一种从老熟期莲子壳中提取多酚的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于从植物中提取功能成分的技术领域，具体涉及到一种从老熟期莲子壳中提取多酚的生产方法。
【背景技术】
[0002]莲子壳即莲的果皮，其硬度随着成熟度的增加而逐渐加强。老熟期莲子壳为已完全成熟的莲子壳，其颜色为黑褐色，质地坚硬，已有研究发现老熟期莲子壳中含有活性较高的多酚物质。多酚具有清除多种活性氧自由基的能力，因此具有较强的抗氧化活性，除此之夕卜，大量还研究表明多酚具有显著的抑菌、抗癌、抗炎症、抗辐射、解毒等作用，并广泛的应用于食品、制药、生物化学、日用化工等领域，具有广阔的应用前景，其中茶多酚已被我国正式列为食品添加剂，在食品抗氧化、抑菌等方面发挥着重要作用。
[0003]老熟期莲子壳产量大，来源广泛，但目前对其应用较少，主要用于食用菌栽培或燃烧后用作肥料，其利用用途不广、利用价值不高。目前关于莲子壳多酚的研究主要集中在新鲜莲子壳上，研究对象多为黄酮类物质。何合高等(何合高等.生化法提取莲子壳中单宁和黄酮类物质的制备工艺，中国发明专利公开号CN103585278A文献)将莲子壳粉与生化反应剂在30°C下反应后用超声波装置萃取处理、加热浸取一定时间后趁热过滤，收集滤液，再采用膜化分离装置收集单宁滤液和黄酮类物质滤液，最后通过减压蒸馏浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥得到莲子壳单宁、黄酮类物质产品。目前尚未有以老熟期莲子壳为原料提取多酚的文章或专利发表。研究老熟期莲子壳多酚的产生工艺，不仅可以避免大量莲子壳的浪费，做到变废为宝，还可以给多酚生产提供一种新方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在提供一种以老熟期莲子壳为原料生产多酚的生产工艺，利用乙醇-水溶剂体系对老熟期莲子壳进行热浸提，再经AB-8大孔树脂分离纯化得到多酚纯化物。本发明的目的还在于提高老熟期莲子壳的利用率和利用价值，减少资源浪费。
[0005]本发明提供的技术方案是:将干燥老熟期莲子壳进行机械粉碎后过筛得到莲子壳粉，取一定量莲子壳粉加入乙醇-水溶剂进行水浴加热提取，将多酚溶液进行旋蒸蒸发浓缩，再经真空冷冻干燥得到多酚粗提物。取一定量粗提物用水溶解后置于AB-8大孔树脂柱中进行进一步纯化，经浓缩、冷冻干燥后得到多酚纯化物。
[0006]具体步骤是:1.利用高速粉碎机将干燥的老熟期莲子壳进行粉碎，过100目筛，得到粒径均匀的莲子壳粉。
[0007]2.所述的乙醇-水热浸提方法中，乙醇-水溶剂中乙醇体积分数为40 %，水浴提取温度为50°C，水浴提取时间为60min，莲子壳与乙醇-水溶剂的质量体积比为1: 30，同一原料提取次数为2次。
[0008]3.采用旋转蒸发浓缩的方法将多酚溶液进行浓缩得到1mL左右的浓缩液。
[0009]4.多酚样品干燥方式为:真空冷冻干燥。
[0010]5.AB-8树脂分离纯化条件为:上样浓度5.0mg/mL,上样速度0.6mL/min, 55%乙醇为洗脱剂，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱剂体积为5BV。
[0011]采用上述方法制备的多酚样品具有良好的还原力、清除DPPH及ABTS+自由基的能力。与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0012](I)老熟期莲子壳来源广泛，价格便宜，成本低，是一种很好的多酚提取原料。
[0013](2)所述方法提取多酚方法简单、快速、产量高，易于工业化生产。
[0014](3)活性评价证明该方法生产的多酚纯化物具有良好的还原力、清除DPPH自由基及ABTS+自由基的能力。
【附图说明】
[0015]图1:熟期莲子壳多酚与Vc的还原力对比。
[0016]图2:老熟期莲子壳多酚与Vc清除DPPH自由基的能力对比。
[0017]图3:老熟期莲子壳多酚与Vc清除ABTS+自由基的能力对比。
具体实施方案
[0018]实施案例一:
[0019]老熟期莲子壳多酚的提取
[0020]将干燥莲子壳置于高速粉碎机中进行粉碎，过100目筛得到粒径均一的莲子壳粉。称取20g莲子壳粉置于100mL圆底烧瓶中，以1: 30的比例加入600mL乙醇-水溶液(乙醇体积分数为20% )，混合均匀后，在水浴温度为50°C的条件下加热60min，得到多酚溶液。将所得的多酚溶液进行真空抽滤，再将该莲子壳粉在相同条件下重复提取I次。
[0021]实施案例二:
[0022]多酚的分离纯化
[0023]1.AB-8大孔树脂的活化
[0024]AB-8大孔树脂先用95%的乙醇在室温下浸泡12h，蒸馏水多次冲洗至无醇味并无白色浑浊，然后加入5% NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性，再用2% HCl溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性，共进行三次酸碱处理，最后将处理好的AB-8树脂进行湿法装柱。
[0025]2.多酚样品过柱分离纯化
[0026]以水为溶剂配制浓度为5.0mg/mL多酚粗提物溶液，用滴管沿壁缓缓滴入柱中，上样速度为0.6mL/min，待多酚样液与柱材料平齐后吸附45min，再用蒸馏水进行冲洗，直至糖分检测不到。然后用55%乙醇作为洗脱剂进行洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，洗脱剂体积为5BV，得到纯化后的多酚溶液。
[0027]实施案例三:
[0028]多酚提取物的干燥方式
[0029]将多酚溶液进行真空旋转蒸发浓缩，蒸发温度为35°C，浓缩至1mL左右后，经真空冷冻干燥得到多酚样品。
[0030]实施案例四:
[0031]多酚纯化物的纯度测定及抗氧化活性鉴定
[0032]1.Folin-C1calteus法测定多酹纯化物的纯度
[0033]准确称取多酚纯化物样品0.0200g，用水溶解定容至250mL容量瓶中。取取ImL多酚溶液于比色管中，加入5mL蒸馏水，3mL7.5%的碳酸钠溶液，ImL FC显色剂(FC显色剂在使用时用蒸馏水进行1:1稀释)，每组设置两个平行，避光放置2小时，于765nm处测定吸光值，将A765代入方程y=0.0144x-0.0025 (R2=0.9990)得到多酚浓度，计算多酚纯度。
[0034]多酚纯度(％) =CX250X 1(Γ6/0.0200X 100%
[0035]多酚纯化物得率(％ )=m/MX100%
[0036]式中，C为样液中多酚浓度(μ g/mL)，m为冷冻干燥后所得多酚纯化物样品质量(mg)，M为莲子壳粉末质量(mg)。
[0037]经计算得到，多酚纯化物的纯度达60%，得率达1.2%。
[0038]2.多酚纯化物还原力的测定
[0039]准确称取0.0lOOg多酚纯化物粉末，蒸馏水溶解后定容至10mL,分别配制浓度为10 μ g/mL>20 μ g/mL>50 μ g/mL>80 μ g/mL、100 μ g/mL的多酹样液,取不同浓度的样液各ImL,依次加入 2.5mL0.2mol/L 的 PBS 缓冲液(ρΗ6.6)，2.5mLl % K3 [Fe (CN) 6]溶液于试管中，充分混匀后，50°C水浴锅中反应20min，流水速冷，加入2.5mL10% TCA，吸取2.5mL上清液，加入0.5mL0.1 % FeCl3和2.5mL蒸馏水，摇匀，测定A7(l(lnm。用蒸馏水调零，VC做阳性对照。
[0040]结果如图1所示，结果显示老熟期莲子壳多酚的吸光值略低于阳性对照Vc，即还原力略低于Vc，但仍具有较好的还原力。
[0041]3.清除DPPH自由基能力的测定
[0042]用无水乙醇配制浓度分别为5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>50 μ g/mL、100 μ g/mL的莲子壳多酚样液，各取2mL于具塞比色管中，加入2mL0.2mmol/L DPPH.溶液，摇匀，室温下避光反应30min，测定反应样液在517nm处吸光值。
[0043]清除率(%) = [A0- (A1-Aj) ] /A0X 100%
[0044]式中，Atl (对照管):2mL DPPH.溶液+2mL无水乙醇A1 (测定管):2mL样液+2mLDPPH.溶液；Α」(标准管):2mL样液+2mL无水乙醇
[0045]结果如图2所示，结果显示老熟期莲子壳多酚具有比Vc更强的清除DPPH自由基的能力。
[0046]4.清除ABTS+自由基能力的测定
[0047]用无水乙醇配制浓度分别为5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL>50 μ g/mL、100 μ g/mL的莲子壳多酚样液，各取200 μ L于试管中，加入4mLABTS+.溶液，充分振摇30s，室温下避光反应6min,于734nm处测定反应后样液的吸光值。
[0048]清除率(%) = [A0- (A1-Aj) ] /A0X 100%
[0049]式中，Atl (对照管):200 μ L无水乙醇+4mLABTS+.溶液夂(测定管):200 μ L样液+4mLABTS+.溶液；A」(标准管):200 μ L样液+4mL无水乙醇
[0050]结果如图3所示，结果表明老熟期莲子壳多酚清除ABTS+自由基的能力强于Vc，因此，老熟期莲子壳多酚均具有提供氢质子和终止自由基链式反应的能力。
[0051]综上所述，本发明所得的多酚抗氧化性略优于Vc。
【主权项】
1.一种从老熟期莲子壳中提取多酚的方法，其特征在于:先将干燥的老熟期莲子壳进行粉碎并过筛，得到粒径均匀的莲子壳粉。采用乙醇-水热浸提得到多酚粗提物，再经进一步分离纯化得到多酚纯化物。2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于:所述的老熟期莲子壳粉碎后过100目筛，得到粒度均匀的莲子壳粉，干燥保存备用。3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于:乙醇-水溶剂中乙醇体积分数为40%，水浴提取温度为50°C，水浴提取时间为60min、莲子壳与乙醇-水溶剂的质量体积比为1: 30，同一原料提取次数为2次。4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于:进一步分离纯化所用树脂为AB-8大孔树脂。5.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于:AB-8大孔树脂分离纯化条件为:上样浓度5.0mg/mL,上样速度0.6mL/min, 55%乙醇为洗脱剂,洗脱流速为1.5mL/min,洗脱剂体积为5BV。6.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于:多酚样品干燥方式为将多酚溶液进行真空旋转蒸发浓缩，蒸发温度为35°C，浓缩至1mL左右后，经真空冷冻干燥得到多酚样品O
【专利摘要】本发明属于从植物中提取功能成分的技术领域，具体涉及到一种从老熟期莲子壳中提取多酚的生产方法。利用乙醇-水溶剂体系对老熟期莲子壳进行热浸提，得到最优提取条件，再经AB-8大孔树脂分离纯化得到多酚纯化物。本发明的目的在于提高老熟期莲子壳的利用率和利用价值，减少资源浪费。所述方法提取多酚方法简单、快速、产量高，易于工业化生产。用此方法所得多酚纯化物的纯度达60％，得率达1.2％，且具有良好的还原力、清除DPPH及ABTS+自由基的能力。
【IPC分类】A61K36/62, A61K131/00, A61P39/06
【公开号】CN104971097
【申请号】CN201410130982
【发明人】黄文 , 陈中惠, 刘莹, 王益
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日