而嗜酸性粒细胞具有最低水平的αd表达。在嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和NK细胞上的表达为中等水平。
用CC趋化因子RANTES刺激外周嗜酸性粒细胞，在任何所述β2整联蛋白表达中均不引起变化。然而，用佛波醇酯处理导致CD11b和αd表达增加2-3倍，但不影响CD11a或CD11c的表达。IL-5处理导致选择性地正调节CD11b表达，而不影响其它整联蛋白亚基的水平。
综合来讲，这些结果表明，在外周血白细胞中，αd一般以与CD11c相当的水平表达。在单核细胞和一个亚群的CD8+淋巴细胞上发现最高水平。人皮肤肥大细胞不表达αd。纯化的嗜酸性粒细胞看来具有预形成的CD11b和αd的胞质内贮藏库。然而，由IL-5对PMA表现出的差别正调节提示，这些贮藏库相互分离。
也采用门控和如上所述的表面标记的组合，通过流式细胞术检查外周血白细胞(PBL)亚组的染色图式，以尝试更精确地限定169A/B阴性淋巴细胞组。如先前所述在Ficoll上分离PBL，并分别用169A、169B和抗CD14(单核细胞/巨噬细胞标记)、CD20(B细胞)、CD56(NK细胞)、T细胞受体α/β(T细胞)、CD16(嗜中性粒细胞、NK)和α4(嗜酸性粒细胞的阴性标记)的单克隆抗体进行染色。通过大小和标记分布限定门控。结果表明，在CD14+单核细胞门中的细胞表现出低水平的169A和169B染色。在较早的实验中在淋巴细胞门中观察到的双峰表达图式，通过增加的前向散射来分辨。混合的TCR+/CD20+群体看来具有低水平但水平均匀的169A/B表达，而一个群体在略高的侧向散射(side scatter)下作图(细胞复杂性)，该群体50％为CD56染色阳性，看来具有一个不同的169A/B阴性群体。所述阴性群体也不为TCR、CD20、CD14或CD16抗体所识别。αd的滑膜分布为了确定αd、其它β2整联蛋白以及它们的对应物在炎性或非炎性滑膜中的细胞分布，在免疫组织学研究中使用了抗所述各种β2整联蛋白的单克隆抗体和免疫球蛋白超基因家族。在正常、骨关节炎和类风湿性滑膜组织样品中检测蛋白表达。
结果表明，所述滑膜内衬细胞层表达高水平的VCAM-1、CD11b/CD18和αd/CD18。在这些细胞中，CD11c/CD18的表达是有限的，而一般检测不到CD11a/CD18。在类风湿性关节炎滑膜炎中，β2整联蛋白在所述滑膜细胞层中的表达随增生程度而按比例增加。表达CD11c的细胞比率显著增加，接近表达CD11b和αd的细胞比率，但在表达CD11a的细胞比率没有增加。
在该组织的内衬下区域中，CD3/CD11a/ICAM-R+淋巴细胞的聚集物和弥散浸润物散布在CD68/CD11b/αd+巨噬细胞中。显著数目的聚集物证明强αd染色，特别是在T细胞富集区中。
滑膜内皮可变地表达ICAM-1和ICAM-2，ICAM-R表达的证据最少。
综合而言，这些结果表明，滑膜巨噬细胞和巨噬细胞样滑膜细胞组成型地表达高水平的β2整联蛋白CD11b和αd。在滑膜炎中，该亚群细胞在内衬和内衬下区中扩增，并且CD11c表达明显增加。类风湿性滑膜T淋巴细胞的特定群体除表达CD11a和ICAM-R外，也表达高水平的αd，以上已经表明后一种分子由外周血淋巴细胞低水平表达。在患病肺和肝组织中的αd表达将来自一个患有肉样瘤病个体的肺组织和来自两个患肝硬变个体的肝组织以6μm的厚度切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)玻片上于室温下风干15分钟。在使用前，将玻片于50℃温育约5分钟。将切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中于室温下固定2分钟，并让其于室温下风干。将切片于室温下置于100ml 1X TBS、1.1ml 30％H2O2(Sigma)、1.0ml 10％NaN3(Sigma)中15分钟，以除去内源过氧化物酶活性。每个切片用150μl含有20％正常人血清(BostonBiomedica)、5％正常大鼠血清(Harlan)和2％BSA(Sigma)在1X TBS的溶液中于室温下封闭30分钟。温育后，轻轻地从切片中吸干溶液。在封闭溶液中制备第一单克隆抗体达到10μg/ml的蛋白浓度，并将75μl于室温下用于每个组织切片1小时。温育后，切片在1X TBS中洗涤3次，每次5分钟，以除去未结合的抗体。通过在最后一次洗涤后抽吸组织周围的TBS，除去过量的TBS。将生物素化大鼠抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)在封闭溶液中以1∶400稀释，将75μl用于每个切片上于室温下达30分钟。玻片用1X TBS洗涤2次，每次5分钟。将过氧化物酶缀合的山羊抗生物素抗体(Vector Laboratories)在封闭溶液中以1∶200稀释，将75μl用于每个切片上于室温下达30分钟。玻片在1X TBS中洗涤2次，每次5分钟。应用底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(Vector Laboratories)或3，3’-二氨基联苯胺(DAB)底物(VectorLaboratories)，通过浸入水中终止显色。将玻片在Gill’s苏木精#2(Sigma)中复染，并在水中冲洗，然后用或者Aquamount(Baxter)或Cytoseal(VWR)固定。
在肉样瘤病肺中，仅217L单克隆抗体将细胞染色，并且大多数217L表位表达被定位至肉芽肿。肉芽肿内的巨细胞看来是217L抗原阴性的。217L表位的表达被定位至从形态上看来是上皮样组织细胞的细胞，上皮样组织细胞是巨噬细胞谱系的高度分化的吞噬细胞。在所述肉样瘤病肺中，观察到其它整联蛋白的分布与217L表位的分布重叠，但表达图式不相同。例如，对所有其它整联蛋白特异性的抗体标记肉芽肿中的细胞以及217L染色阴性的巨细胞。
来自第二个诊断患有肉样瘤病的患者的切片对于217L表位的表达是阴性的，然而从病理学报告中尚不清楚该患者是否接受了类固醇免疫抑制剂，这是最常见的治疗形式。
在来自肝硬变肝组织的切片中，抗αd抗体标记肝小结之间结缔组织中的泡沫细胞以及一个亚群的淋巴细胞。CD11c的分布与αd表达重叠，但不相同；抗CD11c抗体也标记一个亚群的泡沫细胞，但比抗αd抗体标记更多的巨噬细胞和淋巴细胞。在CD11a和CD11b表达与αd表达的分布中没有明显的重叠。抗体217L也将成簇且从用212D和217L两者鉴定的群体中分离出的吞噬细胞染色。抗CD11b和CD11c的抗体以不相类似的方式将217L+细胞簇染色。
在相关实验中，用抗体212D和217L来染色人脾脏组织切片以及非人类灵长类豚尾猴(M.nemestrina)的脾脏的连续切片。也通过流式细胞术，对从新鲜人类和猴脾组织分离出的脾细胞评估其αd表达。抗体212D和217L均识别人类脾细胞和猴脾细胞。通过ICC和FACS测定，αd+群体占总细胞的20％，与表现出更大百分比αd+细胞的啮齿动物不同。所述阳性群体看来形态学上与巨噬细胞相同。人骨髓染色按照标准技术，从健康骨髓供者的髂股获得人骨髓样品。将原始样品在Iscove培养基中以1∶3稀释，并以2000RPM离心20分钟。小心地收集血沉棕黄层，将其洗涤1次并用溶血缓冲液(0.83％氯化铵，0.1％碳酸氢钠，无EDTA)溶血。将细胞再悬浮于含有15％FBS的PBS中，以100,000细胞/管分为100μl的等份并置于冰上。如前所述进行免疫染色。简而言之，将单克隆小鼠抗人αd抗体212D或217L或小鼠抗人CD18抗体或小鼠抗人CD50抗体(ICAM-R特异性的)分别加入每个细胞样品中，达到终浓度为10μg/ml，将混合物在冰上温育20分钟。将细胞洗涤2次，用山羊抗小时FITC温育另外20分钟。洗涤细胞2次，然后再悬浮于1％低聚甲醛中。用荧光激活细胞分类器FACSAN(Becton Dickinson)测定荧光。来自四个实验的结果表明，采用抗体212D测定在13-43％的所述细胞(中值为27％)上发现αd的表达，采用抗体217L测定在6-55％的所述细胞(中值为21％)上发现αd的表达。在60-96％的细胞(中值为71％)上观察到CD18的表达，而在86-99％的细胞(中值为94％)上观察到CD50表达。在乳腺癌患者的外周血单核细胞上的αd表达用血液样品的Ficoll制剂分离来自高危乳腺癌患者的外周血单核细胞，高危乳腺癌患者即预后特征差、已经经历了骨髓移植的乳腺癌患者。通过如上所述免疫染色分析αd的表达来筛选细胞。
结果表明，用抗体212D测定在20％的细胞上发现αd表达，而采用抗体217L在13％的所述细胞上发现αd表达。抗体212D也染色看来最有可能是淋巴细胞的一个亚群的小细胞。表达αd的细胞百分比与一般在正常血液供体中观察到的百分比相当。
另外，抗体212D看来不仅染色为CD14+的大细胞，而且也染色试验性鉴定为CD3+的小得多的细胞。在血液和骨髓中均观察到该结果。
表达αd的细胞数的变化可能解释为供体和供体之间骨髓抽出物的细胞组成(即骨髓量与循环血液量相比)的变化。
实施例19αd表达的正调节因为白细胞整联蛋白在血液透析期间正调节，并且导致在慢性肾衰竭中观察到的免疫改变[Rabb等，J.Am.Soc.Nephrol.61445-1450(1995)和Rabb等，Am.J.Kidnet Dis.23155-166(1994)]，所以检查了血液透析和慢性肾衰竭期间αd/CD18的表面表达。另外，也研究了在PKC刺激后αd/CD18的体外表达。
从5位随机选择的非肾病住院患者获得全血样品。将血液样品与50ng/ml PMA于37℃温育30分钟，然后进行表面染色和流式细胞术。也从慢性肾衰竭患者收集血液样品。患者是稳定的非糖尿病患者，他们一周经历三次透析。在开始透析之前获得基线样品，随后在透析期间于15分钟和180分钟用cuprophane膜抽取样品。来自未患有已知疾病的正常受治疗者的血液样品用作阴性对照。
对于细胞染色，将5μg抗体169A和169B(和阴性对照1B7)与100μl全血在黑暗中温育15分钟。将Becton Dickinson裂解缓冲液(2ml)加入每种混合物中，并在黑暗中继续温育10分钟。然后沉淀细胞，将其再悬浮于PBS中。通过离心再次将细胞沉淀，并与第二FITC缀合的抗体混合，并在黑暗中温育30分钟。然后用PBS洗涤细胞，离心、抽吸并再悬浮于1.0％福尔马林中。
采用Rabb等的方法[J.Am.Soc.Nephrol.61445-450(1995)]进行流式细胞术。用Simulset软件(Becton Dickinson)在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)上分析样品。每个样品分析最少22,000细胞。利用前向散射和侧向散射分选(gate)粒细胞、单核细胞和淋巴细胞亚群。细胞亚群的纯度通过CD45染色和CD14染色来评价。
结果表明，在取自正常人类受治疗者的样品中可以检测到αd/CD18表达；在单核细胞上表达最高，而在淋巴细胞上表达最低。在嗜中性粒细胞上的表达介于单核细胞和淋巴细胞之间。用抗体169B的染色比用抗体169A的染色弱。PMA处理正调节αd/CD18的表达，特别是在嗜中性粒细胞和单核细胞上。
在来自肾衰竭患者的样品中，在透析开始之前，在嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上可检测到αd/CD18的表达。当使用白细胞活化膜透析15分钟后，检测到αd/CD18表达少许增加。到处理结束时，在单核细胞和淋巴细胞上的表达实际上降低了。该结果表明，在透析后，αd/CD18的表达不同于用观察到的CD11a/CD18、CD11b/CD18和L-选择蛋白的表达。
实施例20大鼠cDNA克隆的分离鉴于存在犬和人αd亚基，因此尝试分离在其它物种包括大鼠(本实施例)和小鼠(实施例20，下文)中的同源基因。
表现出与人αd基因同源的大鼠cDNA的部分序列得自大鼠脾λgt10文库(Clontech)。将该文库以2×104pfu/平板接种到150mmLBM/琼脂平板上。如标准方案[Sambrook等，Molecular Cloningalaboratory manual，第2.110页]中所述，将该文库复制到Hybond膜(Amersham)上，变性3分钟，中和3分钟并用缓冲液洗涤5分钟。将膜立即置于Stratalinker(Stratagene)中，用自动交联设置进行DNA交联。将膜分别在用于低严格条件和高严格条件的30％或50％甲酰胺中预杂交和杂交。用由人αdcDNA产生的对应于克隆19A2(SEQ ID NO1)中碱基500-2100的32P标记探针，对所述膜进行初始筛选。用Boehringer Mannheim的随机引发试剂盒，按照生产商建议的方案标记探针。滤膜用2X SSC于55℃洗涤。
鉴定出表现出与人αd、人CD11b和人CD11c具有序列同源性的两个克隆，命名为684.3和705.1。这两个克隆在人αd基因的3’区中与该基因一致，克隆684.2始于残基1871，并延伸至碱基3012，而克隆705.1为从碱基1551至3367。
为了分离更完整的包括5’区的大鼠序列，采用用于初始筛选的同一方案，再筛选同一文库，但利用产生于克隆A1160的小鼠探针(参见实施例20，下文)。从第二次筛选中选择出单个且分离的噬斑，并作为单一克隆维持在LBM/琼脂平板上。将测序引物434FL和434FR(分别为SEQ ID NO34和35)用于标准PCR方案中，以产生用于测序的DNA。5′-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3′(SEQ ID NO34)5′-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3′(SEQ ID NO35)用Quick离心柱(Qiagen)按照生产商建议的方案纯化来自PCR的DNA。
鉴定出与克隆684.3和705.1重叠的两个克隆，命名为741.4和741.11；在所述重叠区中，克隆741.1和741.11与克隆684.3和705.1的同源性为100％。与人αd基因具有同源性的复合大鼠cDNA叙述于SEQ ID NO36中；预测的氨基酸序列叙述于SEQ ID NO37中。大鼠αd5’端的克隆使用Clonetech大鼠脾RACE克隆试剂盒，按照生产商建议的方案，获得大鼠αd基因的5’cDNA片段。所用的该基因特异性寡核苷酸命名为741.11#2R和741.2#1R(分别为SEQ ID NO58和59)。5′-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3′(SEQ ID NO59)5′-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3′(SEQ ID NO58)寡核苷酸741.11#2R包含反向的SEQ ID NO36中的碱基对131-152，而741.2#1R包含也为反向的SEQ ID NO36中的碱基对696-715。用所述最3’的(3’-most)寡核苷酸741.2#1R进行第一次PCR。用寡核苷酸741.11#2R和产生于所述第一次反应的DNA进行第二次PCR。在1％琼脂糖凝胶上检测到一个约300个碱基对的条带。
将第二次PCR的产物按照生产商建议的方案，连接到质粒pCRTAII(Invitrogen)中。挑出白色(阳性)菌落并，将其加入圆底96孔组织培养板各孔含有1μl 50mg/ml羧苄青霉素贮液和1μl M13 K07噬菌体培养物的100μl LBM中。该混合物在37℃温育30分钟至1小时。在初始温育期后，加入100μl LBM(含有1μl 50mg/ml羧苄青霉素和10mg/ml卡那霉素贮液的1∶250稀释液)并于37℃继续温育过夜。
采用无菌96孔金属转移器(transfer prong)，将所述96孔板的上清液转移至4张Amersham Hybond尼龙膜上。采用标准方案，将滤膜变性、中和和交联。滤膜在20ml预杂交缓冲液(5X SSPE；5X Denharts；1％SDS；50μg/ml变性鲑精DNA)中于50℃在震摇下预杂交数小时，。
寡核苷酸探针741.11#1和741.11#1R(分别为SEQ ID NO56和57)分别包含正向和反向的碱基对86-105(SEQ ID NO36)，如下进行标记。5′-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3′(SEQ ID NO56)5′-AGGTTAGACCCATGACAGG-3′(SEQ ID NO57)将12μl dH2O中的约65WP寡核苷酸DNA加热至65℃达2分钟。将3μl 10mCi/mlγ-32P-ATP与4μl 5x激酶缓冲液(Gibco)和1μl T4 DNA激酶(Gibco)一起加入所述管中。将混合物于37℃温育30分钟。温育后，将16μl每种标记寡核苷酸探针加入所述预杂交缓冲液和滤膜中，于42℃继续杂交过夜。滤膜在5X SSPE；0.1％SDS中于室温下洗涤3次，每次洗涤5分钟，然后进行6小时的放射自显影。将阳性克隆扩增，用Magic Mini Prep试剂盒(Promega)，按照生产商建议的方案纯化DNA。选择克隆2F7用于测序，表明在所述重叠区中与克隆741.11的同源性为100％。完整的大鼠αd核酸序列陈述于SEQ ID NO54中；而氨基酸序列陈述于SEQ ID NO55中。大鼠cDNA序列和氨基酸序列的特征先前没有报道β2整联蛋白中大鼠α亚基的核酸序列和氨基酸序列。然而，与所报道的人β2整联蛋白α亚基的序列比较提示，所分离的大鼠克隆及其预测的氨基酸序列与αd核苷酸序列和氨基酸序列最密切相关。
在核酸水平上，与人αdcDAN相比，所述分离的大鼠cDNA克隆表现80％的同一性；与人CD11b相比，表现出68％的同一性；与人CD11c相比，表现出70％的同一性；而与小鼠CD11b相比，表现出65％的同一性。与人CD11a相比和与小鼠CD11a相比时没有发现显著的同一性。
在氨基酸水平上，与人αd多肽相比，由所述分离的cDNA编码的预测的大鼠多肽表现出70％的同一性；与人CD11a相比表现出28％的同一性；与人CD11b相比，表现出58％的同一性；与人CD11c相比，表现出61％的同一性；与小鼠CD11a相比，表现出28％的同一性；而与小鼠CD11b相比表现出55％的同一性。
实施例21RNA印迹分析大鼠组织的αd表达从一组Lewis大鼠组织中获得RNA，以便采用大鼠αd探针进行RNA印迹分析。样品除包括来自正常脾脏、大脑、脊髓、胸腺、皮肤、小肠和大鼠抗原活化的T细胞和患病EAE(试验性变应性脑脊髓炎)脾脏和淋巴结的poly(A)+RNA外，样品还包括来自正常脾脏、肾脏、肝脏、肺部和骨髓的总RNA。使用实施例6中描述的计数进行所述实验。
从大鼠cDNA包括SEQ ID NO54中的核苷酸1184-3008的区域选择αd探针，该区域代表与大鼠CD11c和大鼠CD11b的同源性程度最低的区域。通过用EcoRI限制性酶消化10μg大鼠αdcDNA克隆684.3，产生1124bp的探针。将该片段凝胶纯化，并用于如实施例6中所述的随机引发标记反应。将所述RNA印迹如实施例6中所述进行预杂交、杂交和洗涤，只是将所述探针以5.5×105cpm/ml加入杂交缓冲液中。
在放射自显影5天后，在含有来自正常大鼠以及来自具有活动性EAE的大鼠的脾脏总RNA以及poly(A)+RNA的泳道中鉴定到条带，在具有活动性EAE的大鼠的脾脏中RNA的量显著高于来自正常脾脏的RNA量。检测到的转录物大小与全长大鼠cDNA克隆的大小一致。
实施例22啮齿动物αd特异性抗体-抗大鼠αdI结构域/Hu IgG4融合蛋白的的产生和特征鉴定鉴于已经证明人β2整联蛋白的I结构域参与配体结合，假定对于大鼠αd蛋白情况也是如此。因此对大鼠αdI结构域免疫特异性的单克隆抗体可以用于其中涉及αd结合的人疾病状态的大鼠模型中。
寡核苷酸“大鼠α-DI5”(SEQ ID NO87)和“大鼠α-DI3”(SEQ IDNO88)产生于分别对应于SEQ ID NO54中的碱基对469-493和碱基对1101-1125(反向)的大鼠αd序列。将所述寡核苷酸用于标准PCR反应中，产生含有SEQ ID NO54中跨越碱基对459-1125的I结构域的大鼠αdDNA片段。按照生产商建议的方案，将所述PCR产物连接到载体pCRTAII(Invitrogen)中。选择一个阳性菌落并扩增用于采用Qiagen(Chatswoth，GA)Midi Prep试剂盒，按照生产商的方案进行DNA纯化。所述DNA在标准限制酶消化中用XhoI和BglII消化，凝胶纯化600碱基对的条带，随后将其连接到pDCS1/HuIgG4表达载体中。选择一个阳性菌落，扩增并用Quiagen Maxi Prep试剂盒纯化DNA。
将COS细胞以半汇合接种到100mm培养皿上，并于37℃在7％CO2中生长过夜。细胞用5ml DMEM冲洗1次。向5ml DMEM中加入50μl DEAE-葡聚糖、2μl氯喹和15μg上述大鼠αdI结构域/HuIgG4 DNA。将该混合物加入所COS细胞中并于37℃温育3小时。然后去除培养基，并加入5ml 10％DMSO的CMF-PBS溶液至整1分钟。细胞用DMEM轻轻冲洗。将10ml含有10％FBS的DMEM加入细胞中，并于37℃、7％CO2中继续温育过夜。第二天，培养基用新鲜培养基更换，并继续温育3天。收获培养基，并将新鲜培养基加入平板中。3天后，再次收集培养基并弃去平板。重复所述步骤直至收集到2升培养上清液。
将如上所述收集的上清液加样至ProsepA柱(BioprocessingLimited)上并如下所述进行蛋白纯化。
该柱最初用15倍柱体积的含有35mM Tris和150mM NaCl pH7.5的洗涤缓冲液洗涤。将上清液以低于约60倍柱体积/小时的缓慢速率加样。加样后，该柱用15倍柱体积的洗涤缓冲液、15倍柱体积0.55M二乙醇胺pH 8.5和15倍柱体积50mM柠檬酸pH 5.0洗涤。用50mM柠檬酸pH 3.0洗脱出蛋白。蛋白用1.0M Tris pH 8.0中和并在无菌PBS中透析。
如实施例14中所述分析大鼠αdI结构域。所检测到的蛋白以同人I结构域蛋白观察到的相同方式迁移。抗大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白的单克隆抗体的生产用预先在等体积完全弗氏佐剂(FCA)(Sigma)中乳化的50μg纯化的大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白分别给小鼠免疫。在每只小鼠的背部和胁腹的4个部位注射约200μl所述抗原/佐剂制剂。2周后，给小鼠注射一次100ml预先在等体积不完全弗氏佐剂(FIA)中乳化的100μl大鼠I结构域/HuIgG4抗原(50μg/小鼠)进行加强。再2周后，给小鼠静脉内注射200μl PBS的50μg抗原进行加强。
为了评估免疫小鼠中的血清效价，在第三次免疫后10天在所述动物上进行眶后放血。让血液凝固，通过离心分离血清。将血清用于生物素化(BIP)大鼠脾细胞上的免疫沉淀。来自每只小鼠的血清免疫沉淀大鼠αd和大鼠CD18所预期分子量的蛋白条带。选择一只小鼠用于融合，并如第三次加强所述进行第四次加强。
如上所述通过抗体捕获筛选杂交瘤上清液。用50μl/孔在50mM碳酸盐缓冲液pH9.6中以1∶5000稀释的山羊抗小鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)，于4℃包被Immulon4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)。将板用含有0.05％Tween20的PBS(PBST)洗涤3次，并加入50μl培养上清液。于37℃温育30分钟和如上所述洗涤后，加入在PBST中以1∶3500稀释的50μl辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG9(Fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。将板如上所述进行温育和用PBST洗涤4次。此后，立即加入100μl底物，底物含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml30％H2O2的100mM柠檬酸盐pH 4.5。5分钟后加入50μl 15％H2SO4终止颜色反应。在Dynatech酶标仪上读出490nm的吸光度。
也利用固定化大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白，通过ELISA分析来自含抗体的孔的上清液。用HIgG4抗体包被板进行的ELISA用作对IgG融合配偶体的反应性的对照。选择阳性孔用于利用以下所述的技术，通过大鼠脾细胞裂解液上的BIP进行进一步的筛选。抗大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白的多克隆血清的生产在用完全弗氏佐剂中的100μg纯化的大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白免疫之前，给2只兔预放血。每3周以不完全弗氏佐剂(IFA)中的相同剂量重复注射。3次注射后，给兔子进行试验放血，并收集血清用于大鼠脾细胞裂解液上的标准免疫沉淀。确定来自两只兔子的血清与大鼠αd免疫反应。再次用IFA中的100μg抗原加强兔子，通过免疫沉淀分析所收集血清与大鼠αd的免疫反应性增强。给所述动物最后一次加强，10天后放血并收集血清。大鼠αd组织学针对大鼠αd“I”结构域产生的兔多克隆血清用于通过实施例18中所述技术进行大鼠组织切片的免疫组织化学染色。在冷冻和石蜡包埋的大鼠脾脏切片上检测到的染色图式与用抗人αd抗体观察到的染色图式基本上相同，将整个红髓的单个细胞染色。该染色图式不同于用针对大鼠CD11a、CD11b和CD18的单克隆抗体观察到的染色图式。另外，在胸腺中在整个皮质的各个细胞上观察到一种阳性染色图式。当用兔免疫前血清染色时，这些组织中没有一个给出任何信号。抗体特异性的分析通过用CO2窒息处死大鼠，用标准外科技术取出脾脏。通过用3cc注射器活塞将脾脏在20ml RPMI中温和地推过金属网收获脾细胞。将细胞收集到50ml锥形管中并在适当缓冲液中洗涤。
将细胞在冷D-PBS中洗涤3次，并以108-109细胞的密度再悬浮于40ml PBS中。将4mg NHS-生物素(Simga)加入细胞悬浮液中，让反应于室温下继续进行整15分钟。将细胞沉淀并在冷D-PBS中洗涤3次。
将细胞以108细胞/ml的密度再悬浮于冷裂解缓冲液(1％NP40；50mM Tris-HCl，pH 8.0；150mM NaCl；2mM CaCl2；2mM MgCl；胃蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽和抑酶肽的1∶100溶液，在刚好在加入细胞中之前加入；0.0001g PMSF晶体，刚好在加入细胞中之前加入)中。将裂解液涡旋混合约30秒，在室温下温育5分钟，然后在冰上进一步温育15分钟。将裂解液以10,000xg离心10分钟以沉淀不溶性物质。将上清液收集到新管中并贮藏于4℃至-20℃之间。
通过与200μl A蛋白Sepharose浆液(Zymed)于4℃温育过夜，对1ml裂解液进行预清除。将预清除的裂解液以50μl/管等份分装到Eppendorf管中，用于测试每种抗体。将25μl的多克隆血清或100-500μl单克隆抗体上清液加入预清除的裂解液中，将产生的混合物于4℃在旋转下温育2小时。然后加入100μl结合至A蛋白Sepharose珠粒的兔抗小鼠IgG(Jackson)的PBS浆液，并于室温旋转下继续温育30分钟。温和离心沉淀珠粒，用冷洗涤缓冲液(10mM HEPES；0.2M NaCl；1％ Trition X-100)洗涤3次。通过吸取取出上清液，加入含有10％巯基乙醇的20μl 2X SDS样品缓冲液。将样品在水浴中煮沸2分钟，将样品加样至5％SDS PAGE凝胶上。分离后，将蛋白以恒定电流过夜转移至硝化纤维素上。硝化纤维素滤膜用3％BSA的TBS-T溶液于室温下封闭1小时，然后除去封闭缓冲液。加入链霉抗生物素-HRP缀合物(Jackson)在0.1％BSA TBS-T中的1∶6000稀释液，于室温下继续温育30分钟。将滤膜用TBS-T洗涤3次，每次15分钟，然后用Amersham的ECL试剂盒，按照生产商建议的方案进行放射自显影。抗全长大鼠αd蛋白的单克隆抗体的生产从大鼠脾细胞纯化大鼠αd，以制备用于产生抗大鼠αd单克隆抗体的免疫原。收集来自约50只12-20周龄雌性Lewis大鼠的脾脏，通过迫使脾脏通过细金属网，从该组织制备单细胞悬浮液。通过在含有150mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA pH 7.4的裂解缓冲液中裂解，除去红细胞，剩余的白细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次。通过离心沉淀脾细胞，并在含有50mM Tis、150mM NaCl、2mMCaCl2、2mM MgCl2、10mM PMSF、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂和1％Triton X-100的缓冲液中裂解。脾细胞裂解以每5×108脾细胞1ml裂解液在冰上进行30分钟。离心除去不溶性物质。
通过如下进行免疫沉淀，从脾裂解液中除去CD11a、CD11b和CD11c。将750μl体积的A蛋白-Sepharose浆液与2mg兔抗小鼠免疫球蛋白一起于4℃温育30分钟。所述兔抗小鼠A蛋白-Sepharose用裂解缓冲液洗涤3次，然后悬浮于1.5ml终体积的裂解缓冲液中。将每种大鼠β2整联蛋白特异性单克隆抗体515F(大鼠CD11a特异性)、OX-42(大鼠CD11b特异性)各约200μg和100g(大鼠CD11c特异性)分别加入50ml大鼠脾脏裂解液中。于4℃温育30分钟后，将500μl兔抗小鼠-A蛋白-Sepharose加入所述脾脏裂解液中，并于4℃竖转式(end-over-end)旋转混合30分钟。将裂解液以2500xg离心10分钟，以沉淀结合至兔抗小鼠A蛋白-Sepharose的CD11a、CD11b和CD11c，然后将上清液转移至干净的50ml离心管中。用抗体515F、OX-42和100g的免疫沉淀再重复2次，以确保完全除去CD11a、CD11b和CD11c。
用亲和纯化，分离裂解液中的β2整联蛋白。将约250μl缀合于CNBr-Sepharose的抗大鼠CD18单克隆抗体205C5B浆液加入裂解液中，并于4℃竖转式旋转30分钟。通过以2500xg离心10分钟，沉淀抗体/抗原复合物，将沉淀用裂解缓冲液洗涤3次，然后贮藏于4℃。美洲仓鼠的免疫1.给6-8周龄的美洲仓鼠用完全弗氏佐剂中乳化的约50μg重组蛋白进行最初的免疫，所述重组蛋白由融合于人IgG4重链的大鼠αdI结构域构成。初次免疫后，在第14、33和95天，用在不完全弗氏佐剂中乳化的大鼠αdI结构域/HuIgG4进行随后的免疫。随后进行命名为197和199的两次单独的融合。
融合197(第306天)之前4天，给予1只仓鼠纯化自脾细胞的大鼠αd蛋白和用大鼠αd转染的CHO细胞的组合。在融合之前3天(第307天)用纯化的大鼠αd蛋白和αd转染的CHO细胞给予融合加强。大鼠αd转染的CHO细胞如下所述制备。
将编码全长大鼠αd蛋白的基因区段插入pDC1载体，并通过电穿孔与人CD18-pRC构成物一起转染到CHO细胞中。转染的细胞在次黄嘌呤存在下生长，以选择用pRC构成物成功转染的细胞，并在g418存在下生长，以选择用pDC1构成物成功转染的细胞。3周后，细胞用大鼠αd特异性的兔多克隆血清染色，并通过FACS分类。收集到小百分比的表达最高水平表面αd的细胞(约3％的总群体)，并将其进一步扩增。重复数次FACS选择，以提供具有高水平αd表面表达的一个群体的细胞。
也采用大鼠αd特异性多克隆血清和人CD18特异性单克隆抗体TS1.18.1，通过流式细胞术鉴定所述αd转染的细胞。结果证实，所述转染的CHO细胞表达高水平的大鼠αd和人CD18。
最后，通过免疫沉淀评估所述细胞中αd和CD18的表达。发现大鼠αd特异性兔多克隆血清免疫沉淀具有两种不同分子量的蛋白约170kD的分子量较高的蛋白和95kD的分子量较低的蛋白。这些发现与所述转染的CHO细胞表面上大鼠αd/人CD18异二聚体复合物的表达一致。
融合当天，取出脾脏，通过将脾脏在补充2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清RPMI1640(RPMI)(Gibco，加拿大)中，在两片显微镜玻片的磨砂端之间研磨所述组织，形成单细胞悬浮液。将细胞悬浮液通过无菌70目Nitex细胞滤过器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)过滤，并通过以200xg离心5分钟洗涤2次，然后再将沉淀悬浮于20ml无血清RPMI中。以相似方式制备取自三只初次用于实验的Balb/c小鼠的胸腺细胞。将融合前在含有10％Fetaclone血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.Logan，Utah)的RPMI中保持对数期3天的NS-1骨髓瘤细胞，以200xg离心5分钟，将沉淀如前所述洗涤2次。
将约1.15×108脾细胞与5.8×107NS-1细胞混合，离心并通过抽吸除去上清液。轻敲离心管使细胞沉淀松散，在1分钟内在搅拌下加入7ml 37℃ PEG 1500(75mM Hepes pH 8.0溶液中含量为50％)(Boehringer Mannheim)，然后在7分钟内加入14ml无血清RPMI。再加入8ml RPMI，将细胞以200xg离心10分钟。除去上清液，将沉淀再悬浮于200ml RPMI中，所述RPMI含有15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸苷(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml。将该悬浮液以200μl/孔分配到10块96孔平底组织培养板(Corning，英国)，通过用18G针头(Becton Dickinson)从每孔抽取约100μl，然后加入上述的100μl铺平板培养基，只是所述培养基缺乏胸腺细胞，在融合后第4、5、6和7天饲喂细胞。
第10天，通过流式细胞术，根据对大鼠αd/人CD18转染的CHO细胞的反应性，来筛选来自所述融合孔的上清液。将约5×105大鼠αd转染的CHO细胞悬浮于含有2.0％FBS和0.05％叠氮化钠的50μlRPMI中，将其加入到96孔圆底培养板的约100μl杂交瘤培养上清液中。染色阳性的对照包括兔抗αd多克隆血清和TS1/18(抗人CD18)。将细胞在冰上温育30分钟，在FACS缓冲液(RPMI，2.0％FBS，0.05％叠氮化钠)中洗涤3次，并在冰上与在FACS缓冲液中最终稀释度为1∶200的FITC-缀合的山羊抗仓鼠抗体(Jackson ImmunolResearch Labs)温育30分钟。细胞在FACS缓冲液中洗涤3次，再悬浮于200ml FACS缓冲液中。用Becton Dickinson FACscan分析仪分析样品。为了确保阳性克隆孔是对大鼠αd特异性的，用非转染的CHO细胞进行重复筛选。克隆符合与大鼠αdCHO转染子反应且不与未转染的CHO细胞反应的标准的孔。
在初次筛选后，最初通过双倍稀释，随后通过在RPMI、15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、16mM胸苷和10单位/ml IL-6中进行有限稀释，克隆来自阳性孔的细胞。在有限稀释步骤中，测定表现出生长的孔的百分比，并采用Poisson分布分析，预测克隆率(clobality)。10-12天后，通过FACS分析表现出生长的孔。最后一次克隆后，将阳性孔在RPMI和11％FBS中扩增。克隆产生一个根据这些标准被认为是阳性的培养物，从该克隆亚扩增4个单独的亚克隆，命名为197A-1、197A-2、197A-3和197A-4。
在融合199之前，给第二只仓鼠在第307天用2.3×106大鼠αd(RAD)转染的CHO细胞进行加强。在融合之前4天(第334天)和融合前3天(第335天)给予最后2次免疫。第334天的加强由通过腹膜内注射给予的2×106大鼠αd转染的CHO细胞和200μl结合于Sepharose的纯化大鼠αd(如先前描述的)组成。第335天的加强由也通过腹膜内注射给予的5×106大鼠αd转染的CHO细胞组成。用于融合199的融合和筛选方案与融合197相同，鉴定出上清液与大鼠αd反应的三个杂交瘤，命名为199A、199H和199M，并将其克隆。
2.采用产生融合197和199的相同方案进行第二次免疫。在第334天加强后，直至第394天和第395天才进行进一步的免疫。在融合之前，腹膜内给予仓鼠2×106RAD转染的CHO细胞以及300μl纯化大鼠αd-Sepharose。用于随后的融合205的融合和筛选方案与融合199和197的方案相同，只是在克隆期间使用美洲仓鼠ELISA试剂如山羊抗美洲仓鼠抗体(Jackson ImmunolResearch Labs)作为初始筛选。通过该方法鉴定的阳性孔随后通过如上所述的FACS进行筛选。融合205产生三个单独的阳性克隆，命名为205A、205C和205E。
3.在产生抗大鼠αd单克隆抗体的另一方法中，在第1天皮下给予完全弗氏佐剂中的纯化大鼠αd-Sepharose，免疫6-12周龄BALB/c小鼠。在第25天以相同途径用不完全弗氏佐剂中的同一免疫原给予第二次加强。在第42天，进行与第二次相同的第三次加强。在融合前加强之前不进行进一步加强，所述融合前加强由腹膜内注射的400μl(对于融合226)和250μl(对于融合236)纯化大鼠αd-Sepharose组成。通过考马斯染色测定，每个体积含有约10-15μg抗原。在第62天和63天进行融合226的融合前加强，而在第66天进行融合。对于236，在第132天和133天进行融合前加强，而在第136天进行融合。两种融合方案与上述用于美洲仓鼠融合方案的不同之处在于与所述美洲仓鼠融合中脾细胞与NS-1细胞之比为2∶1比率相比，使用5∶1的比率。
用于融合226和236的筛选和克隆方案与用于融合197、199和205的方案相同，只是通过ELISA进行初始筛选。在所述ELISA中，用山羊抗小鼠全分子来捕获来自杂交瘤上清液的小鼠抗体，，而用山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物来检测小鼠抗体。阳性上清液随后通过上述用于197至205的FACS进行筛选。
融合226产生9个阳性克隆，命名为226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H和226I。融合236产生10个阳性克隆，命名为236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、236L和236M。通过在实施例15中所述的ELISA，确定从这些克隆产生的单克隆抗体的同种型。发现所有抗体均为IgG1同种型。对大鼠αd的单克隆抗体的表征为了表征所述抗大鼠αd抗体，如以上实施例22D节随所述，制备生物素标记的脾脏裂解液。在用于免疫沉淀之前，将裂解液预清除。最初，将50μg/ml正常鼠类免疫球蛋白加入所述裂解液中，将产生的溶液于4℃竖转式旋转30分钟。加入75μl包被有兔抗小鼠免疫球蛋白的A蛋白-Sepharose浆液，并以竖转式旋转继续混合30分钟。在台式微量离心机中，将兔抗小鼠包被的A蛋白珠粒通过以15,000rpm离心4分钟进行沉淀，然后收集上清液。弃去沉淀的物质。
对于每个克隆的杂交瘤，将约300μl上清液置于Eppendorf微量离心管中，向离心管中加入30μl 10％Triton X-100、30μl胃蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽和抑酶肽的100X贮液、100μg PMSF晶体和50μl预清除的生物素化大鼠脾脏裂解液。将样品温和地涡旋混合，并置于4℃竖转式旋转器上30分钟。通过将10mg/ml兔抗大鼠αd特异性多克隆抗体加入50μl大鼠脾脏裂解液中，制备对照样品。
在温育30分钟后，将75μl A蛋白-Sepharose珠粒的PBS浆液加入每种样品中，在竖转式旋转下于4℃温育30分钟。通过在台式微量离心机中于4℃以15,000rpm离心5分钟，沉淀A蛋白偶联珠粒，并收集上清液。沉淀的珠粒顺序用一系列1ml如下的去垢剂洗涤液洗涤缓冲液#1含有10mM Tris、400mM NaCl、1.0％Triton X-100，pH 8.0；缓冲液#2含有10mM Tris、400mM NaCl、0.5％ TritonX-100，pH 8.0；缓冲液#3含有10mM Tris、400mM NaCl、1.0％Triton X-100、0.1％脱氧胆酸盐，pH 8.0；而缓冲液#4含有10mMTris、400mM NaCl、0.5M LiCl2，pH 8.0。用洗涤缓冲液#1进行最后一次洗涤。在每次洗涤之间将珠粒温和涡旋混合，并采用台式微量离心机沉淀。通过移液管除去上清液，在最后一次洗涤后，用Hamilton注射器从珠粒中除去所有剩余的缓冲液。向每种沉淀中加入50μl等份的SDS样品缓冲液，所述样品缓冲液含有溴酚蓝以及焦宁Y染料和终浓度为10％的β-巯基乙醇。将该混合物剧烈涡旋混合1-2分钟，并于室温下温育5-10分钟。将样品在台式微量离心机中于4℃以15,000rpm离心5分钟，收集释放的蛋白并将其转移至新离心管中。将来自每种样品的等份样品在水浴中煮沸4分钟，然后加样至7.5％SDS-PAGE凝胶上。通过PAGE分离后，以200mAmps将蛋白转移至硝化纤维素滤膜1小时，滤膜于4℃在3.0％BSA/TBS-T溶液中封闭过夜。向每张滤膜加入含有链霉抗生物素-OPD的1∶6000稀释液的0.1％BSA-TBS-T溶液，让其于室温下继续温育1小时。在TBS-T中将滤膜洗涤5次，每次10分钟，用Amersham的ECL试剂盒，按照生产商建议的方案进行显色。
发现克隆199M免疫沉淀一种异二聚体蛋白。较大的蛋白亚基的分子量约为170-175kD，这与由兔抗大鼠αd多克隆对照免疫沉淀的蛋白的大小一致。也沉淀了第二种蛋白，其分子量约为95kD，与CD18的分子量一致。
实施例23单克隆抗体199M的特异性用具有缀合的199M单克隆抗体的CNBr-Sepharose亲和柱来从脾细胞裂解液中亲和纯化大鼠αd。简而言之，将约1.3×1010大鼠脾细胞在由150mM NaCl、10mM PMSF、10mM Tris、1％TritonX-100pH 8.0组成的缓冲液中裂解。将缓冲液中的细胞于冰上温育30分钟，并于4℃以10,000xg离心30分钟。
按照下面方法将抗体199M缀合于CNBr活化Sepharose4B(Pharnacia)。将1克活化树脂悬浮于1mM Hcl中15分钟，用15ml 1mM HCl洗涤3次，用含有0.1mM HCO3、0.5M NaCl，pH 8.0的15ml偶联缓冲液洗涤1次。将偶联缓冲液中的抗体199M以约10-20mg/ml的终浓度加入树脂悬浮液中，并将混合物于4℃温育过夜。第二天，通过离心沉淀缀合的树脂，并除去上清液。通过于室温下在0.1M Tris，pH 8.0中温育1小时，封闭树脂上未反应的基团。缀合树脂用0.1M柠檬酸pH3.0洗涤，在裂解缓冲液中以1∶2的含0.1％叠氮化钠的浆液贮藏。
对于亲和纯化，将脾细胞在竖转式混合下与0.4ml 199M缀合的Sepharose树脂一起温育过夜。然后树脂通过离心沉淀，并用15ml裂解缓冲液洗涤4次。将等份的约100μl每张凝胶在还原样品缓冲液中短暂煮沸，所述样品缓冲液含有0.1M Tris-HCl，pH 6.8、2.0％SDS、20％甘油、0.0002％溴酚蓝、10％β-巯基乙醇(终浓度为5％)，并将其加样至6.0％聚丙烯酰胺SDS凝胶(SDS-PAGE)上，并采用该凝胶分离蛋白。
发现亲和纯化的物质在SDS-PAGE上分离时，含有两个主要蛋白种类和一个次要蛋白种类。分子量为90kD的一个主要蛋白条带与CD18的已知大小一致，未对该条带测序。检测到160kD的第二个主要条带，它与αd的预测分子量一致。另外，也检测到表观分子量为200kD的一个次要条带。通过进行氨基末端蛋白质测序，并将结果与大鼠αdcDNA预测的氨基酸序列以及CD11c和CD11b的已知氨基酸序列进行比较，对160kD和200kD种类进行进一步分析。发现160kD和200kD条带的序列与克隆的大鼠αd的预测氨基酸序列一致，表明可能有两种形式的αd，也许产生于剪接变体或糖基化差异。
实施例24利用表达大鼠αd的巨噬细胞的T细胞增殖测定将从大鼠脾脏分离的表达αd的巨噬细胞用作抗原呈递细胞(APC)，以刺激名为LR-21的髓磷脂碱性蛋白特异性T细胞系。简而言之，给大鼠静脉内注射100μl体积的铁粒子(BioMag，Cambridge，MA)。第二天，从脾脏制备单细胞悬浮液，并用磁铁收集已经吞噬铁粒子的αd+巨噬细胞。流式细胞术和免疫沉淀表明，50-80％吞噬铁的细胞是αd+。
结果表明，与例如胸腺巨噬细胞的其它APC相比，表达αd的脾脏巨噬细胞是非常差的APC。在该增殖测定中，也用αd阳性巨噬细胞和LR-21细胞系，测试了命名为205C的单克隆抗体。然后如下进行增殖测定。
将αd表达阳性的脾脏巨噬细胞以6×106细胞/ml的密度悬浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，每孔加入100μl所述巨噬细胞悬浮液。将来自LR-21系的细胞以1×106细胞/ml悬浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，并且每孔加入50μl所述悬浮液。将50μl体积的单克隆抗体205C加入每孔中，至终浓度为50、10和2μg/ml。将板于37℃温育72小时，在温育的最后24小时加入1μCi3H-胸苷。将细胞收获至玻璃纤维垫上，用直接β计数器(Packard Matrix 96)测定3H的掺入。
来自所述实验的结果表明，高浓度的抗体205C(10和50μg/ml)能够以剂量依赖方式减少T细胞的增殖。
实施例25从大鼠骨髓免疫沉淀αd通过用PBS冲洗股骨，从Lewis大鼠收获骨髓细胞。将细胞洗涤、生物素化，并基本如实施例18中所述，用20μg纯化的单克隆抗体免疫沉淀，以免疫沉淀来自100μl预清除细胞裂解液的蛋白。以先前所述的方式进行免疫沉淀蛋白的测定。
大鼠αd单克隆抗体205C免疫沉淀两个条带，它们以160kD和95kD迁移。这一大小的条带与在用同一抗体免疫沉淀来自脾细胞裂解液的蛋白中观察到的αd/CD18中的α和β链的大小一致。抗大鼠CD11a、CD11b或CD11c的抗体免疫沉淀的α链不同于αd，并且所有抗体共免疫沉淀分子量与CD18已知分子量一致的蛋白。
实施例26αd在动物模型中的表达初步结果表明，大鼠αd由巨噬细胞亚群选择性地表达，所述巨噬细胞亚群包括胸腺中的皮质巨噬细胞、肝脏中的肝巨噬细胞、中枢神经系统中的血管周围细胞、腹膜神经细胞的一个亚群和居留骨髓巨噬细胞。另外，用地塞米松刺激后，一个亚群的硫代乙醇酸巨噬细胞表现出αd表达的正调节。观察到的巨噬细胞限制的大鼠αd表达，建议进一步分析在各种动物模型中αd的表达。大鼠αd在苯肼模型中的表达将苯肼给予动物，导致引起一过性贫血的大量红细胞(rbc)损伤。损伤的rbc通过红髓巨噬细胞从循环中清除，导致明显的脾大。提出表达αd的巨噬细胞可能参与从循环中清除损伤rbc和其它外源物质。
为了测试这一假说，仅用盐水或用溶于盐水中的苯肼处理各组大鼠，并通过以100mg/kg体重的剂量腹膜内注射给予各组大鼠。在某些实验中，用针对大鼠αd“I结构域”产生的多克隆抗血清处理大鼠。
在给予苯肼后的各个时间点处死动物。将脾脏重量和血细胞比容用作rbc清除的参数。另外，收集肾脏、脾脏和肝脏用于组织病理学评估，这包括CD11a、CD11b、CD11c和αd的免疫染色。
总的发现表明，用苯肼(盐水对照和αd处理)处理后4天，大鼠产生明显的脾大，而血细胞比容水平下降。用αd多克隆血清处理对脾脏重量或者用苯肼诱发的血细胞比容的下降没有影响。
将来自盐水处理的大鼠和苯肼处理4天的大鼠的组织以4μm厚度切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)玻片上于室温下风干15分钟。在使用之前，将玻片于50℃温育约5分钟。将切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中于室温下固定2分钟，让其于室温下干燥。将切片于室温下在100ml 1X TBS、1.1ml 30％H2O2(Sigma)、1ml 10％NaN3(Sigma)中放置15分钟，以除去内源过氧化物酶活性。每个切片用150μl含有30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的1X TBS的溶液中于室温下封闭30分钟，此后将溶液轻轻从切片中吸干。每个切片接受75μl封闭溶液中稀释的蛋白浓度为13.3μg/ml的生物素化仓鼠抗大鼠αd抗体205C，于室温下达1小时。温育后，切片在1X TBS中洗涤3次，每次5分钟，以除去任何未结合的抗体。通过在最后一次洗涤后吸取所述组织周围的TBS，除去过量的TBS。过氧化物酶缀合的山羊抗生物素抗体(Vector Laboratories)在封闭溶液中以1∶200稀释，将75μl用于每个切片上，于室温下达30分钟。温育后，切片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。应用AEC底物(Vector Laboratories)，并通过浸入水中终止颜色反应。将切片在Gill苏木精#2(Sigma)中复染，并在水中冲洗，此后将它们连续在70％、95％、100％EtOH和二甲苯中脱水。然后用cytoseal(VWR)将切片固定。
在盐水处理的大鼠脾脏切片中，大多数αd表达定位于脾脏红髓中形态学鉴定为巨噬细胞、粒细胞和一个淋巴细胞亚群的细胞上。然而在苯肼处理的大鼠脾脏中，脾脏红髓经历了形态改变，以致于唯一鉴定的细胞类型是已经吞噬了损伤的红细胞的大巨噬细胞群体。观察到大多数这些大巨噬细胞表达αd。也在苯肼处理的大鼠中，看来在脾脏白髓中表达αd的巨噬细胞数有增加。
也在苯肼处理的大鼠脾脏中进行了一个测定αd和CD11c表达的双标记实验。如前所述，在脾脏红髓中看来已经吞噬了受损红细胞的大巨噬细胞上检测到αd表达。在脾脏红髓中的大巨噬细胞中也检测到CD11c表达，看来在红髓中CD11c阳性细胞比αd阳性细胞多。大多数表达αd的巨噬细胞也表达CD11c，即使观察到一个小亚群的αd阳性巨噬细胞不表达CD11c。也有一个群体的CD11c阳性巨噬细胞不表达αd。
因此，免疫组织学分析表明，在第4天，与盐水对照相比，在苯肼处理的动物的脾中看来有CD11c表达的正调节。然而，其它整联蛋白CD11a、CD11b和αd的表达看来未受苯肼处理的影响。用多克隆“I”结构域αd抗体也显示对红髓巨噬细胞摄入rbc没有影响，但大多数吞噬rbc的巨噬细胞是αd阳性的。在给予苯肼后7天收集的脾脏中，不存在已经吞噬受损rbc的αd阳性巨噬细胞。
然后在第4天苯肼处理的大鼠脾脏上，用细胞凋亡测定和利用生物素缀合抗体205C的ICC，进行了双标记实验。将来自正常大鼠和第4天苯肼处理大鼠的组织以4微米厚度切片，并在Superfrost Plus玻片(VWR Scientific)上于室温下风干15分钟，并于-20℃贮藏。在使用之前，将玻片温热至50℃。将温热的玻片于室温下置于含有100ml1X TBS、1.1ml 30％H2O2(Sigma)、1ml 10％NaN3(Sigma)中放置15分钟，以除去内源过氧化物酶活性。每个切片用150μl含有20％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的1X TBS的溶液中于37℃封闭10分钟，此后将溶液轻轻从切片中吸干。每个切片于37℃与75μl生物素化仓鼠抗大鼠αd抗体205C一起温育30分钟，蛋白浓度为封闭溶液中稀释的26.6μg/ml。然后切片在1X TBS中洗涤3次，每次5分钟，以除去任何未结合的抗体。在最后一次洗涤后，通过吸取所述组织周围的TBS，除去多余的TBS。将按照生产商的说明制备的碱性磷酸酶缀合的抗生物素/生物素复合物(VectorLaboratories)于37℃用于每个切片20分钟。温育后，玻片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。将切片用4％低聚甲醛(Sigma)于4℃固定。然后将切片在1X PBS中冲洗，并于4℃在CSK缓冲液(100mMNaCl，300mM蔗糖，10mM pipes pH 6.8，3mM MgCl2，0.5％Triton-X-100)中放置2分钟。将切片在1X PBS中于室温下洗涤2分钟，此后将切片用1X PBS中洗涤3次，每次5分钟。将TUNEL反应混合物(Boehringer Mannheim)于37℃用于每个切片60分钟。温育后，将切片在1X PBS中洗涤3次，每次洗涤5分钟。细胞凋亡试剂盒方法学与原位杂交类似；所述TUNEL试剂(它为FITC缀合的)与“裸露”DNA杂交。将Converter-POD(识别TUNEL试剂上的FITC标记的过氧化物酶缀合的抗体)于37℃用于每个切片30分钟，并用1X PBS洗涤切片3次，每次5分钟。应用AEC(Vector Laboratories)，并通过浸入水中终止颜色反应。将切片用Aquamount(VWR)固定。
在该模型中，脾脏红髓和白髓中的许多细胞均经历细胞凋亡，但发现红髓中已经吞了RBC的大巨噬细胞(其表达αd，并在该模型的第7天消失)不经历细胞凋亡。正常大鼠脾脏上大鼠αd表达的细胞类型分析为了确定哪些大鼠细胞类型表达αd，在正常大鼠脾脏上进行双标记染色。如上所述通过大鼠血清封闭步骤，制备正常大鼠脾脏的切片。在加入第一细胞标记抗体后，将碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)在用于第一抗体的相同稀释剂中以1∶500稀释，并将75μl于室温下用于每个切片30分钟。将切片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。将碱性磷酸酶缀合的猴抗山羊抗体(JacksonLaboratories)在抗体稀释剂中以1∶300稀释，并将75μl于室温下用于每个切片30分钟。如上洗涤和封闭后，每个切片接受75μl蛋白浓度为20μg/ml的生物素化仓鼠抗大鼠αd抗体(205C)达1小时45分钟，然后进行洗涤以除去未结合的抗体。通过在最后一次洗涤后吸取组织周围的TBS以除去过量的TBS。将过氧化物酶缀合的山羊抗生物素(Vector Laboratories)在抗体稀释剂中以1∶200稀释，并将75μl于室温下用于每个切片45分钟。将切片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。应用AEC底物(Vector Laboratories)，并通过浸入水中终止颜色反应。然后应用坚牢蓝底物(Vector Laboratories)，并通过浸入水中终止颜色反应。然后切片用Aquamount(Baxter)固定。
采用抗CD5、CD2、CD4、CD8、NK标记或HIS 45(T细胞标记)的抗体并结合抗αd抗体进行双抗体免疫细胞化学分析，以尝试确定表达αd的细胞表型。用CD2/αd或HIS 45/αd未检测到双标记细胞。在正常大鼠脾脏红髓中，αd标记了发现也表达CD5的小细胞簇。未确定所述CD5阳性细胞是T细胞还是B细胞。也确定在红髓中一其小群体的αd表达细胞表达CD4。另外，也鉴定出一个亚群的NK细胞和CD8阳性细胞表达αd。因此，脾脏中的αd表达发现位于一个亚群的T细胞上，可能是一个B细胞亚群、一个NK细胞亚群和一个巨噬细胞亚群。来自F344大鼠模型的大粒细胞性白细胞(LGL)肿瘤细胞的αd表达用从国立癌症研究所获得的肿瘤细胞，将其静脉内注射给3只F334大鼠(每只106细胞)，在所述F344大鼠中设计了LGL白血病的大鼠模型。该疾病用3个月来表现，此时处死其中几只动物，通过FACS和组织化学分析检查组织。
对于FACS分析，取出一部分所述脾脏，如以下实施例中所述制备单细胞悬浮液。简而言之，用剪刀将脾组织切为较小的块，并使其在D-PBS存在下通过金属网。离心沉淀细胞，并将其重悬浮于30mlD-PBS中。通过将5.0ml细胞悬浮液铺在15ml离心管中的5.0mlHistopaque上，制备Histopaque梯度(Sigma)。采用Beckman台式离心机将梯度以1500rpm离心30分钟，收集细胞层，并在D-PBS中洗涤1次，然后通过血细胞计数器技术。将细胞再悬浮液FACS缓冲液(RPMI-1640/2％FBS，0.2％叠氮化钠)中至1×106细胞/样品的密度。
通过与缀合于生物素的仓鼠抗大鼠αd抗体205C(10μg/ml)和一系列缀合FITC的抗大鼠细胞标记的抗体一起温育，对所述细胞进行双色染色。除包括具有NK细胞特异性的FITC缀合抗体(Harlan)外，这些第二抗体还包括抗巨噬细胞FITC、抗CD3-FITC和抗IgM(B细胞)-FITC抗体(均得自ParMingen)。所述FITC缀合的抗体各以10μl/样品使用。
将样品首先在冰上与205C-生物素抗体一起温育30分钟，在FACS缓冲液中洗涤3次，并再悬浮于1.0ml FACS缓冲液中。加入FITC缀合物以及5μl链霉抗生物素-PE(Pharmingen)，并将样品置于冰上30分钟。温育后，样品在FACS缓冲液中洗涤3次，并再悬浮于200μl FACS缓冲液中。用Becton Dickinson FACscan检查样品，并利用Lysis II软件(Becton Dickinson)分析数据。
结果令人信服地证明在NK细胞或LGL细胞上αd的表达。B细胞标记和T细胞标记染色阳性的细胞没有表现出αd表达，用巨噬细胞标记染色的细胞仅表现出轻微程度的αd表达。据信，在疾病的这一点上，脾脏主要由NK肿瘤细胞组成，与大群体的脾细胞染色既表达NK标记又表达αd的观察一致。
这些观察也与得自一个平行实验的结果一致，该平行实验采用也从所述相同动物并如上用于FACS所述加工的外周血细胞。采用外周血细胞的结果表明，循环NK细胞也表达αd，而血液中表达其它细胞标记的细胞没有表现出αd表达。然而，采用外周血细胞的结果没有脾细胞的结果显著，推定是由于脾脏和外周血中存在的不同细胞类型百分比的差异而引起的。
在随后的对来自这些模型动物的脾细胞的FACS分析中，获得相同的结果。在利用上述方法进一步分析细胞制备物时，也已经表明LGL肿瘤细胞对于CD18以及CD11a、Cd11b和CD11c表达是染色的。
采用上述的ICC方法，在正常组织和NK F344患病组织上进行了组织化学分析。初步数据表明，αd在NK F344肿瘤肺组织和肝组织中表达，但在正常的相应组织中检测不到，或以非常低的水平表达。患病肺组织表现出αd在小细胞簇和大细胞簇上以及整个肺部的单个细胞上表达。NK F344肝在血管周围以及所述组织的其它细胞中显示弱标记。抗所述其它β2整联蛋白的抗体表明，这些分子在正常组织和患病组织中均以相似水平表达，尽管标记图式的确不同。
在平行分析中，正常大鼠胸腺表现出在皮质中散布细胞中轻微的αd表达，而F344 NK胸腺表现出αd表达水平提高。正常脾脏表现出在红髓中表达，而NK脾脏在整个组织中具有成簇的标记。
然后从疾病发作时起以一周的间隔测试NK脾脏，表明αd表达水平提高直至第3周，然后在第4周下降。
实施例27利用抗αd单克隆抗体分析对NK肿瘤细胞诱发的靶细胞裂解的抑制NK细胞的一个特定功能是导向并杀伤病毒感染细胞和外源细胞。为了分析NK细胞裂解特定靶细胞的能力，用51Cr标记靶细胞，当裂解发生时，在培养基中检测到放射性增加。假定先前显示在NK细胞上表达的αd可能参与NK定向的细胞杀伤。为了试验这种假说，将肿瘤细胞与αd抗体预温育，以便评价αd在功能分析中的作用。αd阳性NK肿瘤效应细胞的制备给F344大鼠注射NK肿瘤细胞，所述肿瘤细胞最初得自国立癌症研究所，并在取出脾脏之前通过动物传代3-4周。取出脾脏，将其切成小块，并使小块在D-PBS存在下通过金属网。所产生的细胞悬浮液于室温下在Beckman台式离心机上以1500rpm离心10分钟。吸出上清液，将细胞沉淀再悬浮于30ml D-PBS中。
如下进行从血液中Histopaque分离单核细胞。将5ml Histopaque(Sigma)加入6个15ml离心管中，在其上如上所述铺上5.0ml细胞悬浮液。将细胞在Beckman台式离心机中以1500rpm于室温下离心30分钟。收集细胞层，将其合并并用血细胞计数器计数。在D-PBS缓冲液中制备所分离的肿瘤细胞的几种稀释液，随后将其在存在或缺乏浓度为50μg/ml的抗大鼠αd抗体情况下温育。对照抗体包括抗大鼠CD18抗体和抗大鼠ICAM-1抗体，将对照抗体也以50μg/ml的浓度与所述细胞一起温育。在分析之前，将肿瘤细胞与抗体于37℃预温育30分钟。Yak-1靶细胞的Cr标记在10％FBS/RPMI 1640中培养Yak-1细胞(ATCC)，这是一种小鼠淋巴瘤细胞系。通过离心收获细胞，并将其以约1×107细胞的密度再悬浮于1.5-4.0ml RPMI“试验培养基”中，所述“试验培养基”由500ml RPMI 1640、5ml Pen-Strep抗生素溶液和10ml FBS制备。将约200-300μCi的51Cr加入Yak-1细胞悬浮液中，然后将其于37℃在温和混合下温育45-60分钟。温育后，用试验培养基将体积增至50ml，并通过离心沉淀细胞。弃去上清液，将细胞悬浮于1-3ml试验培养基中，并调至5×104细胞/ml的密度。也以1×107细胞/ml的浓度制备非标记的Yak-1细胞，用作自体对照。
通过利用γ计数器分析三份平行测定中的100μl所述标记的细胞悬浮液，测定标记细胞的活性。短期铬释放测定将每种稀释度的NK效应细胞以三份平行样品接种到96孔微量滴定板中的体积为100μl的试验培养基中，向每孔中加入100μl标记的Yak-1细胞。通过在每个效应子稀释度下，将100μl标记细胞与未标记Yak细胞一起温育，获得自体释放，即自发或背景释放。通过将1.0％Triton加入一组孔中的靶细胞中，获得总的51Cr释放。根据在仅有靶细胞的孔中发现的51Cr量确定自发释放。效应子/靶细胞的温育于37℃进行4小时，此后将所述板离心，从每孔收集100μl上清液，并测定放射性。
利用以下公式计算细胞裂解活性 结果表明，仓鼠抗大鼠αd抗体(包括199M和205C)或者小鼠抗大鼠αd抗体(226A、226B、226C、226D、226F、226G、226H和226I)均不影响NK肿瘤细胞杀伤或裂解标记的靶细胞的能力。
实施例28小鼠cDNA克隆的分离尝试分离小鼠αd同系物。
采用两种PCR产生的探针对应于来自人克隆19A2(SEQ ID NO1)的碱基522-2047的1.5kb片段以及对应于人克隆19A2(SEQ ID NO1)中碱基1900-2900的1.0kb大鼠片段，进行交叉物种杂交。用分别叙述于SEQ ID NO38和39中名为ATM-2和9-10.1的引物对，产生所述人探针；用分别描述于SEQ ID NO34和35的引物对434L和434R产生所述大鼠探针。将样品于94℃温育4分钟，然后经过以下温度步骤顺序的30个循环94℃；50℃2分钟；72℃4分钟。5′-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3′(SEQ ID NO38)5′-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3′(SEQ ID NO39)用Qiagen Quick Spin试剂盒，按照生产商建议的方案，纯化PCR产物，并用Boehringer Mannheim的随机引物标记试剂盒，按照生产商建议的方案用200μCi[32P]-dCTP标记约180bp DNA(180 inDNA)。用Centri-sep离心柱(Princeton Separation，Adelphia，NJ)，按照生产商建议的方案除去未掺入的放射性同位素。在使用之前，用0.2NNaOH将探针变性，并用0.4M Tris-HCl pH 8.0中和。
将λZAPII(Stratagene)中的小鼠胸腺寡核苷酸dT引发的cDNA文库以约30,000噬斑/15cm平板铺平板。将硝化纤维素滤膜(Schleicher& Schuell，Keene，NH)上的噬斑复制物在搅拌下，于50℃含有30％甲酰胺的预杂交溶液(8ml/复制物)中温育1小时。将标记的人探针和大鼠探针加入预杂交溶液中，于50℃继续温育过夜。滤膜在2X SSC/0.1％SDS中于室温下洗涤2次，在2X SSC/0.1％SDS中于42℃洗涤1次。利用增感屏将滤膜于-80℃曝光于Kodak X-Omat AR胶片27小时。
将在双份的复制物上产生阳性信号的4个噬斑在含有镁的LB培养基(LBM)/羧苄青霉素(100mg/ml)的平板上再划线接种，并于37℃温育过夜。用Hybond滤膜(Amersham)复制噬斑，如初次筛选一样进行探测，并利用增感屏，于-80℃曝光于Kodak X-Omat AR胶片24小时。
将产生阳性信号的12个噬斑转移至含有10mM Tris-HCl和1mMMgCl2的低Mg++噬菌体稀释液中。采用T3和T7引物(分别为SEQ IDNO13和14)和以下反应条件，通过PCR扩增确定插入片段的大小。将样品于94℃温育4分钟，然后经过30个循环的以下温度步骤顺序94℃15秒；50℃30秒；和72℃1分钟。
6个样品产生不同的条带，大小范围为300个碱基至1kb。通过与辅助噬菌体共感染释放噬菌粒，并将其再环化产生BluescriptSK(Stratagene)。将所产生的菌落在LBM/羧苄青霉素(100mg/ml)中培养过夜。用Promega Wizard小量制备试剂盒(Madison，WI)，按照生产商建议的方案分离DNA。对纯化DNA的EcoRI限制分析证实了用PCR检测的分子量。利用分别叙述于SEQ ID NO40和41中的M13和M13reverse.1引物，对插入片段DNA测序。5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′(SEQ ID NO40)5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′(SEQ ID NO41)如实施例4中所述进行测序。
在6个克隆中，仅名为10.3-1和10.5-2的2个克隆提供序列信息并且是相同的600bp片段。所述600bp片段与人αd的对应区有68％相同，与人CD11a有40％相同，是人CD11c有58％相同，而与小鼠CD11b有54％相同。然后利用该600bp片段来分离更完整的编码推定小鼠αd同系物的cDNA。
将λZapII(Stratagene)中的小鼠脾cDNA文库(寡聚dT和随机引发的)以2.5×104噬菌体/15cm LBM平板进行平板接种。将噬斑复制在Hybond尼龙转移膜(Amersham)上，用0.5M NaOH/1.5M NaCl变性，用0.5M Tris碱/1.5M NaCl/11.6 HCl中和，并在2X SSC中洗涤。将DNA通过紫外辐射交联至滤膜上。
用先前如上所述标记的探针10.3-1和10.5-2筛选约500,000噬斑。将探针加入预杂交溶液中并于50℃温育过夜。滤膜在2X SSC/0.1％SDS中于室温下洗涤2次，在2X SSC/0.1％SDS中于37℃洗涤1次，在2X SSC/0.1％SDS中于42℃洗涤1次。利用增感屏，将滤膜于-80℃曝光于Kodak X-Omat AR胶片24小时。对在双份复制物上产生阳性信号的14个噬斑进行第二次筛选，第二次筛选与初次筛选相同，只是在2X SSC/0.1％SDS中于50℃、在0.5X SSC/0.1％SDS于50℃和在0.2X SSC/0.1％SDS于55℃进行另外最后的高严格性洗涤。利用增感屏，将滤膜于-80℃曝光于Kodak X-Omat AR胶片13小时。
将18个阳性噬斑转移至低Mg++噬菌体稀释液中，如上所述通过PCR扩增测定插入片段的大小。所述样品中的7个样品给出大小范围为600bp-4kb的信号条带。对所纯化DNA进行的EcoRI限制分析证实了来自PCR观察到的大小，用引物M13和M13 reverse.1(分别为SEQ ID NO40和41)对所述DNA测序。
仅一个名为B3800的克隆含有对应于人αd19A2克隆5’端下游200个碱基的区域的4kb插入片段，并包括3’非翻译区的553个碱基。克隆B3800表现出与人αd的对应区有77％同一性，与人CD11a的对应区有44％同一性，与人CD11c的对应区有59％同一性，与小鼠CD11b的对应区有51％同一性。第二个克隆A1160是1.2kb的插入片段，其序列与人αd起始甲硫氨酸下游约12个核酸的人αd编码区5’端一致。克隆A1160表现出与人αd的对应区有75％同一性，与人CD11a的对应区有46％同一性，与人CD11c的对应区有62％同一性，与小鼠CD11b的对应区有66％同一性。
克隆A1160是更接近人克隆A19A2的5’端的片段，其长度为1160个碱基，与克隆B3800共享始于碱基205并继续至碱基1134的重叠区。克隆A1160具有一个在克隆B3800的重叠区不存在的110个碱基插入(克隆A1160的碱基704-814)。该插入发生在可能的外显子-内含子边界[Fleming等，J.Immunol.150480-490(1993)]并在随后连接克隆A1160和B3800之前将其除去。推定的小鼠αd克隆5’cDNA末端的快速扩增利用RACE PCR[Frohman，“RACEcDNA末端的快速扩增”，PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Innis等(编辑)，第28-38页，Academic PressNew York(1990)]来获得推定小鼠αd克隆的缺失的5’序列，包括5’非翻译序列和起始甲硫氨酸。按照生产商建议的方案使用小鼠脾脏RACE-Ready试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)。设计两种反义基因特异性引物A1160 RACE1-初次引物和A1160RACE2嵌套引物(SEQ ID NO42和43)，进行初次PCR和嵌套PCR。5′-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3′(SEQ ID NO42)5′-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3′(SEQ ID NO43)引物SEQ ID NO42和43分别对应于始于距所述5’端302个碱基和247个碱基的区域。采用5’锚定引物(SEQ ID NO44)和与试剂盒一起供应的小鼠脾cDNA如上所述进行PCR。5′-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3′(SEQ ID NO44)所述PCR产物的电泳揭示出一个大小约280个碱基的条带，用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照生产商建议的方案将其亚克隆。培养所产生的菌落，分离DNA并对DNA测序。用该方法鉴定出另一60个碱基的5’序列，其对应于SEQ ID NO45中的碱基1-60。小鼠cDNA序列和预测氨基酸序列的特征编码人αd推定的同系物的小鼠cDNA的复合序列叙述于SEQ IDNO45中。虽然人克隆和小鼠克隆的外部结构域之间的同源性高，但胞质结构域之间的同源性仅为30％。所观察到的变异可能表明人蛋白和小鼠蛋白之间的C末端功能差异。或者，所述胞质结构域中的变异可能产生于间接变异，或可能表明存在另外的β2整联蛋白基因。
在氨基酸水平上，所述小鼠cDNA预测了一种蛋白(SEQ ID NO46)，该蛋白与小鼠CD11a的同一性为28％，与小鼠CD11b的同一性为53％，与人CD11a的同一性为28％，与人CD11b的同一性为55％，与人CD11c的同一性为59％，而与人αd的同一性为70％。人αd胞质结构域与推定的小鼠同系物的氨基酸序列的比较显示出具有相同长度、但具有不同一级结构的区域。这些区的相似序列长度表明是物种变异而不是剪接变异形式。当与以上实施例20的预测大鼠多肽相比时，小鼠和大鼠的胞质结构域表现出同一性大于60％。
实施例29分离另外的小鼠αdcDNA克隆用于序列确证为了确证实施例28中描述的小鼠αd的核酸序列和氨基酸序列，分离出另外的小鼠序列用于证实。
利用λZAPII(Stratagene)中的小鼠脾脏随机引发文库和寡聚dT引发的cDNA文库，用两种同源αd探针(3’和5’)通过杂交分离小鼠cDNA。将文库以5×105噬菌体/15cm LBM平板进行平板接种。将噬斑复制在Hybond尼龙膜(Amersham)上，将膜变性(0.5M NaOH/1.5M NaCl)，中和(0.5M Tris碱/1.5M NaCl/11.6M HCl)，并洗涤(2X SSC盐溶液)。将DNA通过紫外辐射交联至滤膜上。
采用下述引物，在以下条件的PCR反应中产生探针。将样品于94℃保持4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序(94℃15秒；50℃30秒；72℃1分钟，在Perkin-Elmer 9600热循环仪中进行)。
3’探针长约900个碱基，跨越核苷酸2752-3651(在SEQ ID NO1中)(5’→3’)，用分别示于SEQ ID NO69和74中的引物11.b-1/2FOR11和11.b-1/2REV2产生。该探针用于第一组复制物中。
5’探针长约800个碱基，跨越核苷酸149-946(在SEQ ID NO1中)(5’→3’)，用分别示于SEQ ID NO50和85中的引物11.b-1/2FOR1和11.a-1/1REV1产生。该探针用于第二组复制物中。
在第三组复制物中，将上述探针一起用于相同的平板上。
用来自上述的以实施例20中所述的相同方式标记的两种探针，筛选约500,000个噬斑。将标记的探针加入含有45％甲酰胺的预杂交溶液中，于50℃温育过夜。将滤膜在2X SSC/0.1％SDS中于室温(22℃)下洗涤2次。在2X SSC/0.1％SDS中于50℃进行最后一次洗涤。利用增感屏，在Kodak X-Omat AR胶片上于-80℃进行放射自显影19小时。
在至少双份复制物上产生阳性信号的13个噬斑如上所述进行第二次筛选，第二次筛选如初次筛选一样进行，只是既使用3’标记探针又使用5’标记探针进行杂交，并且加入采用2X SS/0.1％SDS中于65℃的另一次最后的洗涤。如上所述进行放射自显影2.5小时。
将产生阳性信号的13个噬斑(命名为MS2P1至MS2P13)转移至低Mg++噬菌体稀释液中。采用退火至ZAPII中的Bluescript噬菌粒的T3和T7引物(先前描述的序列)和如上所述的相同条件，通过PCR扩增(Perkin-Elmer9600热循环仪)确定插入片段的大小。条带大小范围为500个碱基至4Kb。分离、制备噬菌粒，并用M13引物和M13reverse.1引物(分别为SEQ ID NO40和41)对其测序。对所述13个克隆中的5个克隆MS2P-3、MS2P-6、MS2P-9、MS2P-12和MS2P-13测序，所述5个克隆结合在一起代表从5’端约碱基200至3’端第一个终止密码子后约300个碱基为止的区域。
如实施例4中所述，通过首先采用M13引物和M13 reverse.1引物(分别为SEQ ID NO40和41)进行自动测序，以对每个克隆的末端测序，以确定其相对于构成物#17(SEQ ID NO45)的位置。然后利用用于该特定区的合适的引物(以下列出的)，对每个克隆进行全测序。11.b-1/2FOR1 5′-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3′ (SEQ ID NO50)11.a-1/1FOR2 5′-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3′(SEQ ID NO60)11.a-1/1FOR3 5′-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3′ (SEQ ID NO61)11.b-1/2FOR4 5′-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3′ (SEQ ID NO62)11.b-1/2FOR5 5′-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3′(SEQ ID NO63)11.b-1/2FOR6 5′-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3′ (SEQ ID NO64)11.b-1/2FOR7 5′-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3′ (SEQ ID NO65)11.b-1/2FOR8 5′-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3′(SEQ ID NO66)11.b-1/2FOR9 5′-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3(SEQ ID NO67)11.b-1/2FOR10 5′-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3′ (SEQ ID NO68)11.b-1/2FOR11 5′-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3′ (SEQ ID NO69)11.b-1/2FOR12 5-GTCACAGAGGGAACCTCC-3′(SEQ ID NO70)11.b-1/2FOR13 5′-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3′ (SEQ ID NO71)11.b-1/2FOR14 5′-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3′ (SEQ ID NO72)11.b-1/2FOR15 5′-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3′ (SEQ ID NO73)11.b-1/2REV2 5′-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3′(SEQ ID NO74)11.b-1/2REV3 5′-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3′(SEQ ID NO75)11.b-1/2REV4 5′-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3′ (SEQ ID NO76)11.b-1/2REV5 5′-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3′ (SEQ ID No77)11.b-1/2REV6 5′-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3′ (SEQ ID NO78)11.b-1/2REV7 5′-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3′ (SEQ ID No79)11.b-1/2REV8 5′-GATCCAACGCCAGATCATACC-3′(SEQ ID NO80)11.b-1/2REV9 5′-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3′ (SEQ ID NO81)11.b-1/2REV10 5′-CACGTCCCCTAGCACTGTCAG-3′ (SEQ ID NO82)11.b-1/2REV11 5′-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3′ (SEQ ID NO51)11.b-1/2REV12 5′-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3′ (SEQ ID NO83)11.b-1/2REV13 5′-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3′ (SEQ ID NO84)11.a-1/1REV1 5′-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3′(SEQ ID NO85)11.a-1/1REV2 5′-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3′(SEQ ID NO86)对序列进行编辑、序列对比，并与先前分离的小鼠αd序列(构成物#17，SEQ ID NO45)进行比较。
所述新序列的序列对比揭示出构成物#17中一个始于核苷酸2308的18个碱基的缺失；该缺失不引起读框移码。如上所述测序的克隆MS2P-9也揭示出相同的18个碱基的缺失。该缺失已经在50％的包括该区的小鼠克隆中发现，但该缺失未在大鼠或人αd克隆中检测到。该18个碱基的缺失的特征为12个碱基的回文序列AAGCAGGAGCTCCTGTGT(SEQ ID NO91)。在所述核酸序列中的这种反向重复是自身互补的，并且可以形成环出，引起反转录期间的切割。包括另外18个碱基的小鼠αd序列叙述于SEQ ID NO52中；所推定的氨基酸序列叙述于SEQ ID NO53中。
实施例30小鼠中的原位杂交然后测定小鼠αd的组织分布，以便提供与实施例6中描述的人αd组织分布的比较。
通过体外RNA转录掺入35S-UTP(Amersham)，从DNA模板产生对应于鼠类cDNA胞质尾区中核苷酸3460-3707的单链200bp mRNA探针。
用放射标记的单链mRNA探针，原位杂交小鼠全胚胎(于受精后第11-18天收获的)和各种小鼠组织，包括脾脏、肾脏、肝脏、肠和胸腺。
以6μm的厚度制备组织切片，并粘附于Vectabond(VectorLaboratories，Burlingame，CA)包被玻片，于-70℃贮藏。在使用之前，从-70℃取出玻片，将其置于50℃约5分钟。将切片在4％低聚甲醛中于4℃固定20分钟，用增加的乙醇梯度(70-95-100％)在每个浓度下于4℃脱水1分钟，并于室温下风干30分钟。将切片在70％甲酰胺/2XSSC中于70℃变性2分钟，在2X SSC中冲洗2次，用上述乙醇梯度脱水并风干30分钟。在下述溶液中于55℃杂交过夜，所述溶液含有6×105cpm/切片的35S标记的核糖核酸探针和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水，使得终浓度为50％甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.5、10％硫酸葡聚糖、1X Denhardt溶液、100mM二硫苏糖醇(DTT)和5mM EDTA。杂交后，将切片于室温下在4X SSC/10mM DTT中洗涤1小时，于60℃在50％甲酰胺/2X SSC/10mM DTT中洗涤40分钟，于室温下在2X SSC中洗涤30分钟，并在于室温下在0.1X SSC中洗涤30分钟。将切片脱水、风干2小时，用Kodak NTB2照相乳剂包被，风干2小时，显影(在完全黑暗下于4℃贮藏后)并用苏木精/曙红复染。
脾组织主要在红髓中表现出强信号。这种图式与脾脏中组织巨噬细胞的分布图式一致，但不排除其它细胞类型。
实施例31小鼠表达构成物的产生为了构建包括表现出与人αd具有同源性的小鼠cDNA序列的表达质粒，连接来自克隆A1160和B3800的插入片段。然而，在该连接之前，将包括起始甲硫氨酸的5’前导序列加入克隆A1160中。设计名为“5’PCR前导序列”(SEQ ID NO47)的引物含有(1)于位置1-6的相同的非特异性序列，用于消化；(2)位置7-12的一个BamHI位点(在SEQ ID NO47中下划线)，以促进亚克隆到表达载体中；(3)位置13-18的一个共有Kozak序列，(4)信号序列，包括起始甲硫氨酸的密码子(在SEQ ID NO47中的粗体)，和(5)另外31个碱基的特异性重叠5’序列，来自克隆A1160，以允许引物退火。使用名为“3’end frag”(SEQ ID NO48)的引物与引物“5’PCR前导序列”，从克隆A1160扩增所述插入片段。5′-AGTTACGGATCCGGCACCATGAC--CTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3′(SEQ ID NO47)5′-GCTGGACGATGGCATCCAC-3′(SEQ ID NO48)所产生的PCR产物不为BamHI所消化，提示在该限制位点之前的碱基数目不足，妨碍该酶的识别。增加所述5’引物(SEQ ID NO47)中BamHI位点之前的“尾”序列的长度，并在来自第一次PCR的扩增产物上重复PCR。设计名为mAD.5’.2(SEQ ID NO49)的5’引物于位置1-4具有额外的非特异性碱基以及特异性重叠先前使用的“5’PCR前导序列”引物序列的另外20个碱基。5′-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3′(SEQ ID NO49)将引物“mAD.5’.2”和“3’end frag”一起用于PCR，并且用来自第一次PCR扩增的产物作为模板。将产生的第二次PCR的产物按照生产商建议的方案亚克隆到质粒pCRtmII(Invitrogen)，并转化到感受态One shot细胞(Invitrogen)。用BamHI和EcoRI进行限制性酶分析，鉴定出含有所述PCR产物的一个克隆，并对其测序。确证所述序列后，通过用BamHI和EcoRI消化分离出所述插入片段，并将其进行凝胶纯化。
通过用EcoRI和NotI消化，分离出来自克隆B3800的插入片段，将其凝胶纯化，并加入到包括增加的A1160 BamHI/EcoRI片段的连接反应中。让连接于14℃进行14小时。将用BamHI和NotI消化的载体pcDNA.3(Invitrogen)加入具有另外添加的连接酶的连接反应中，再继续反应12小时。将一等份反应混合物转化到感受态大肠杆菌细胞中，培养所产生的菌落，用引物11.b-1/2FOR1和11.b-1/2REV11(分别为SEQ ID NO50和51)，通过PCR分析鉴定出一个阳性克隆。这些引物桥接A1160片段和B3800片段，因此检测到扩增产物就表明连接了所述两种片段。用叙述于SEQ ID NO50和51的引物确证了所述阳性克隆的序列，所述反应扩增了起始甲硫氨酸之后的碱基100-1405。
实施例32剔除小鼠的构建为了更准确地评价由推定的小鼠αdcDNA所编码蛋白的免疫学作用，设计了“剔除”小鼠，其中通过同源重组破坏了编码所述推定αd的同系物的基因组DNA序列。因此根据缺乏所编码蛋白评价由所述破坏的基因编码的蛋白的重要性。“剔除”小鼠的产生描述于Deng等，Mol.Cell.Biol.132134-2140(1993)。
这样的小鼠的设计始于含有待通过同源重组事件“剔除”的序列的质粒的构建。用所述小鼠cDNA的750个碱基对的片段(对应于SEQID NO45中的核苷酸1985-2733)，鉴定编码来自λFIXII基因组文库的推定小鼠αd同系物的小鼠基因组序列。初次筛选产生14个阳性噬斑，其中7个噬斑通过第二次筛选得到证实。从其中两个产生最强信号的噬斑获得液体裂解液，并通过常规方法分离λDNA。限制图谱和DNA印迹分析证实了一个名为14-1的克隆的真实性，通过用NotI消化分离出所述插入片段DNA。将该片段克隆到BluescriptSKII+中。
为了鉴定约9-14kb的限制片段，据报道该片段长度优化同源重组事件的概率，用所述750bp cDNA探针进行DNA印迹杂交。在杂交之前，构建克隆14-1的限制图谱。一个12kb的片段被鉴定为可能的候选者，将该片段亚克隆到pBluescriptSKII+中的适当位置，其中所述小鼠DNA邻接胸苷激酶编码盒。用I结构域探针(对应于SEQ IDNO45中的核苷酸454-1064)对该克隆的进一步分析表明，该克隆不含有I结构域编码序列。
采用相同的I结构域探针再筛选λFIXII基因组文库。最初，检测到6个阳性克隆，其中一个在第二次筛选时仍为阳性。从该克隆分离出的DNA在DNA印迹分析中与I结构域探针强反应。然而，用原始750bp探针没有检测到反应性，表明该克隆包括SEQ ID NO45的核苷酸1985-2773的5’的区域。
或者，与所述750bp探针无杂交可能提示该克隆是蛋白的整联蛋白家族的另一成员。为了确定这种解释是否有道理，将所述13kb片段亚克隆到pBluescriptSKII+中。用对应于SEQ ID NO52中αdI结构域核酸序列441-461、591-612、717-739和反向898-918的引物对纯化的DNA测序。仅用前4441-4461引物获得序列信息，仅所述I结构域的最5’外显子被有效扩增。所述I结构域的其余部分未被扩增。因此所产生的克隆包含小鼠αd基因的外显子6以及至所述外显子3’端和5’端的内含子序列。在该克隆中没有外显子7。测序后，产生含有新霉素抗性和胸苷激酶基因的构成物。
将新霉素抗性(neor)基因插入所产生的质粒中，其插入方式中断了基因组小鼠DNA的该蛋白编码序列。因此所产生的质粒含有在所述小鼠基因组DNA序列中的neor基因，所有neor基因均位于胸苷激酶编码区内。需要以该方式构建质粒，以使与随机重组相比有利于同源重组[Chisaka等，Nature 355516-520(1992)]。
用一种替代策略产生可用于产生αd剔除小鼠的构成物。将两组寡核苷酸引物提交Genome Systems，Inc.(St.Louis，MO)，用于对由胚胎干细胞的基因组DNA制备的大插入片段文库进行高严格性PCR分析。所述引物对应于αd中I结构域的第一外显子和最后一个外显子。鉴定出3个克隆，命名为1117和1118的其中两个克隆与两种引物均反应，而名为1119的一个克隆仅与来自最后一个外显子的引物反应。小鼠基因组αdDNA的鉴定按照生产商的说明(Genome Systems，Inc.)，由克隆1117和1118的细菌裂解液制备质粒DNA。用寡核苷酸madk.f1(SEQ ID NO104)和madk.r1(SEQ ID NO105)和madk.r2(SEQ ID NO106)，通过PCR证实所述αd插入片段。
madk.f1SEQ ID NO104TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCmadk.r1SEQ ID NO105GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGGmadk.r2SEQ ID NO106TAT AGC ATA GCG AAT GAT CC用限制酶BamHI、PstI、SacI、SalI、SmaI、XbaI和XhoI(Boehringer Mannheim)消化两种质粒等分样品。将每种消化样品在0.8％琼脂糖凝胶上分离，并将所述寡核苷酸转移至Hybond-N+核酸转移膜(Amersham)上用于分析。该印迹用采用1.6kb模板产生的32P-随机引发的DNA进行探测，所述模板采用寡核苷酸madfor 1(SEQ IDNO107)和madrev 1(SEQ ID NO108)通过PCR获得。
madfor 1 SEQ ID NO107ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATCmadrev 1 SEQ ID NO108TCG AGA TCC ACC AAA CTG CAC在具有50％甲酰胺的SSPE缓冲液中于42℃进行杂交过夜。标记的印迹在2X SSPE中于室温下洗涤5次。通过将所述印迹于-70℃曝光于Kodak X-Omat放射自显影胶片2小时，显现放射标记的条带。
从克隆1118中鉴定出插两个目的片段一个4.1kb的SacI片段和一个8.3kb的XbaI片段。将来自克隆1118的SacI和XbaI消化的完整的样品内容物不经进一步纯化而连接到载体pBluescriptR KS+中，在连接之后，将完整的反应内容物转化到大肠杆菌菌株TG1/λSmR的钙感受态制备物中。分离所产生的菌落，并在含有M13KO7辅助病毒的200μl选择培养基中培养过夜，以复制单链DNA。然后将来自每孔的10μl等份的上清液印迹到Hybond-N+转移膜上，用上述相同的探针和方案进行杂交。从9个阳性克隆扩增培养物，用WizardPlus小量制备DNA纯化系统(Promega)从每种培养物分离质粒DNA。用限制性消化物和PCR证实在所分离的质粒中存在插入片段和插入片段的大小。
用载体引物T3和T7以及对应于鼠类αd序列的寡核苷酸引物，对3个克隆进行序列分析。采用Geneworks软件将这3个克隆与所述鼠类cDNA的序列进行比较，表明所有3个克隆均含有鼠类αd的外显子1和外显子2。最长的克隆称为A，是长8280kb的XbaI克隆，而两个较短的克隆称为E和H，是相同的长4112kb的SacI克隆。选择8280kb XbaI克隆用于进一步研制。
实施例33兔αd的克隆兔cDNA文库的构建和筛选对大鼠和小鼠中人αd同系物的鉴定导致研究兔同系物的存在，兔同系物在上述人疾病状态的兔模型中可能是有用的。
利用Invitrogen FastTrack试剂盒(San Diego，CA)，按照生产商建议的方案和试剂盒供应的试剂，从兔全脾中制备poly A+RNA。从1.65g组织分离出73μg poly A+RNA。利用Stratagene(La Jolla，CA)的试剂盒，用兔脾RNA构建ZAP表达cDNA文库。将所产生的cDNA定向克隆到pBK-CMV噬菌粒载体λ臂中的EcoRI和XhoI位点中。用GigapackII Gold(Stratagene)将所述λ臂包装到噬菌体颗粒中。所产生的文库的滴度估计约为8×105粒子，平均插入片段大小为1.2kb。
通过将平板接种以进行融合噬斑生长，将所述文库扩增1次，并收集细胞裂解液。将扩增的文库以约30,000噬斑形成单位(pfu)/150mm平板与大肠杆菌一起平板接种，将产生的混合物于37℃温育12-16小时，以形成噬斑。将噬菌体DNA转移至HybondN+尼龙膜(Amersham，Arlington Heights，Illinois)上。将所述膜与两种随机引发放射标记的小鼠αdPCR DNA探针的混合物杂交。第一种探针产生自跨越SEQ ID NO52中核苷酸149-946的PCR产物。第二种探针来自跨越SEQ ID NO52中核苷酸2752-3651的PCR产物。通过随机引发(Boehringer Mannheim随机引发DNA标记试剂盒)标记探针，使反应混合物通过SephadexG-50柱，以除去未掺入的核苷酸。杂交溶液由5X SSPE、5X Denhardts、1％SDS、40％甲酰胺和1×106dpm/ml的标记探针组成。于42℃杂交16-18小时。滤膜在2X SSPE/0.1％SDS中于室温下充分洗涤，并曝光于X胶片以显现任何杂交噬斑。
鉴定出与人αd具有显著序列同源性的2个克隆。克隆#2长约800bp，作图至人αd的5’端。克隆#2包括一个起始甲硫氨酸和完整的前导序列。克隆#7约为1.5kb，包括一个起始甲硫氨酸。克隆#7的5’端重叠克隆#2的5’端，而所述3’序列终止于所述I结构域序列之外的一个点。通过引物步查法对克隆#7进行全测序。克隆#7的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别叙述于SEQ ID NO100和101。
从克隆#2和克隆#7测定的兔αd的预测N末端氨基酸序列显示出一种蛋白与人αd的同一性为73％，该蛋白与小鼠αd的同一性为65％，而与小鼠CD11b、人CD11b和人CD11c的同一性为58％。克隆#2的核酸序列叙述于SEQ ID NO92；预测的氨基酸序列叙述于SEQ IDNO93.
利用标记的兔克隆#7并且筛选衍生所述片段的cDNA文库，尝试分离全长的兔αdcDNA。鉴定出25个额外的克隆，一个名为克隆49的克隆确定为最长的克隆。采用嵌套缺失技术，对克隆49进行全测序。克隆49的核苷酸序列和氨基酸序列分别叙述于SEQ ID NO102和103。由于克隆#7和#49不重叠，因此设计寡核苷酸以用作PCR中的引物，利用第一链兔脾cDNA，分离缺失的序列。
这两个部分克隆与其它白细胞整联蛋白的推定氨基酸序列的关系描述于表1中。
表1β2整联蛋白家族成员在氨基酸水平上的同一性百分比人αd兔#7 兔#49人αd100 7480小鼠αd706774大鼠αd706673小鼠CD11a随机*2828小鼠CD11b555953人CD11a 362828人CD11b 605855人CD11c 665962*如果同一性＜25％，它仅仅是随机序列对比，没有显著性。
兔αd克隆的分离使得能够或者在转染子表面上或者作为可溶性全长形式或者截短形式表达所述蛋白。然后将该蛋白用作免疫原，用于生产人类疾病状态兔模型中使用的单克隆抗体的生产。
实施例34猴αd的分离亲和柱的制备为了制备亲和柱以从猴脾分离αd，将抗人αd抗体212D和217L各10mg对含有0.1M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3的偶联缓冲液透析过夜。按照生产商建议的方案，制备约1.0g CNBr Sepharose4B(Pharmacia，Piscataway NJ)，并将1.0ml树脂与每种透析抗体混合。所产生的浆液通过于4℃旋转过夜混合，并通过在Beckman台式离心机中以1000rpm离心5分钟获得偶联树脂。收集未吸附的上清液部分，用分光光度计分析其未偶联蛋白的存在。结果表明，所有可利用的抗体均结合于凝胶基质上。用1M乙醇胺于室温下封闭未偶联的活性基团2小时，将树脂在一系列交替的高pH和低pH改变的偶联缓冲液中洗涤，然后用含有0.1M NaC2H3O2·3H2O和0.5M NaCl，pH 4.0的乙酸缓冲液进行最后的洗涤。将两种树脂于4℃贮藏于偶联缓冲液中。猴脾的制备雌性猕猴脾得自华盛顿大学的区域灵长类中心(Regional PrimateCenter)。给脾组织注射100U/ml胶原酶D(Sigma)并将其切成小块。然后将组织小块悬浮于小体积的含有50mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2，pH 8.0和1.0％Triton-X100去垢剂的连接缓冲液中，并贮藏于-70℃。加入蛋白酶抑制剂PLA(胃蛋白酶抑制剂A、亮抑酶肽和抑酶肽的混合物，每种均来自Sigma)和4-(2-氨乙基)苯磺酰氟-HCl(AEBSF)(Nova Biochem，La Jolla，CA)，防止贮藏期间蛋白的蛋白水解。贮藏组织直至获得总共6个猕猴脾脏。
将来自所述6个猕猴的脾组织合并，在韦林氏搅切机中匀浆，在含有25mM Tris、0.15M NaCl、0.02％NaN3、1.0％Triton、1XPLA和0.1mM AEBSF的TSA裂解缓冲液中进行3个循环，每个循环10秒。收集裂解液，并将其在4℃摇床上放置1小时，然后在Beckman台式离心机中以3000rpm离心15分钟。收集上清液并弃去沉淀的细胞碎片。收集总体积为550ml的裂解液，通过将所述裂解液于4℃与在1M乙醇胺中预先处理以封闭反应位点的CNBr Sepharose一起温育2小时，对裂解液进行预清除。温育后，通过离心除去树脂，并收集上清液。亲和纯化及测序将如上所述制备的脾裂解液分为两半，分别与212D-和217L-制备的CNBr Sepharose凝胶混合。将产生的浆液在旋转下于4℃混合3天，此后在Beckman台式离心机中以1500rpm离心10分钟收集，并挽救未吸附的部分。将凝胶转移至15ml离心管中，连续在数倍体积的D-PBS中洗涤。将每种凝胶约100μl的等份在还原性样品缓冲液中短暂煮沸，所述还原性样品缓冲液含有0.1M Tris-HCl，pH 6.8、2.0％SDS、20％甘油、0.0002％溴酚蓝、10％β-巯基乙醇(终浓度为5％)，并加样至6.0％聚丙烯酰胺凝胶SDS凝胶(SDS-PAGE)上，并用该凝胶分离。将凝胶进行考马斯染色，检测到分子量与αd和CD18一致的蛋白以及许多背景蛋白。
在改进分子量类似于αd的蛋白的纯化的研究中，通过不同方法洗涤具有结合蛋白的凝胶两个100μl等份。在一种方法中，凝胶在含有150mM NaCl、10mM Tris、1.0％Triton-X100，pH 8.0的缓冲液中洗涤数次，而在第二种方法中，凝胶的洗涤相同，但结合蛋白在具有0.05M甘氨酸，pH 2.4的最终洗涤液中洗脱出。如前所述，将洗脱的蛋白在还原性样品缓冲液中短暂煮沸，并在6.0％SDS-PAGE凝胶上分离。考马斯染色仅检测到来自低pH甘氨酸缓冲液中洗涤的树脂的与αd和CD18一致的蛋白，因此选择该分析方法。为了分离蛋白用于测序，将剩余的CNBr Sepharose树脂如上所述洗涤4次，将约3/4的所述树脂悬浮于2.0ml 0.05M甘氨酸pH 2.4中，并剧烈涡旋混合。通过离心3分钟沉淀树脂并收集未吸附的部分。然后将凝胶在甘氨酸缓冲液中洗涤1次，将该洗涤液与先前的未吸附部分合并。将合并的部分对D-PBS于4℃透析过夜，其中更换两次D-PBS。透析后，将样品干燥以将体积减小至1.0ml。
对于测序，将洗脱物在7.0％分离凝胶上分离，如实施例2中所述将蛋白转移至Immobilon(PVDF)膜(Millipore，Bedford MA)。简而言之，将凝胶在去离子水中洗涤1次，在含有10％甲醇的10mM环己基氨基丙磺酸缓冲液(CAPS)pH 10.5中平衡15-45分钟。PVDF膜在甲醇和蒸馏水中洗涤，然后在CAPS转移缓冲液中平衡15-30分钟。将蛋白于70伏、30小时转移至PVDF膜上，此后将所述膜在过滤的0.1％R250考马斯染液中染色10分钟。将膜在50％甲醇/10％乙酸中洗涤脱色3次，每次洗涤10分钟，在过滤水中再洗涤1次，然后干燥。
从212D-和217L-偶联树脂上均检测到约150kD和95kD、与在先前的分析规模的电泳凝胶上检测的蛋白一致的两个主要蛋白条带。在得自217L偶联树脂的膜上观察到差异较小的一个条带，该条带紧接150kD蛋白之下，但该条带在膜干燥后检测不到。从膜上切下来自每张膜的l50kD条带，用Applied Biosystems(Foster City，CA)473A型蛋白测序仪，按照生产商建议的方案直接测序。
结果表明，用212D-偶联树脂分离的猴蛋白的氨基末端序列具有叙述于SEQ ID NO109的氨基酸序列，用217L-偶联树脂分离的蛋白氨基末端具有示于SEQ ID NO110的序列。SEQ ID NO110中的“X”表示不可确定的残基。
212D-偶联蛋白 SEQ ID NO109NLDVEEPTIFQEDA217L-偶联蛋白 SEQ ID NO110NLDVEEPTIFXEDA所述猴序列与人αd和β2整联蛋白家族中其它α链的氨基末端序列的比较示于表2中。
表2猴αd氨基末端序列与人β2α亚基的比较蛋白SEQ ID NO 氨基末端序列猴αd111 F N L D V E E P T I F Q E D A人αd112 F N L D V E E P T I F Q E D A G G人CD11c 113 F N L D T E E L T A F V D S A Gr CD11b 114 F N L D T E N A M T F Q E N A R G根据所述序列同一性，可以推断212D和217L均识别猕猴和人中的αd。
实施例35217L抗原的鉴定根据在前一实施例中从猴脾中沉淀的蛋白的N末端序列，可以推断，抗体217L和212D识别猴和人中的αd蛋白。然而，免疫细胞化学(ICC)分析和免疫沉淀实验表明，217L具有212D没有的额外反应性。采用对所有α链的抗体进行的FACS和ICC实验排除了217L与最密切相关的白细胞整联蛋白α链CD11c以及CD11b的反应性。因此，可能217L抗体也识别αd的构象变体、糖基化变体或剪接变体或与αd共享序列同一性的新α链。
抗体217L识别的抗原在肉样肺组织中的独特分布(参见实施例18)以及与CD11c相比非重叠染色图式，提示该抗原可能具有生物学重要性。因此，为了更全面地了解217L抗原的重要性，需要分析所述蛋白和编码该蛋白的主要DNA，设想了各种方法。
用抗体217L免疫沉淀来自人树突细胞或外周血的蛋白复合物，然后进行所沉淀蛋白的N末端序列分析。序列分析将揭示出，在外周血细胞上识别的蛋白是否与αd共享氨基末端同一性。然后，用去糖基化酶处理从树突细胞或外周血细胞沉淀的蛋白，将其与从其它来源沉淀的CD11c和αd相比，以提供一级氨基酸序列的分子量的比较。
另外，用完整的αdcDNA在低严格性下探测由树突细胞RNA产生的cDNA文库。通过在所述克隆的整个长度进行核酸测序来分析反应性克隆，以便确定非αd序列是否存在于所述克隆中。
实施例36确定αd治疗用途的动物模型狗中的免疫组织学数据以及大鼠和小鼠中的原位杂交已经确定，脾脏中的αd主要由存在于红髓和淋巴结中的巨噬细胞表达，在髓索和血窦中发现αd。表达图式明显类似于已经报道的由单克隆抗体F4/80和SK39限定的两种鼠类抗原的表达图式。虽然这些鼠类抗原的生化表征已经证明它们不同于αd，但非常可能αd与鼠类F4/80和SK39抗原一样限定了相同的巨噬细胞亚群。
在小鼠中，在脾红髓和淋巴结髓质中鉴定出SK39阳性巨噬细胞，在红髓中它们可能参与从循环中清除外源物质[Jutila等，J.Leukocyte Biol.5430-39(1993)]。已经报道了在急性炎症和慢性炎症部位的SK39阳性巨噬细胞。此外，募集到硫代乙醇酸发炎腹膜腔的单核细胞也表达SK39抗原。总而言之，这些发现提示，如果SK39+细胞也是αd+，则这些细胞负责在脾脏中清除外源物质并且参与在其中巨噬细胞起重要作用的炎症。
虽然尚不清楚αd的功能，但已经表明其它更充分表征的β2整联蛋白参与种类繁多的促进细胞迁移、增强吞噬作用和促进细胞-细胞相互作用的粘着事件，这些事件全都导致炎性过程的正调节。因此，看来很有道理的是，干扰正常的αd功能也可能干扰其中巨噬细胞起重要作用的炎症。这样的抗炎效应可能产生于i)阻断巨噬细胞募集至炎症位点，ii)防止炎症部位的巨噬细胞激活或iii)干扰巨噬细胞的效应子功能，所述效应子功能或者通过特异性自身免疫应答或者作为旁观者细胞损伤而损伤正常的宿主组织。
有证据表明巨噬细胞在病程中起重要作用的疾病状态包括多发性硬化、关节炎、移植物动脉粥样硬化、某些形式的糖尿病和炎性肠病。已经表明，下述的动物模型再现了这些人们疾病的许多方面。在这些模型系统中测试αd功能的抑制剂，以确定是否存在治疗相应人类疾病的潜力。移植动脉粥样硬化心脏移植现在是普遍接受的某些类型的晚期心脏病的治疗介入形式。由于环孢菌素A的应用将一年存活率提高至80％，因此进行性移植动脉粥样硬化已经作为存活超过1年的心脏移植物中的主要死因出现。最近的研究已经发现，心脏移植后3年明显移植动脉粥样硬化的发生率范围为36-44％[Adams等，Transplantation 531115-1119(1992)；Adams等，Transplantation 56794-799(1993)]。
移植动脉粥样硬化通常包括弥散的、闭塞性内膜损伤，它影响整个冠状血管壁，通常伴随有脂质沉积。虽然仍不了解移植动脉粥样硬化的发病机理，但推定与供体和受体之间组织相容性差异有关，并且性质上是免疫学相关的。在组织学上，内膜增厚区域主要由巨噬细胞组成，尽管偶尔观察到T细胞。因此，可能是表达αd的巨噬细胞在移植动脉粥样硬化的诱发和/发生中可能起重要作用。在这样一种情况下，可以将αd功能的单克隆抗体或小分子抑制剂(例如可溶性ICAM-R)预防性地给予接受心脏移植并且有发生移植动脉粥样硬化风险的个体。
虽然心脏移植物中的动脉粥样硬化造成对生命的最大威胁，但在其它实体器官移植物中包括在肾脏和肝脏中也观察到移植动脉粥样硬化。αd阻断剂的治疗性应用可能在其它器官移植物中防止移植动脉粥样硬化，并减少由于移植物衰竭引起的并发症。
一个大鼠中移植动脉粥样硬化的模型涉及越过次要组织相容性障碍移植的异位心脏同种移植物。当将Lewis心脏同种移植物移植到I类和II类MHC相容性F-344受体中时，80％的所述同种移植物存活至少3周，而25％的所述移植物存活不确定。在这种低程度移植排斥期间，在供体心脏中形成动脉粥样硬化损伤。在120日龄的同种移植物中的动脉损伤通常具有弥散性纤维变性性内膜增厚，这种内膜增厚在外观上不能与排斥人心脏同种移植物中发现的移植动脉粥样硬化损伤区别。
大鼠用次要组织相容性抗原不匹配的心脏移植，例如将Lewis移植到F-344中。定期给予移植受体大鼠αd特异性单克隆抗体或αd的小分子抑制剂。预期治疗将降低非排斥性供体心脏中移植动脉粥样硬化的发生率。用αd的单克隆抗体或小分子抑制剂治疗大鼠，可能不限于预防性治疗。也预期阻断αd功能将减少巨噬细胞介导的炎症并使得移植物中的动脉损伤逆转。饲喂胆固醇的兔中的动脉粥样硬化饲喂含胆固醇补充剂的致动脉粥样化饮食约12-16周的兔子发生内膜损伤，所述损伤覆盖上行主动脉的大部分腔表面[Rosenfeld等，Arteriosclerosis 79-23(1987)；Rosenfeld等，Arteriosclerosis 724-34(1987)]。在这些兔子中观察到的动脉粥样硬化损伤与人类中的损伤类似(simmer to)。损伤含有大量T细胞，其中大多数表达CD45RO，这是一种与记忆T细胞相关的标记。约一半的浸润T细胞也表达II类MHC抗原，某些表达IL-2受体，提示所述细胞中的许多细胞处于活化状态。
在饲喂胆固醇的兔子中发现的、但在啮齿动物模型中明显不存在的动脉粥样硬化损伤的一个特征，是富含泡沫细胞的损伤的积累。人们认为泡沫细胞巨噬细胞产生于氧化型低密度脂蛋白(LDL)被特定受体摄入。已经发现氧化型LDL颗粒对于某些细胞类型是有毒的，所述细胞类型包括内皮细胞和平滑肌细胞。潜在有毒的氧化型LDL颗粒被巨噬细胞摄入，作为一种刺激，驱动巨噬细胞活化，导致与动脉粥样硬化损伤相关的炎症。
一旦产生针对兔αd的单克隆抗体，则可治疗胆固醇饲喂的兔子。处理包括预防性给予αd单克隆抗体或小分子抑制剂，以证明αd+巨噬细胞参与该病程。另外的研究将能证明，抗αd的单克隆抗体或小分子抑制剂能够逆转在饲喂致动脉粥样化食物的兔子中检测到的血管损伤。依赖于胰岛素的糖尿病BB大鼠在70-150日龄时自发发生依赖于胰岛素的糖尿病。利用免疫组织化学，可以检测到在该疾病早期浸润胰岛的II类MHC+、ED1+巨噬细胞。所述巨噬细胞中的许多巨噬细胞看来参加细胞碎片或正常细胞的吞噬作用。当疾病进行时，发现大量的巨噬细胞浸润胰岛，尽管显著量的T细胞和后来的B细胞看来也被募集至该位点[Hanenberg等，Diabetologia 32126-134(1989)]。
BB大鼠中糖尿病的发生看来依赖于早期巨噬细胞的浸润和随后的T细胞募集。用对巨噬细胞有毒的二氧化硅粒子处理BB大鼠，已经有效地阻断早期巨噬细胞对胰岛的浸润。在缺乏早期巨噬细胞浸润的情况下，由自侵性(autoaggressive)淋巴细胞群体引起的继发性组织损伤不能发生。给予阻断该疾病的T细胞相关期的单克隆抗体OX-19(对大鼠CD5特异性)或单克隆抗体OX-8(对大鼠CD8特异性)，也有效抑制糖尿病的发生。
在该模型的病理学中巨噬细胞的中心作用使其在测试αd功能的抑制剂方面有吸引力。有发生依赖于胰岛素的糖尿病的遗传素因的大鼠用抗αd的单克隆抗体或小分子抑制剂治疗，并评估该疾病的发生。防止或延迟临床发作是证明αd在巨噬细胞对胰岛细胞的损伤中起关键作用的证据。炎性肠病(局限性回肠炎、溃疡性结肠炎)用于研究炎性肠病(IBD)的动物模型一般通过直肠内给予有害刺激物(例如乙酸或三硝基苯磺酸/乙醇)来诱发。由这些试剂诱发的结肠炎症是划线损伤或代谢损伤的结果，并且没有与人IBD相关的慢性和自发复发性炎症。然而，最近描述的利用浆膜下注射或者来自A群(group A)或者来自D群链球菌的纯化肽聚糖-多糖(PG-PS)聚合物的模型，看来是人IBD的生理学上更为相关的模型[Yamada等，Gastroenterology 104759-771(1993)]。
在该模型中，将PG-PS注射到远端结肠的浆膜下层。所产生的炎症反应是双相的，在注射后3天初次急性发作，然后在3-4周后为自发慢性期。后期反应性质上是肉芽肿，导致结肠增厚、粘连、结肠小结和粘膜损伤。除粘膜损伤外，PG-PS性结肠炎通常导致关节炎性贫血和肉芽肿性肝炎。该疾病的肠外表现使得该模型在研究局限性回肠炎方面有吸引力，因为大量的活动性局限性回肠炎患者患有关节炎性关节病和肝胆管炎症。
肉芽肿性损伤是慢性炎症的结果，导致单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞募集和随后的活化。在局限性回肠炎和上述动物模型中肉芽肿性损伤的存在使得这是一个αd单克隆抗体或αd功能的其它抑制剂的有吸引力的临床靶。预期αd功能的抑制剂阻断IBD相关性损伤的形成或甚至逆转该疾病中观察到的组织损伤。关节炎关节炎看来是一个多因素病程，涉及多种炎性细胞类型，包括嗜中性粒细胞、T淋巴细胞和吞噬性巨噬细胞。虽然存在多种关节炎模型，但链球菌细胞壁蛋白聚糖的制剂产生最类似于人类疾病的疾病。
在大鼠中，链球菌细胞壁诱发外周关节炎症，所述外周关节炎症的特征为疾病进行的反复发作，然后缓解，并在数个月时期内最终导致关节破坏[Cromartie等，J.Exp.Med.1461585-1602(1977)；Schwab等，Infection and Immunity 594436-4442(1991)]。在该疾病的慢性期内，认为单核巨噬细胞或巨噬细胞在滑膜破坏中起主要作用。此外，抑制巨噬细胞募集到滑膜中的因子有效地减少关节炎特征性的炎症和病理学。
巨噬细胞在导致关节炎的滑膜破坏中的中心作用预测出，抗αd单克隆抗体或αd功能的抑制剂可能在治疗该疾病中具有治疗潜力。如在先前描述的其它模型中一样，预期预防性给予αd单克隆抗体或小分子抑制剂将阻断或缓和关节炎症，并防止滑膜破坏。干扰αd功能的因子也可能通过防止更多的巨噬细胞募集到该关节，或阻断巨噬细胞活化，而缓和正在发生的炎症。净结果可能是逆转正在发生的关节的破坏并促进组织修复。多发性硬化虽然仍不清楚多发性硬化(MS)的发病机理，但一般认为，该疾病由识别中枢神经系统中自身抗原并启动炎症级联的CD4+T细胞介导的。所产生的免疫应答导致更多的炎性细胞包括导致该疾病的活化巨噬细胞的募集。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种再现MS某些方面的动物模型。最近，已经表明，与炎性巨噬细胞上存在的CD11b/CD18反应的单克隆抗体[Huitinga等，Eur.J.Immunol.23709-715(1993)]阻断临床疾病和组织学疾病。结果提示，抗αd单克隆抗体或αd的小分子抑制剂可能有效阻断EAE中的炎症反应。这样的因子在MS治疗中也具有重要的治疗应用。免疫复合物性肺泡炎位于肺泡小管、气道、结缔组织和肺部胸膜间隙中的肺泡巨噬细胞代表肺部对所吸入的环境因子的第一道防线。在对包括细菌衍生LPS、IFN-γ和免疫复合物的因子刺激反应时，肺泡巨噬细胞释放多种有效的炎性介质，包括高反应性氧自由基和氮中间体。虽然过氧化物阴离子、过氧化氢和一氧化氮(NO·)在根除病原体和裂解肿瘤靶方面具有重要功能，但这些因子可能对正常组织具有有害效应。
在免疫复合物性肺泡炎的大鼠模型中，已经表明，从肺泡巨噬细胞释放NO·介导大多数肺部损害[Mulligan等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88638-6342(1991)]。NO·也作为介质涉及免疫复合物介导的损伤，包括皮肤血管炎[Mulligan等，参见上文]，并且可能在例如肾小球性肾炎的疾病中潜在起作用。
NO·介导的组织损害不限于涉及免疫复合物的炎症。例如，由例如PMA、LPS或IFN-γ的因子刺激的小神经胶质细胞，产生能够杀伤少突神经胶质细胞的水平的NO·[Merrill等，Immunol.1512132(1993)]。也已经发现胰岛细胞对NO·敏感，并且已经将巨噬细胞释放这种介质与导致糖尿病的组织损害相关联[Kroncke等，BBRC 175752-758(1991)]。新近，确定性地证明了NO·的释放在内毒素性休克中起作用[MacMicking等，Cell 81641-650(1995)]。当给予脂多糖(LPS)时，正常野生型小鼠经历了导致死亡的严重的进行性动脉压下降。然而，缺乏可诱导的一氧化氮的小鼠在对LPS反应时经历的动脉压下降的严重程度要轻得多，并且全都在该处理后存活下来。
体外测定表明，阻断αd有效地阻断了巨噬细胞(一般而言，或者表达αd的白细胞)活化的某些方面，包括NO·释放。发现在抗αd多克隆抗血清(在兔中针对大鼠αdI结构域多肽产生的)存在下用IFN-γ刺激的肺泡巨噬细胞所产生的NO·的分解产物亚硝酸盐/硝酸盐比用对照抗血清处理的巨噬细胞明显要少。这一发现表明，抗αd、特别是抗所述I结构域的单克隆抗体可能是有效的抗炎药，在MS、糖尿病、肺部炎症和内毒素性休克中具有潜在用途。此外，与影响种类繁多的白细胞类型功能的CD18相反，对于防止巨噬细胞(一般而言，或表达αd的白细胞)活化而言，αd的有限分布使其成为比CD18更有吸引力的靶。
大鼠IgG免疫复合物诱发的肺泡炎是广泛使用的、在了解急性肺部损伤方面重要的实验模型。通过气管套管插入术将抗牛血清白蛋白(BSA)抗体滴注到肺部，然后静脉内注射BSA来诱发该损伤。在肺部微脉管系统中形成免疫复合物，导致补体激活和将嗜中性粒细胞募集到肺部。假定在白细胞从血液外渗、随后白细胞运动穿过肺部上皮后在肺部形成免疫复合物。随后从参与疾病进程的活化的内皮细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞释放介质，包括自由基、TNF-α和一氧化氮(NO·)。该疾病的病理特征包括导致水肿的血管渗透性增加以及在肺泡间隙中存在的大量红细胞和PMN的出现。
在免疫复合物诱发的肺泡炎大鼠模型中，测试了对αd的I结构域特异性的多克隆抗血清。通过气管套管插入术给予αd多克隆抗血清，同时将抗BSA引入肺部。随后通过静脉内给予BSA以及微量125I标记的BSA(约800,000cpm)激发肺部损伤，以定量测定由肺部损伤引起的水肿。让肺部损伤进行4小时，利用肺部渗透性数值评价损害，肺部渗透性数值定义为与存在于1.0ml血液中的标记物量相比的肺部中125I标记的BSA的比率。通常，认为阳性对照的肺部渗透性数值的范围为0.6-0.8，而阴性对照(未接受BSA的大鼠)的渗透性指数数值范围为0.1-0.2。
初步研究表明，用抗αd多克隆抗血清治疗将肺部渗透性数值降低50％以上，表示明显缓和肺部损伤。历史上，用抗CD18治疗将渗透性数值降低60％。这些发现表明，αd可能在急性肺部损伤期间可能是最重要的β2整联蛋白，然后不能精确地确定所述抗血清的效应是否抑制白细胞从血液外渗或运动穿过肺部上皮。
作为αd缓和肺部损伤的另一个证明，评估了支气管肺泡灌洗液中的TNF-α水平。发现用所述抗αd抗血清处理，将TNF-α水平降低约4倍。长期以来TNF-α一直被认为是急性肺部炎症中的重要介质，并且造成将炎性细胞募集到炎症位点、细胞活化和组织损害。假定抗αd抗血清在免疫复合物性肺泡炎期间阻断居留肺泡巨噬细胞的活化，并因此缓和TNF-α和NO·的释放，减少由这些因子和嗜中性粒细胞募集引起的继发性组织损害。LGL白血病的F344大鼠模型F344中的LGL白血病在二十世纪80年代早期至中期被首次描述为具有稳定NK细胞活性的可移植性白血病。已经提出将这种白血病作为人Tγ淋巴瘤和T细胞慢性淋巴细胞性白血病的可能模型[Ward和Reynolds，Am.J.Pathol.1111-10(1982)；Stromberg，Am.J.Pathol.119517-519(1985)；Reynolds等，J.Immunol.132534-540(1984)]。该模型提供了用于研究LGL和NK细胞功能的丰富的细胞。特别关注的是利用实施例26中描述的使用仓鼠抗大鼠205C通过FACS分析检测到的在这些细胞表面上存在αd。鉴于这一观察，检查αd的体外(例如利用先前描述的细胞裂解测定)和体内作用。
LGL白血病的病理特征包括严重的脾大、肝脏有苍白色斑、外周淋巴结增大以及肺部、大脑和淋巴结中点状出血。因为αd存在于正常大鼠脾脏的红髓中(在脾脏巨噬细胞上)，并且LGL白血病的标志是严重的脾大，所以假定αd阳性NK肿瘤细胞也可能“返回脾中(home)”或附着到已经确定的配体，并在此增殖。为了测试这种假说，将肿瘤细胞放射标记，并结合或不结合αd抗体处理注射到受体大鼠中。3小时后取出这些动物的脾脏，并测定NK肿瘤细胞的存在。所用方法和实验结果的更全面的描述如下。
在每个实验之前2-4周，将得自患有LGL白血病并如下所述制备的大鼠脾脏的肿瘤细胞，继承性地转移至受体大鼠。根据组织学和FACS分析进行的先前研究，已知该肿瘤的快速增殖和所产生的脾大发生在继承性转移后的3-4周。在第一个实验中，从已经暴露于肿瘤细胞4周的动物中取出脾脏。通过用剪刀将脾脏剪切成小块并使这些小块在D-PBS存在下通过金属网，制备单细胞悬浮液。将细胞悬浮液收集到50ml离心管中，并在Beckman台式离心机中于室温下以1500rpm离心10分钟。弃去上清液，将细胞再悬浮于30ml D-PBS中。将约5.0ml该细胞悬浮液铺在5.0ml Histopaque上，将该梯度以1500rpm离心30分钟。收集来自这些梯度的细胞层，将其合并并用血细胞计数器计数。调节细胞数以使每只受体大鼠接受1.0×107细胞，略微高估以计及洗涤和制备注射器期间的细胞损失。将所述细胞悬浮于NK“试验培养基”(RPMI-1640加抗生素加2％FBS)，并用10mCi51Cr于37℃标记1小时。温育后，用试验培养基将细胞悬浮液的体积增至50ml，并通过以1200rpm离心10分钟沉淀细胞。弃去上清液，并如上所述再将细胞洗涤2次。将标记的细胞以1×107细胞/ml的终浓度悬浮，并在存在或缺乏抗大鼠αd抗体以及对照IgG1抗体的情况下预温育，然后注射到受体大鼠体内。将每只动物所用的抗体终浓度调至5.5mg/kg或约1mg/动物。每种条件最少使用4只动物。
将受体大鼠称重，并皮下注射150-200μl ACE溶液(含有0.25ml氯胺酮、0.2ml Ace和0.8ml Rompin)进行麻醉。从每种抗体处理，将1.0×107细胞静脉内注射到动物体内。用γ计数器检查约300μl每种细胞悬浮液，以测定注射的总cpm/大鼠。让标记的NK细胞在大鼠体内循环3小时，此后处死动物，通过主动脉穿刺取出1.0ml外周血。取出每只动物的脾脏，称重，并用γ计数器计数。为了测定返回到脾脏的细胞百分比，将每分钟的计数(cpm)/脾脏除以注射到大鼠体内的已知的总cpm。为了测定外周血中的cpm，假定血液占大鼠总体重的6.0％。将1.0ml血液中的cpm乘以该动物总体重的6.0％，以确定血液中的总cpm。然后将该数值除以注射到每只动物体内的cpm总数，获得在血液中剩余的cpm百分比。
在第一个实验中，使用抗体226B、226G、226H、226I、20C5B(一种非阻断性CD18抗体)和对照抗体。与对照抗体和其它两种226抗体相比，抗体226B和226G看来显著降低返回脾脏的细胞数；在与对照抗体温育后，约7-8％的标记细胞返回脾脏，而在与226B和226G抗体温育后，约6％的标记细胞返回脾脏。在除226B外的处理组之间血液中总cpm百分比为0.9-1.4％，没有表现出明显差异，226B的数值低于所有其它组。
在第二个实验中，对上述方案进行几种调节。首先，每种条件增加至4只动物，其次，在继承性转移后2.5周而不是上述的4周，取出带有肿瘤的大鼠的脾脏。以完全相同的方式制备NK细胞，并将其在与上述剂量的或者抗体226B或226G或对照抗体温育后，将其注射到受体动物体内。再者，让标记细胞循环3小时，此后处死动物，并如上所述收集血液和脾脏。另外，取每种条件中2只动物的组织，以确定肿瘤细胞的其它位置。这些组织包括肝脏、大脑、胸腺、肺部、长骨(用于骨髓)和肾脏。
结果表明，在对照IgG1中，约32％的肿瘤细胞在脾脏中，而226B和226G表现出在脾脏中标记细胞数分别减少28％和29％。对于每种抗体，血液中的细胞百分比是相似的，在血液中发现约3-4％的总cpm，226G抗体处理比其它两组略低。
在处理组之间组织分布是相似的，肝脏表现出27％的总cpm，大脑表现出0.05％的总cpm，胸腺表现出0.10％的总cpm，肺部表现出15％的总cpm，肾脏表现出0.80％的总cpm，而长骨表现出1.3％的总cpm。
在第三个实验中，增加每种条件的动物数(n＝6或7)，以试图检测以上三个处理组之间的统计学差异。再者，使用在该实验前2周注射肿瘤细胞的动物的脾脏，并用上述相同的方法进行制备。以相同方式标记细胞，并将其注射到动物体内，让其循环3小时。在该实验中，由于使用的动物数量大，因此仅从动物中收集血液样品和脾脏。
所述结果与第二个实验一致，因为观察到在对照组中约30％的标记细胞已经返回脾脏，而在脾脏中仅发现25％的226B抗体处理细胞和27％的226G抗体处理细胞。血液样品又没有表现出组间主要差异，在对照组中在血液中发现约17％的总cpm，在226B和226G处理组中在血液中分别发现15.8％和14.75％的总cpm。
为了确定3小时是否是检查处理组之间差异的最佳时间点，在第四个实验中进行小调整。再次，以相同的方式分离和制备细胞，用于注射到受体动物体内，只是将另外的抗CD18抗体20C5B加入试验抗体组中。另外，每种条件仅使用4只动物。在该试验中，让细胞在注射后仅循环30分钟，在该时间点取血液样品并取出动物的脾脏。
在30分钟时间点，脾脏中的总cpm从第二个实验和第三个实验中观察到的数值降至12-13％。在脾脏样品中在所有处理组之间没有明显差异，尽管在用抗体226B处理组中4只动物中的2只动物确有略低的数值。血液数值在所有组之间又是相似的，在血液中发现约6-7％的总cpm。血液组之间唯一的显著差异是在来自226B和226G抗体处理动物的数据点有较大的扩大。这些发现表明，αd在白血病细胞返回脾脏中起作用。实验表明，返回需要数小时，用所述αd特异性单克隆抗体的最大抑制发生在3小时。多发性硬化和动脉粥样硬化的猕猴模型通过免疫细胞化学染色和免疫沉淀表明，单克隆抗体212D和217L与猕猴脾细胞交叉反应。通过免疫沉淀和对来自猕猴脾脏的αd物种同系物的氨基末端测序(实施例34)，证实了识别的特异性。鉴于这些先前的观察，在或者实验性自身免疫性脑炎(EAE)或者动脉粥样硬化研究中，使用所述两种抗体对得自猕猴的组织染色。这两种疾病的标志均为在EAE中吸收髓磷脂碱性蛋白(MBP)或在动脉粥样硬化中吸收低密度脂蛋白的吞噬性巨噬细胞浸润到损害中。通过形态学或者通过用油红O(ORO)或抗体Ham 56(Dako，Carpinteria，CA)染色，可以鉴定MBP或负载脂质的巨噬细胞。在这些研究中使用的方案如实施例18所述，以表征人组织中αd的表达。
患有EAE的猕猴大脑的切片标志为淋巴细胞和巨噬细胞的浸润。αd表达定位于损害中用ORO染色、表明先前摄入MBP的一个亚群的巨噬细胞。对ORO染色为阴性的损伤也对αd表达是阴性的。该结果暗示，在ORO染色和αd之间有直接相关关系。用抗体217K、217I和217H观察到相似的结果。
从高脂肪饮食的猕猴的或者胸动脉或腹动脉获得动脉粥样硬化损害。在人类中损害发生在这两个位置，但病理学进行性损害更常位于腹主动脉中。将在该项研究中测试的损害分为5个不同的时期(I至V)以及正常。(IV/V)期损害得自腹主动脉，而其余损害得自胸主动脉。
早期损害(I/II)表现出很少巨噬细胞浸润，并且αd表达水平低或甚至没有表达。在较晚期损害中，泡沫细胞的浸润较大，并且可检测到αd表达。
在这两种组织中，其它白血病整联蛋白α链亚基的染色图式与αd表达重叠，但不相同。最值得注意的是，在不被抗αd抗体染色的淋巴细胞上检测到非αd白血病整联蛋白α亚基的表达。
这些结果表明，αd表达可能是两种动物模型中吞噬性巨噬细胞的特征。然而，不清楚αd是直接参与吞噬作用，还是参与某些下游过程，例如抗原呈递。
实施例37αd在临床前模型中的表达为了评价αd在各种疾病状态中的差别表达，用如上所述(参见实施例22)产生的抗αd多克隆血清将来自动物疾病模型的组织切片染色。来自正常大鼠和患病大鼠的组织以6μm的厚度切片，并在SuperfrostPlus(VWR Scientific)玻片上于室温下风干过夜。干燥后，将切片贮藏于-70℃直至使用。在使用之前，从-70℃取出玻片，将其置于50℃约5分钟。在冷(4℃)丙酮(Stephens Scientifc)中将切片于室温下固定10分钟，并让其于室温下干燥。每个切片用150μl在1X TBS中含有30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、5％正常山羊血清(VectorLaboratories)和1％牛血清(BSA)(Sigma Chemical Company)的溶液中于室温下封闭30分钟，此后轻轻吸干切片的溶液。蛋白浓度为34μg/ml的兔多克隆血清和蛋白浓度为38.5μg/ml的来自同一只兔的免疫前血清在封闭溶液中稀释，分别将100μl于37℃应用于每个组织切片30分钟。吸干切片的血清溶液，通过在1X TBS中洗涤3次，每次5分钟来除去未结合的抗体。在最后一次洗涤后吸干，除去过量的TBS。按照生产商建议的方案，用Elite Rabbit IgG VectastainABC试剂盒(Vector)制备生物素化山羊抗兔抗体，将100μl所产生的溶液于37℃应用于每个切片15分钟。将玻片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟，此后将100μl在5％正常大鼠血清和1％BSA中以1∶100稀释的链霉抗生物素-金缀合物(Goldmark Biologicals)于室温下应用于每个切片1小时。玻片用TBS洗涤3次，每次洗涤5分钟，于室温下应用100μl TBS中的1％戊二醛(Sigma)5分钟。将玻片再次在TBS中洗涤3次，每次洗涤5分钟，在无菌去离子水中洗涤5次，每次洗涤3分钟。从每个切片吸干过量的液体，每个切片应用银增强溶液和起始溶液(Goldmark Biologicals)各2滴。让反应于室温下进行20-30分钟，此后将切片在无菌去离子水中充分冲洗，于室温下风干过夜并用Cytoseal60(VWR)固定。作为对照，在相同方案的相同实验中，用识别CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体标记组织切片。
用αd多克隆血清和抗CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体标记，揭示出不同于其它α亚基的αd的染色图式。
在正常肺组织中，在支气管呼吸上皮(而不是肺泡间隙中的上皮)上和看来是气隙中的肺泡巨噬细胞的单个细胞上检测到αd表达。用所述多克隆血清观察到的信号显著高于用免疫前血清对照获得的背景信号水平。在肺部肉芽肿组织中，在给予聚糖后24小时和96小时，用遍及肺泡区的αd染色呼吸上皮鉴定到不同的信号，在遍及气道的看来是肺泡巨噬细胞的细胞上检测到较强的信号。在来自推定已经从所述疾病中恢复的动物(给予聚糖后16天处死)的肺组织中，用所述αd抗体没有观察到信号。在这些组织的每种组织中，用免疫前血清观察到非常低的背景。
采用来自抗原诱发的哮喘模型的肺组织，用αd抗体在支气管和肺泡间隙的呼吸上皮中均检测到非常强的信号。该信号高于免疫前血清对照中的背景信号水平。临床前模型-单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)证明表明，脾脏红髓中的αd阳性巨噬细胞参与从循环中清除受损rbc和其它颗粒。假定脾脏红髓中的αd阳性巨噬细胞也从循环中清除细菌因子。可能不需要诱导抗原特异性T细胞应答的非感染性因子可能被红髓巨噬细胞直接消除。相反，被红髓巨噬细胞清除的机会性感染因子的确需要产生T细胞免疫应答，以消灭所述细菌。因此提出，红髓巨噬细胞上的表达可能用来通过调节巨噬细胞从红髓移至边缘区中，或通过作为参与巨噬细胞/T细胞相互作用导致T细胞活化的辅助分子，调节巨噬细胞/T细胞相互作用。
为了研究感染性因子免疫应答期间αd的作用，用单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogens)的鼠类模型，评估脾脏中αd的表达。检查已经吞噬细菌的红髓巨噬细胞上αd的表达。在该模型中也测试抗αd抗体，以确定αd在诱导对单核细胞增生利斯特氏菌的保护性T细胞应答中所起的作用。
实施例38αd在脊髓损伤中的作用在中枢神经系统(CNS)创伤后，免疫应答涉及浸入性嗜中性粒细胞、天然杀伤细胞和吞噬性单核细胞/巨噬细胞的混合物[Means等，J.Neurophathol.& Exp.Neurol.，42707-719(1983)]。这种应答包括释放炎性介质、诱导反应性小神经胶质细胞、血小板浸润、血管渗透性增强的内皮损害和发生水肿。最近的观察表明，脊髓中创伤后炎症部分通过脱髓鞘或通过对神经元或轴突更为直接的损害造成慢性缺陷[Blight，A.R.，Central Nervous System Trauma，2299-315(1985)]。另外，最近的研究报道，碰撞伤后，巨噬细胞/小神经胶质细胞数目明显与脊髓每个水平的组织损害量有关[Carlson等，Exp.Neurol.，15171-81(1998)]。嗜中性粒细胞和巨噬细胞均吞噬碎片，这进而诱导氧化爆发(oxidative burst)，导致产生活性氧种类。这些抗菌剂尽管有效，但可能在周围健康组织中引起损害。因此，可能白细胞的浸润和同时产生活性氧种类涉及原始碰撞伤位点之外的继发性损伤的蔓延。休克或脊髓损伤后，阻断嗜中性粒细胞或巨噬细胞浸润导致损伤程度的降低，这些研究支持这一假说[Blight，Neurosci，60263-273(1994)]。
为了评价αd在脊髓损伤中的作用，利用大鼠模型结合抗αd单克隆抗体，其中某些单克隆抗体阻断与其配体VCAM-1的结合。在该模型中，在第四胸椎(T)脊髓段引入完全横切，这一致地产生自主反射异常[Krassioukov等，Am.J.Physiol.268H2077-H2083(1995)]。该模型是有利的，因为这种小外科损伤产生充分确定的窄区的原发性组织破坏，这便于分析该区域上脊髓损伤的影响。
按照先前加拿大动物管理协会(Canadian Counsel on Animal Care)制订的“实验动物管理和使用指南”中确定的方针，进行所有实验。最初通过腹膜内注射，给予42只重270-320克的雄性Wistar大鼠(Charles River)阿托品(0.5mg/kg)和地西泮(2.5mg/kg)。10分钟后，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉大鼠。必要时在手术期间给予补充注射麻醉剂(2mg/kg)。在手术期间将大鼠置于加热垫，将体温保持接近37℃。除去第三胸(T3)椎骨的背侧病变，进行椎板切除术以在显微镜指导下暴露脊髓。用解剖刀刀片在T4脊髓段将脊髓完全横切。闭合椎板切除术之上的肌肉和皮肤，在加热灯下让所述动物恢复。如先前所述[Krassioukov等，Neurosci.70211-226(1996)]进行截瘫大鼠的手术后护理。从手术恢复后，随意提供食物和水。动物在手术后存活2天。
将大鼠(每组4-5只)分为以下处理组(1)1mg/kg或者αd单克隆抗体226H、236L、236B或者不相关同种型匹配的IgG1 κ抗体1B7，和(2)5mg/kg或者αd单克隆抗体226H、236L或者对照1B7。每只小鼠仅接受该治疗方案中的一种抗体。
用融合于一个免疫球蛋白区的重组人VCAM-1和表达大鼠αd和人CD18的CHO细胞系，按照体外结合测定选择抗体。检查一组抗体的单个抗体阻断αd与VCAM-1结合的能力。结合测定的结果表明，某些抗体不阻断结合(“非阻断剂”)，某些阻断结合的范围为50％(“中等阻断剂”)，而其它阻断结合的范围为75-85％(“强阻断剂”)。选择来自非阻断组、中等阻断组和强阻断组的代表性抗体如下所述进行应用。
在手术前一天、紧接手术后和手术后第一天，通过尾静脉注射给予所有单克隆抗体。抗体在pH 7.2磷酸缓冲盐溶液中稀释，缓冲液中不含氯化钙或氯化镁，以确保易于注射的适当体积。在另一对照组中，在完全横切脊髓后30分钟、2小时和24小时，通过尾静脉注射15mg/kg甲泼尼龙(MP)。将另外一组大鼠对照组如上所述横切脊髓，但不接受任何伴随的处理。
手术后2天，在经心脏灌注之前，腹膜内注射3g/kg乌拉坦(Aldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee，WI，USA)深度麻醉所述动物。打开胸腔后，将肝素注射到左心室中。给大鼠灌注250ml氧合组织培养基pH 7.4(Dulbecco改进的Eagle培养基；Gibco BRL)，然后灌注500ml 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)中的4％甲醛固定液。取出所述横切尾侧的胸椎脊髓(T4-8)用于如先前所述的检查[Krenz和Weaver，Neurosci 85443-458(1998)]。在同一固定液中后固定(postfixation)过夜后，于4℃用10％、20％和30％蔗糖的PBS溶液对脊髓部分进行超低温保护。然后将脊髓部分在恒冷切片机上切成水平切片(50μm)。采用标准方法用1％甲酚紫pH 4将切片染色，以显现多形核白细胞，在二甲苯中澄清，并用DPX浸片剂(BDH Laboratory Supplies，Poole，英国)加盖玻片。在损伤部位的脊髓区域，计数表现出圆形吞噬细胞形态的巨噬细胞/小神经胶质细胞数目和在甲酚紫染色后表现出特征性多叶核的嗜中性粒细胞的数目。采用亮视野显微镜和配有光栅(总面积为0.08mm2)的40X物镜，进行免疫细胞的定量。检查始于横切脊髓边缘并向尾侧、从一侧边缘至另一侧边缘区域移动的三个样品区域，来检查免疫细胞。该程序导致平均脊髓总定量面积为2.72mm2。然后在另一脊髓切片中重复该过程。从具有最大灰质的脊髓水平切片(在V层和VII层之间的边界)中选择样品区域，因为炎症反应最主要在灰质中。将每个样品区中计数的巨噬细胞和嗜中性粒细胞总数除以总的样品面积(mm2)，获得每个处理组中每mm2巨噬细胞和嗜中性粒细胞的平均数。将抗体处理组(1mg/kg和5mg/kg)与同一剂量的相应的不相关IgG匹配对照以及非药物处理的横切对照相比。在再一比较中，将最显著降低免疫细胞平均数的组与MP处理动物和手术对照动物相比。在处理组的鉴定方面，所有细胞计数均以盲法进行。
结果表明，在横切2天后的损伤位点，明显有活化的小神经胶质细胞和/或鉴定为具有大的半透明胞质的单核圆细胞的血液巨噬细胞。发现不接受伴随的αd抗体或皮质类固醇处理的对照动物在脊髓损伤位点有平均396±27个巨噬细胞/小神经胶质细胞/mm2。用不相同IgG1抗体1B7以较低剂量(1mg/kg)处理，将巨噬细胞/小神经胶质细胞的数目增加至462±46/mm2，但该数值与不接受抗体处理的对照动物没有显著差异。在所测试的αd抗体中，与1B7抗体和横切对照相比，226H和236L分别在1mg/kg下导致每mm2巨噬细胞平均数显著降低。具体地说，与1B7以及不接受处理的动物相比，给予226H将每mm2巨噬细胞/小神经胶质细胞减少至147±17，而给予236L将每mm2巨噬细胞/小神经胶质细胞减少至131±8。相反，注射1mg/kg的抗体226B将每mm2巨噬细胞/小神经胶质细胞数目减少至327±65，这与对照数值没有显著差异。MP处理导致观察到每mm2250±24个巨噬细胞/小神经胶质细胞，这显著低于对照动物，但高于在用226H和236L处理的动物中检测到的水平。这一结果是意想不到的，因为甲泼尼龙是最广泛使用的药物，在临床上用于治疗急性脊髓损伤。
当将αd抗体的剂量增至5mg/kg时，用226H和236L处理获得的每mm2巨噬细胞/小神经胶质细胞的平均数目显著低于对照，但该数目与用不相关IgG1同种型匹配的对照抗体处理的动物中的数目没有显著差异。
关于嗜中性粒细胞白细胞(NL)的结果表明，大多数是或者单个检测到的，或者以遍及灰质的聚集体检测到的。仅一小部分可见的NL是在灰质每一侧的白质中检测到的。此外，发现某些嗜中性粒细胞粘着至脊柱组织切片中的小静脉和小动脉的腔表面上。在不接受处理的动物中，每mm2的NL数目是295±56，而在用1mg/kg 1B7处理的动物中，NL数目显著增至503±93。当与不接受处理的对照动物相比时，没有一种αd抗体处理显著降低NL数目。具体地说，1mg/kg的226H和226B分别达到将每mm2NL数目增至361±80和332±43。与1B7处理动物相比，用1mg/ml 236L和MP处理分别将每mm2的NL数目显著降低至263±47和193±39。然而，这些观察与不接受处理的对照组没有显著差异。
5mg/kg下的1B7处理将NL平均数增至343±37，但观察到的增加与未处理动物组相比没有显著性。与1B7处理相比，抗体226H将NL平均数降低至236±38，但这种降低与未接受处理的动物相比没有显著性。相反，236L将每mm2NL数目降低至190±17，这与接受1B7处理的动物相比有显著差异。
这些结果表明，αd单克隆抗体在低剂量下可能通过破坏与VCAM-1的相互作用降低受损伤脊髓中的白细胞数目，这与先前报道的观察一致。采用已知的对VCAM-1的最佳反受体VLA-4的其它报道表明，减少VLA-4阳性细胞浸润到大脑中，并防止实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的临床和病理学病征。同样，表明抗TNF-α处理抑制EAE的发生率和严重程度，一个作用机制是脊髓管中VCAM-1的表达，导致进入CNS中的白细胞显著减少。这些先前的观察表明，阻断白细胞表面上的αd与内皮细胞或胶质细胞表面上的VCAM-1的相互作用，可能造成观察到的减弱的炎症反应。
因为阻断巨噬细胞浸润的一种抗体226H不阻断αd和VCAM-1之间的结合，所以这些结果表明，所述抗体的抑制模式可能包括在非VCAM-1的αd结合配偶体之间阻断。一种可能性是存在ICAM-R的大鼠对应物。先前的观察已经表明，除VCAM-1外，αd也结合ICAM-R，尽管亲和性比对VCAM-1的亲和性低得多。有趣的是，ICAM-R看来不存在于内皮细胞上，主要在居留单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞上表达，排除了它涉及正常情况下白细胞-内皮细胞粘着的可能性。已经表明，ICAM-R在白细胞细胞-细胞接触的初始阶段有作用，并且ICAM-R涉及LFA-1/ICAM-1白细胞胞间相互作用的条件。已经表明，ICAM-R在早期白细胞相互作用中的作用是诱导细胞聚集。导致聚集的初始接触的破坏降低了免疫应答的效力。也已经表明，ICAM-R的另一配体LFA-1的相互作用诱导在胞内接触位点上LFA-1转换至其活化状态。可能αd和ICAM-R在居留白细胞上的共表达可以以大致相同的方式起作用，并且所述两种蛋白之间的相互作用可以促进依赖于接触的白细胞活化事件。相反，例如通过应用αd抗体破坏相互作用可能解释进入脊髓的白细胞减少。
几种解释可能解释巨噬细胞浸润的增加。最简单的是，该结果可能是该系统的现象。另一方面，较高剂量抗体可能已经导致FcγR在成熟巨噬细胞上交联，导致趋化因子产生的初始爆发，这将更多的白细胞吸引到损伤位点中。同样，趋化因子的产生可以解释在大多数情况下发生的用1B7处理后损伤位点的嗜中性粒细胞和巨噬细胞数目均较高。因为在Wistar大鼠的远交品系中测试了所述αd抗体，所以对于所述观察的结果的另一种可能的解释是动物内的变异性。例如，不同组的大鼠可能具有略微不同的免疫活性状态。为了测试这种可能性，同时在来自同一窝或相关窝的动物中应用低剂量和高剂量的单克隆抗体，来重复进行所述实验。
实施例39αd在局限性回肠炎中的表达先前的研究(实施例18)表明，在来自局限性回肠炎患者的组织切片中检测到较高水平的白细胞整联蛋白。为了评价在局限性回肠炎中αd表达受调节的程度，在患病结肠和正常结肠的组织切片中如下检查表达。
来将自5个局限性回肠炎个体的结肠组织和正常结肠以6μm的厚度切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)玻片上于室温下风干5分钟。将玻片于-20℃贮藏直至进行测定。在使用之前，将玻片于50℃温育约2分钟。将切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中固定2分钟，并让其于室温下风干。将切片于室温下在含有100ml 1X TBS、1.1ml30％H2O2(Sigma)和1.0ml 10％NaN3(Sigma)的缓冲液中放置15分钟，以除去内源过氧化物酶活性。每个切片在150μl在1X TBS中含有20％正常人血清(Boston Biomedica)、5％正常大鼠血清(Harlan)和2％BSA(Sigma)的封闭溶液中于室温下封闭30分钟。温育后，轻轻地从切片中吸干溶液。以10μg/ml的蛋白浓度在封闭溶液中制备第一单克隆抗体，并将75μl于室温下用于每个组织切片1小时。温育后，切片在1X TBS中洗涤3次，每次5分钟，以除去未结合的抗体。通过在最后一次洗涤后抽吸组织周围的TBS，除去过量的TBS。将生物素化大鼠抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)在封闭溶液中以1∶400稀释，将75μl用于每个切片上于室温下达30分钟。玻片用1X TBS洗涤2次，每次洗涤5分钟。通过加入9μl试剂A和9μl试剂B加入782μl 1X TBS中，制备过氧化物酶缀合的抗生物素/生物素复合物(Vector Laboratories)，所述试剂A和试剂B均由生产商供应，将75μl所产生的混合物用于每个切片上于室温下达30分钟。玻片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。应用底物3，3’-二氨基联苯胺(DAB)(Vector Laboratories)，并通过浸入水中终止显色。在每个切片上加一滴1％锇酸(VWR)达约15秒，以增加信号强度，通过浸入水中终止反应。将切片在Gill’s苏木精#2(Sigma)中复染，并在水中冲洗，然后脱水并用Cytoseal(VWR)固定。
在正常结肠中，用抗体217L、217K或212D没有检测到标记。抗体240I标记了淋巴样聚集物种的许多细胞以及散布在固有层(lamina propria)中的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。抗体240I也标记了看来是或者巨噬细胞或者活化淋巴细胞的细胞类型。应用抗体169A的染色与抗体240I的染色相似。抗体169B除标记了动脉周围和外肌层(muscluaris extema)中的一个亚群的平滑肌细胞外，还标记了散布在固有层和粘膜下层的淋巴细胞和巨噬细胞。
关于局限性回肠炎结肠样品，用所述各个抗体观察到的标记图式重叠，但表达图式不相同。用抗体212D或217K没有检测到标记。抗体240I标记了在淋巴样聚集体中的多核巨细胞上有不同表达的肉芽肿，还标记了淋巴样聚集体中的淋巴细胞。抗体240I标记了固有层中散布的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。抗体217L也标记在淋巴样聚集体中的多核巨细胞上有不同表达的肉芽肿.抗体217L标记了固有层和粘膜下层中淋巴瘤的也被240I标记的一个小亚群。抗体169A的染色图式与用240I发现的染色图式非常相似，只是169A标记了较少的淋巴细胞。抗体169B染色与169A图式类似，只是169B也标记了血管周围和外肌层中的一个亚群的平滑肌细胞。
实施例40从大鼠脾αd+细胞释放TNFα为了在刺激时产生细胞因子的能力方面表征特有的αd+细胞脾亚群，进行以下实验。
给Lewis大鼠背部胁腹皮下注射100μl PBS中的完全弗氏佐剂(CFA)的1∶1乳剂，7天后处死动物。收获脾脏，并采用标准方法制备单细胞悬浮液。利用预结合在抗小鼠IgG磁珠缀合物上的抗CD4单克隆抗体(抗体W3/25，E.A.A.C.C.No84112002)、抗CD11b单克隆抗体(抗体OX42，E.A.A.C.C.No87081803)和抗CD45Ra/b单克隆抗体(抗体OX33，Pharmingen)，选择性地除去B细胞、CD4+T辅助细胞和巨噬细胞。所述CD4抗体鉴别T细胞，所述CD11b抗体鉴别巨噬细胞、单核细胞、粒细胞和天然杀伤细胞，而所述CD45Ra/b抗体识别B细胞、T细胞亚群、单核细胞、粒细胞和巨噬细胞。然后用磁铁除去包有抗体的细胞。收集非粘附细胞，用生物素化大鼠抗αd单克隆抗体205C和226G进行正选择，然后与链霉抗生物素磁珠一起温育。利用磁铁收集包有抗体的细胞，并将其以5×105细胞/ml悬浮于生长培养基(RPMI 1640，包含2％正常Lewis大鼠血清、青霉素/链霉素丙酮酸钠；L-谷氨酰胺)中。
将2ml细胞悬浮液加入包被有3μg/ml抗大鼠CD3单克隆抗体(G418，Pharmingen)、非相关对照抗体或未包被抗体的24孔板上的各个孔中。将板于37℃在7％CO2中温育，20小时、48小时和72小时后收集来自各孔的上清液。将上清液分成等分样品，并在收集后立即于-70℃贮藏。在测定之前，将上清液以1∶2稀释，并置于抗大鼠TNFα检测测定(Biosource)中。
结果表明，在用抗CD3单克隆抗体刺激后，与用所述抗体对照和仅用培养基的处理组中释放约40pg/ml TNFα相比，αd+细胞在20小时后释放约280pg/ml的TNFα。
实施例41用αd抗体调节从活化脾细胞中释放TNFα为了评价αd+吞噬性脾细胞在炎症反应中的作用，进行以下实验。
因为先前已经表明，αd+脾脏巨噬细胞吞噬注射到大鼠体内的磁性颗粒，以以下方式收集该类型的细胞。给4只小鼠静脉内注射200μl磁珠悬浮液(胺缀合的，Perspective Biosystems)。24小时后，取出脾脏，通过使组织通过金属网制备单细胞悬浮液。用磁铁分离细胞，并在含有镁和钙的PBS中洗涤1次，将其置于RPMI/10％FBS培养基中培养，并在以下6种条件下生长(i)不处理；(ii)用仓鼠抗大鼠αd单克隆抗体205C(10μg/ml)处理，该抗体与小鼠αd交叉反应；(iii)用仓鼠抗大鼠单克隆抗体205E(10μg/ml)处理，该抗体也与小鼠αd交叉反应；(iv)用脂多糖(LPS)处理；(v)用LPS和单克隆抗体205C(10μg/ml)处理；和(vi)用LPS和单克隆抗体205E(10μg/ml)处理，该抗体与小鼠αd交叉反应。
当指明时，所述细胞首先用所述抗体处理30分钟，此后收集200μl条件培养基样品，以代表初始时间点(t＝0)。然后将LPS(10ng/ml)如上所述加入各孔中，在0.5小时、1小时、2小时和4小时收集等份的培养基，并采用鼠类TNFα试剂盒(ENDOGEN，#005452)通过ELISA分析释放的TNFα。收集时，将样品立即冷冻直至测定。在测定之前，将条件培养基以1∶1稀释，并按照生产商建议的方案进行测定。
结果表明，尚未用LPS活化的脾细胞没有表现出将TNFα释放到培养基中，而与先前的抗体处理无关。已经用LPS处理的脾细胞将可检测水平的TNFα释放到培养基中，而用或者205C或者205E抗体处理的LPS活化细胞表现出TNFα释放水平显著较低。这些结果在所有时间点上均一致，并在随后的重复测定中得到证实。另外，在采用用磁珠分离不到的脾细胞进行的后来实验中观察到相同的结果。最后，初步结果表明，从脾细胞释放IL-1β同样受所述抗αd单克隆抗体的抑制。
实施例42嗜酸性粒细胞上αd表达的表征先前的观察表明，αd在所有外周血嗜酸性粒细胞上表达(实施例18)。为了进一步检查人嗜酸性粒细胞上的αd的表达和功能，进行以下分析。αd整联蛋白在人粒细胞上的表达在如下制备的细胞上检查αd在人粒细胞上的表达。通过如前所述的密度梯度离心、低渗红细胞裂解和免疫磁性负选择[Hansel等，J.Immunol.Meth.145105(1991)]，从变应性志愿者的外周血分离密度正常的嗜酸性粒细胞(即具有大于1.09的正常比重的嗜酸性粒细胞)。仅通过密度梯度离心和低渗红细胞裂解，从正常志愿者的外周血中纯化嗜中性粒细胞[Bochner等，J.Immunol.，1451832(1990)]。所述细胞类型各自的纯度总是超过95％。利用将嗜碱性粒细胞数目增至总白细胞计数的3-10％的双percoll密度梯度分离，对外周血进行嗜碱性粒细胞的富集[Bochner等，J.Immunol.Meth.125265(1989)]。利用如前所述的单色间接免疫荧光和流式细胞术[Bochner等，J.Immunol.Meth.125265(1989)；Matsumoto等，Blood 861437(1995)]，评估在培养物中刺激后在从血液新鲜分离的细胞上整联蛋白的表达。也进行嗜碱性粒细胞的双色检测(利用抗IgE)。将所有样品在0.1％低聚甲醛(Sigma)中固定，并利用EPICS Profile流式细胞仪(Coulter)进行分析。收集了约10,000个事件，所述事件在4log范围上显示，产生平均荧光强度(MFI)数值。
结果表明，嗜酸性粒细胞表达所有四种所述β2整联蛋白。αd整联蛋白的表面表达水平高于CD11c的表达水平，但低于α4整联蛋白(CD49d)、CD11a或CD11b的表达。结果也表面，嗜碱性粒细胞的αd整联蛋白表达水平比嗜中性粒细胞的表达水平略高。人嗜酸性粒细胞上的αd整联蛋白表面表达的调节进行初步研究，以确定嗜酸性粒细胞是否可以如所报道的嗜中性粒细胞一样[Van der Vieren等，Immunity 3683(1995)]，快速调动αdβ2的胞内贮存。将纯化的外周血嗜酸性粒细胞(如上所述制备的)与或者PMA或者钙离子载体A23187一起温育15分钟，通过间接免疫荧光(上文所述)测定β2整联蛋白家族的几种α链的表面表达。
结果表明，50ng/ml的PMA和1μM钙离子载体均显著增加αd和CD11b的表达。在加入PMA的数分钟内，表达增加，并在10分钟时达到显著增加的水平。这一观察表明，嗜酸性粒细胞有αdβ2的胞质贮存，这种贮存与CD11b的贮存相似，可以被快速调动至细胞表面。
鉴于这些结果，测试了其它嗜酸性粒细胞活性刺激物对αdβ2表达的急性效应。嗜酸性粒细胞与MDC(100nM)、IL-5(10ng/ml)、RANTES(100ng/ml)和eotaxin(100μm)一起温育15分钟，不能改变αd整联蛋白的表达。
先前的观察已经表明，通过在一种称为“引发”的现象中延长对某些细胞因子例如IL-5的暴露，可以增强许多嗜酸性粒细胞应答[Walsh等，Immunol.71258(1990)]。因此设计了实验，以检查用IL-5引发嗜酸性粒细胞培养物是否能够导致αd整联蛋白表面表达的改变。将如上所述制备的纯化嗜酸性粒细胞与10ng/ml IL-5一起温育4天，并如上所述分析各种整联蛋白的表达。
结果表明，虽然αd整联蛋白在细胞表面上的表达增加4-5倍，但α4整联蛋白表达水平仍未改变。αd整联蛋白表达增加的动力学表明在培养4-7天后表达有统计学上显著的增加。相反，α4整联蛋白水平未显著改变。用PMA暴露增强的αd表达的动力学与CD11b的相似，提示这两种白细胞整联蛋白可能存在于相似或相同的胞内区室。不知道这两种整联蛋白中任一种的区室在嗜酸性粒细胞中的位置；然而，在嗜中性粒细胞中，已经将CD11b的预先形成的贮存定位至特定的颗粒[Todd等，J.Clin.Invest.741280(1984)；Bainton等，J.Exp.Med.1661641(1641)]。
因为晚期支气管肺泡灌洗(BAL)嗜酸性粒细胞表达细胞因子引发的嗜酸性粒细胞的许多特征[Kroegel等，Ann.Rev.Respir.Dis.143A45(1991)；Sedgewick等，J.Immunol.1493710(1992)]，所以也检查了αd在该细胞类型上的表达。从已经经历如先前所述用或者豚草或者D.petrynissinus提取物进行支气管内段变应原攻击[Kroegel等，J. Clin.Allergy Immunol. 93725(1994)]的变应性患者获得BAL细胞18小时。晚期BAL流体中嗜酸性粒细胞的纯度为19±4％。
结果表明，晚期BAL嗜酸性粒细胞也表现出αd整联蛋白表达的统计学显著性增加，表达水平与在用IL-5刺激培养物3天后观察到的水平相似。在对晚期BAL嗜酸性粒细胞(即已经经历了细胞粘着和迁移到达气道腔的细胞)上αd整联蛋白水平的检查中，观察到最接近在新鲜分离且IL-5培养的嗜酸性粒细胞上所见到的水平的表达水平。这些结果表明，在IL-5培养后发现的提高的αd水平中的至少一部分可能是由于αd整联蛋白转录和翻译增加引起的。表达αd的嗜酸性粒细胞与VCAM-1结合虽然已经表明αd整联蛋白结合ICAM-R并可能介导白细胞-白细胞粘着[Van der Vieren等，Immunity 3683(1995)]，但设计了实验以检查嗜酸性粒细胞上表达的αd的其它可能的配体。部分因为先前的研究提示有依赖于β2整联蛋白、与CD11b无关的嗜酸性粒细胞粘着于VCAM-1[Matsumoto等，Blood 861437(1995)]，所以利用固定化重组VCAM-1进行初步研究。
对于新鲜纯化的嗜酸性粒细胞和培养的嗜酸性粒细胞，如先前所述[Matsumoto等，Blood 861437(1995)]于37℃进行51Cr标记细胞与VCAM-1(250ng/ml)或BSA(1％)包被孔的粘着达30分钟。在某些实验中，将细胞于4℃与饱和浓度的一种或多种以下阻断性单克隆抗体一起预温育30分钟，然后检查粘着抗CD18(7E4)、抗CD11a(MHM24)、抗CD11b(克隆44)、抗CD11c(BU-15)、抗αd(240I)和抗α4(HP2/1)。
对于转染的CHO细胞和亲代CHO细胞，用与先前用于嗜酸性粒细胞粘着的相同包被板进行粘着。对转染的CHO细胞的检查表明，αd表达相对低，结果检测到的CHO转染子和VCAM-1之间的相互作用不如嗜酸性粒细胞和VCAM-1之间的相互作用强。因此使用先前描述的温和洗涤技术[Shanley等，J.Immunol. 1601014(1998)]的改进技术。该技术允许通过以1×g于20℃离心使非粘着细胞从倒置板上脱离(dislodge)。然后利用0.1 MEDTA(Sigma)取出剩余的粘着细胞并通过流式细胞术计数。除VCAM-1外，在一些粘着实验中也用E-选择蛋白(100ng/ml)包被各孔。除了在所述嗜酸性粒细胞研究中使用的封闭单克隆抗体外，用F(ab’)2抗VCAM-1单克隆抗体的合适稀释液预处理固定化VCAM-1，然后加入CHO细胞。
结果表明，新鲜分离的嗜酸性粒细胞粘着至VCAM-1，并且阻断α4整联蛋白的单克隆抗体有效地抑制粘着。用抗CD11b抗体阻断没有效应。抗αd单克隆抗体240I也可以显著性地并且一致地抑制粘着，尽管其程度(约30％抑制)低于用抗α4抗体观察到的程度。
甚至更突出的是VCAM-1粘着实验的结果，其中使用了IL-5培养的、αd整联蛋白表达水平提高的嗜酸性粒细胞。在这些条件下，抗CD18、αd或α4整联蛋白的单克隆抗体在将粘着降低至背景水平方面同样有效，而抗CD11a、CD11b和CD11c的阻断性抗体的组合没有效应。也观察到，与用新鲜分离的嗜酸性粒细胞的粘着相比，IL-5培养的嗜酸性粒细胞表现出背景粘着增强，而VCAM-1粘着减弱。根据用新鲜分离的嗜酸性粒细胞的单克隆抗体阻断实验，粘着于VCAM-1主要通过α4整联蛋白介导。然而，在IL-5培养的嗜酸性粒细胞中，αd和α4整联蛋白对粘着于VCAM-1的介导是等同的。综合来讲，这些数据首先证明了人嗜酸性粒细胞上αdβ2整联蛋白表达和功能的活化依赖性调节，并证明αdβ2的新功能是VCAM-1的替代配体。
根据嗜酸性粒细胞上的αd整联蛋白与VCAM-1结合并可以用IL-5正调节的结果，这种白细胞整联蛋白可以在细胞因子引发的嗜酸性粒细胞募集至炎症位点中起作用。
实施例43表达αd的CHO细胞结合VCAM-1为了进一步确证αdβ2的功能是VCAM-1的配体，如下产生表达人αd和β2整联蛋白链的CHO转染子。
如实施例11中所述转染中国仓鼠卵巢细胞。在含有1mM丙酮酸盐和2mM L-谷氨酰胺(Biofluids)、补充10％透析FBS、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和600μg/ml G418(全都得自LifeTechnologies)的DMEM/F12培养基中，培养αdβ2转染的CHO细胞。用于培养亲代CHO细胞系的培养基是相似的，只是使用非透析FBS(Life Technologies)，并用0.1M次黄嘌呤和16nM胸苷(Sigma)取代G418。αdβ2转染的细胞以适当水平表达αd和β2整联蛋白链，但不表达CD11a、CD11b、CD11c或α4整联蛋白。亲代CHO细胞系不能表达任何这些整联蛋白。如以上实施例42中所述进行粘着测定。
结果表明，αdβ2转染的CHO细胞粘着于VCAM-1包被孔。抗VCAM-1第一结构域的F(ab’)2单克隆抗体以及抗或者CD18或者αd的单克隆抗体有效地阻断粘着。相反，亲代非转染CHO细胞不能粘着于VCAM-1，这两种细胞类型均未表现出显著粘着于E-选择蛋白包被的孔。
抗VCAM-1的第一结构域中α4整联蛋白结合位点的单克隆抗体完全阻断了依赖于αdβ2整联蛋白的VCAM-1的粘着，这一发现有力地表明，αdβ2结合位点在α4整联蛋白结合位点附近或与α4整联蛋白结合位点相同。由于在αd整联蛋白和α4整联蛋白之间几乎没有氨基酸同源性，因此这一结果是出乎意料的。尚不知道αdβ2整联蛋白是否可以结合于其它α4整联蛋白配体，例如纤连蛋白或粘膜地址素细胞粘着分子-1。αd结合所需的VCAM-1区已经表明，VCAM-1的前两个结构域支持整联蛋白，并且已经鉴定了那些结构域中的相关氨基酸。为了确定αd是否享有VCAM-1分子中的相似识别位点，构建了一种质粒，该质粒含有融合于人免疫球蛋白Fc的VCAM-1结构域1和2的序列。另外，通过PCR产生了包括一个置换突变的修饰形式的两种结构域VCAM-1表达载体，其中残基40的丙氨酸用天冬氨酸残基取代。采用先前描述的DEAE-葡聚糖方案，将这两种表达构成物瞬时转染到COS细胞中。用A蛋白Sepharose，如先前所述，从培养上清液中纯化蛋白。
如下测试表达或者α4β1或者αdβ2的CHO细胞结合5个结构域的VCAM-1/Ig融合蛋白或ICAM-1/Ig融合蛋白的能力。将CAM以0.5μg/孔的碳酸氢盐缓冲液(pH 9.5)固定至96孔微量滴定板。用1％鱼明胶将板封闭，并用或者缓冲液、不相关抗体或者阻断性VCAM-1抗体处理。或者仅用缓冲液、用对所述α链特异性的单克隆抗体的不相关抗体(对于αd为130K或217I，或对于α4为α4.1)、或者用阻断性α链抗体处理αd或α4转化的CHO细胞。在以100,000细胞/孔的密度加入CAM包被孔之前，将细胞洗涤。将细胞在所述固定化抗体存在下温育20分钟，然后加入5％戊二醛。固定之后，用蒸馏水洗涤板，并用1％结晶紫将细胞染色，用66％乙醇脱色数小时后，在Dynatch酶标仪上测量570nm的吸光度。
结果表明，αdβ2和α4β1在同等程度上识别5个结构域形式的和2个结构域形式的VCAM-1，表明结合可能不需要另外的结构域。虽然在αd/VCAM-1结合和α4/VCAM-12结合之间检测到差异，但有可能所述差异产生于所述转化CHO细胞的差别表达。这两种细胞系的结合均被VCAM-1抗体(50-100％)、α4抗体(100％)和αd抗体(50％)阻断。α4转染的系不识别突变VCAM-1，并且所述αd细胞系与该突变的结合是用野生型VCAM-1检测的50％。CHO细胞系中没有一个表现出ICAM-1/Ig的结合。综合而言，这些结果表明，αd和α4识别VCAM-1的结构域1和2，并且识别重叠的、但不相同的表位。
实施例44将αd作为肿瘤抗原靶αd的空间和时序限制的表达提示，该分子可能用作除去在表面上表达αd的致病细胞群体的靶。几个先前的观察产生这种可能性。
例如，与其它白细胞整联蛋白相比，αd的表达的分布不太广泛。αd的表达看来限于一个特化的和/或高度分化的白细胞亚群。与其它白细胞整联蛋白不同，αd的表达在原代细胞或培养物中的转化细胞上快速负调节证明，αd的表达看来是调节的对象。即使抗αd单克隆抗体对αd具有特异性，但所述抗体表现出可变的反应性。例如，与用另一抗αd单克隆抗体217L观察到的反应性相比，抗αd抗体212D表现出与正常组织和高度分化的骨髓细胞的反应性有限。有趣的是，剔除小鼠存活至分娩和更长时间(until birth and beyond)，但这一观察提供很少的涉及αd生物学功能的信息。最后，已经在估计的70％犬白血病上检测到αd表达，已经在来自F344大鼠的新鲜分离的NK白血病细胞上检测到高水平的αd表达(实施例26)。虽然肿瘤细胞可能是利用αd作为靶的进行清除的优选群体，但以下述的方式也可能清除了表达αd的不希望有的细胞类型。
选择一种或多种抗体，优选表现出与正常组织具有低水平反应性的抗体。由于以下讨论的原因，一种可能性可能是抗体212D。也选择合适的对照抗体，包括作为阴性对照的不相关抗体。从白血病患者和淋巴瘤患者获得血液和肿瘤样品，通过免疫细胞化学并利用选定的抗体通过FAScan、免疫沉淀和蛋白质印迹分析根据细胞表面表达进行筛选。检测可阳性染色将产生在开发清除方法时的替代程序。
在一种方法中，克隆以上选定的阳性染色抗体的高变区，并将其在补体固定人同种型背景中表达。在亚克隆和同种型转换后，再次如上所述，包括例如FACS分析、在正常组织上的组织学和免疫沉淀，评价特异性和反应性。开发了一种用于表达人IgG1背景中的选定高变区的盒式载体(cassette vector)。另外，设计并合成了一系列引物，以有助于从杂交瘤细胞系中扩增目的抗体的高变区[Gavilondo-Cowley等，HYBRIDOMA，第9卷第5期，1990，Mary Anne Leibert Inc.，Publishers，Media，PA，第407-417页]。然后体外测试所产生的抗体，以确定在补体存在下的结合是否导致细胞死亡。最好是用肿瘤细胞进行所述体外测定。对照测定将确定所述单克隆抗体在不表达αd的细胞培养物中是否表现出相同活性。
也测试所述单克隆抗体，以确定结合是否导致内化，内化表明所述抗体可以与细胞毒性药物缀合。
开发了一个其中检查体内细胞裂解活性的临床前模型。在一个实施例中，在所述F344大鼠模型中(实施例26)检查到相当的活性(equivalency)。另一种模型是SCID/Hu系统，其中已经移植了人细胞。例如，将骨髓U937细胞、Jurkat T细胞或人结肠癌HTC166细胞移植到小鼠体内，收获肿瘤，并用抗αd抗体(例如212D和217L)对肿瘤进行表面抗原染色。αd表达的检测导致体内应用所述抗体以除去肿瘤。
实施例44
人抗αd单克隆抗体通过如先前所述筛选在丝状噬菌体上呈现的抗体所有组成成分[Waterhouse等，Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)；Parsons等，Protein Engineering 91043-1049(1996)]，鉴定人单克隆抗体。简而言之，用来自非免疫人供体的功能性V基因区段，构建在噬菌体表面上呈现的所有组成成分的单链Fc(scFv)片段。将片段克隆到噬菌粒载体中，所述噬菌粒载体允许噬菌体展示以及并进行亚克隆就产生可溶性scFv。已经掺入组氨酸标记，以便于通过镍螯合层析来快速纯化scFv。应用该文库形式一般允许在不到2周内分离人单克隆抗体片段。如先前所述进行分离[Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，Vaughan等，Nature Biotechnol.14309-314(1996)]。最好鉴定特异性地识别所述I结构域的抗体。
实施例45在motheaten小鼠中的抗αd抗体治疗在motheaten突变小鼠[Koo等，J.Immunol.1471194-1200(1992)；Koo等，J.Immunol.1516733-6741(1993)]中，在C57BL/6小鼠中常染色体隐性mev基因作为造血细胞蛋白亮氨酸磷酸酶的点突变而自发产生。纯合体发生涉及肺部和皮肤中骨髓单核细胞积累的慢性骨髓单核细胞性炎症，这导致间质性肺炎、胸腺萎缩以及T细胞和NK细胞功能障碍。所述炎症可通过这些小鼠的骨髓细胞转移，表面mev突变是由于骨髓单核细胞途径中干细胞缺陷引起的。由于αd存在于骨髓细胞中，因此进行一种方法，以评价从motheaten突变小鼠移植骨髓后在正常小鼠中用抗αd单克隆抗体治疗对免疫病理变化的抑制效应。
C57BL/6J(B6)-mev/mev及其正常的+/-同胞(B6)-+/-小鼠得自Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME。将小鼠维持在无病原体环境中，随意提供食品和水。所有小鼠均为6-10周龄。
于第-1天，所有小鼠通过腹膜内注射，接受0.5ml PBS中的2μg/mlα-NK1.1抗体PK136(Pharmingen)。第0天，所有B6+/-小鼠以750Rad进行照射。从(B6)mev/mev如前所述收获骨髓。将从胫骨和股骨取出的细胞转移至补充RPMI培养基中，并温育2小时，然后静脉内注射到经照射的小鼠体内。小鼠立即通过腹膜内注射，用200μl PBS中的5mg/ml或者抗αd抗体205C或者不相关的抗体治疗。以上已经描述了与小鼠αd单克隆抗体交叉反应的纯化的205C仓鼠抗大鼠。作为阴性对照，一组小鼠接受等体积盐水注射。第4天至第25天，小鼠每隔一天用或者抗体或者盐水注射进行治疗，总共进行10次治疗，监测动物体重和病征的变化。一般而言，对每组的观察继续进行总共2个月。
在该测定中，濒死状态是终点。然而，处死病情非常严重的动物。评价各组中的存活率，并将组织的组织学分析用作αd抗体治疗效力的另外的指标。进行一个检查αd抗体治疗特性的相似研究，以补充上述的预防性研究。
到第35天为止，用αd抗体治疗的小鼠中没有一只死亡，而盐水处理组中9只小鼠中的2只小鼠死亡，其余7只中有3只小鼠正在发生该综合征的典型病症。在用不相关抗体处理的组中，8只小鼠中有3只小鼠死亡。
实施例46αd在人白血病中表达根据细胞谱系可以将白血病分为两类-骨髓性白血病和淋巴性白血病，这两类均可以进一步区别为急性或慢性。因为αd表达明显限于骨髓谱系的细胞，所以假定骨髓性白血病表达αd，而不是淋巴性白血病表达αd。假若第一个假说正确，则第二条调查路线是确定αd表达是否根据发病机理而变化，由此暗示αd在这些细胞上的疾病相关功能。
如实施例18中所述，已经利用抗体212D和217L检测到外周血细胞上αd的表达。在白血病细胞的检查中，首先通过流式细胞术分析正常骨髓细胞的αd表达，以建立该细胞类型的基线。按照标准方案，用抗体212D和217L将患者样品染色，在骨髓中这两种抗体均表现出与单核细胞的弱反应性。抗体212D仅为临界阳性。
对患者外周血或骨髓的白血病细胞的流式细胞术分析表明，在急性髓细胞白血病(AML)患者中的成骨髓细胞(myeloid blasts)和成单核细胞存在212D和217L表位。在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的细胞上也观察到表达。所述细胞上的αd表达比对照单克隆抗体高50-100％，但显著低于CD11a、CD11b和CD11c表达水平。
根据这些结果，也评价了与M-4期(按照M1-M5的分化标准)AML细胞等同的一种骨髓谱系白血病-U937细胞系。CD11a、CD11b、CD11c和αd的表达图式与AML患者细胞的表达图式相似。有趣的是，细胞表面αd蛋白的存在取决于培养条件。具有高血清水平的丰富培养基(Iscove改进的Dulbecco培养基，20％FBS)支持αd表达，而基础培养基(RPMI，10％FBS)不支持αd表达。
在来自CLL患者的成淋巴细胞上检测到αd表达，这一发现表明αd可以在淋巴细胞谱系细胞中表达，并且与其它数据(即大鼠CD5+细胞和犬CD8+细胞上的αd表达)一致。其它白血病整联蛋白在这些细胞上的相对高水平的表达可能妨碍以可再现方式应用这些细胞以检查αd的功能，并且提示该家族的功能丰余性可能对这些细胞类型中一个成员的抑制进行代偿。事实上，这些细胞的αd表达可能与异常转录同时发生。
虽然这些实验不完全支持原始假说，但在骨髓谱系白血病和淋巴谱系白血病上存在αd蛋白提示，广泛的患者群体可能受益于应用目标为除去肿瘤而不是功能性抑制的抗αd疗法。
预期本领域技术人员会想到在以上说明性实施例中叙述的本发明中的许多修改和变化。因此本发明应该仅受所附权利要求书中出现的这种限制。
序列表<110>Gallatin，Michael W.
Van der Vieren，Monica<120>新的人β2整联蛋白α亚基<130>27866/35694<140><141><150>08/173,497<151>1993-12-23<150>08/286,889<151>1994-08-05<150>08/362,652<151>1994-12-21<150>08/943,363<151>1997-10-03<150>09/193,048<151>1998-11-16<150>09/350,259<151>1999-07-08<160>114<170>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>3726<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(3)..(3485)<400>1tg acc ttc ggc act gtg ctt ctt ctg agt gtc ctg gct tct tat cat47Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15gga ttc aac ctg gat gtg gag gag cct acg atc ttc cag gag gat gca95Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala20 25 30ggc ggc ttt ggg cag agc gtg gtg cag ttc ggt gga tct cga ctc gtg143Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val35 40 45gtg gga gca ccc ctg gag gtg gtg gcg gcc aac cag acg gga cgg ctg191Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu50 55 60tat gac tgc gca gct gcc acc ggc atg tgc cag ccc atc ccg ctg cac239Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys 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21<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>64cagatcggct cctactttgg 20<210>65<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>65catggagcct cgagacagg 19<210>66<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>66ccactgtcct cgaagctgga g 21<210>67<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>67cttcgtcctg tgctggctgt gggctc 26<210>68<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>68cgcctggcat gtgaggctga g 21<210>69<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>69ccgtgatcag taggcaggaa g 21<210>70<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>70gtcacagagg gaacctcc 18<210>71<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>71gctcctgagt gaggctgaaa tca 23<210>72<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>72gagatgctgg atctaccatc tgc 23<210>73<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>73ctgagctggg agatttttat gg 22<210>74<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>74gtggatcagc actgaaatct g 21<210>75<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>75cgtttgaaga agccaagctt g 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Gly Arg Leu Tyr50 55 60gag tgt gcg cct gcc tcc ggc acc tgc acg ccc att ttc cca ttc atg 300Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met65 70 75 80ccc ccc gaa gcc gtg aac atg tcc ctg ggc ctg tcc ctg gca gcc tcc 348Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser85 90 95ccc aac cat tcc cag ctg ctg gct tgt ggc ccg acc gtg cat aga gcc 396Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala100 105 110tgc ggg gag gac gtg tac gcc cag ggt ttc tgt gtg ctg ctg gat gcc 444Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala115 120 125cac gca cag ccc atc ggg act gtg cca gct gcc ctg ccc gag tgc cca 492His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro130 135 140gat caa gag atg gac att gtc ttc ctg att gac ggc tct ggc agc att 540Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile145 150 155 160agc tca aat gac ttc cgc aag atg aag gac ttt gtc aga gct gtg atg 588Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val 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权利要求
1.在中枢神经系统损伤位点抑制巨噬细胞浸润的方法，包括给予个体有效量的抗αd单克隆抗体。
2.按照权利要求1的方法，其中所述抗αd单克隆抗体阻断αd和结合配偶体之间的结合。
3.按照权利要求2的方法，其中所述结合配偶体是VCAM-1。
4.按照权利要求1的方法，其中所述抗αd单克隆抗体选自由杂交瘤226H分泌的单克隆抗体和由杂交瘤236L分泌的单克隆抗体。
5.按照权利要求1-4中任一项的方法，其中所述中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
6.在中枢神经系统损伤位点减轻炎症的方法，包括给予个体有效量的抗αd单克隆抗体的步骤。
7.按照权利要求6的方法，其中所述抗αd单克隆抗体阻断αd和结合配偶体之间的结合。
8.按照权利要求7的方法，其中所述结合配偶体是VCAM-1。
9.按照权利要求6的方法，其中所述抗αd单克隆抗体选自由杂交瘤226H分泌的单克隆抗体和由杂交瘤236L分泌的单克隆抗体。
10.按照权利要求6-9中任一项的方法，其中所述中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
11.调节从巨噬细胞释放TNFα的方法，包括使所述巨噬细胞与有效量的免疫特异性αd单克隆抗体接触的步骤。
12.调节从脾吞噬细胞释放TNFα的方法，包括使所述吞噬细胞与有效量的免疫特异性αd单克隆抗体接触的步骤。
13.按照权利要求12的方法，其中所述抗αd单克隆抗体抑制TNFα的释放。
14.按照权利要求13的方法，其中所述免疫特异性抗αd单克隆抗体选自由杂交瘤205C分泌的单克隆抗体和由杂交瘤205E分泌的单克隆抗体。
15.杂交瘤217L(美国典型培养物保藏中心保藏号HB-12701)。
16.由权利要求15的杂交瘤分泌的单克隆抗体。
17.杂交瘤236G。
18.由权利要求17的杂交瘤分泌的单克隆抗体。
19.与权利要求16的单克隆抗体竞争与αd结合的抗体。
20.与权利要求18的单克隆抗体竞争与αd结合的抗体。
21.多肽，包含一种或多种的权利要求16、18、19或20的单克隆抗体的αd抗原结合序列。
22.筛选树突细胞的方法，包括以下步骤a) 使候选细胞类型与权利要求16或19的单克隆抗体接触；和b) 检测所述单克隆抗体与所述细胞的结合。
23.筛选组织样品中肉芽肿组织的方法，包括以下步骤a) 使所述组织样品与权利要求16或19的单克隆抗体接触；和b) 检测所述单克隆抗体与所述组织的结合。
24.筛选上皮样组织细胞(hystiocytes)的方法，包括以下步骤a) 使细胞与权利要求16或19的单克隆抗体接触；和b) 检测所述单克隆抗体与所述上皮样组织细胞的结合。
25.筛选肉样瘤病组织样品的方法，包括以下步骤a) 使组织样品与权利要求16或19的单克隆抗体接触；和b) 检测所述单克隆抗体与所述组织的结合。
26.筛选树突细胞的方法，包括以下步骤a) 使候选细胞类型与权利要求21的多肽接触；和b) 检测所述多肽与所述细胞的结合。
27.筛选组织样品中肉芽肿组织的方法，包括以下步骤a) 使所述组织样品与权利要求21的多肽接触；和b) 检测所述多肽与所述组织样品的结合。
28.筛选上皮样组织细胞的方法，包括以下步骤a) 使细胞与权利要求21的多肽接触；和b) 检测所述多肽与所述上皮样组织细胞的结合。
29.筛选肉样瘤病组织样品的方法，包括以下步骤a) 使组织样品与权利要求21的多肽接触；和b) 检测所述多肽与所述组织样品的结合。
全文摘要
公开了抑制脊髓损伤后的炎症和巨噬细胞浸润的方法以及调节从表达α－d的细胞释放TNF－α的方法。抗α－d单克隆抗体用来阻断α－d和VCAM－1之间的结合。公开了分泌所述抗体的杂交瘤以及采用所述抗体的诊断方法。
文档编号A61K38/00GK1352651SQ99815633
公开日2002年6月5日 申请日期1999年11月16日 优先权日1998年11月16日
发明者M·W·加拉廷, M·范德维伦 申请人:艾科斯有限公司