一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病理学领域，具体涉及ー种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒 方法。
【背景技术】
[0002] 根结线虫（Meloidogynespp.)是ー种高度专化型的植物病原线虫。已知为害蔬 菜的根结线虫主要有南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫等。其寄 主范围广泛，可为害蔬菜、果树、观赏植物、粮食作物、以及中草药等2000多种植物，尤其以 番茄、黄瓜等经济作物受害严重，为害同时还造成ー些真菌和细菌性病害的复合侵染。根结 线虫以为害各种植物的根部为主，表现为侧根和须根比正常的增多，并在幼根或须根上形 成球形或不规则形大小不等的瘿瘤，有的呈念珠状。被害植株地上部生长矮小、緩慢、叶色 异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。
[0003] 根结线虫是植物的重要病原之一。在根结线虫的研宄过程中，如果深入研宄该病 原的致病机制或其与寄主植物的分子互作等，常常涉及到根结线虫的无外源培养，根结线 虫卵的表面消毒和孵化率是试验成败的关键。因此，获得保持根结线虫卵孵化活性的简单 易行的方法对该病害的深入研究有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，以克服现有 接种根结线虫技术常常受到污染或造成卵孵化率低的不足。本发明提供的技术方案是：
[0005] ー种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006] (1)制备根结线虫卵悬浮液：获得感病植株根系并制备根结线虫卵悬浮液；
[0007] (2)表面消毒：将卵悬液倒入自制筛子，然后将盛有线虫卵的筛子浸入70%こ醇 溶液，表面灭菌，将筛子移出，用无菌水多次重复冲洗线虫卵去除残余的こ醇溶液；
[0008] (3)污染检测：将一部分表面消毒的线虫卵均匀涂布到PDA平板中，每处理组3次 重复，置于25°C恒温箱中，观察污染情况，检测其是否灭菌彻底；
[0009] (4)孵化率检测：另一部分表面消毒的线虫卵置于96孔细胞培养板，每孔50±10 个卵，4次重复，显微镜下记录卵的初始数量，每3天记录卵孵化出二龄幼虫的数量，计算孵 化率。
[0010] 本技术方案中，步骤（1)中获得根结线虫卵悬浮液的浓度为20-50粒卵/yし
[0011] 本技术方案中，步骤（2)中灭菌时间为30-60S。
[0012] 本技术方案中，步骤（2)中自制筛子为可拆装可灭菌的消毒筛，其尺寸为内径 2cm，筛网网孔直径30ym。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
[0014] 1、本发明采用こ醇溶液作为消毒液，无毒，经济，容易获得以及对环境无污染。
[0015] 2、本发明操作简单，操作过程不损失卵粒。
[0016] 3、本发明节约时间，与其它线虫卵消毒液（如硫酸链霉素）相比可节省时间3_5h。
【附图说明】
[0017] 图1为根结线虫卵经70%こ醇溶液灭菌后利用PDA平板培养基检测灭菌效果；
[0018] 主要附图标记说明：
[0019] A、B、C是经70%こ醇溶液消毒处理；D、E、F为对照试验（只经无菌水冲洗）。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体例对本发明作进ー步详细的说明。
[0021] 实施例1:根结线虫卵悬浮液的获取及消毒，按如下步骤讲行操作:
[0022] (1)利用次氯酸钠法收集接种后25-35天的感病番茄植株根系上根结线虫卵囊中 的卵；
[0023] (2)根据需要配制成相应浓度的卵悬液，本试验的卵粒浓度为20-50粒卵/微升；
[0024] (3)试验前准备高压灭菌过的蒸馏水、IOOmL烧杯、消毒筛等用具；
[0025] (4)配制70%的こ醇溶液40mL，置于烧杯中，将卵悬液緩慢倒入消毒筛，然后将消 毒筛放入盛有70%的こ醇溶液烧杯中，浸没筛子高度的一半；
[0026] (5)消毒时间为30-60S，然后取出消毒筛，迅速用无菌水冲洗卵以去除残余的こ 醇溶液；
[0027] (6)用无菌水将处理好的卵移入另ー灭菌小烧杯中，即获得表面消毒的并保持卵 孵化活力的根结线虫卵，可以用于根结线虫的无外源培养等。
[0028] 实施例2 :PDA平板污染检测和孵化率检测试验
[0029] 试验方案：线虫卵的获取及其消毒方法同实施例1，为了证明上述消毒方法对卵 的孵化率的影响，进行了如下试验：
[0030] (1)污染检测：将一部分表面消毒的线虫卵均匀涂布到PDA平板中，每处理组3次 重复，置于25°C恒温箱中，观察污染情况，检测其是否灭菌彻底；
[0031] (2)孵化率检测：另一部分表面消毒的线虫卵置于96-孔细胞培养板，每孔50±10 个卵，4次重复，显微镜下记录卵的初始数量，每3天记录孵化出二龄幼虫的数量，计算孵化 率。
[0032] 试验結果：
[0033] (I)PDA平板污染检测表明，经70%こ醇溶液表面消毒的卵没有任何污染，而未经 消毒的对照卵在接种PDA平板上呈现了细菌和真菌污染（详见图1)。
[0034] (2)70%こ醇溶液表面消毒的卵和未经消毒的卵相比较（详见表1)，二者的累积 孵化率在孵化期间的各个时间均无显著差异（P> 〇. 05)，在第15天时，表面消毒处理组累 积孵化率为93. 3%，对照组为93. 9%。结果表明，利用70%こ醇溶液表面灭菌对根结线虫 卵的孵化没有影响。
[0035] 表1根结线虫卵表面灭菌后孵化率
[0036]
【主权项】
1. 一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备根结线虫卵悬浮液：获得感病植株根系并制备根结线虫卵悬浮液； (2) 表面消毒：将卵悬液倒入自制筛子，然后将盛有线虫卵的筛子浸入70%乙醇溶液， 表面灭菌，将筛子移出，用无菌水多次重复冲洗线虫卵去除残余的乙醇溶液； (3) 污染检测：将一部分表面消毒的线虫卵均匀涂布到PDA平板中，每处理组3次重 复，置于25°C恒温箱中，观察污染情况，检测其是否灭菌彻底； (4) 孵化率检测：另一部分表面消毒的线虫卵置于96孔细胞培养板，每孔50± 10个 卵，4次重复，显微镜下记录卵的初始数量，每3天记录孵化出二龄幼虫的数量，计算孵化 率。
2. 如权利要求1所述的保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，步骤 (1) 中获得根结线虫卵悬浮液的浓度为20-50粒卵/ y L。
3. 如权利要求1所述的保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，步骤 (2) 中灭菌时间为30-60S。
4. 如权利要求1所述的保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，其特征在于，步骤 (2)中自制筛子为可拆装可灭菌的消毒筛，其尺寸为内径2cm，筛网网孔直径30 ym。
【专利摘要】本发明属于植物病理学领域，具体涉及一种保持根结线虫卵孵化活性的表面消毒方法，包括以下步骤：制备根结线虫卵悬浮液、表面消毒、接种和检测。本方法具有操作简单，消毒效果好，经消毒后根结线虫卵孵化率高的优点。本方法对植物病理学、植物线虫学的研究以及根结线虫无外源培养等方面有极为重要的利用价值。
【IPC分类】A61L2-18, A61L101-34, C12Q1-06
【公开号】CN104623707
【申请号】CN201510018392
【发明人】吴海燕, 周勋波, 何琼
【申请人】广西大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月14日