一种布氏菌病治疗制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种布氏菌病治疗制剂，该制剂可用于哺乳动物布氏菌感染的免疫治 疗，属于治疗类生物制品生产技术领域。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病（简称布氏菌病、布病）是由布鲁氏菌属引起的一类人畜共患疾病。可 通过口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道、甚至未损伤的皮肤而感染。家畜感染后可引发母畜流 产和不育，人感染则主要引起波浪热和转化为慢性感染。据调查，全球已有170多个国家和 地区有布病发生和流行。
[0003] 我国50~60年代在我国人畜中有较重流行，自70年代布病疫情逐年下降，至90 年代初人间感染率仅为0.3%，发病率只有0.02/10万。但自1993年布病疫情出现了反弹， 1996年全国发病率为0. 09人/10万人，2013年发病率升为3. 36人/10万人。十几年间， 发病率已经增加近40倍，2013年卫计委报告新发病人数多达46, 289人。这个现象与世界 上部分地区的布病疫情遥相呼应。该状态已引起世界和我国有关部门的关注。
[0004] 本病所累及的组织器官很广泛，但以单核一巨噬细胞系统、骨关节系统、神经系统 等常见。初期为炎性细胞渗出，组织细胞变性、坏死。亚急性和慢性期为组织细胞增生，肝、 脾、淋巴结等处能见增殖性结节和肉芽肿。慢性期部分病人肉芽组织发生纤维硬化性变，临 床则出现后遗症。
[0005] 目前，布病感染急性期要以抗菌治疗为主。常用抗生素有链霉素、四环素族药物、 磺胺类及TMP，另外氯霉素、利福平、氨苄青霉素也可使用。有些药物治疗有复发情况，如果 治疗不规范，如治疗剂量不足或疗程不够会出现慢性感染。对慢性布病无特效药物治疗，只 能以对症治疗为主。
【发明内容】
[0006] 本发明人发现布氏菌104M菌株对患有布氏菌病的哺乳动物有良好的免疫治疗效 果。将小鼠用羊种M5弱毒菌株感染，感染1个月后给予布氏菌104M菌株进行免疫治疗，治 疗1个月后进行解剖分离脾脏活菌数，治疗组小鼠脾脏荷菌数（Iog ltl)为2. 98,未治疗对照 组脾脏荷菌数（Iogltl)为5. 17,差异显著（P < 0. 05);治疗3个月后治疗组小鼠脾脏荷菌数 均为〇,未治疗对照组脾脏荷菌数（Iogltl)为1.94,差异明显。
[0007] 本发明提供了一种用于治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂，该制剂中含有布氏菌 104M菌株。本发明还涉及布氏菌104M菌株在制备用于免疫治疗哺乳动物布氏菌病的治疗 制剂中的应用。
[0008] 本发明的治疗制剂为活疫苗，是冻干制剂，在冻干前，每升中含有I X 10n-5 X IO14 个布氏菌，优选含有约5X IO11个布氏菌。进一步，本发明的治疗制剂中还含有冻干保护剂， 例如，在冻干前，每升中还含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g，余 量为灭菌注射用水；优选每升疫苗中含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约 50g，余量为灭菌注射用水。
[0009] 本发明的治疗制剂优选通过皮内接种、鼻腔接种、皮下接种或皮上划痕接种。优选 哺乳动物为人、牛、羊、犬或猪。
[0010] 本发明的治疗制剂可以按照本领域已知的各种方法制备。例如，本发明的冻干制 剂的制备方法可以包括如下步骤：将布氏菌104M种子批传代培养，收获时用冻干保护剂洗 下菌苔或刮取菌苔于冻干保护剂内，得原液；用冻干保护剂将原液稀释至所需浓度，例如， I X 10n-5X IO14个/L，优选约5X 10 11个/L ;分装，例如，每安瓿含0. 5ml (5次人用剂量）； 冻干，得成品。其中所使用的冻干保护剂可以每升含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲 4_6g和蔗糖40-60g，优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g，余量 为灭菌注射用水。当然，也可以使用本领域已知的其他的冻干保护剂。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1、菌种检定
[0012] I. 1菌体培养：取一支保存的104M菌株（CMCC55010)，接种于TSA中管斜面培养 基，35~37°C培养44~48小时；
[0013] 1.2变异检查检查：
[0014] 1. 2. 1热凝集试验：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为2. 5XIO9个/ml的 菌悬液，置90°C水浴中30分钟，观察有无凝集现象。
[0015] 1. 2. 2三胜黄素试管凝集试验：取浓度为2. 5XIO9个/ml的菌悬液，与1 : 1000 三胜黄素水溶液等量混合，于37°C放24小时，观察有无凝集现象。
[0016] 1. 2. 3结晶紫染色检查：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为IXIO3个/ml 的菌悬液，接种TSA平皿，每平皿0. lml，共接种2个平皿，35~37°C培养5天，然后用结晶 紫菌落染色法检查，计算阳性率。
[0017] 1. 3培养特性：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为I X IO9个/ml的菌悬液， 分别接种在含有1 : 50000碱性复红TSA中管斜面培养基及1 : 50000硫堇TSA中管斜面 培养基上观察生长情况；另外，取菌液接种于TS A中管斜面培养基，加入醋酸铅试纸条，观 察有无硫化氢产生。
[0018] 1.4分子生物学检查：取菌液提取基因组，进行16SRNA基因序列测定。
[0019] 1.5 结果：
[0020] 粗造型特性检查结果见下表1，培养特性检查结果见下表2,16sRNA基因序列比对 表明104M菌株与布氏标准菌株序列完全一致。因此，所使用的104M菌株具有典型布氏菌 的培养特性及分子生物学特征。
[0021] 表 1
[0022]
【主权项】
1. 一种用于治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂，其特征在于，该制剂中含有布氏菌 104M菌株。
2. 如权利要求1所述的治疗制剂，其特征在于，所述治疗制剂为冻干制剂，在冻干前每 升中含有IX10n-5XIO14个布氏菌，优选每升中含有约5X10 11个布氏菌。
3. 如权利要求2所述的治疗制剂，其特征在于，所述冻干制剂在冻干前每升中还含有 海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g，余量为灭菌注射用水；优选含有 海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g，余量为灭菌注射用水。
4. 布氏菌104M菌株在制备用于免疫治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂中的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述治疗制剂通过皮内接种、鼻腔接种、皮 下接种或皮上划痕接种。
6. 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为人、牛、羊、犬或猪。
7. 如权利要求4-6所述的应用，其特征在于，所述治疗制剂为冻干制剂，在冻干前每升 中含有IX10n-5XIO14个布氏菌，优选每升中含有约5X10 11个布氏菌。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述冻干制剂在冻干前每升中还含有海藻 糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g，余量为灭菌注射用水；优选含有海藻 糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g，余量为灭菌注射用水。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗布氏菌病的治疗制剂，其含有布氏菌104M菌株。本发明还公开了布氏菌104M菌株在制备治疗布氏菌病的治疗制剂中的用途。本发明的治疗制剂可用于布氏菌感染的哺乳动物的免疫治疗。
【IPC分类】A61K9-19, A61P31-04, A61K39-10
【公开号】CN104771753
【申请号】CN201510124743
【发明人】魏东, 陈成, 李恪梅, 王国治
【申请人】中国食品药品检定研究院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月20日