一种新型纳米诊断治疗胶束及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种新型纳米胶束，包括嵌段共聚物、抗癌药物、荧光探针，其中各组分的重量比为：100:80:1~400:16:1。本发明主要是利用嵌段共聚物，将两种或多种抗癌药物及荧光探针制备成纳米诊疗胶束，并使其中的药物与探针同步释放，进而兼具诊断与治疗的作用。所述的多种药物联合应用，可达到增加疗效，减少毒副作用，减少或延缓耐药的出现，达到最大药效能力的作用。所包载的荧光探针，有些不仅具有成像诊断作用，同时还具有光热治疗的作用，进一步增加治疗效果。
【专利说明】
一种新型纳米诊断治疗胶束及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及一种新型纳米胶束，并提供了所述纳米 胶束的应用。
【背景技术】
[0002] 共聚物胶束作为一种有效的纳米载体已在医药领域受到广泛关注，其利用两亲性 的高分子材料在水中自发形成一种自组装结构，疏水嵌段形成包载药物的内壳，亲水嵌段 包绕在外起到保护作用。在共聚物胶束中，嵌段共聚物胶束是常见的一种，其具有以下优 点：（1)粒径较小，使之不易被网状内皮组织吞噬，因而能长时间在血液中循环并保持稳定；
[2] 纳米级的粒径使载药胶束在靶部位表现出更强的细胞穿透力；（3)具有较低的临界胶束 浓度值，在血液循环中不易被血液稀释而破坏胶束的结构，较稳定；（4)增溶难溶性药物，将 难溶性药物包裹在聚合物胶束的疏水内壳中，提高生物利用度，由于外部有亲水部分的保 护，使其不易于蛋白质和吞噬细胞吸附和识别，不易因酶降解而失活，从而保证在血浆与组 织中的停留时间，通过增加渗透与滞留达到被动靶向的效果。因此，聚合物胶束作为药物载 体，具有广阔的应用前景。
[0003] -般共聚物胶束都只包载一种药物，但是长期使用单一药物，会使病人对药物产 生一定的抗性，耐药性增加，疗效降低，尤其是癌症的治疗。以抗癌药物为例，目前使用的抗 肿瘤药物对肿瘤细胞缺乏靶向性，在杀伤癌细胞的同时，对正常细胞表现出强烈的毒副作 用，或自身水溶性很差，或在血液中半衰期短，或易与血浆蛋白结合，从而不能很好地发挥 药效。多种化疗药物联合用药已成为成功治疗许多癌症的策略之一。由于肿瘤细胞对药物 抗性的频频发生，越来越多的研究者将注意力集中在联合用药上，尤其是不同作用机制的 抗肿瘤药物联合应用、多管齐下，形成一种独特的细胞毒性机制，从而减少抗性的发生，特 别是吉西他滨与紫衫烧类药物联合用药（Biochemical and Biophysical Research Communications. ,2004,316:71-77.)，如胰腺癌的治疗，已经形成了几种不同的多药联合 的策略，如F0LFIRN0X方案和吉西他滨与白蛋白结合的紫杉醇联合用药应用方案 (Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,2006,103:4028-4033.)〇
[0004] 联合化疗指联合应用两种或两种以上无交叉性且有协同作用的药物治疗肿瘤性 疾病。联合化疗方案应遵循以下原则：1、联合化疗方案中的各种药物，在单独使用时对该癌 症是有效的；2、尽量选择作用机制、作用时间不同的药物组成联合化疗方案，以便更好的发 挥协同作用；3、尽量选择毒副作用不同的药物联合，以免毒性相加，使患者难以忍耐。故根 据抗肿瘤药的作用机制和肿瘤细胞增殖动力学进行合理联合用药，是近年来化疗给药治疗 肿瘤中的重要进展之一。与传统的单药治疗相比，多药治疗可促进增效作用，增加治疗的靶 向选择性，克服癌细胞对不同作用机制药物的抗性，减少不良反应的发生。
[0005] 在传统临床应用中，疾病的诊断与治疗是两个相对独立的过程，诊断用药和治疗 用药也是两种独立的药物。在这种情况下，患者往往需要接受先诊断后治疗两次医疗过程， 而且中间往往间隔时间较长，常常贻误了疾病治疗的最佳时期。另外，诊断用药物和治疗用 药物往往都对患者有一定的副作用，分为两次用药会增大患者不必要的痛苦和风险。于是， 在最近几年，一种全新的疾病处理方式--治疗诊断学(1116^110 81：；[08)作为一种新的理 念，逐渐发展起来。
[0006] 治疗诊断学将诊断和治疗两个过程合二为一，在得到诊断结果的同时，立即基于 诊断结果进行对症治疗。用于治疗诊断学的制剂被称为治疗诊断制剂，简称诊疗制剂 (Theranostic Agent)。诊疗制剂非常适用于癌症的诊断和治疗，因为肿瘤组织的不均一性 和癌细胞的自适应耐药性一直是癌症治疗中一个棘手的问题，治疗诊断学的出现使这一复 杂问题的解决重现曙光。使用治疗诊断制剂可以显现肿瘤内部不同变性的亚型，然后基于 不同诊断结果进行靶向治疗。
[0007] 在最近的研究中，纳米材料由于其独特而优越的特性，如较小的尺寸，良好的生物 相容性，可控的结构成分，表面易被生物亲和分子修饰等等，被越来越多地应用于生物医药 制剂的开发和研制中。用于诊疗制剂研究中的纳米材料即被称为纳米诊疗制剂 (Nanotheranostic Agent)。通过纳米技术将诊断制剂和治疗制剂整合为一体，得到纳米诊 疗制剂。首先使用纳米诊疗制剂，通过诊断成像技术确定疾病尤其是肿瘤的位置和形态;之 后在诊断结果的基础上进行对症治疗，这样将诊断和治疗两个过程合二为一，毕其功于一 役，提尚了诊疗效率。
[0008] 肿瘤的诊疗制剂是将抗癌药物与成像探针结合到一个纳米传递系统的平台上，可 将药物与探针以有效的浓度选择性地传递到肿瘤部位，从而起到肿瘤监测与治疗的作用。 目前的肿瘤诊疗制剂是将抗癌药物和纳米探针共同包载在一个纳米粒上，但是由于所包载 药物和探针性质的不同，这使得它们在肿瘤细胞中的释放速率和滞留时间也不同，所以制 剂中探针的诊断和药物的治疗是不同步的、脱节的，两者之间没有很好的相关性，诊断和治 疗就不能有机地结合起来，就无法进行同步的诊断与治疗。
[0009] 光动力治疗(Photodynamic Therapy ,Ρ?Τ)是一种临床上获得批准，可以选择性杀 伤恶性肿瘤细胞的微创治疗方法。该方法的过程涉及光敏化剂的给药，以及随后用适当波 长的光对其进行照射，在有氧气存在的情况下产生活性氧物质，虽然引发肿瘤细胞直接死 亡，但也损害微血管，诱导局部炎症反应等。PDT具有特异性和选择性，一方面光敏剂能特异 性地在病变组织富集，另一方面光照的部位可直接定位到病变组织，从而可以选择性地治 疗病变区域。正因如此，PDT正成为各种肿瘤治疗研究的热点。
[00?0] 光热治疗（Photodynamic Therapy,ΡΤΤ)是应用可见光或近红外光照射病变组织 进而引发热损伤的治疗方法，与光动力疗法通过激发光敏剂产生活性氧物质不同，光热治 疗是通过光吸收剂将激光能量转化为热量。光热治疗能引发一系列生物学变化，如蛋白结 构变化和组织碳化等。在光热治疗中，温度可升至45~300°C，通过使用近红外光使其治疗 效果也能达到足够深度。与光动力治疗相似，光热治疗具有特异性，只有在被光照射到的病 变组织才有治疗效果，而对周围正常组织的损伤非常小，这种空间特异性和非侵入性治疗 方式使光热治疗相比其它手术或者侵入性治疗方法，更成为一种广受欢迎的治疗方式。 [0011]光动力疗法与光热疗法具有其独特的优点，但是，由于缺乏理想的光敏剂，制约了 它们在临床上更广泛的应用。目前常用的光敏剂大多数呈疏水性，在生理条件下容易聚集， 导致荧光淬灭和光动力疗效大幅下降。因此，寻找一种适合的光敏剂成为了光动力疗法与 光热疗法亟待解决的问题。
【发明内容】
[0012] 本发明设计了一种新型纳米胶束，利用嵌段共聚物，将两种或多种抗癌药物和荧 光探针，共同包载于纳米胶束中，克服了以上所述的目前诊疗制剂的不足。同时，该诊疗制 剂可将所包载的药物与纳米探针同步释放，起到同步的诊断与治疗作用。
[0013] 本发明所设计的新型纳米胶束可同时包载两种或多种抗癌药物，联合用药，在增 大疗效的同时，克服或减缓了多药耐药性，最大限度地发挥药效。
[0014] 本发明所述的纳米胶束包含嵌段共聚物、抗癌药物、荧光探针，所述的嵌段共聚 物、抗癌药物、荧光探针的重量比为：100:80:1~360:16:1，但包载不同材料时，该重量比不 同，如MPEG-PLGA胶束的重量比为1000:80:1~400:16:1，优选比例为：1200:80:1~360:16: 1 ;PEG-VE胶束（或FA-PEG-VE胶束）的重量比为100:80:1~100 :16:1，优选比例为100:80:1 ~60:16:1; PLA-PEG-PLA 胶束的重量比为 1000:80:1~400:16:1，优选比例为：1200:80:1~ 360:16:1; Phi s-PLA-PEG-PLA-Phi s胶束的重量比为 1200 :80 :1 ~400:16:1，优选比例为： 1800:80:1~400:16:1。
[0015] 其中，所述的嵌段共聚物可为两嵌段共聚物、三嵌段共聚物或多嵌段共聚物中的 一种或几种：
[0016] 所述的两嵌段共聚物为聚氧乙烯-聚苄基天冬氨酸共聚物(PE0-PBLA)、苯乙烯-丁 二烯共聚物（SRB)、单甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物(MPEG-PLGA)、聚甲基丙 烯酸甲酯-聚苯乙烯(PMMA-PS)、聚丙烯酸甲酯-聚苯乙烯(PMA-PS)、聚环氧乙烷-聚苯乙烯 (PE0-PS，PEG-b-PS)、聚环氧乙烷-聚（烷基）丙烯酸酯（ΡΕ0-ΡΜΜΑ，PEG-PMMA)、聚环氧乙烷-聚乳酸(PEG-PLA)或聚乙二醇-维生素 E (PEG-VE)、叶酸-聚乙二醇-维生素 E (FA-PEG-VE)中 的一种或几种，优选为单甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物(MPEG-PLGA)、聚乙二 醇-维生素 E(roG-VE)和叶酸-聚乙二醇-维生素 E(FA-PEG-VE)。其中，聚乙二醇-维生素 E (PEG-VE)和叶酸-聚乙二醇-维生素 E(FA-PEG-VE)为实验室自制。此外，单甲氧基聚乙二醇 外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物(MPEG-PLGA)中PLGA的分子量范围为1000~14000,优选为2000 ~9000〇
[0017] 所述的三嵌段共聚物为苯乙烯-丁二烯-苯乙烯（SBS)、苯乙烯-丁二烯-内酯嵌段 共聚物、苯乙烯-丁二烯-3-氯丙烯共聚物、聚（环氧乙烷）-聚（环氧丙烷）-聚（环氧乙烷） (ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0)、三嵌段共聚物P123、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物（PLA-PEG-PLA)中的一种或几种，优选为聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物(PLA-PEG-PLA);
[0018] 所述的多嵌段共聚物为苯乙烯-丁二烯-苯乙烯-甲基丙烯酸酯嵌段共聚物、 PHBPEG多嵌段共聚物或聚组氨酸-聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸-聚组氨酸（Phis-PLA-PEG-PLA-Phis)嵌段共聚物中的一种或几种，优选为:聚组氨酸-聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸-聚组 氨酸(Phis-PLA-PEG-PLA-Phis)嵌段共聚物，其为实验室自制。
[0019] 本发明中，所述自制的两嵌段共聚物的合成步骤如下：
[0020] 以维生素 E琥珀酸单酯(VES)为起始原料，在（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并三唑(Η0ΒΤ)催化下，与H-lys-Obzl酰化生成中间体1，1先后经 过Pd/C催化氢化脱苄基，与PEG2000和叶酸(FA)酯化生成目标化合物PEG-VE和FA-PEG-VE， 合成路线如下：
[0021]
[0022] Reagents and condition:a)EDC，H0BT，DCM;b)Pd/C，H2,3(TC;c)FA，mPEG-2000， EDC，DMAP
[0023] 本发明中，所述自制的多嵌段共聚物的合成步骤如下：
[0024] 以Nim-DNP-L-histidine为起始原料，经卤代，环合，缩合反应，生成中间体A (PHis);丙交酯单体和PEG，在Sn(0Ct)2的催化下生成中间体B，B与⑶I在乙腈溶液中反应生 成中间体C，中间体A和C在DMS0中反应生成中间体D，D与2-巯基乙醇在室温下反应生成终产 物 PHi s-PLA-PEG-PLA-PHi s。合成路线如下：
[0026] Reagents and condition：a)S0C12,THF,rt.；b)isopropyl amine,DMF,rt.；c)Sn (0ct)2,150°C ;d)CDl，CH3CN，rt · ; e)DMS0，rt · ;f)2-mercaptoethanol，DMS0，rt ·
[0027] 本发明中所述的抗癌药物为吉西他滨、阿霉素、奥沙利铂、依铂、紫杉醇、多烯紫杉 醇、5_氟尿嘧啶、依托泊苷、长春新碱、羟基喜树碱等中的两种或多种，最佳的为吉西他滨和 紫杉醇;此外，所述的抗癌药物为VE修饰后的药物，如将吉西他滨(GEM)、紫杉醇(PTX)通过 维生素 E(VE)进行修饰，合成步骤如下：
[0028] 维生素 E丁二酸单酯(VE-SA)与吉西他滨在苯并三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟 磷酸盐(HBTU)做缩合剂的条件下，以酰胺键连接为目标化合物GEM-VE，合成路线如下：
[0030] 在二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，紫杉醇与维生素 E琥 珀酸单酯缩合，生成目标化合物PTX-VE，合成路线如下：
[0032]本发明中所述的荧光探针为磺酰罗丹明B、吲哚菁绿、异硫氰酸荧光素、溴化乙锭、 水溶性荧光蓝、萘酐类水溶性荧光染料、水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯类染料、藻红蛋白香豆 素，Dil(细胞膜红色荧光探针），罗丹明200,荧光素酯中的一种或几种，首选磺酰罗丹明B或 吲哚菁绿;此外，所述的荧光探针为VE修饰后的探针。荧光探针的主要作用是在肿瘤发生部 位显色，从而起到诊断作用。如将磺酰罗丹明B(SRB)、吲哚菁绿（ICG)通过维生素 E进行修 饰，合成步骤如下：
[0033]以SRB为起始原料，在三乙胺和二甲基吡啶存在下，与叔丁基-2-氨基氨基甲酸乙 酯成酰胺，生成中间体1，1在低温下，由三氟乙酸催化脱去B0C保护基，得到中间体2,2与维 生素 E琥珀酸单酯在DCC和DMAP作用下生成目标化合物SRB-VE，合成路线如下：
[0035]将琥珀酸，单[(2R)-3，4-二氢-2，5，7，8-四甲基-2-[ (4R，8R)-4，8，12-三甲基十三 烷基]-2H-1-苯并吡喃-6-基]酯（4)和60mg(0.08mmol)lH-苯并[e]吲噪-2-[7-[3-(3-羧丙 基)-1，3_二氢-1，1-二甲基-2H-苯并[e]吲哚-2-叉基]-1，3,5-庚三烯-1-基]-1，1-二甲基-3-(4-磺丁基）内铵盐(3)溶于二氯甲烷中，再加入DCC和催化量的DMAP，混合物在氮气保护 下室温搅拌5h，得ICG-VE，合成路线如下：
[0037]本发明通过如下方法制备：
[0038] (1)将嵌段共聚物、抗癌药物与荧光探针溶于可与水互溶的有机溶剂中，得有机溶 液(若嵌段共聚物为水溶性的，则将其溶于水中）；
[0039] (2)将上述有机溶液滴加至水中，并搅拌；
[0040] (3)蒸发除去溶剂，除杂，即可；
[0041] 其中，步骤（1)中，有机溶剂可为丙酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰 胺或四氢呋喃等;为获得更佳的效果，首选丙酮。
[0042]其中，步骤(2)中，所述的有机溶剂滴加至水时体系的温度控制，较佳的为50°C~ 70°(：，最佳为60°(：。
[0043]其中，步骤（3)中，所述的蒸发除去溶剂中，搅拌时间的控制，较佳的是30min~ 50min，较佳的为40min。
[0044] 其中，步骤(3)中，所述的除杂为过0.22μπι滤膜。
[0045] 本发明中，所述的制备方法，有机溶液与水的比例为1:1~1:3,最佳为1: 2。，
[0046] 本发明中，所述纳米诊疗胶束制剂中残留的丙酮含量少于lOppm。
[0047] 本发明中，所述纳米诊疗胶束的平均粒径在90nm~170nm之间。
[0048]本发明中，所述纳米诊疗胶束在4°C稳定性超过168h。
[0049] 本发明所设计的新型纳米诊疗胶束中可包载的荧光探针，有些除具有荧光显色的 作用，还具有光动力学治疗或光热治疗的作用，如吲哚菁绿，在治疗癌症时，除具有荧光成 像的作用，即诊断肿瘤病灶的同时，还可杀伤肿瘤细胞，起到治疗的目的，进一步增加抗肿 瘤效果。
[0050] 本发明所设计的新型纳米诊疗胶束可通过溶剂挥发法制备，本法操作简便，包封 率高，所制备的纳米胶束粒径均匀，分散较好，且较稳定。
[0051] 本发明的纳米诊疗胶束，可同时包载两种或多种的药物，充分利用了联合用药的 优势，严格遵循了联合用药的原则，使治疗效果更佳，克服或减缓了多药耐药现象。同时，本 发明的纳米诊疗胶束包载的荧光探针，一般选择理想的可作为荧光探针的物质，特别是在 针对肿瘤的诊疗时。其中，吲哚菁绿在充分发挥荧光探针作用的同时，还具有光热效应，在 光的激发下，产生有毒物质和局部产热杀死肿瘤细胞，进而发挥治疗的效用。此外，本发明 中纳米诊疗胶束所用的制备方法为溶剂挥发法，该法操作简便，包封率较高，所制备的胶束 性质稳定，兼具诊断与治疗双重功效，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0052] 图1为本发明实施例1的MPEG-PLGA2Q(X)胶束的粒径分布图。
[0053]图2为本发明实施例2的MPEG-PLGA5Q(X)胶束的体外释放曲线图。
[0054]图3为本发明实施例3的MPEG-PLGA9Q(X)胶束的透射电镜图。
[0055] 图4为本发明实施例6的FA-PEG-VE胶束的小动物活体成像图。
[0056] 图5为本发明实施例6的FA-PEG-VE胶束的离体组织分布图。
【具体实施方式】
[0057] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明实施方案进行描述，但是应当 理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0058] 本发明采用微柱离心法测定所制备胶束的载药量和包封率，具体步骤如下：将制 备好的胶束溶液200yL于葡聚糖凝胶柱(G50)上，2000rpm离心2min，后加200yL去离子水， 2000rpm离心2min，并重复3次。收集4次离心所得的液体，用十倍量的甲醇破坏，4000rpm离 心5min，取上清液测定药物的含量，计算载药量和包封率，计算公式如下：
[0059] 载药量=所测得的药物含量/载体与药物的总量X 100%
[0060] 包封率=所测得的药物含量/初始加入的药物量X 100%
[0061 ] 本发明采用1&8丨6181261'激光粒度仪测定所制备胶束的粒径、？01值和26丨3电位 值。
[0062]本发明采用动态透析法进行胶束的体外释放研究:精密量取MPEG-PLGA2Q(X)胶束于 透析袋(截留分子量8000~14000)内，扎紧透析袋，然后置于100mL含0.5%十二烷基硫酸钠 (SDS)的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(？85)中（参照药典2015版8004缓冲液的配制），37°(：搅拌， 转速为 l〇〇rpm/min，分别于0.5，1，2,4,6,8，10，12,24,36,48,60,7211时间点取样，并补充相 应量新鲜的释放介质，计算累计释放度，并绘制释放曲线，并用f 2相似因子法对两种药物与 荧光探针的释放进行拟合:若f 2值均大于50，说明三者可达到同步释放。
[0063] 实施例1MTOG-PLGA2_载药纳米诊疗胶束的制备（载体：药物：荧光探针为1200: 80:1)
[0064] 将吉西他滨（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0065] 将 12mg MPEG-PLGA2_溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 10yg的3mL丙 酮中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1: 2)，在60 °C水 浴下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制 备的纳米诊疗胶束过ο. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0066] 采用微柱离心法测得MPEG-PLGA2QQ()胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载 药量和包封率为4.74 %、82.07 %，PTX-VE的载药量和包封率为0.39 %、80.64 %。
[0067]采用动态光散射法测定所制备Μ P E G - P L G Α 2 ο ο 〇胶束的粒径，结果为：粒径为 152 · 6nm，PDI值为0 · 083，Zeta电位为-19 · 9mV。粒径分布图如图1。
[0068] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备MPEG-PLGA2Q(X)胶束的形态。
[0069] 实施例2MPEG-PLGA5Q(X)载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物：荧光探针为750:40: 1)
[0070] 将吉西他滨（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhoda mine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0071] 将 15mg MPEG-PLGA5_溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 20yg的3mL丙 酮中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1: 2)，在60 °C水 浴下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制 备的纳米诊疗胶束过〇. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0072] 采用微柱离心法测得MPEG-PLGAsooo胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载 药量和包封率为4.10%、87.80%，PTX-VE的载药量和包封率为0.33%、83.87%。
[0073]采用动态光散射法测定所制备Μ P E G - P L G Α 5 ο ο 〇胶束的粒径，结果为：粒径为 118.9nm，PDI 值为 0.132,26七&电位为-11.411^〇
[0074] 本发明采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备MPEG-PLGAsooo胶束的形态。
[0075]本发明采用动态透析法进行胶束的体外释放研究，释放曲线如图2。用5相似因子 法对两种药物与荧光探针的释放进行拟合，拟合结果见表l，f2值均大于50,说明三者可达 到同步释放，体外诊断与治疗可达到同步。
[0076] 表1 MPEG-PLGA·。胶束体外释放的f2值
[0078] 实施例3 MPEG-PLGA.o载药纳米诊疗胶束的制备（载体：药物：荧光探针为360: 16:1)
[0079] 将吉西他滨（Gemcitabine, GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及吲噪菁绿 (Indocyanine Green，ICG)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0080] 将 18mg MPEG-PLGA9_溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、ICG-VE50yg的3mL丙酮 中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1:2)，在60 °C水浴 下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备 的纳米诊疗胶束过〇. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0081 ] 采用微柱离心法测得MPEG-PLGA9000胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载 药量和包封率为3.19 %、81.40 %，PTX-VE的载药量和包封率为0.25 %、77.40 %。
[0082]采用动态光散射法测定所制备Μ P E G - P L G A 9 ο ο 〇胶束的粒径，结果为：粒径为 109 · 6nm，PDI 值为 Ο · 172，Zeta 电位为-22 · 4mV〇
[0083] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备MPEG-PLGA9Q(X)胶束的形态，如图3。
[0084]实施例4PEG-VE载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物:荧光探针为100:40:1)
[0085] 将吉西他滨（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0086] 将GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 20yg溶于3mL丙酮中，搅拌成为有机相。精 密称取2mg PEG-VE于6mL水中（有机溶剂:水=1:2)，在60°C水浴下将有机相缓缓滴至水中， 并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备的纳米诊疗胶束过〇.22μπι 滤膜除杂，即得。
[0087] 采用微柱离心法测得PEG-VE胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载药量和 包封率为23·76%、90·62%，PTX-VE的载药量和包封率为1.95%、88.71%。
[0088]采用动态光散射法测定所制备PEG-VE胶束的粒径，结果为:粒径为95.58nm，PDI值 为 0.139,26七3电位为-14.211^。
[0089] 本发明采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备PEG-VE胶束的形态。
[0090] 实施例5FA-PEG-VE载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物:荧光探针为100:80:1)
[0091 ] 将吉西他滨（Gemcitabine, GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及吲噪菁绿 (Indocyanine Green，ICG)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0092]将GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、ICG-VE 10yg溶于3mL丙酮中，搅拌成为有机相。精 密称取lmg FA-PEG-VE及2mg碳酸钠于3mL水中（有机溶剂:水=1:1)，在60°C水浴下将有机 相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备的纳米诊 疗胶束过0.22μπι滤膜除杂，即得。
[0093] 采用微柱离心法测得FA-PEG-VE胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载药量 和包封率为29.40%、72.00%，PTX-VE的载药量和包封率为2.80%、82.00%。
[0094]采用动态光散射法测定所制备FA-PEG-VE胶束的粒径，结果为:粒径为156.7nm， PDI 值为 0 · 145，Zeta 电位为-62 · 5mV。
[0095] 本发明采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备FA-PEG-VE胶束的形态。
[0096] 实施例6 FA-PEG-VE载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物:荧光探针为100:40:1)
[0097] 将吉西他滨（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0098] 将GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 20yg溶于3mL丙酮中，搅拌成为有机相。精 密称取2mg FA-PEG-VE及6mg碳酸钠于6mL水中（有机溶剂:水=1:2)，在60 °C水浴下将有机 相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备的纳米诊 疗胶束过0.22μπι滤膜除杂，即得。
[0099] 采用微柱离心法测得FA-PEG-VE胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载药量 和包封率为23.88 %、91.08 %，PTX-VE的载药量和包封率为1.98 %、90.32 %。
[0100]采用动态光散射法测定所制备FA-PEG-VE胶束的粒径，结果为：粒径为96.93nm， PDI 值为 0 · 151，Zeta 电位为-55mV。
[0101] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备FA-PEG-VE胶束的形态。
[0102]以口腔上皮敏感细胞株MCF-7和耐药株MCF-7/adv为肿瘤模型，建立荷瘤小鼠模 型。尾静脉注射上述所制备的FA-PEG-VE胶束后，在不同时间点利用小动物活体成像仪观察 所制备胶束在活体小鼠肿瘤部位的分布，如图4。之后处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾及肿 瘤，测定胶束在荷瘤小鼠各组织中的分布，如图5。说明所制备的纳米胶束可良好地应用于 活体成像及组织分布，兼具诊断与治疗的作用。
[0103] 实施例7 FA-PEG-VE载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物:荧光探针为60:16:1)
[0104] 将吉西他滨（Gemcitabine,GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0105] 将GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 50yg溶于3mL丙酮中，搅拌成为有机相。精 密称取3mg FA-PEG-VE及9mg碳酸钠于9mL水中（有机溶剂:水=1:3)，在60 °C水浴下将有机 相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备的纳米诊 疗胶束过0.22μπι滤膜除杂，即得。
[0106] 采用微柱离心法测得FA-PEG-VE胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载药量 和包封率为16.08%、83.70%，PTX-VE的载药量和包封率为1.30%、80.64%。
[0107]采用动态光散射法测定所制备FA-PEG-VE胶束的粒径，结果为：粒径为168.9nm， PDI 值为 0 · 132，Zeta 电位为-66 · 5mV。
[0108] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备FA-PEG-VE胶束的形态。
[0109] 实施例8 PLA-PEG-PLA载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物：荧光探针为1200: 80:1)
[0110] 将吉西他滨（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0111] 将 12mg PLA-PEG-PLA溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 10yg的3mL丙酮 中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1:2)，在60 °C水浴 下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备 的纳米诊疗胶束过〇. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0112] 采用微柱离心法测得PLA-PEG-PLA胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载药 量和包封率为4.76 %、82.43 %，PTX-VE的载药量和包封率为0.40 %、82.01 %。
[0113] 采用动态光散射法测定所制备PLA-PEG-PLA胶束的粒径，结果为:粒径为157.4nm， PDI 值为 0 · 154，Zeta 电位为-12 · 6mV。
[0114] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备PLA-PEG-PLA胶束的形态。
[0115] 实施例9 PLA-PEG-PLA载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物:荧光探针为360:16: 1)
[0116] 将吉西他滨（Gemci tab ine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及横酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0117] 将 18mg PLA-PEG-PLA溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 50yg的3mL丙酮 中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1:2)，在60 °C水浴 下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完成。将所制备 的纳米诊疗胶束过〇. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0118] 采用微柱离心法测得PLA-PEG-PLA胶束的载药量和包封率，结果为:GEM-VE的载药 量和包封率为3.26 %、83.07 %，PTX-VE的载药量和包封率为0.26 %、80.71 %。
[0119]采用动态光散射法测定所制备PLA-PEG-PLA胶束的粒径，结果为:粒径为162. lnm， PDI 值为 0.123,26七3电位为-11.911^。
[0120] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备PLA-PEG-PLA胶束的形态。
[0121] 实施例10 Phis-PLA-PEG-PLA-Phis载药纳米诊疗胶束的制备(载体:药物:荧光探 针为 1800:80:1)
[0122] 将吉西他滨（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及磺酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0123] 将 18mg Phis-PLA-PEG-PLA-Phis溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 10μ g的3mL丙酮中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1:2)， 在60°C水浴下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完 成。将所制备的纳米诊疗胶束过〇. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0124] 采用微柱离心法测得Phis-PLA-PEG-PLA-Phis的载药量和包封率，结果为:GEM-VE 的载药量和包封率为3.28%、83.47%，PTX-VE的载药量和包封率为0.27%、82.33%。
[0125] 采用动态光散射法测定所制备Phis-PLA-PEG-PLA-Phis胶束的粒径，结果为:粒径 为 162.5nm，PDI 值为 0.154,26七3电位为-15.611^〇
[0126] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备Phis-PLA-PEG-PLA-Phis胶束的形态。
[0127] 实施例llPhiS-PLA-PEG-PLA-PhiS载药纳米诊疗胶束的制备(载体 :药物:荧光探 针为400:16:1)
[0128] 将吉西他滨（Gemcitabine，GEM)、紫杉醇（Paclitaxel ,ΡΤΧ)及磺酰罗丹明B (Sulforhodamine B，SRB)用维生素 E(Vitamine E，VE)进行修饰。
[0129] 将20mg Phis-PLA-PEG-PLA-Phis溶于含GEM-VE 740yg、PTX-VE 62yg、SRB-VE 50μ g的3mL丙酮中，搅拌使其溶解成为有机相。精密量取6mL水于烧杯中（有机溶剂:水=1:2)， 在60°C水浴下将有机相缓缓滴至水中，并不断搅拌，滴加完成后继续搅拌直至丙酮挥发完 成。将所制备的纳米诊疗胶束过〇. 22μπι滤膜除杂，即得。
[0130] 采用微柱离心法测得Phis-PLA-PEG-PLA-Phis的载药量和包封率，结果为:GEM-VE 的载药量和包封率为2.85%、80.32%，PTX-VE的载药量和包封率为0.24%、81.08%。
[0131] 采用动态光散射法测定所制备Phis-PLA-PEG-PLA-Phis胶束的粒径，结果为:粒径 为 173.1nm，PDI 值为 0.168,26七3电位为-14.811^〇
[0132] 采用JEM-2100透射电子显微镜观察所制备Phis-PLA-PEG-PLA-Phis胶束的形态。
【主权项】
1. 一种新型的纳米胶束，其特征在于，包括嵌段共聚物、抗癌药物、荧光探针，其中各组 分的重量比为：100:80:1~400:16:1。2. 根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于:所述的嵌段共聚物为两嵌段共聚物、 三嵌段共聚物或多嵌段共聚物中的一种或几种。3. 根据权利要求1或2所述的纳米胶束，其特征在于:所述的两嵌段共聚物为聚氧乙烯-聚苄基天冬氨酸共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、单甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共 聚物、聚甲基丙烯酸甲酯-聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯-聚苯乙烯、聚环氧乙烷-聚苯乙烯、聚环 氧乙烷-聚(烷基)丙烯酸酯、聚环氧乙烷-聚乳酸、聚乙二醇-维生素 E、叶酸-聚乙二醇-维生 素 E中的一种或几种，优选为单甲氧基聚乙二醇外消旋聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乙二醇-维 生素 E及叶酸-聚乙二醇-维生素 E。4. 根据权利要求1-3任何一项所述的纳米胶束，其特征在于:所述的三嵌段共聚物为苯 乙烯-丁二烯-苯乙烯、苯乙烯-丁二烯-内酯嵌段共聚物、苯乙烯-丁二烯-3-氯丙烯共聚物、 聚（环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚（环氧乙烷）、三嵌段共聚物P123、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳 酸三嵌段共聚物中的一种或几种，优选为聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物。5. 根据权利要求1-4任何一项所述的纳米胶束，其特征在于:所述的多嵌段共聚物为苯 乙烯-丁二烯-苯乙烯-甲基丙烯酸酯嵌段共聚物、PHBPEG多嵌段共聚物或聚组氨酸-聚乳 酸-聚乙二醇-聚乳酸-聚组氨酸嵌段共聚物中的一种或几种，优选为聚组氨酸-聚乳酸-聚 乙二醇-聚乳酸-聚组氨酸嵌段共聚物。6. 根据权利要求1-5任何一项所述的纳米胶束，其特征在于:所述的抗癌药物为吉西他 滨、阿霉素、奥沙利铂、依铂、紫杉醇、多烯紫杉醇、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、长春新碱、羟基喜 树碱中的两种或多种，优选为吉西他滨和紫杉醇。7. 根据权利要求1-6任何一项所述的纳米胶束，其特征在于:所述的荧光探针为磺酰罗 丹明B、吲哚菁绿、异硫氰酸荧光素、溴化乙锭、水溶性荧光蓝、萘酐类水溶性荧光染料、水溶 性菁染料琥珀酰亚胺酯类染料、藻红蛋白香豆素，Dil(细胞膜红色荧光探针），罗丹明200， 荧光素酯中的一种或几种，优选为磺酰罗丹明B或吲哚菁绿。8. 根据权利要求1-7中任何一项所述的纳米胶束，其特征在于:所述的抗癌药物及荧光 探针均为经VE修饰的药物和探针。9. 根据权利要求1-8任何一项所述的纳米胶束，其特征在于，用溶剂挥发法、薄膜水化 法或透析法制备，优选溶剂挥发法。10. 权利要求1-9任何一项所述的纳米胶束在制备实现肿瘤诊断和治疗同步进行的药 物中的应用。
【文档编号】A61K47/32GK105833293SQ201511020259
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月30日
【发明人】杨星钢, 高云云, 狄岩, 潘卫三
【申请人】沈阳药科大学