一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用

一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体，其特征在于，包括肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体；所述肽类树状大分子体系包括肽类树状大分子和成像分子，肽类树状大分子包括可逆化学键和羧基，成像分子包括可逆化学键或能与可逆化学键反应的官能团，成像分子引发肽类树状大分子交联，形成肽类树状大分子体系；所述抗肿瘤药物前驱体由抗肿瘤药物经过物理或化学处理制得，抗肿瘤药物前驱体和肽类树状大分子体系通过弱相互作用形成自组装单元。本发明的肽类树状大分子自组装体具有结构稳定、响应于体内特征的生物学信号、集诊断与治疗一体的优点。
【专利说明】
一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制 备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备方法及 其在生物医学领域的应用研究。
【背景技术】
[0002] 近年来，我们通过发展肽类树状大分子及其自组装策略，获得了一系列性能优越 的树状大分子组装系统，很大程度上减少了树状大分子精确合成的繁琐步骤、改善了树状 大分子递送系统的生物相容性;更为重要的是，树状大分子组装系统更有利于实现纳米系 统的功能整合与优化，大幅度提高了生物活性分子的传递效率。但是，树状大分子组装体在 作为纳米递送系统的应用中也逐渐显露出其不足之处：（1)基于弱相互作用形成的树状大 分子组装体在稳定性存在不足，难以应对体内复杂的生理屏障；（2)缺乏诊断治疗一体化的 多功能集成，无法满足现代医学的个体化治疗需求。因此，利用现代分子与超分子构建策 略，发展体内循环稳定、肿瘤特定响应、诊疗一体的树状大分子组装系统具有重要的基础研 究和应用研究价值。

【发明内容】

[0003] 本发明针对现有技术中制备的肽类树状大分子组装体存在的结构不稳定，在粒 径、形貌和功能保持上的不足，本发明提供了一种结构稳定同时能够响应于体内特征的生 物学信号的诊疗一体化的肽类树状大分子组装体。
[0004] 本发明采用的技术方案如下:一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装 体，包括肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体;所述肽类树状大分子体系包括肽类树 状大分子和成像分子，肽类树状大分子包括可逆化学键和羧基，成像分子包括可逆化学键 或能与可逆化学键反应的官能团，成像分子引发肽类树状大分子交联，形成肽类树状大分 子体系;所述抗肿瘤药物前驱体由抗肿瘤药物经过物理或化学处理制得，抗肿瘤药物前驱 体和肽类树状大分子体系通过弱相互作用形成自组装单元。
[0005] 作为可选方式，所述肽类树状大分子为一代肽类树状大分子、二代肽类树状大分 子或三代肽类树状大分子，优选为三代肽类树状大分子。
[0006] 作为可选方式，所述肽类树状大分子为扇形肽类树状大分子。所述扇形肽类树状 大分子的外围包括羧基，扇形肽类树状大分子的核心分子包括可逆化学键，内核具有疏水 性。所述扇形肽类树状大分子的结构式如下：
[0008]其中，Ri和Rm-起构成扇形肽类树状大分子的核心分子，m代表核心分子的官能 度，m为1或2 ;E为谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，组氨酸中的至少一种； D为酸性氨基酸，端基为羧基;G1.0、G2.0和G3.0分别代表一代肽类树状大分子、二代肽类树 状大分子和三代肽类树状大分子；
[0009]作为可选方式，所述可逆化学键pH敏感化学键、氧化还原敏感化学键、活性氧 (R0S)敏感化学键或酶敏感化学键中的一种。pH敏感化学键可以为腙键、酯键等;氧化还原 敏感化学键为二硫键、单硫键等;活性氧(R0S)敏感化学键为苯硼酸酯键等;酶敏感化学键 为组织蛋白酶敏感键、金属基质蛋白酶敏感化学键等。可逆化学键能够保证组装体在循环 过程中稳定存在及肿瘤微环境响应敏感药物释放。
[0010]作为可选方式，肽类树状大分子的核心分子中具有类似缩醛、缩酮或缩硫酮的结 构。
[0011] 作为可选方式，所述成像分子由可修饰的成像分子制得。可修饰的成像分子可以 采用荧光分子，如钙黄绿素(Calcein)，异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明，菁染料(Cy系列染 料)中任意一种，也可以为核素分子(含 11(：、1^、150、1￥或82此等中至少一种）。优先0 75.5。
[0012] 作为可选方式，所述可逆化学键为HS-或-S-S^HS-或-S-S-在氧化还原环境中能 够实现二者之间的相互转化，能够保证系统的稳定性及响应性。所述成像分子结构式如下： ?Λ
[0014] 其中，F为可修饰的成像分子。
[0015] 作为可选方式，所述抗肿瘤药物采用疏水性抗肿瘤药物或亲水性肿瘤药物。疏水 性抗肿瘤药物可以为紫杉醇(ΡΤΧ)、疏水阿霉素(D0X)或甲氨蝶呤(ΜΤΧ)等;所述亲水性抗肿 瘤药物可以为替伊莫单抗、贝伐单抗或修饰的金属药物等。优选亲水性抗肿瘤药物。
[0016] 作为可选方式，所述抗肿瘤药物采用亲水性抗肿瘤药物，其结构式如下：
[0018] 其中，Μ为金属原子。Κ为碱性氨基酸，能够提供氨基并与金属发生配位作用，优选 为赖氨酸;R2为亲水高分子聚合物，能够增加抗肿瘤药物的亲水性。所述亲水高分子聚合物 R2可采用聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚和聚乙烯醇中任意一种，优选为聚乙二醇单甲醚。
[0019] 本发明还提供了一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备方 法，包括如下步骤：
[0020] 1)制备肽类树状大分子；
[0021] 2)制备成像分子；
[0022] 3)将成像分子加入到肽类树状大分子的水溶液中，成像分子引发肽类树状大分子 的交联，制备肽类树状大分子体系；
[0023] 4)抗肿瘤药物的负载。包括疏水性抗肿瘤药物或亲水性肿瘤药物的负载。首先制 备抗肿瘤药物前驱体，再将去质子化的肽类树状大分子体系和抗肿瘤药物前驱体混合，通 过弱相互作用形成肽类树状大分子组装体。
[0024] 疏水性抗肿瘤药物的装载:将肽类树状大分子体系与疏水性抗肿瘤药物共溶于少 量溶剂中，于超声条件下缓慢滴加至大量去离子水中，超声l〇min后，室温下搅拌24h，浓缩， 过滤，滤液冻干，即可得到负载疏水性抗肿瘤药物的肽类树状大分子组装体；
[0025] 亲水性抗肿瘤药物的装载:将亲水性抗肿瘤药物于水中活化制备抗肿瘤药物前驱 体，将抗肿瘤药物前驱体滴加至肽类树状大分子体系的水溶液中，室温反应24h后，浓缩，透 析冻干，即可得到负载亲水性抗肿瘤药物的肽类树状大分子组装体。
[0026] 作为可选方式，步骤1)中所述的肽类树状大分子的制备可选用发散法或收敛法或 发散-收敛相结合的方法。
[0027] 作为可选方式，步骤2)中成像分子的制备方法具体为：
[0028] 按比例称取可修饰的成像分子（In当量），含引发基团的单官能团分子（1.2η当 量），缩合剂（1.2η当量)和催化剂（1.2η当量），室温条件下在水中反应，反应结束后，透析除 去缩合剂及未反应的分子，冻干得到产物并于_20°C条件下储存。
[0029] 作为可选方式，可采用以下制备方法制备步骤4)中所述亲水性抗肿瘤药物：
[0030] a)称取氨基保护的的碱性氨基酸（In当量），亲水高分子聚合物（In当量），缩合剂 (1.2n当量)和催化剂（1.2n当量），在0°C，氮气保护下，加入到无水溶剂中，再往以上混合溶 液中加入有机碱(4n当量），而后在室温条件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过 滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
[0031] b)准确称取带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物（In当量），加入 溶剂溶解后，再加入脱保护试剂（20η当量），在氮气保护下室温反应，脱除保护后，减压浓 缩，通过萃取或沉淀处理得到碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
[0032] c)称取抗肿瘤药物（In当量），碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物（In当量)于室 温条件下反应24h，浓缩透析得到亲水性抗肿瘤药物。
[0033]本发明还提供一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体(TSPDSs)的 应用，该组装体在正常生理环境中具有良好的稳定性，但在体内特定环境的响应性实现组 装体的迅速崩解。同时，通过成像分子和抗肿瘤药物分子的引入，形成集成像和治疗于一 体，能够实现其在肿瘤诊断和肿瘤治疗的应用。
[0034]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥 的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0035]本发明的有益效果：
[0036] 1.本发明提供了一种超分子组装方法，成功将成像分子及抗肿瘤药物整合到同一 个纳米粒子中，实现肿瘤的治疗及载药粒子体内外分布监测。
[0037] 2.本发明所述肽类树状大分子组装体，具有精确的结构，以肽类树状大分子为基 础赋予该体系良好的生物相容性，提高了整个系统的生物安全性。
[0038] 3 .本发明所述肽类树状大分子组装体通过分层次组装的方式制备，工艺简单，可 以通过控制各原料的配比进行形貌，荧光强度，载药量的控制，具有很强的可控性。
[0039] 4.本发明所述肽类树状大分子组装体通过分层次组装的方式制备，能够通过不同 化学键的引入设计制备得到具有不同肿瘤微环境响应的载药组装体，实现粒子在循环过程 中的稳定性及肿瘤微环境响应性药物释放。
[0040] 5.本发明所述肽类树状大分子组装体，提供了一种普适性的方法构建诊生物响应 型诊断治疗一体化的纳米粒子，可以有更广的生物医学应用。
【附图说明】
[0041 ]图1为本发明实施例2中所肽类树状大分子的合成示意图。
[0042]图2为本发明实施例4中所述荧光分子前驱体的合成示意图。
[0043]图3为本发明实施例7中所述亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体的合成 示意图。
[0044] 图4为本发明生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备流程图。
[0045] 图5为本发明实施例10中所述动态化学键稳定的组装体包载疏水药物D0X的荧光 光谱图
[0046] 图6为本发明实施例11中所述肽类树状大分子的临界聚集浓度。
[0047] 图7至图9为本发明实施例12中所述肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及 Tsross的粒径和电位。
[0048] 图10至图12为本发明实施例12中所述肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及 Tsross的透射电镜图片。
[0049] 图13为本发明实施例12中所述Tsross的能谱分析图。
[0050] 图14为本发明实施例12中所述Tsross的X-射线电子能谱分析图。
[0051 ]图15为本发明实施例12中所述Tsross的热重分析图。
[0052] 图16至图20为本发明实施例13中所述TSH)Ss在不同环境中孵育不同时间时的粒 径分布图。
[0053] 图21为本发明实施例14中所述Tsross体外药物释放结果。
[0054] 图22为本发明实施例15中所述TSH)SS的蛋白吸附结果。
[0055] 图23为本发明实施例16中所述TSH)Ss对A549细胞的毒性结果。
[0056] 图24为本发明实施例16中所述TSH)Ss对A549细胞周期分布影响图。
[0057]图25为本发明实施例16中所述TSPDSs及商品化顺铂作用后细胞内Pt的分布定量 图。
[0058]图26和图27为本发明实施例17中所述TSH)SS胞内递送过程研究的激光共聚焦图 片（附彩色图）。
[0059]图28为本发明实施例18中所述TSH)SS的活体成像图片（附彩色图）。
[0060]图29为本发明实施例18中所述Tsross的离体分布图片。
[00611图30为本发明实施例19中所述Tsross对A549荷瘤鼠肿瘤体积影响结果。
[0062]图31为本发明实施例19中所述TSroSs对A549荷瘤鼠体重影响结果。
[0063]图32为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠的肿瘤进行组织形态学及免 疫组化分析图片。
[0064]图33为本发明实施例19中所述TSH)SS对A549荷瘤鼠的心、肝、脾和肺进行组织形 态学分析图片。
[0065]图34为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠的肾脏进行组织形态学及免 疫组化分析图片。
[0066]图35为本发明实施例19中所述TSPDSs对A549荷瘤鼠治疗结束后的血尿素氮及肌 酐两项生化指标进行检测的结果。
[0067]图36为本发明实施例20中所述TSH)SS的药代动力学分析结果。
[0068]图37为本发明实施例21中所述TSPDSs单次给药后，Pt在肾及肿瘤组织处的分布结 果。
【具体实施方式】
[0069] 下面结合是实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例 证的目的，绝不限制本发明的保护范围。以下实施例中所述原料选用分析纯且均为市售。
[0070] 实施例1:肽类树状大分子的制备
[0071] a)对氨基酸进行官能团保护:根据所要制备的肽类树状大分子的核心分子表面官 能团的不同对氨基酸进行保护，如核心分子表面官能团为氨基则对氨基酸的氨基进行保 护，如核心分子表面官能团为羧基则对氨基酸的羧基进行保护；
[0072] b)制备一代肽类树状大分子:按比例称取核心分子(官能度为n，n = l或2)、含保护 基团的氨基酸（1.5n当量），缩合剂（1.5n当量)和催化剂（1.5n当量），在0°C，氮气保护下，加 入到无水溶剂中，再往混合溶液中加入有机碱(4n当量)进行脱水缩合反应，而后在室温条 件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有 保护基团的第一代肽类树状大分子；
[0073] c)脱保护:准确称取带有保护基团的第一代肽类树状大分子（In当量)和脱保护试 剂(20η当量），用溶剂溶解，在氮气保护下室温反应，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀 处理得到第一代肽类树状大分子；
[0074] d)制备二代肽类树状大分子:按比例称取第一代肽类树状大分子(官能度为2η)、 含保护基团的氨基酸(3η当量），缩合剂(3η当量)和催化剂(3η当量），在0°C，氮气保护下，加 入到无水溶剂中，再加入有机碱(8n当量)进行脱水缩合反应，而后在室温条件下反应，反应 结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的第二 代肽类树状大分子。
[0075] e)脱保护:准确称取带有保护基团的第二代肽类树状大分子（In当量)和脱保护试 剂(40η当量），用溶剂溶解，在氮气保护下室温反应，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀 处理得到第二代肽类树状大分子；
[0076] 重复以上缩合反应和脱保护步骤，可得到第三、第四代负电荷表面的肽类树状大 分子。
[0077] 本实施例中所述缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂，可选择现有技术中已知的用于羧 基与氨基的脱水缩合的各种缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂。
[0078]实施例2:肽类树状大分子的具体合成例(合成路线如图1)
[0079] a) -代肽类树状大分子(LA-G lu-COOH)的合成
[0080] 称取lg硫辛酸（LA)，1.51g H-Glu(0tBu)-0tBu，1.12g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和0.79gl-羟基苯并三唑(Η0ΒΤ)于100mL带支管的烧瓶中，抽真 空，充氮气，反复三次，加入50mL重蒸二氯甲烷(DCM)，冰浴搅拌溶解，加入19.2mLN，N-二异 丙基乙胺(DIPEA)，继续反应0.5h，撤去冰浴反应24h。依次用饱和NaCl，NaHC0 3和HCl(lmol/ L)洗涤，Na2S04干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(DCM/Me0H = 15:1))分离得到浅黄色固体LA-G lu (OtBu) -OtBu。
[0081] b)脱保护
[0082] 称取1.50gLA-Glu(0tBu)-0tBu于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加入 5mL重蒸DCM溶解原料，接着加入5.2mL三氟乙酸(TFA)反应4h，减压除去TFA，油栗抽干后加 入无水乙醚搅拌得到白色沉淀，即为LA-Glu-COOH。产物无需提纯，直接用于下一步反应。 [0083] c)二代肽类树状大分子(LA-G lu (G2) -C00H)的合成
[0084] 称取l·00gLA-Glu-C00H，l·87gH-Glu(0tBu)-0tBu，l·39gEDCI和0·98gH0BT于 100mL带支管的烧瓶中，抽真空，充氮气，反复三次，加入50mLDCM，冰浴搅拌溶解，加入 24. OmLDIPEA，继续反应0.5h，撤去冰浴反应24h。依次用饱和NaCl，NaHC03和HC1 (lmol/L)洗 涤，Na2S〇4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/Me0H= 15:1)分离得到浅黄色 固体 LA-Glu(G2)(0tBu)-0tBu。
[0085] d)脱保护
[0086] 称取1.00gLA-Glu (G2) (OtBu) -OtBu于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加 入3mL重蒸DCM溶解原料，接着加入3.7mL TFA反应4h，减压除去TFA，油栗抽干后加入无水乙 醚搅拌得到白色沉淀，即为LA-Glu(G2)-C00H。产物无需提纯，直接用于下一步反应。
[0087] e)三代肽类树状大分子(LA-Glu(G3)_C00H)的合成
[0088] 称取0.50gLA-Glu(G2)_⑶0H，1.00g H-Glu(0tBu)-0tBu，0.73g EDCI和0.52g Η0ΒΤ于100mL带支管的烧瓶中，抽真空，充氮气，反复三次，加入50mLDCM，冰浴搅拌溶解，加 入2. lmLDIPEA，继续反应0.5h，撤去冰浴反应48h。依次用饱和NaCl，NaHC03和HC1 (lmol/L) 洗涤，Na2S〇4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/Me0H= 15:1)分离得到浅黄 色固体 LA-Glu(G3)(0tBu)-0tBu。
[0089] f)脱保护
[0090] 称取1.00gLA-Glu(G3)(0tBu)-0tBu于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加 入3mL重蒸DCM溶解原料，接着加入3.7mL TFA反应8h，减压除去TFA，油栗抽干后加入无水乙 醚搅拌得到浅黄色沉淀，即为LA-Glu(G3)-C00H。产物无需提纯，直接用于下一步反应。
[0091] 如图1中所示的LA-G 1 u (G3) -C00H的结构式，可以明显看出LA-G 1 u (G3) -C00H是外 围包括羧基，核心分子包括可化学逆键-S-S-的扇形肽类树状大分子。
[0092] 实施例3:荧光分子前驱体的制备
[0093]可修饰的成像分子采用荧光分子制备的成像分子即为荧光分子前驱体。
[0094]方法一:单官能团反应
[0095]按比例称取荧光分子（In当量），含引发基团的单官能团分子（1.2η当量），缩合剂 (1.2η当量)和催化剂（1.2η当量），室温条件下在水中反应，反应结束后，透析除去缩合剂及 未反应的分子，冻干得到产物并于-20°C条件下储存。
[0096]方法二:双官能团反应
[0097] 按比例称取含引发基团的双官能团分子（In当量），荧光分子(2.2η当量），缩合剂 (2.2η当量)和催化剂(2.2η当量），室温条件下在水中反应，反应结束后，透析除去缩合剂及 未反应的分子，冻干得到产物冰浴-20°C条件下储存。
[0098] 实施例4:荧光分子前驱体的具体合成例(合成路线如图2)
[0099] 称取1.10mgCy5.5-活性酯（Cy5.5-NHS)溶于200μ1二甲基亚砜(DMS0)，缓慢加至 O.lOmg胱胺的lmL水溶液中，室温避光反应24h后，4°C透析(截留分子量为1000)除去有机溶 剂及未反应的分子。冻干得到Cy5.5-cystamine-Cy5.5,并于-20°C条件下储存。根据图2中 Cy5.5-cystamine_Cy5.5的结构式可知，Cy5.5-cystamine_Cy5.5 包括可逆化学键-S-S-。
[0100] 实施例5:肽类树状大分子体系的制备
[0101] 称取100mg LA-Glu(G3)-C00H溶于水中，在其临界胶束浓度之上，成为LA为疏水内 核，谷氨酸羧基为亲水外围的纳米粒子。〇 . 90mg三（2-羧乙基）膦(TCEP)于水中与8.79mg Cy5.5-cystamine_Cy5.5反应45min将二硫键原位还原为疏基，并将其加入上述纳米粒子溶 液中引发纳米粒子的交联，反应24h后去离子水中透析48h，冻干得到核稳定的肽类树状大 分子体系。
[0102] 实施例6:亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体的制备
[0103] a)称取氨基保护的的碱性氨基酸（In当量），亲水高分子聚合物（In当量），缩合剂 (1.2n当量)和催化剂（1.2n当量），在0°C，氮气保护下，加入到无水溶剂中，再往以上混合溶 液中加入有机碱(4n当量），而后在室温条件下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，过 滤，减压浓缩，经过柱层析分离得到带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
[0104] b)脱保护:准确称取带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物（In当 量），加入溶剂溶解后，再加入脱保护试剂(20η当量），在氮气保护下室温反应，脱除保护后， 减压浓缩，通过萃取或沉淀处理得到碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物。
[0105] c)亲水性抗肿瘤药物前驱体制备:称取抗肿瘤药物（In当量），碱性氨基酸修饰的 亲水高分子聚合物（In当量)于室温条件下反应24h，浓缩透析得到亲水性抗肿瘤药物。碱性 氨基酸修饰的亲水高分子聚合物中的端基为氨基，氨基和亲水性抗肿瘤药物中的金属原子 形成配位键。将亲水性抗肿瘤药物（In当量)与AgN0 3(1.9n当量)于37°C条件下避光反应4h， 得到的白色沉淀通过lOOOOrpm离心15min，通过0.22μπι滤膜过滤即得抗肿瘤药物前驱体。
[0106] 实施例7:亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体的具体合成例(合成路线如 图3)
[0107] a)称取lg甲氧基聚乙二醇(mPEG)，0· 35g Boc_Lys(Boc)-Boc，0· 23g EDCI和0· 16g Η0ΒΤ于lOOmL带支管的烧瓶中，抽真空，通氮气，反复三次，加入50mL DCM，冰浴搅拌溶解，加 入0.7mL DIPEA，继续反应0.5h，撤去冰浴反应24h。依次用饱和NaCl，NaHC03和HC1 (lmo 1/L) 洗涤，Na2S〇4干燥后，过滤，减压除去溶剂，柱层析(洗脱剂为DCM/Me0H=20:1)分离得到白色 固体Bo c_Ly s (Bo c) -mPEG (mPEG-K-Bo c)。
[0108] b)脱保护：称取lg mPEG-K-Boc于50mL带支管的单颈瓶中，抽真空，充氮气，加入 lmL重蒸DCM中溶解原料，接着加入1. lmLTFA反应4h，减压除去TFA，油栗后加入无水乙醚搅 拌得到白色沉淀，即为具有良好亲水性的NH2-Lys-mPEG(mPEG-K)。产物无需提纯，直接用于 下一步反应。
[0109] C)称取lOO.OOmg K2PtCl4溶于2mL水中，向其中缓慢滴加68yL DMS0,室温避光搅拌 4h，得到浅黄色沉淀，冰水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥得到Pt(DMSO)2Cl 2。
[0110] C)亲水性抗肿瘤药物前驱体制备:称取50.00mg Pt(DMSO)2Cl2分散于lmLMeOH中， 缓慢滴加至133.89mg mPEG-K的MeOH中，室温反应24h，mPEG-K的一端的NH2-中的氮原子与 Pt(DMSO)2Cl2中的Pt原子形成配位键，过滤除去未反应的固体，滤液浓缩得到亲水性抗肿瘤 药物Pt(II)-K-mPEG。称取 100.OmgPt(II)-K-mPEG溶于水中，并与25.84mg AgN03于室温避 光条件下反应4h以除去氯离子。白色沉淀通过lOOOOrpm离心15min，再通过0.22μηι滤膜过滤 去除上清液即得到亲水高分子聚合物修饰的抗肿瘤药物前驱体。
[0111] 实施例8:环境响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的制备
[0112]称取88.70mg核稳定的肽类树状分子体系，在3.20mg NaOH的水溶液中反应去质子 化，再与AgN03处理的Pt (II) -K-mPEG于37 °C条件下反应24h。去离子水中透析(截留分子量 为3500)48h，冻干得到稳定的环境响应型的肽类树状大分子组装体(TSPDSshPtdD-K-mPEG中的Pt能够和肽类树状大分子体系中外围的羧基通过配位键实现药物的装载。图4为 制备环境响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体的流程图。
[0113]实施例9:疏水性抗肿瘤药物的装载
[0114]将核稳定的肽类树状分子体系与疏水性抗肿瘤药物(一定质量比）共溶于少量良 溶剂(如二甲基亚砜）中，于超声条件下缓慢滴加至大量去离子水中，超声l〇min后，室温下 搅拌24h，浓缩，过滤，滤液冻干，即可得到负载疏水性抗肿瘤药物的生物响应型诊疗一体化 肽类树状大分子组装体。
[0115] 实施例10:疏水药物D0X的具体装载实例
[0116] 称取100.00mg核稳定的肽类树状分子体系和10.00mg疏水阿霉素(D0X)，溶于100μ L二甲基亚砜中，于超声条件下缓慢滴加至10mL去离子水中，超声10min后，室温下剧烈搅拌 24h，浓缩，450μπι滤膜过滤，收集滤液，冻干，即可得到负载疏水D0X的组装体。
[0117] D0X作为具有荧光的疏水模型药物。通过荧光光谱可以验证其是否包载入该组装 体中。如图5所示，与游离D0X相比，相同浓度下包载入组装体内的D0X显示出更低的荧光强 度，这是由于D0X聚集而导致的荧光淬灭，表明D0X被包载如组装体疏水空腔。
[0118] 实施例11:肽类树状大分子临界聚集浓度的测定实例
[0119]肽类树状大分子的临界聚集浓度通过芘荧光法进行测定。具体的，将芘溶于丙酮 中制备到浓度6.0Xl(T5m〇l/L。肽类树状大分子lmL水溶液配置成一系列浓度（1.0ΠΓ 6至 1.0mg/mL)。向其中加入10yL花的丙酮溶液，超声30min讲丙酮彻底挥干。固定395nm发射波 长测定300nm至360nm的发射光谱。以浓度的对数为横坐标，1338/1334为纵坐标，拟合得到 两条直线，两条直线的交点即为肽类树状大分子的临界聚集浓度。
[0120]如图6所示，该肽类树状大分子的临界聚集浓度为43.6yg/mL。
[0121] 实施例12:TSPDSs的表征
[0122] 1)粒径，电位及形貌表征
[0123] 肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及肽类树状大分子组装体(TSPDSs)配置成 水溶液l〇〇yg/mL，采用动态光散射法(DLS)测定其水合粒径和Zeta电位，每个样品重复3次。
[0124] 结果如图7,图8和图9所示，肽类树状大分子粒径为160.9±2.4nm，电位为-8.79土 0.45mV，肽类树状大分子体系粒子粒径为67.6 ± 5.7nm，电位为-9.12 ± 0.20mV，结果表明肽 类树状大分子交联后粒子具有更加紧实的结构，粒径较小。通过超分子作用实现药物装载 及PEG化后，粒子粒径进一步变大为126.4 ± 3.7nm，电位为-20.20 ± 0.27mV。
[0125] 对肽类树状大分子，肽类树状大分子体系及肽类树状大分子组装体用透射电镜 (TEM)进行形貌及粒径的表征。将lOOyg/mL的样品滴在铜网上，室温条件下干燥后即可进行 检测，如图10-图12所示，透射电镜的结果均与DLS的结果相符合。
[0126] 2)特征能谱分析(EDS)及X-射线电子能谱(XPS)
[0127] 铂元素在TSPDSs中的存在及存在形式通过特征能谱分析及X-射线电子能谱进行 分析。
[0128] TSPDSs在进行扫描电镜检测时同时进行特征能谱分析，如图13所示，TSPDSs中可 见C、0、S、C1及Pt的特征峰。
[0129] TSroSs进行X-射线电子能谱分析，如图14所示，Pt的结合能，75.8eV和72.3eV，表 明Pt以+2价的形式存在。
[0130] 3)热重分析(TGA)
[0131] 准确称取10mg的TSH)Ss，置于坩埚中，使用德国耐驰公司的热失重分析仪，在空气 氛围中，以10°C/min的升温速率测定TSroSs从40°C到900°C的质量变化曲线。同时相同条件 下对肽类树状大分子及mPEG-K的混合物做热重分析用做对比。
[0132] 结果如图15所示，肽类树状大分子及mPEG-K的混合物在温度上升至420°C时，残余 质量趋于平稳，温度上升至600°C时，残余质量为1.46%，而TSroSs在530°C时残余质量趋于 平稳，最终残余质量为14.44%。该结果表明在空气氛围中，随着温度的上升，有机物逐渐被 燃烧氧化并被吹扫气带走，最后至剩下无法被燃烧的金属。残余质量的差值为12.98%即为 tstoss中Pt的含量。
[0133] 实施例13: TSPDSs在不同生理环境中的粒径变化
[0134] 将 TSPDSs 配置成100yg/mL 不同条件(磷酸盐缓冲液、ρΗ=7·4、ρΗ = 6·8、ρΗ=5·0、 ΙΟμΜ DTT及10mM DTT)的水溶液，分别模拟正常生理环境，肿瘤组织环境及肿瘤细胞内环 境。孵育不同时间（011，0.511，1.011，6.011和12.011)后，通过01^测定粒子的粒径变化。设置三 个平行样。
[0135] 如图16到图20所示，在正常生理环境及肿瘤组织环境中（即pH 7.4，pH 6.8及10μ MDTT)，TSroSs的粒径变化不大，而在肿瘤细胞内环境中（ρΗ= 5.0)，低pH条件下，TSPDSs粒 径明显变小，表明在酸性条件下该TSPDSs脱去PEG层释放抗肿瘤药物。而在强还原环境中 (10mM DTT)，该TSPDSs粒径变大，表明该组装体呈现解组装的过程。这一结果揭示了该 Tsross在体内循环过程中稳定存在，当其到达肿瘤部位时能够实现抗肿瘤药物的释放，同 时实现组装体的崩解。
[0136] 实施例14: TSPDSs体外释放行为的研究
[0137] 在lmL pH 7·4，ρΗ 6·8+10μΜ DTT，pH 5.0,及pH 5.0+10mM DTT的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中分别溶解lmgTSPDSs。分别将上述制备的溶液转移至截留分子量为2000的透析袋 中，并浸没于20mL相应的PBS中，于37°C条件摇床中孵育。在设定的时间点时，取出0.5mL透 析袋外的液体，并及时补充相应的新鲜PBS。设置三个平行样。释放的Pt用电感耦合等离子 共振质谱仪进行分析。
[0138] 结果如图21所示，？!17.4条件下，释放4811时，？七的释放量不足20%;?!16.8+1(^1 DTT条件下，释放48h时，Pt的释放量不足50 %。而在pH 5.0条件下，释放8h，Pt的释放量即到 达50%以上。pH 5.0+10mM DTT条件下，释放8h，Pt的释放量达到了65%。表明肿瘤微环境低 pH条件能够触发Pt的释放，同时强还原环境能够触发组装体的崩解进而加速Pt的释放。而 在正常生理环境中，TSPDSs能够保持稳定，避免了药物的提前释放对正常组织造成损伤。
[0139] 实施例15: TSPDSs抗蛋白吸附研究
[0140]以牛血清蛋白（BSA)为模型蛋白，考察TSH)SS的蛋白吸附行为。将BSA配置成100μ g/mL的roS(pH 7.4)溶液。与等体积等浓度的商品化顺铂溶液于37°C孵育lh，2h，4h和6h后， 取lmL样品，8000rpm离心15min，上清液用紫外可见(UV-Vis)分光光度计检测280nm处的吸 收，通过标准曲线法测定吸附的蛋白量。设置三个平行样。
[0141] 结果如图22所示，商品化顺铂及TSPDSs的蛋白吸附量很低，均在20 %以下。表明 Tsross具有较好的抗蛋白吸附作用，具有较长的血液循环时间同时在血液循环过程中能够 很好的保持其形态。
[0142] 实施例16: TSPDSs体外生物学评价
[0143] 1)细胞毒性评价
[0144] 利用CCK-8法测定TSPDSs的体外细胞毒性。选取处于生长活跃期的人肺腺癌细胞 (A549细胞)接种于96孔板中，初始细胞接种密度为8X 103个/孔，加入lOOyL RPMI 1640培 养基培养 24h，配置不同 Pt 浓度(0.002、0.01、0.02、0.1、0.2、1、2、4、10和2(^8/1^)的材料的 培养基溶液与细胞孵育48h。不同Pt浓度下等量的肽类树状大分子(D)，mPEG-K，D+mPEG-K的 培养基溶液作实验对照。细胞不做任何处理作为空白对照。孵育48h后，移除培养基，PBS (pH 7.4)洗涤三遍，加入1 OOyL无血清培养基稀释10倍的CCK-8，无细胞仅1 OOyL无血清培养基稀 释10倍的CCK-8作对照，37 °C孵育2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。每个浓度设置6个 平行样。相对细胞存活率按以下公式计算：
[0145] Cell Viability = (0Dsampie-0Dbackgr_d)/(0Dcontr〇i-0Dbackgr_d) X 100%
[0146] 结果如图23所示，D、mPEG-K，及两者的物理混合物(D+mPEG-K)在低浓度和高浓度 时细胞存活率均在100 %左右，显示出良好的生物相容性，而Tsross在Pt浓度为lyg/mL时从 100%的细胞存活率降至90%，随着Pt浓度的增加，细胞存活率逐渐减低，4yg/mL时，细胞存 活率降至50%左右，10yg/mL时细胞存活率将至10%以下。肽类树状大分子及mPEG-K作为基 础材料显示出良好的生物安全性，而构建的TSH)S S具有较好的体外抗肿瘤效果。
[0147] 2)细胞周期检测
[0148] 采用碘化丙锭(PI)染色流式细胞术(FACS)对材料对细胞周期的影响进行检测。选 取处于生长活跃期的A549细胞接种于6孔板中，初始细胞接种密度为2 X105个/孔，将D+ mPEG-K，商品化顺铂及TSPDSs(Pt浓度为1.5yg/mL)分别与细胞孵育，细胞不做任何处理作 为空白对照。24h后，移除培养基，PBS(pH 7.4)洗涤一次，胰酶消化后收集细胞，lOOOrpm离 心5min，弃掉上清液，用冰浴预冷的70 %乙醇于4 °C固定2h后，冰浴预冷的roS洗两次，按照 碧云天公司提供实验操作手册用500yLPI工作液重悬细胞，37°C条件下避光孵育30min，最 后使用流式细胞仪检测细胞周期分布，488nm激发光，收集575nm处发射光。每个实验组设置 三个平行样。
[0149] 结果如图24所示，未进行任何材料处理的细胞及D+mPEG-K处理的细胞显示很低的 凋亡(subGl期细胞不足2% )，同时60%左右细胞处于G0/G1期，10%左右细胞处于S期，30% 左右细胞处于G2/M期。而商品化顺铂及TSPDSs处理的细胞显示较低的凋亡细胞（subGl期 4%左右），但仅15 %左右的细胞处于G0/G1期，10%左右细胞处于S期，75 %左右细胞处于 G2/M期。相关研究表明，铂类药物能够与DNA碱基发生配位，抑制DNA的复制，使得细胞周期 阻滞于G2/M期，最终引起细胞凋亡。实验结果显示通过设计制备得到的TSPDSs具有与顺铂 类似的抗肿瘤机制，而肽类树状大分子及mPEG-K对细胞周期无影响。
[0150] 3)胞内Pt分布
[0151] 选取处于生长活跃期的A549细胞接种于6孔板中，初始细胞接种密度为2X105个/ 孔，将商品化顺铂和TSPDSs(Pt浓度为1.5yg/mL)分别与细胞孵育24h后，移除培养基，PBS (pH 7.4)洗涤一次，胰酶消化后收集细胞，进行细胞计数后，lOOOrpm离心5min，收集细胞， 按照Thermo Fisher Scientific公司操作手册进行细胞核细胞质分离。H202和HN03消解 后，利用ICP-MS进行细胞质细胞核内Pt含量的测定。
[0152] 结果如图25所示，TSPDSs在细胞内的富集量为211.4ng Pt/106个细胞，略多于商 品化顺铂（196.5ng Pt/106个细胞）。同时TSH)Ss能够递送更多的Pt进入细胞核（52.1 % )， 商品化顺铂仅能递送49.7%Pt如细胞核。
[0153] 实施例17: TSPDSs体外细胞递送
[0154] 选取处于生长活跃期的A549细胞按初始密度为5 X103个/皿接种于玻底皿中，培 养24h，加入TSH)Ss分别孵育lh和3h，用roS(pH 7.4)洗涤两遍，用4%多聚甲醛固定511^11后， 0:10进行细胞膜染色25111；[11，？133(。!17.4)洗涤两遍，在激光共聚焦显微镜(0011；1；'003113861 scanning microscope，CLSM)下观察并采集焚光图片。
[0155] 结果如图26所示，红色荧光代表TSH)Ss，绿色代表DiO标记的细胞膜，lh时即能在 细胞能找到Tsross的红色荧光。随着孵育时间的增加，越来越多的红色荧光进入细胞内。
[0156] 选取处于生长活跃期的A549细胞按初始密度为5X 103个/皿接种于玻底皿中，24h 后，加入了3?038分别孵育311和611，用?83(?!17.4)洗涤两遍，用含有1^〇1^〇1?^81116 0冊-22(50mM)的培养基标记溶酶体，然后用PBS(pH 7.4)洗涤两遍。细胞与谷胱甘肽乙酯(GSH-0Et)预先孵育2h后再与TSroSS孵育3h后进行溶酶体染色作比较。利用CLSM进行荧光图像采 集。
[0157] 结果如图27所示，红色荧光代表TSPDSs，蓝色代表LysoTracker标记的溶酶体。孵 育3h时，TSPDSs的红色荧光和溶酶体的蓝色荧光几乎重叠，表明Tsross内吞进入溶酶体，随 着孵育时间的增长，6h时，TSPDSs的红色荧光和溶酶体的蓝色荧光部分分离，表明Tsross从 溶酶体中逃逸出来。通过对细胞预先GSH-〇Et处理，提高细胞内GSH含量，在孵育3h即可观察 到明显的溶酶体逃逸现象。表明该Tsross通过溶酶体途径进入细胞，并在溶酶体弱酸性条 件及高GSH浓度环境中发生崩解及药物的释放，同时荧光基团的引入能够有效的实现整个 胞内途径的示踪。
[0158] 实施例18: TSPDSs体内成像效果评价
[0159] 1)体内成像
[0160] 选取4周龄的BALB/c雄性裸鼠，在其腋下接种2X 106个A549癌细胞，待其上肿瘤长 至100mm3左右，尾静脉注射TSPDSs，单次给药剂量为3.25mg Pt/kg/只，将小鼠用4%的水合 氯醛麻醉后，使用CRi Maestro EX活体成像仪，以675nm为激发波长，695nm为发射波长，在 注射前，及注射后lh，3h，6h进行活体成像研究。使用Maestro measurement software对成 像结果进行处理。
[0161] 结果如28所示，TSPDSs在给药后lh开始在肿瘤组织处富集，随着时间的增加， Tsross在肿瘤组织处富集量增大。表明Tsross能够通过增强肿瘤渗透及滞留（epr)效应在 肿瘤组织处富集，通过诊疗粒子的构建能够有效的将粒子在肿瘤组织处的富集过程可视 化，同时粒子在肿瘤组织处的富集能够有效的降低药物在其他组织的分布，从而降低药物 的毒副作用。
[0162] 2)离体成像
[0163] 2处后，将裸鼠处死并将心、肝、脾、肺、肾及肿瘤进行剥离，用?85(?!17.4)洗涤两 遍，置于CRi Maestro EX活体成像仪，以675nm为激发波长，695nm为发射波长进行成像研 究，小鼠尾静脉注射生理盐水的脏器最为对照。使用Maestro measurement software对成 像结果进行处理。
[0164] 结果如图29所示，TSPDSs在肿瘤处富集量最大，与活体成像结果一致。
[0165] 实施例19:TSPDSs体内抗肿瘤效果评价
[0166] 1)小鼠肿瘤体积变化及体重变化
[0167] 选取4周龄的BALB/c雄性裸鼠，在其右后腿上部接种2X 106个A549癌细胞，待其上 肿瘤长至100mm3左右，将老鼠随机分为4组(6只每组），分别尾静脉注射生理盐水，D+mPEG-K，商品化顺铂及TSPDSs，给药剂量为3.25mg Pt/kg/只，每三天给药一次，共给药4次，同时 进行肿瘤体积及小鼠体重的测量。每三天测量一次，共持续21天。
[0168] 肿瘤体积变化结果如图30所示，生理盐水及D+mPEG-K组肿瘤体积增长至初始肿瘤 的6倍左右，而商品化顺铂及TSPDSs组肿瘤体积仅增长至初始肿瘤的1.5倍左右，且TSH)S S 的治疗效果稍稍好于商品化顺铂。
[0169] 小鼠体重变化结果如图31所示，生理盐水及D+mPEG-K组小鼠体重变化不明显，到 治疗结束，小鼠体重稍稍上升。商品化顺铂组在第四次给药时，小鼠体重开始下降，体重仅 为初始体重的90%，第五次体重测量时，小鼠的体重下降至最低，仅初始体重的85%，整个 治疗结束，小鼠的体重未能恢复，仅为初始体重的87 %。而TSH)Ss组小鼠体重未见下降，且 小鼠体重有缓慢上升的趋势。
[0170] 2)肿瘤及脏器切组织学及免疫组化分析
[0171] 小鼠在完成21天治疗后，取其中三只断颈处死，剥离心肝脾肺肾及肿瘤，4%福尔 马林固定24h，石蜡包埋后切片，用苏木精伊红(H&E)染色进行组织病理学分析，用⑶31，Ki-67及TUNEL染色进行免疫组化分析。
[0172] 结果如图32所示，肿瘤组织的病理学及免疫组化结果显示，生理盐水组及D+mPEG-K组，小鼠肿瘤组织肿瘤细胞形态正常，且分布密实紧凑，而商品化顺铂及TSPDSs组的肿瘤 组织处肿瘤细胞明显变小，肿瘤组织疏松，不密实。通过⑶31对新生血管进行染色，Ki-67对 增殖细胞进行染色，及TUNEL对凋亡细胞进行染色，实验结果表明生理盐水及D+mPEG-K组新 生血管，增殖细胞很明显，而凋亡的细胞较少。TSPDSs组小鼠肿瘤组织的新生血管及增殖的 细胞明显减少，同时凋亡的细胞明显增多。这一结果显示，TSPDSs能够有效的杀伤癌细胞， 抑制新生血管的生成及癌细胞的增殖，同时引起癌细胞的凋亡。
[0173] 对心肝脾肺脏器进行H&E染色分析，结果如图33显示，生理盐水，D+mPEG-K及 TSPDSs组对小鼠的心肝脾肺四个脏器无明显影响，商品化顺铂对小鼠的心脾肺无明显影 响，但肝组织处干细胞的形态出现不正常，表明商品化顺铂对肝组织有一定的损伤。对肾脏 进行H&E染色剂TUNEL染色分析，结果如图34所示，生理盐水，D+mPEG-K及TSH)Ss组小鼠的肾 脏形态正常，而商品化顺铂组小鼠的肾脏出现明显的病变，如肾小球的肿胀，边缘糊化，同 时出现肾脏细胞的凋亡。
[0174]以上结果表明，通过整合纳米技术能够有效的进行癌症治疗其效果与商品化顺铂 相当，减少小分子药物对正常组织产生的毒性从而降低药物的毒副作用。
[0175] 3)生化指标分析
[0176] 小鼠在完成21天治疗后，每组取三只，眼球取血至肝素管中，3000rpm离心15min， 分离得到血清进行血尿素氮及肌酐含量测定。
[0177] 结果如图35所示，血尿素氮及肌酐表征肾的生理机能，商品化顺铂组血尿素氮及 肌酐两项指标均高于其他三组，表明商品化顺铂对于肾脏有相应的毒副作用，也正是铂类 药物对肾脏的毒性限制着其在临床上的应用。
[0178] 实施例20: TSPDSs药代动力学分析
[0179] 选取4周龄BALB/c雄鼠，商品化顺铂及TSPDSs进行尾静脉单次给药，给药剂量为 3.25mg Pt/kg/只，在给药后特定的时间点(0.05h，0.5h，lh，6h和12h)对小鼠进行眼球取血 lmL，样品用H2〇2和HN〇3进行消解后定容成5mL水溶液，ICP-MS测定样品中Pt的含量。设置三 个平行样。
[0180] 结果如图36所示，0.05h时，商品化顺铂组Pt的血药浓度仅13yg/mL左右，0.5h时， 血液中Pt的浓度已趋近于0，而TSroSs组在0.05h时，血液中Pt的浓度约为100yg/mL，6h时， Pt的浓度约为10yg/mL，表明TSroSs能够有效的增加药物的半衰期，增长药物在血液中的滞 留时间。
[0181] 实施例21: TSPDSs组织分布分析
[0182] 选取4周龄的BALB/c雄性裸鼠，在其右后腿上部接种2 X 106个A549癌细胞，待其上 肿瘤长至100mm3左右，商品化顺铂及TSPDSs进行尾静脉单次给药，给药剂量为3.25mg Pt/ kg/只，在给药后2h和12h后将小鼠处死，剥肾和肿瘤，记录重量后，用H2O2和HN〇3进行消解后 定容成5mL水溶液，ICP-MS测定样品中Pt的含量。设置三个平行样。
[0183] 结果如图37所示，2h和12h时，商品化顺铂组药物在肾组织处的量大于其在肿瘤处 的量。而TSPDSs组，药物在肿瘤组织处的量明显大于其在肾脏处的量，同时随着时间的增 长，药物在肿瘤组织处的量会明显增加。
【主权项】
1. 一种生物响应型诊疗一体化的肤类树状大分子组装体，其特征在于，包括肤类树状 大分子体系和抗肿瘤药物前驱体;所述肤类树状大分子体系包括肤类树状大分子和成像分 子，肤类树状大分子包括可逆化学键和簇基，成像分子包括可逆化学键或能与可逆化学键 反应的官能团，成像分子引发肤类树状大分子交联，形成肤类树状大分子体系;所述抗肿瘤 药物前驱体由抗肿瘤药物经过物理或化学处理制得，抗肿瘤药物前驱体和肤类树状大分子 体系通过弱相互作用形成自组装单元。2. 根据权利要求1所述的肤类树状大分子组装体，其特征在于，所述肤类树状大分子为 一代肤类树状大分子、二代肤类树状大分子或Ξ代肤类树状大分子，优选为Ξ代肤类树状 大分子。3. 根据权利要求1所述的肤类树状大分子组装体，其特征在于，所述肤类树状大分子为 扇形肤类树状大分子。4. 根据权利要求3所述的肤类树状大分子组装体，其特征在于，所述扇形肤类树状大分 子的外围包括簇基，扇形肤类树状大分子的核屯、分子包括可逆化学键，内核具有疏水性;所 述扇形肤类树状大分子的结构式如下： 式1其中，扣和Rm-起构成扇形肤类树状大分子的核屯、分子，m代表核屯、分子的官能度，m为！ 或2;E为谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，组氨酸中的至少一种;D为酸性 氨基酸;G1.0、G2.0和G3.0分别代表一代肤类树状大分子、二代肤类树状大分子和Ξ代肤类 树状大分子。5. 根据权利要求4所述的肤类树状大分子组装体，其特征在于，所述可逆化学键抑敏感 化学键、氧化还原敏感化学键、活性氧(ROS)敏感化学键或酶敏感化学键。6. 根据权利要求1所述的肤类树状大分子组装体，其特征在于，所述抗肿瘤药物采用亲 水性抗肿瘤药物，其结构式如下： 式3其中，K为碱性氨基酸;化为亲水高分子聚合物;Μ为金属原子。7. 根据权利要求6所述的肤类树状大分子组装体，其特征在于，所述亲水高分子聚合物 R2为聚乙二醇、聚乙二醇单甲酸和聚乙締醇中任意一种。8. -种生物响应型诊疗一体化的肤类树状大分子组装体的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤： 1) 制备肤类树状大分子； 2) 制备成像分子； 3) 将成像分子加入肤类树状大分子的水溶液中，成像分子引发肤类树状大分子的交 联，制备肤类树状大分子体系； 4) 抗肿瘤药物的负载。9. 根据权利要求8中所述的肤类树状大分子组装体的制备方法，其特征在于，所述抗肿 瘤药物的负载包括W下步骤： 疏水性抗肿瘤药物的装载:将肤类树状大分子体系与疏水性抗肿瘤药物共溶于少量溶 剂中，于超声条件下缓慢滴加至大量去离子水中，超声lOmin后，室溫下揽拌2地，浓缩，过 滤，滤液冻干，即可得到负载疏水性抗肿瘤药物的肤类树状大分子组装体； 亲水性抗肿瘤药物的装载:将亲水性抗肿瘤药物于水中活化制备抗肿瘤药物前驱体， 将抗肿瘤药物前驱体滴加至肤类树状大分子体系的水溶液中，室溫反应24h后，浓缩，透析 冻干，即可得到负载亲水性抗肿瘤药物的肤类树状大分子组装体。10. 根据权利要求9中所述的肤类树状大分子自组装体的制备方法，其特征在于，所述 亲水性抗肿瘤药物的制备包括W下步骤： 1) 称取氨基保护的碱性氨基酸（In当量），亲水高分子聚合物（In当量），缩合剂（1.2n当 量)和催化剂（1.化当量），在〇°C，氮气保护下，加入到无水溶剂中；再往W上混合溶液中加 入有机碱(4n当量），室溫条件下反应，反应结束后的溶液经洗涂、干燥、过滤、减压浓缩，经 过柱层析分离得到带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物； 2) 准确称取带有保护基团的碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物（In当量），加入溶剂 溶解后，再加入脱保护试剂(20η当量），在氮气保护下室溫反应，脱除保护后，减压浓缩，通 过萃取或沉淀处理得到碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物； 3) 称取抗肿瘤药物（In当量），碱性氨基酸修饰的亲水高分子聚合物（In当量)于室溫条 件下反应24h，浓缩透析得到亲水性抗肿瘤药物。
【文档编号】A61K45/06GK105833294SQ201610282064
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】顾忠伟, 徐翔晖, 李芸焜, 李亚超, 张晓 , 张志军
【申请人】四川大学