注射用a群链球菌药物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属医药生物技术领域，主要涉及一种注射液用A群链球菌药物及其制备方 法，其目的旨在解决生产过程中A群链球菌经灭活，细胞壁受到损伤后，如何保持横一状态 的问题。
【背景技术】
[0002] A群链球菌是β -溶血性链球菌SIPI722#低毒菌株，它类似日本生产的0K-432 (Picibanil)，于1967年首次被日本学者Toyate等应用于临床。该产品通过活化巨噬细胞、 NK细胞、诱生可溶性细胞因子（IFN- γ、TNF- a、IL-2)发挥作用，同时它还能阻碍DNA、RNA 合成蛋白产物的翻译而使肿瘤细胞变性、崩解，从而产生直接的杀瘤效应。目前在临床上主 要用于治疗恶性胸腔积液，瘤内及全身用药对实体瘤有一定疗效，常用于配合手术、放疗或 化疗，用于恶性肿瘤的辅助治疗。A群链球菌如果不经灭活是一种致病菌，在灭活后，如果没 有合适的保护条件，细菌在药品的配制及冷冻干燥过程中很容易死亡，或者细菌重新恢复 活性，造成药物失效或者增加临床使用的副作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种注射用A群链球菌药物及其制备方法，药物能够方便冻 干状态下存储又能在使用时保证低副作用下的抗癌活性，而该制备方法能生产出符合要求 的药物。
[0004] 本发明的目的是以如下方式实现的：该注射用A群链球菌药物，组分含量按质量 份是：A群链球菌占 3~6份，麦芽糖占 13~26份，蛋氨酸占 55~75份，氯化钠占 0. 3~0. 5份， 青霉素 G钾占6~12份。其中的麦芽糖可选用上海蓝季科技有限公司生产的产品，蛋氨酸可 选用石家庄冀荣药业有限公司生产的产品，青霉素 G钾可选用山东鲁抗医药股份有限公司 生产的产品。
[0005] 制备以上A群链球菌组合物的方法，按规格为IKE的药物1万支为例，不同批量按 比例投料，制备步骤如下： a. A群链球菌冷冻管活化及血斜面培养：取冻干管一支，直接加入无菌生理盐水溶解 后，接入5%酵母粉培养基中于37±0. 5°C活化培养18-24小时，然后涂片镜检，确认链球菌 生长正常无污染后，将菌株接入血琼脂斜面于37±0. 5°C培养18-24小时； b. 接种培养：采用三级培养法，第一级培养系将菌种从血斜面接种入一级酵母浸膏粉 培养基内于37±0. 5°C培养20小时，培养液经涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，按 5% v/v的接种量接入二级酵母浸膏粉培养基中，于37±0. 5°C培养20小时，与接种二级同 样的方法，将菌种接入三级酵母粉培养基内，于37±0. 5°C培养20小时； c. 灭活：取3级培养的A群链球菌菌体，经0. 45 μ m滤膜过滤，经无菌0. 9%氯化钠溶 液分三次洗去残余培养基，获得生产用A群链球菌菌体；加入12万μ/ml青霉素 G钾的10% 麦芽糖的无菌溶液400ml，pH值为7. 5, 37°C水浴加入30分钟后，继续升温至45°C加热20 分钟； d. 配制：向上述菌液中加入继续加入12万μ/ml青霉素 G钾的0. 9%氯化钠无菌溶液 100mL摇匀，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7. 5 ;取样后，按2000版中国生 物制品规程中规定的浓度测定方法测含量，补加按1- 2%无菌蛋氨酸溶液至1万ml，本溶液 用磷酸二氢钾和氢氧化钠将PH值预调至7. 5,搅匀，灌装，每瓶装量Iml ; e. 冷冻干燥：将灌装好的药液，半压塞放入冻干机内，制品通过搁板降温，在-40°C预 冻2小时，然后抽真空至0. 3-0. 4mbar，经过搁板加热，在12小时内逐渐升温至(TC,抽真空 至0. 09-0. 15mbar，在4小时内逐渐升温至30°C，维持30 °C干燥3小时，冻干结束，压塞、压 铝盖出箱，即制得成品。
[0006] A群链球菌经灭活后，使其不产生溶血素 S (SLS)，但保留了使癌细胞裂解的抗癌 活性，本发明中采用霉素 G钾在特定的条件下使A群链球菌细胞壁缺损，细胞并非真正死 亡，但A群链球菌细胞壁缺损后，由于失去了细胞壁的渗透屏障，失去了保护膜，细菌变得 脆弱，如果没有合适的保护条件，细菌在冷冻干燥过程中很容易死亡，本发明使A群链球菌 保持稳定的衡一状态，在合适的条件下仍可恢复其生理活性。
[0007] 本发明的有益效果是：药物保持A群链球菌在青霉素 G钾灭活过程中不被完全杀 死，并且保持A群链球菌经青霉素灭活细胞壁缺损后的稳定衡一状态，能够在使用时恢复 生理活性，而该制备方法能够制备出稳定的产品。
【具体实施方式】
[0008] 正常A群链球菌是兼性厌氧菌，其生长代谢需要以下条件：（1)充足的营养物质： 主要为合适的N源和C源。（2)适宜的温度：最适宜的温度为37°C。（3)合适的酸碱度：pH 范围在7. 2~7. 6之间。（4)合适的溶氧浓度：溶氧浓度过高或者过低都会影响细菌的代 谢，保持一定的氧浓度，满足生产菌对氧的需求同时，还可以减低有害废物的产生。
[0009] 本发明中提到的A群链球菌制剂是经青霉素 G钾灭活后细胞壁缺损的细菌，经细 菌培养发现，在5%的酵母粉培养基中不再复活，在由牛肉汤、胰蛋白胨、蔗糖、无菌绵羊血 清和氯化钠等组成的高渗培养基中能够复活。由此可知A群链球菌经青霉素灭活后，细胞 壁受到损伤，在冷冻过程中，如果没有合适的保护剂，则其可能彻底死亡；在生产和储存过 程中，如果养分条件充足，菌体则有可能复活，只要不能够保持灭活后稳定的衡一状态，则 不利于临床治疗。
[0010] 本发明中旨在保持A群链球菌在青霉素 G钾灭活过程中不被完全杀死，以及保持 A群链球菌经青霉素灭活细胞壁缺损后的稳定衡一状态，解决的方法主要有两方面，第一： 通过选择合适的养分，主要为合适的N源和C源。第二：控制合适的氧浓度。另外温度和酸 碱度控制如下：储存温度采用2~8°C冷藏保存，以控制细菌的生长；pH范围控制在7. 2~ 7. 6之间，使其接近人体血液的pH。研究结果如下： 一、A群链球菌青霉素 G钾灭活过程中保护剂的选择，以配制量按1万支消耗计： 方案一：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万μ/ml青霉素 G钾的无菌溶液400ml， (pH :7. 5)，37°C恒温水浴加热30分钟后，继续升温至45°C恒温加热20分钟，冷却放置1小 时后待检。
[0011] 方案二：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万μ/ml青霉素 G钾的5%葡萄糖 无菌溶液400ml，（pH :7. 5)，37°C水浴恒温加热30分钟后，继续升温至45°C恒温加热20分 钟，冷却放置1小时后待检。
[0012] 方案三：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万μ/ml青霉素 G钾的10%麦芽糖 无菌溶液400ml，（pH :7. 5)，37°C恒温水浴加热30分钟后，继续升温至45°C恒温加热20分 钟，冷却放置1小时后待检。
[0013] 方案四：取经三级培养好的A群链球菌，加入12万μ/ml青霉素 G钾的20%甘露醇 无菌溶液400ml，（pH :7. 5)，37°C恒温水浴加热30分钟后，继续升温至45°C恒温加热20分 钟，冷却放置1小时后待检。
[0014] 将按上述方案处理的样品，分别加入5%的酵母粉培养基中培养和在由牛肉汤、胰 蛋白胨、蔗糖、无菌绵羊血清和氯化钠等组成的高渗培养基中，37°C恒温培养。结果见下 表：
【主权项】
1. 一种注射用A群链球菌药物，其特征在于组分含量按质量份是:A群链球菌占3~6 份，麦芽糖占13~26份，蛋氨酸占55~75份，氯化钠占0. 3~0. 5份，青霉素 G钾占6~12份。
2. -种制备如权利要求1所述的A群链球菌组合物的方法，其特征在于配制规格为 IKE的药物1万支按顺序包括以下步骤： a. A群链球菌冷冻管活化及血斜面培养：取冻干管一支，直接加入无菌生理盐水溶解 后，接入5%酵母粉培养基中于37±0. 5°C活化培养18-24小时，然后涂片镜检，确认链球菌 生长正常无污染后，将菌株接入血琼脂斜面于37±0. 5°C培养18-24小时； b. 接种培养：采用三级培养法，第一级培养系将菌种从血斜面接种入一级酵母浸膏粉 培养基内于37±0. 5°C培养20小时，培养液经涂片镜检，确认链球菌生长正常无污染后，按 5% v/v的接种量接入二级酵母浸膏粉培养基中，于37±0. 5°C培养20小时，与接种二级同 样的方法，将菌种接入三级酵母粉培养基内，于37±0. 5°C培养20小时； c. 灭活：取3级培养的A群链球菌菌体，经0. 45 μ m滤膜过滤，经无菌0. 9%氯化钠溶 液分三次洗去残余培养基，获得生产用A群链球菌菌体；加入12万μ/ml青霉素 G钾的10% 麦芽糖的无菌溶液400ml，pH值为7. 5, 37°C水浴加入30分钟后，继续升温至45°C加热20 分钟； d. 配制：向上述菌液中加入继续加入12万μ/ml青霉素 G钾的0. 9%氯化钠无菌溶液 100mL摇匀，本溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将pH值预调至7. 5 ;取样后，按2000版《中国 生物制品规程》中规定的浓度测定方法测含量，补加按1- 2%无菌蛋氨酸溶液至1万ml，本 溶液用磷酸二氢钾和氢氧化钠将PH值预调至7. 5,搅匀，灌装，每瓶装量Iml ; e. 冷冻干燥：将灌装好的药液，半压塞放入冻干机内，制品通过搁板降温，在-40°C预 冻2小时，然后抽真空至0. 3-0. 4mbar，经过搁板加热，在12小时内逐渐升温至(TC,抽真空 至0. 09-0. 15mbar，在4小时内逐渐升温至30°C，维持30 °C干燥3小时，冻干结束，压塞、压 铝盖出箱，即制得成品。
【专利摘要】本发明公开了一种注射用A群链球菌药物及其制备方法。药物的组分含量是：A群链球菌占3%~6%(W/W)，麦芽糖占13%~26%(W/W)，蛋氨酸占55%~75%(W/W)，氯化钠占0.3%~0.5%(W/W)，青霉素G钾6%~12%(W/W)。制备方法包括群链球菌冷冻管活化及血斜面培养、接种培养、灭活、配制、冷冻干燥等步骤。本发明的药物保持A群链球菌在青霉素G钾灭活过程中不被完全杀死，使其保留了使癌细胞裂解的抗癌活性，并且保持A群链球菌经青霉素灭活细胞壁缺损后的稳定衡一状态，能够在使用时恢复活性低副作用的情况下发挥其临床疗效，而该制备方法能够制备出稳定的产品。
【IPC分类】A61P35-00, A61K9-19, A61K35-744, A61K47-22
【公开号】CN104644693
【申请号】CN201510082767
【发明人】邢晋华, 王成华, 张守洋, 宋昭震, 李京平
【申请人】国药集团鲁亚（山东）制药有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月16日