一种介导肝素细胞内传递的交联纳米载体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种介导肝素细胞内传递的交联纳米载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]肝素作为临床广泛使用的抗凝血药物，已有60多年的历史。其抗凝血活性主要是通过其戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-1II)，并诱导其构象转变，进而激活AT-1II，AT-1II进一步结合并抑制凝血连锁反应中的多种凝血酶(包括凝血因子Xa和IIa等)，从而显示出抗凝血活性。除了经典的抗凝血及其相关的抗血栓生成活性以外，肝素还具有抗平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤及抗病毒等多种生物活性，并且这些生物活性同肝素的特殊分子结构密切相关。临床治疗过程中，人们发现肝素可有效延长恶性肿瘤患者的存活时间，由于肝素具有良好的生物相容性、水溶性和生物可降解性等诸多优点，目前对于肝素在肿瘤生长抑制方面的研宄逐渐成为热点。
[0003]已有研宄表明肝素的抗肿瘤作用可分为胞外作用和胞内作用，在细胞外，肝素可抑制血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)刺激的血管内皮细胞的增殖，抑制肿瘤新生血管的形成；肝素进入细胞后，可与细胞内转录因子结合，使转录因子无法正常发挥作用，从而干扰肿瘤细胞的生长增殖。研宄发现肝素的抗肿瘤作用涉及抑制肿瘤形成、癌细胞生长及转移各个环节，在这些环节中肝素与其他物质相互作用，扮演着重要的角色。虽然肝素的抗肿瘤作用展现了良好的应用前景，但是因肝素分子表面带大量负电荷，难以通过负电性的细胞膜进入细胞，并且易与血浆中蛋白结合，易被细胞表面的肝素酶降解。
[0004]基于上述分析，设计阳离子聚合物作为药物载体，通过静电作用与肝素形成纳米颗粒复合物，颗粒表面因载体所具有的正电荷而呈现正电性，容易与细胞膜吸附，通过内吞作用携带肝素进入细胞，在细胞内发挥抗肿瘤作用，将有助于拓宽肝素的临床应用范围。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种介导肝素细胞内传递的交联纳米载体的制备方法。
[0006]本发明的技术方案为:采用PEG修饰的PEI，利用PEI的阳离子性能包载肝素，增加细胞内吞能力，PEG分子提高载体及纳米复合物的水溶性、稳定性、血液代谢能力，防止复合物与蛋白结合受到清除，同时避免肝素受肝素酶作用降解，此外为了实现肝素在细胞内的有效释放，在此基础上通过交联剂引入二硫键，以使纳米粒子降解而释放肝素，使其在细胞内发挥生物学作用。
[0007]本发明提出的一种介导肝素细胞内传递的交联纳米载体的制备方法的具体操作步骤如下:通过合成PEG-C00H，利用其末端的羧基与PEI末端的胺基反应，制备得到PEG-PEI嵌段共聚物，取一定量的肝素钠溶液，缓慢滴加到一定量的PEG-PEI溶液中，滴加完毕后立即震荡5?10分钟，静置30分钟，制得PEG-PEI/Heparin纳米复合物，在此基础上加入适量交联剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)，形成带二硫键的交联PEG-PEI/Heparin纳米复合物，再将纳米复合物粒子作用于肿瘤细胞，在荧光倒置显微镜下观察肝素在交联纳米载体介导下向肿瘤细胞内传递的情况，并分析其对肿瘤细胞生长的影响。
[0008]本发明的独到之处有两点:首先采用PEG修饰的PEI，利用PEI的阳离子性能包载肝素，增加细胞内吞能力，PEG分子提高载体及纳米复合物的水溶性、稳定性、血液代谢能力，防止复合物与蛋白结合受到清除，同时避免肝素受肝素酶作用降解，此外在此基础上通过交联剂引入二硫键，以使纳米粒子在细胞内崩解而有效释放肝素；其次将制备得到的载体运用于肝素向细胞内的传递，使肝素借助该载体实现更大限度的细胞内的分布，从而达到细胞内直接作用于转录因子，抑制肿瘤细胞生长增殖的作用。
【具体实施方式】
[0009]以下利用实施例进一步详细说明本发明，但不能认为是限定发明的范围。
[0010]实施例一:PEG-COOH的制备
[0011]量取一定量的乙腈，加入0.5-1% P205于82°C下共沸回流8小时，分馏得到无水乙腈，浸泡在4A分子筛中待用；吡啶与一定量的NaOH于116°C下共沸回流12小时，分馏得到无水吡啶，浸泡在4A分子筛中待用。称取1g PEG溶于20mL无水乙腈，加入3g 丁二酸酐和15mL无水吡啶，室温搅拌过夜，旋转蒸发除去乙腈和吡啶，残余无色透明粘稠液体滴入150mL无水乙醚中剧烈搅拌，产生白色沉淀，抽滤得到的固体反复用无水乙醚洗涤3次，最后抽滤所得白色固体用异丙醇重结晶3次，即PEG-COOH纯化产物，产物通过红外光谱检测表征，在1725cm-l处出现了较强的吸收峰，此处为羧基的C = O伸缩振动峰。
[0012]实施例二:PEG-PEI嵌段共聚物的制备
[0013]称取0.2g PEG-COOH溶于1mL去离子水中，调节pH值到4.5?6之间，加入
0.077g EDC.HCl搅拌溶解；称取0.432g PEI溶于1mL去离子水中，将PEI水溶液缓慢滴加到PEG-⑶OH的溶液中，边滴加边涡旋振荡，室温搅拌反应24小时，用MWCO 100Da的透析袋在去离子水中透析3天，除去小分子杂质，冻干得到PEG-PEI共聚物。核磁共振和红外光谱检测产物的形成，红外在1103CHT1处出现了较强的吸收峰，此处为C-O-C的吸收峰；1471CHT1处为C-N的伸缩振动吸收峰，1628cm ―1处为酰胺I带C = O的吸收峰，2949cm ―1处为-CH2-的吸收峰，3369CHT1处为为N-H的吸收峰；1H-NMR分别显示了对应于PEG-COOH的氢化学位移的吸收峰(-OCH2CH2-, 3.65ppm ;CH30-，3.38ppm)和对应于PEI的氢化学位移的吸收峰(-CH2CH2NH-, 2.5-2.9ppm)，表明 PEG-C00H 已与 PEI 连接。
[0014]实施例三:PEG-PElAfeparin纳米复合物的制备及交联
[0015]称取40mg PEG-PEI和40mg肝素钠分别溶于4mL去离子水中。取一定量的肝素钠溶液，缓慢滴加到一定量的PEG-PEI溶液中，边滴加边震荡，滴加完毕后立即震荡5?10分钟，静置30分钟。按照以上方法分别制备PEG-PEI = H印重量比(w/w)分别为
0.4，0.6，0.8，I, 2，5的复合物，并控制肝素钠的终浓度为0.5mg/mL。在此基础上，加入适量的交联剂DSP的DMSO溶液(DMS0的量小于5% )，用枪头混合均匀，放置30min，使交联反应充分进行，得到交联的PEG-PEI/Heparin纳米复合物。测定交联纳米复合物的粒径及其分布情况以及纳米粒子的Zeta-电位。PEG-PEI/Heparin比例为1:1时的粒径较为稳定，粒径在135nm左右，电位在+35mV左右，为最佳配比，此后可被用作细胞实验配比。
[0016]实施例四:交联PEG-PEI/Heparin纳米复合物在细胞内的分布与体外抗肿瘤作用
[0017]使用FITC标记肝素，进行纳米复合物的细胞内传递实验，在荧光倒置显微镜下观察到孵化4小时后细胞对药物的吞噬情况，与交联PEG-PEI/Heparin纳米复合物共同孵化的细胞内部带有绿色荧光，与游离的肝素共同孵化的细胞不带有绿色荧光，复合物纳米粒子可以有效通过静电作用粘附于负电性的细胞膜表面，之后通过胞吞作用进入细胞，并得以释放进入胞浆。细胞毒性实验显示交联PEG-PEI/Heparin纳米复合物在体外较游离肝素具有较好的抗肿瘤作用，当肝素量为5 μ g/ml时，纳米复合物和游离肝素作用于细胞其存活率分别为55.67%和88.34%。
【主权项】
1.一种介导肝素细胞内传递的交联纳米载体的制备方法，通过合成PEG-COOH，利用其末端的羧基与PEI末端的胺基反应，制备得到PEG-PEI嵌段共聚物，取一定量的肝素钠溶液，缓慢滴加到一定量的PEG-PEI溶液中，滴加完毕后立即震荡5?10分钟，静置30分钟，制得PEG-PEI/Heparin纳米复合物，在此基础上加入适量交联剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸醋)(DSP)，形成带二硫键的交联PEG-PEI/Heparin纳米复合物，再将纳米复合物粒子作用于肿瘤细胞，在荧光倒置显微镜下观察肝素在交联纳米载体介导下向肿瘤细胞内传递的情况，并分析其对肿瘤细胞生长的影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:称取1gPEG溶于20mL无水乙腈，加入3g 丁二酸酐和15mL无水卩比啶，室温搅拌过夜，旋转蒸发除去乙腈和卩比啶，残余无色透明粘稠液体滴入150mL无水乙醚中剧烈搅拌，产生白色沉淀，抽滤得到的固体反复用无水乙醚洗涤3次，最后抽滤所得白色固体用异丙醇重结晶3次，即PEG-COOH纯化产物；称取0.2gPEG-COOH溶于1mL去离子水中，调节pH值到4.5?6之间，加入0.077g EDC.HCl搅拌溶解，称取0.432g PEI溶于1mL去离子水中，将PEI水溶液缓慢滴加到PEG-COOH的溶液中，边滴加边涡旋振荡，室温搅拌反应24小时，用MWCO 100Da的透析袋在去离子水中透析3天，除去小分子杂质，冻干得到PEG-PEI共聚物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:称取40mgPEG-PEI和40mg肝素钠分别溶于4mL去离子水中。取一定量的肝素钠溶液，缓慢滴加到一定量的PEG-PEI溶液中，边滴加边震荡，滴加完毕后立即震荡5?10分钟，静置30分钟，在此基础上加入适量的交联剂DSP的DMSO溶液(DMS0的量小于5% )，用枪头混合均匀，放置30min，使交联反应充分进行，得到交联的PEG-PEI/Heparin纳米复合物。
4.根据权利要求1和3所述的方法，其特征在于:PEG-PElAfeparin质量比例为1:1时的粒径较为稳定，粒径在135nm左右，电位在+35mV左右，为最佳配比。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:使用FITC标记肝素，将纳米复合物作用于肿瘤细胞，在荧光倒置显微镜下观察肝素在交联纳米载体的作用下向肿瘤细胞内传递的情况，并分析其对肿瘤细胞生长的影响。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种介导肝素细胞内传递的交联纳米载体的制备方法。其采用PEG修饰的PEI，利用PEI的阳离子性能包载肝素，增加细胞内吞能力，PEG分子提高载体及纳米复合物的水溶性、稳定性、血液代谢能力，防止复合物与蛋白结合受到清除，同时避免肝素受肝素酶作用降解，此外为了实现肝素在细胞内的有效释放，在此基础上通过交联剂引入二硫键，以使纳米粒子降解而释放肝素，使其在细胞内发挥生物学作用。
【IPC分类】A61K31-727, A61P35-00, A61K47-48
【公开号】CN104524591
【申请号】CN201410752947
【发明人】滕丽萍, 付海田, 王敏, 陈敬华
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日