一种石蒜生物碱靶向缓释制剂及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种石蒜生物碱靶向缓释制剂及其制备方法和用途。本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂是由石蒜生物碱、丙炔酰化壳聚糖和具有叠氮探针的低密度脂蛋白组成，三者的摩尔比为1:(0.1～1):(0.1～2)。本发明选取血脑屏障内皮细胞的LDL受体作为传输石蒜生物碱来治疗AD的靶点，以生物相容性很好的壳聚糖作为药物载体材料，研制低毒高效的石蒜生物碱纳米脑靶向制剂，填补了目前石蒜生物碱作为AD治疗药物的临床应用前研究的一些空白。
【专利说明】
一种石蒜生物碱靶向缓释制剂及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种石蒜生物碱靶向缓释制剂及其制备方法 和用途。
【背景技术】
[0002] 老年性痴呆(Alzheimer ' s disease， AD)是一种以记忆缺损和认知障碍为主要临 床表现的老年性神经退行性疾病，其病理特征为细胞外淀粉样肽(0-Amyloid peptide，A0) 大量沉积为主的老年斑（Seni 1 eplaques，SP)、细胞内磷酸化的tau蛋白为主的神经纤维缠 结(Neurofibri 1 lary tangles，NFT)和胆碱能神经元为主的中枢神经细胞的大量变性和丢 失。虽然AD的发病机制尚未完全阐明，但胆碱能假说和AP假说最受关注。
[0003] 目前，AD药物治疗尤其是改善认知功能的药物仍以抗乙酰胆碱酯酶制剂为主，已 有几种合成药物，例如他克林(tacrine)，多奈哌齐(donepezil)和基于天然产物的卡巴拉 汀(rivastigmine)被用来治疗由AD引起的认知功能障碍和记忆力减退，从中草药石蒜中提 取的加兰他敏和其他的石蒜生物碱也被证实具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用。但这些化合物 引起胃肠道紊乱、肝脏和全身毒副作用大及存在生物利用度低问题。因此，研究人员必须在 自然资源中寻找更好的乙酰胆碱酯酶抑制剂和其他抗痴呆药物。
[0004] 石蒜（Lycoris Herb?)属于单子叶植物纲石蒜科(Amaryllidaceae)植物，有20多 种，主要分布于亚洲，在我国石蒜有16种(含2变种），其中有12种为世界上特有种。在我国的 石蒜资源主要处于野生状态，分布于长江流域至华东、华南、西南、西北地区等16个省区； 其分布区域无论是经炜度还是海拔高度都相当广泛，其分布区内气候和土壤条件差异很 大，可见石蒜类植物对环境的适应能力强。
[0005] 力可拉敏是一种石蒜生物碱，又称石蒜胺碱。片状结晶（丙酮），易溶于水，溶于乙 醇，其盐易水解。存在于石蕊科植物石蒜（Lycoris radiate Herb)的鳞茎，紫花石蕊 (L. squamigera Maxim)的鳞莖，铁色箭(L. sanguinea Maxim.)的鳞莖。有抑制胆碱酯酶的 作用，对中枢性M-及N-胆碱能受体有兴奋作用。
[0006] 迄今为止，对力可拉敏的药理，特别是胆碱酯酶的抑制作用国内外都有了些研究； 此外，从石蒜资源中提取、或者化学合成方面的研究开展的比较多;并研究了含量的测量方 法，有高效液相色谱法、气相色谱-质谱法、流动注射化学发光法、薄层层析及纸层析鉴别法 和紫外分光光度法。
[0007] 研究表明：石蒜多种生物碱均具有胆碱酯酶抑制作用，其中加兰他敏已在美国等 多个国家被批准用于老年性痴呆的治疗，但其体内分布广泛、存在较多的外周副作用，特别 是西方国家报道有增加中老年人死亡的风险，因而临床使用受限。石蒜三种主要生物碱加 兰他敏、石蒜碱、力可拉敏中，除加兰他敏外，其他生物碱尚无用于老年性痴呆的研究。而对 于如何增强力可拉敏血脑屏障通透性与脑靶向性、提高生物利用度、降低其毒副作用的研 究尚属罕见。本发明基于低密度脂蛋白（LDL)受体为靶点，进行力可拉敏脑靶向纳米药物的 脑靶向研究，来填补这一空白，为力可拉敏的临床应用提供一定的研究基础。
[0008] 血脑屏障（blood-brain barrier，BBB)的存在对脑组织形成有效保护，避免有害 物质（如毒素和病毒等）的侵害，但也阻碍许多治疗药物进入脑部病灶区，如抗癌药、抗生 素和大分子物质(肽类)等。如何使药物有效透过血脑屏障进入脑内成为药物发挥治疗作用 的关键环节。目前解决这一难题的方法有:制备前体药物、打开血脑屏障紧密结构或使用载 体系统如抗体、脂质体、纳米粒等。
[0009] 纳米粒载体由一些多聚体颗粒制备而成，药物可通过吸附、包裹或共价结合等方 式结合到纳米粒表面，形成载药纳米粒。载体体系递送至靶组织后，药物通过解吸、扩散以 及纳米粒降解等机制释放;载药纳米粒经过表面修饰后，可避免网状内皮系统吞噬，使药物 有效透过血脑屏障，提高药物的脑内浓度。
[0010] Kreuter提出载药纳米粒透过血脑屏障的可能机制为：（1)脑血管内皮细胞可通过 胞吞作用携带纳米粒，使药物扩散入脑；（2)吸附于脑毛细血管壁，延长药物在毛细血管壁 的滞留时间并提高血管内外药物的浓度梯度，从而通过被动扩散促进药物通过血管内皮进 入脑内；（3)纳米粒表面活性剂聚山梨酯-80能够抑制高效外排栗的作用，尤其是抑制P-糖 蛋白（P-glycoprotein，P-gp)的外排作用，从而延长药物活性；（4)使血脑屏障的紧密连接 开放，从而使药物入脑；（5)通过跨膜方式透过血脑屏障并释放药物入脑；（6)纳米粒表面活 性物质可提高血管内皮细胞膜脂质的溶解度，使膜流动性增加，提高血脑屏障对药物的通 透性。
[0011] 目前，细胞胞吞作用是研究最多，也是载药纳米粒入脑最有可能的机制。它包括受 体介导的胞吞作用和吸附介导的胞吞作用。关于受体介导的胞吞作用，如胰岛素受体、叶酸 受体及转铁蛋白受体等受关注。由于某些转运体在脑内皮细胞上也呈高表达，其本身可允 许一些重要的营养物质进入脑内，维持脑中内环境稳定，故可通过这些转运体使靶向治疗 药物入脑。目前相关的研究报道有葡萄糖转运体、胆碱转运体等，载药纳米粒可与其结合透 过血脑屏障到达脑内。
[0012] 目前关于纳米技术在AD上的应用，主要是诊断和从氧化应激方面用金属缀合物纳 米颗粒进行治疗AD。采用纳米技术从抑制AchE来治疗AD的报道很少，2008年Wilson等人利 用1%聚山梨酯-80包裹聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒来传输卡巴拉汀用于治疗AD，发现卡 巴拉汀的脑内浓度比无载体的情况下高出3.82倍。因此，对高效负载药物且具有脑靶向性 的载体进行的研究是目前欠缺而又具有研究意义和应用价值的科学研究。
[0013]在体外血脑屏障模型中，Dehouck等研究发现对比乙酰化LDL，酰化前的LDL能够被 模型的细胞层胞吞。这一过程能够被C7单克隆抗体阻断，说明该过程与LDL受体有关。而且 Dehouck等发现胞吞量与LDL受体表达的上调成正比。Kreuter等推测纳米粒经包裹聚山梨 酯后，血浆中ApoE吸附到纳米粒表面(ApoE通常只吸附于被表面活性剂包被的纳米粒)并与 血脑屏障内皮细胞的低密度脂蛋白（LDL)受体作用后，被脑内皮细胞识别和摄取，随后药物 在内皮细胞中释放，并扩散至脑组织。Michaelis等和Kim等近几年的先后研究也证实了这 个假说。因此，我们选取血脑屏障内皮细胞的LDL受体作为传输力可拉敏来治疗AD的靶点。 希望能够通过LDL与其受体的特异性结合将力可拉敏靶向性输送到脑内，高效治疗AD。
[0014]脂蛋白是指一类由类脂体与蛋白构成的大分子聚集体。其外形近乎球形，组成包 含类脂体(甘油三酯和胆固醇酯）构成的核心、磷脂膜和嵌在膜上的未酯化胆固醇与蛋白。 机体可将疏水性的营养物质通过脂蛋白运送给细胞。载酯蛋白ApoB-100是LDL上唯一的蛋 白，LDL上能被LDL受体识别的配体。
[0015] LDL被视为脂质体的天然搭档，具有脂质核心，可被应用于药物载体的研究中。LDL 作为靶向因子在肿瘤诊断（负载显影剂）、抗肿瘤药物和基因载体等领域得到过应用。如法 国Paul Sabatier大学Francoise Nepveu研究小组提出将与In络合的分子中接上一段疏水 链段，将疏水链段作为"铆钉"插入LDL的磷脂单分子层，达到靶向输送In造影剂到癌细胞以 增强造影效果的目的。美国Pennsylvania大学Rong Zhou研究小组利用该方法制备了LDL介 导靶向Gd造影剂，并用活体实验进一步证实了这种靶向造影剂造影增强效果。
[0016] 尽管用途不同，但是根据治疗因子与LDL复合物形成的方法，认为这些研究主要分 为两种类型：1:治疗因子通过疏水链插入LDL磷脂层，从而"锚定"在LDL表面上（"铆钉法"； 2:萃取LDL的类脂体再用脂溶性的药物重组LDL( "重组法"）。
[0017]含疏水侧链的大分子同样存在"嵌入"LDL可能。Jin-Seok Kim等人研究了由带硬 脂基侧链的聚赖氨酸/LDL/DNA所形成的"Terplex"体系作为DNA载体的应用。体系间主要是 通过疏水聚赖氨酸、LDL和质粒DNA之间的电荷/疏水力平衡达到稳定，在组成比合适的情况 下并不会发生沉淀。这一体系对平滑肌A7R5细胞的转染率甚至超过了Lipofectin相当（高 出2.2倍），在实验中发现"Terplex"的胞吞是经由LDL受体介导的。进一步的实验结果表明， 在不同细胞系（CCD-32LU成纤维细胞)这一体系仍然可以被用作DNA载体。然而需要注意的 是，聚合物与LDL之间的比例非常重要，否则会造成聚合物完全覆盖LDL。
[0018] "重组法"是将LDL中心的胆固醇脂萃取出来，再把药物填入LDL的磷脂单分子层空 壳中，这种"重组法"弊端是工序繁琐，蛋白质收率不高，且整个过程可能会破坏LDL的结构， 而且要求对亲水药物进行疏水改性。
[0019]以上研究结果显示LDL作为靶向因子的作用主要是LDL表面的载酯蛋白在发挥作 用，而如何保护载酯蛋白ApoB-100使其充分暴露在细胞膜受体表面也是LDL实现靶向的关 键。
[0020]因此，本发明提出一个新的方法来实现LDL对力可拉敏的高效负载，并尽可能保护 载酯蛋白使其充分暴露在LDL表面从而实现靶向功能。这一过程分为两步:首先是利用带有 叠氮功能基团的小分子疏水探针插入LDL，实现对LDL表面的修饰。用体积比较小的分子对 LDL表面进行修饰，可能增大LDL的负载量，增强复合物的稳定性。第二步则是通过含炔基的 药物载体特异性的化学反应与疏水探针键合，从而将药物锚定在LDL表面。这种方法可以同 时解决"铆钉法"药物负载率较低和"重组法"的LDL易于失活的不足。
[0021]此外，由于力可拉敏为水溶性的药物，LDL无法通过脂蛋白将其运送给细胞。所以 本项目设计合成高效、两亲性、含炔基的丙炔酰化壳聚糖，并建立丙炔酰化壳聚糖在LDL表 面发生点击化学反应的温和方法，从而形成LDL为疏水端的两亲性分子，通过自组装将亲水 的药物力可拉敏包裹在其中，保护载酯蛋白ApoB-100使其充分暴露在细胞膜受体表面，制 备力可拉敏靶向纳米载体。
[0022] 壳聚糖，1，4_2_氨基-2-脱氧-0-D-葡萄糖，由广泛分布于自然界甲壳纲动物虾蟹 的甲壳素脱乙酰化而得，是一种天然阳离子聚合物。壳聚糖的分子中存在着羟基、氨基、乙 酰氨基，能进行一系列的化学修饰，制成具有各种特性的衍生物。
[0023] 壳聚糖及其衍生物作为一种天然有机高分子，具有独特的生物学特性。这种生物 学特性来自于其壳聚糖的聚阴离子特征及溶液中的高电荷密度。壳聚糖可生物降解，具有 良好的生物兼容性，壳聚糖兼有高等动物组织中胶原质和高等植物组织中纤维素两者的生 物功能，对动植物具有良好的适应性，可以与生物体在细胞水平上进行亲和作用，大大减少 了抗原出现的机会。无口服毒性，壳聚糖典型的葡萄糖基结构单元，与体内存在的无毒氨基 葡萄糖结构类似，作为人体服用的材料是安全的。目前，美国和日本已经允许少量壳聚糖添 加到食品中。此外，壳聚糖还具有良好的生物黏附性、凝结能力和免疫刺激活性。基于以上 种种优良的生物特性，近年来，壳聚糖作为一种新型的药物载体，在各种给药系统中得到了 广泛的应用。
[0024]已有几种合成药物，例如他克林（丨3〇1'；[116)，多奈哌齐((10116口62；[1)和基于天然产 物的卡巴拉汀(rivastigmine)被用来治疗由AD引起的认知功能障碍和记忆力减退时会引 起胃肠道紊乱、肝脏和全身毒副作用大及存在生物利用度低等问题。因此，必须在自然资源 中寻找更好的乙酰胆碱酯酶抑制剂和其他抗痴呆药物。
[0025]石蒜多种生物碱均具有胆碱酯酶抑制作用，其三种主要生物碱加兰他敏、石蒜碱、 力可拉敏中，除加兰他敏外，其他生物碱尚无用于老年性痴呆的研究。加兰他敏已在美国等 多个国家被批准用于老年性痴呆的治疗，但其体内分布广泛、存在较多的外周副作用，特别 是西方国家报道有增加中老年人死亡的风险，因而临床使用受限。
[0026] 此外，血脑屏障的存在限制了它们应用于临床。目前解决药物有效透过血脑屏障 的方法有：制备前体药物、打开血脑屏障紧密结构或使用载体系统如抗体、脂质体、纳米粒 等。前体药物存在改变药性、引入毒性的风险而打开血脑屏障紧密结构有可能引入其他有 害物质。
[0027] 本发明选取血脑屏障内皮细胞的LDL受体作为传输石蒜生物碱来治疗AD的靶点， 以生物相容性很好的壳聚糖作为药物载体材料，研制低毒高效的石蒜生物碱纳米脑靶向制 剂。其目的是增强石蒜生物碱的脑靶向性、增强疗效、降低其毒副作用，并提高其生物利用 度。
【发明内容】
[0028] 目前国内外关于石蒜生物碱脑靶向制剂的研究非常罕见，本发明从降低有效成分 的毒性，提高有效成分的脑靶向性和缓释性出发，研究适用于老年性痴呆治疗的石蒜生物 碱靶向缓释制剂。
[0029]本发明采用如下技术方案：
[0030] 本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂是由石蒜生物碱、丙炔酰化壳聚糖和具有叠氮 探针的低密度脂蛋白组成，三者的摩尔比为1: (〇. 1~1): (〇. 1~2)。
[0031] 优选:石蒜生物碱、丙炔酰化壳聚糖和具有叠氮探针的低密度脂蛋白的摩尔比为1 :0?5:1?5〇
[0032] 本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂的制备方法是：
[0033] 通过点击化学反应在20_60°C的条件下丙炔酰化壳聚糖上的炔基与具有叠氮探针 的低密度脂蛋白上的叠氮发生反应2-24小时后合成LDL靶向端作为疏水端的两亲性分子， 该分子与石蒜生物碱自组装形成LDL靶向端裸露在外面的石蒜生物碱纳米脑靶向制剂。
[0034] 作为一种天然多糖，壳聚糖具有生物相容性好，可生物降解等特点，特别适合于药 物载体。然后限制其应用的主要问题是水溶性较差，需要在酸性介质中才能溶解。因此本发 明中，首先利用高碘酸盐对壳聚糖进行氧化处理，得到了不同分子量、壳聚糖链上含有邻二 醛功能基团的，大大提高了其水溶性。
[0035] 在高碘酸盐氧化后，CS-CH0的水溶性大幅度提高，可以很好地溶解于去离子水中， 因此可以在均相介质中对其进行修饰。采用NHS活化羧基，EDC盐酸盐作为缩合剂，在水介质 中进行"一锅煮"的反应。所有反应物和产物均溶于水，小分子杂质可以在透析中除去。
[0036] 所述的丙炔酰化壳聚糖的合成路线如下：
[0037] (1)醛化壳聚糖(CS-CH0)的合成：
[0039] (2)丙炔酰化壳聚糖(PA-CS-CH0)的合成：
[0041 ]所述合成方法的具体步骤如下：
[0042] (1)醛化壳聚糖(CS-CH0)的合成：
[0043]氮气气氛下，壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液与高碘酸钾以合适的比例4°C下搅拌 反应24~48h后，然后向溶液中加入适量的乙二醇溶液来中止反应，产物经旋转蒸发浓缩后 分别在NaCl水溶液和去离子水中透析以除去杂质，最后产物冷冻干燥，备用。其中，所述壳 聚糖、醋酸-醋酸钠缓冲溶液、高碘酸钾、乙二醇之间的摩尔体积比为1: (1~5): (0.1~1): (0.1~1)〇
[0044] (2)丙炔酰化壳聚糖(PA-CS-CH0)的合成：
[0045] 在氮气保护下，丙炔酸水溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后逐滴滴入 CS-CH0水溶液中，搅拌均匀后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCL)，醛化壳聚糖、丙炔酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐 酸盐的摩尔比为1: (1~4): (1~3): (1~3)混合物反应10~72h后，转移至透析袋中，在 NaCl水溶液和去离子水中透析除去未反应的小分子，冷冻干燥得到产物，备用。
[0046] 所述的具有叠氮探针的低密度脂蛋白的合成方法的具体步骤如下：
[0047] (1)叠氮探针的合成：
[0048] 合成路线如下：
[0050] a，2-( 2-氨基乙氧基）乙醇，1N的HBTU和HOBt，在DMF溶液中室温反应24小时；b， TsCl，吡啶;c，1.2N氮化钠，吡啶
[0051 ] (1 ? 1 )Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇H(NHEP)的合成：
[0052] 棕榈酸、羟基乙氧基乙胺和三乙胺在氮气气氛下，加入二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶 解，置入冰浴中，冷却后加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N入屮-四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt )，室温反应，薄层层析确定反应终点，反应物溶液逐滴滴 入搅拌中的冷水中，用氯仿萃取，收集到的氯仿溶液依次用柠檬酸溶液，碳酸氢钠溶液，饱 和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后旋蒸去氯仿得到粗产物，粗产物在乙醇中重结晶纯 化，真空干燥，干燥器保存;其中，所述棕榈酸、2-(2_氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰 胺、苯并三氮唑-N，N，Y，M -四甲基脲六氟磷酸盐和N-羟基苯并三氮唑的摩尔比为1: (1~ 1.5):(1~3):(1~5):(1~4.5):(1~6)。
[0053] (1.2)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇Ts(PEMBS)的合成：
[0054] NHEP溶于氯仿中，加入吡啶，降温后，加入对甲基苯磺酰氯，回复至室温，搅拌过 夜，薄层层析确定反应终点，产物滴入盐酸溶液中，离心出去上清液后得到产物，产物分别 用盐酸和水冲洗，在室温下真空干燥，干燥器储存;其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、对甲基苯磺 酰氯的摩尔比为1:(1~6): (4~5.6): (1~1.4)。
[0055] (1.3)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2N3(NAEP)的合成：
[0056] PEMBS在氮气保护下溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入叠氮钠(NaN3)，缓慢加热，回 流10~72h后降至室温，产物溶液在搅拌中滴入冰水中，过滤，用水反复冲洗滤饼后，室温真 空干燥，通过柱层析纯化得到最终产物，在室温下真空干燥，干燥器储存。其中，所述PEMBS、 二甲基甲酰胺、叠氮钠的摩尔比为1:(1~5): (4~5.6)。
[0057] (2)LDL的探针标记：
[0058] 采用密度梯度法从人血浆中提取LDL，NAEP与LDL在共溶溶剂中混合，通过自组装 反应得到表面具有叠氮探针的LDL (NAEP-LDL，标记为N3-LDL)。
[0059] 所采用的壳聚糖为聚合物，故其分子量的范围可为0.4-2万g/mol;
[0060] 固定在LDL的磷脂层中叠氮探针的脂肪酸的烷基的碳链长度为10-16个碳原子。 [0061 ]本发明的方法具有以下特点：
[0062] (1)选择生物相容性好，可生物降解的壳聚糖作为药物载体，且利用高碘酸盐对壳 聚糖进行氧化处理，解决壳聚糖水溶性较差的主要问题。
[0063] (2)以具有十六烷基的棕榈酸作为"探针"固定在LDL的磷脂层中，并引入了一个单 缩二乙二醇单元作为"spacer"，来防止功能基团一一叠氮端基被完全埋入LDL中而失去反 应性。
[0064] (3)设计合成形成LDL为疏水端的两亲性分子，通过自组装将亲水的药物包裹在其 中，解决LDL负载亲水的药物无法通过脂蛋白将其运送给细胞的问题。
[0065] 本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂可以用于治疗老年性痴呆。
[0066]本发明的积极效果如下：
[0067] 本发明选取血脑屏障内皮细胞的LDL受体作为传输石蒜生物碱来治疗AD的靶点， 以生物相容性很好的壳聚糖作为药物载体材料，研制低毒高效的石蒜生物碱纳米脑靶向制 剂，填补了目前石蒜生物碱作为AD治疗药物的临床应用前研究的一些空白。与已有的合成 药物相比：
[0068] 1、本发明中由天然药物石蒜生物碱以及可生物降解的壳聚糖载体制备的纳米脑 靶向制剂的毒性低，在靶向穿透血脑屏障的同时不会改变药物的药性和引入其他有害物 质；
[0069] 2、石蒜生物碱通过纳米脑靶向制剂更加集中地分布在脑内，生物利用度得到提 尚。
[0070] 3、本发明采用的药物负载在LDL上的新方法，同时解决"铆钉法"药物负载率较低 和"重组法"的LDL易于失活的不足。
【具体实施方式】
[0071] 下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0072] 实施例1
[0073] 本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂是由石蒜生物碱、丙炔酰化壳聚糖和具有叠氮 探针的低密度脂蛋白组成，三者的摩尔比为1:0.5:1.5。
[0074]本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂的制备方法是：
[0075]通过点击化学反应在室温的条件下丙炔酰化壳聚糖上的炔基与具有叠氮探针的 低密度脂蛋白上的叠氮发生反应24小时后合成LDL靶向端作为疏水端的两亲性分子，该分 子与石蒜生物碱自组装形成LDL靶向端裸露在外面的石蒜生物碱纳米脑靶向制剂。
[0076]作为一种天然多糖，壳聚糖具有生物相容性好，可生物降解等特点，特别适合于药 物载体。然后限制其应用的主要问题是水溶性较差，需要在酸性介质中才能溶解。因此本 发明中，首先利用高碘酸盐对壳聚糖进行氧化处理，得到了不同分子量、壳聚糖链上含有邻 二醛功能基团的，大大提高了其水溶性。
[0077]在高碘酸盐氧化后，CS-CH0的水溶性大幅度提高，可以很好地溶解于去离子水中， 因此可以在均相介质中对其进行修饰。采用NHS活化羧基，EDC盐酸盐作为缩合剂，在水介质 中进行"一锅煮"的反应。所有反应物和产物均溶于水，小分子杂质可以在透析中除去。
[0078] 所述的丙炔酰化壳聚糖的合成路线如下：
[0079] (1)醛化壳聚糖(CS-CH0)的合成：
[00811 (2)丙炔酰化壳聚糖(PA-CS-CH0)的合成：
[0083]所述合成方法的具体步骤如下：
[0084] (1)醛化壳聚糖(CS-CH0)的合成：
[0085] 氮气气氛下，壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液与高碘酸钾以1:0.2的比例4°C下搅 拌反应48h后，然后向溶液中加入0.2倍壳聚糖摩尔量的乙二醇溶液来中止反应，产物经旋 转蒸发浓缩后分别在NaCl水溶液和去离子水中透析以除去杂质，最后产物冷冻干燥，备用。 [0086] (2)丙炔酰化壳聚糖(PA-CS-CH0)的合成：
[0087] 在氮气保护下，丙炔酸水溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后逐滴滴入 CS-CH0水溶液中，搅拌均匀后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCL)，醛化壳聚糖、丙炔酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐 酸盐的摩尔比为1: 2: 2:1混合物反应48h后，转移至透析袋中，在NaCl水溶液和去离子水中 透析除去未反应的小分子，冷冻干燥得到产物，备用。
[0088]所述的具有叠氮探针的低密度脂蛋白的合成方法的具体步骤如下：
[0089] (1)叠氮探针的合成：
[0090] 合成路线如下：
[0092] a，2-( 2-氨基乙氧基）乙醇，1N的HBTU和HOBt，在DMF溶液中室温反应24小时；b， TsCl，吡啶;c，1.2N氮化钠，吡啶
[0093] (1 ? l)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇H(NHEP)的合成：
[0094] 棕榈酸、羟基乙氧基乙胺和三乙胺在氮气气氛下，加入二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶 解，置入冰浴中，冷却后加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N入屮-四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt )，室温反应，薄层层析确定反应终点，反应物溶液逐滴滴 入搅拌中的冷水中，用氯仿萃取，收集到的氯仿溶液依次用柠檬酸溶液，碳酸氢钠溶液，饱 和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后旋蒸去氯仿得到粗产物，粗产物在乙醇中重结晶纯 化，真空干燥，干燥器保存;其中，所述棕榈酸、2-(2_氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰 胺、苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N-羟基苯并三氮唑的摩尔比为1:1:2:3 :2.5:4〇
[0095] (1.2)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇Ts(PEMBS)的合成：
[0096] NHEP溶于氯仿中，加入吡啶，降温后，加入对甲基苯磺酰氯，回复至室温，搅拌过 夜，薄层层析确定反应终点，产物滴入盐酸溶液中，离心出去上清液后得到产物，产物分别 用盐酸和水冲洗，在室温下真空干燥，干燥器储存;其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、对甲基苯磺 酰氯的摩尔比为1:4:5:1。
[0097] (1.3)Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2N3(NAEP)的合成：
[0098] PEMBS在氮气保护下溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入叠氮钠(NaN3)，缓慢加热，回 流48h后降至室温，产物溶液在搅拌中滴入冰水中，过滤，用水反复冲洗滤饼后，室温真空干 燥，通过柱层析纯化得到最终产物，在室温下真空干燥，干燥器储存。
[0099] (2)LDL的探针标记：
[0100]采用密度梯度法从人血浆中提取LDL，NAEP与LDL在共溶溶剂中混合，通过自组装 反应得到表面具有叠氮探针的LDL(NAEP-LDL，标记为N3-LDL)。
[0101] 实施例2
[0102] 本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂是由石蒜生物碱、丙炔酰化壳聚糖和具有叠氮 探针的低密度脂蛋白组成，三者的重量比或摩尔比为1:1:1.5。
[0103] 其他同实施例1。
[0104] 实施例3
[0105] 本发明的石蒜生物碱靶向缓释制剂是由石蒜生物碱、丙炔酰化壳聚糖和具有叠氮 探针的低密度脂蛋白组成，三者的重量比或摩尔比为1:1: 2。
[0106] 其他同实施例1。
[0107] ( - )纳米脑靶向制剂药物释放规律和体系降解机理的研
[0108] 将纳米脑靶向制剂的溶液转移至透析袋中，在ros溶液(pH = 7.4)中于37 ± 1°C的 电热恒温振荡水槽中透析。在不同的透析时间点取透析液，以加兰他敏为对照品，分别采用 高效液相法和紫外分光光度法对透析液中石蒜生物碱的含量进行测定。以时间为横轴和生 物碱含量为纵轴绘制释放曲线，研究脑靶向制剂的组成、粒径和形态对药物释放的影响，揭 示释放规律。
[0109] 将纳米脑靶向制剂的溶液转移至透析袋中，在ros溶液(pH = 7.4)中于37 ± 1°C的 电热恒温振荡水槽中透析。在不同的透析时间点取一定量的透析液，进行相关的测定，计算 出透析液中制备脑靶向制剂的原材料的含量，推算出脑靶向制剂材料的降解率，探讨降解 机理。
[0110] (二)纳米脑靶向制剂的安全性(细胞毒性以及急性毒性）
[0111] 将载药体系分五组分别进行体外细胞实验:①空白对照组;②石蒜生物碱原药;③ 空白载体PA-CS-CH0;④未组装LDL的负载石蒜生物碱的纳米粒;⑤组装LDL后的负载石蒜生 物碱体系。
[0112] 采用MTT法进行对各实验组的细胞毒性测定；急性毒性试验:取健康小白鼠，每组 10只，将各实验组灌胃给药，观察小鼠的毒性反应与死亡率，Bliss法计算LD 50。
[0113 ](三)纳米脑革巴向制剂的体外及体内的焚光分析
[0114]对石蒜生物碱、鼠脑血管内皮细胞和LDL分别以不同的荧光试剂标记，研究不同载 体结构、载药量及浓度的药物纳米脑靶向制剂在体外培养的鼠脑血管内皮细胞体系及动物 体内的靶向效果。
[0115](四）纳米脑靶向制剂通过血脑屏障的评价
[0116]将载药体系分三组分别进行抑制乙酰胆碱酯酶率的检测:①石蒜生物碱原药;② 未组装LDL的负载石蒜生物碱的纳米粒;③组装LDL后的负载石蒜生物碱体系。进行以下研 究来考察通过血脑屏障的效果。
[0117] 1)对体外血脑屏障模型的检测
[0118] DeBauh和Cane i 1 la首次报道了部分丧失的屏障特性可以经由血管内皮细胞同星 形胶质细胞联合培养的方式再诱导，而且有实验证明星形胶质细胞对于诱导内皮细胞，维 持血脑屏障特性有着非常重要的作用。
[0119] 本课题应用共培养鼠脑血管内皮细胞和星形胶质细胞构建血脑屏障的体外实验 模型:在明胶包埋的24孔板细胞插入器的微孔滤膜的一侧培养鼠脑血管内皮细胞，底部培 养星形胶质细胞，至汇合状态。通过4h液面渗透实验、扫描和透射电镜的形态学观察、以及 血脑屏障形成前后膜两侧的电阻来证实血脑屏障的形成。
[0120] 运用此体外模型研究纳米脑靶向制剂的通透性，采用高效液相法来测定石蒜生物 碱的含量。
[0121] 2)对离体脑组织检测
[0122] 通过给药后对脑组织中的药物成分定性或定量评价，来验证其可通过BBB。本课题 采用静脉注射技术，并联合运用高效液相色谱分析来检测离体脑组织中的石蒜生物碱。
[0123] 静脉注射技术被誉为评价BBB通透性的"金标准"。小鼠经股静脉或尾静脉置管，注 入目标药剂及血浆体积标记物(用以校正脑微血管内的残存的目标化合物），经股动脉置管 于不同时间点取血。实验完毕后，杀死动物，取脑组织，匀浆，再用右旋糖酐成分密度离心法 来清除脑匀浆中微血管壁上及微血管内皮细胞中尚未进入脑组织中的化合物，最后用高效 液相色谱测脑内石蒜生物碱浓度。
[0124] 3)对动物活体的检测
[0125] 通过脑内微透析法对动物活体进行检测。脑内微透析技术是在推挽灌流基础上发 展起来的一种连续灌注并采集清醒自由活动动物特定脑区灌流液的一种新方法。本课题将 该技术与高效液相色谱检测系统相结合，灌流能透过透析膜的药物脑靶向制剂，检测石蒜 生物碱的含量。
[0126] 具体操作为:将PE10导管与透析探头的输入管相连，而将PE10的另一端通过旋转 接头和与无脉冲的微量灌流栗相连的PE50相连。灌流栗以l-2iil/min流速、恒速输入经过滤 的纳米脑靶向制剂溶液。探头的输出管经另一 PE10导管与400iU离心管(作为收集管)相连。 收集到的液体，经适当处理后，用高效液相法来测定其中的石蒜生物碱的含量。
[0127] (五)体外纳米脑靶向制剂对乙酰胆碱酯酶抑制作用的研究
[0128] 将载药体系分四组分别进行抑制乙酰胆碱酯酶率的检测:①石蒜生物碱原药;② 空白载体PA-CS-CH0;③未组装LDL的负载石蒜生物碱的纳米粒;④组装LDL后的负载石蒜生 物碱体系。
[0129] 结合TLC生物自显影法、Ellman法和电泳介导的微量分析法的检测结果，综合分析 各实验组抑制乙酰胆碱酯酶的作用效果，探讨该课题制备的石蒜生物碱纳米靶向脑靶向制 剂抑制乙酰胆碱酯酶的作用机理。
[0130] 1)TLC生物自显影法
[0131]选取硫代乙酰胆碱为底物，DTNB为显色剂。在薄层板上将待测样品展开，然后将薄 层板与乙酰胆碱酯酶、底物相接触，培养一定时间后喷显色剂，有抑制活性的成分将会抑制 乙酰胆碱酯酶的活性，不能与底物，显色剂反应，这样该部位会出现薄层板本身的白色，而 其他部位根据不同的底物和显色剂为不同的背景色。
[0132] 2)Ellman法
[0133] Ellman法是一种能够定量评价乙酰胆碱酯酶抑制活性的方法。与TLC生物自显影 法不同，本方法选取碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)作为底物，它在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下 分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成405nm下有最大 光吸收的黄色物质5-巯基-2-硝基苯甲酸盐。根据测得的A值计算酶抑制率，公式如下：
[0134] 抑制率=[(A空白组-A完全抑制组)_(A样品-A样品本底）]/(A空白组-A完全抑制 组）X100%
[0135] 3)电泳介导的微量分析法
[0136] 电泳介导的微分析法不仅具有快速简便、重复性好、试剂消耗少、准确度高。是一 种在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外230nm处直接测定产物峰面积实 现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法。
[0137] 将酶溶液和底物溶液分别导入毛细管一端;其中为了提高酶活性，将在底物溶液 中加入无机镁离子盐如硫酸镁。此后在毛细管上加上一定的电压使两者混合一段时间后； 断开电压，使酶和底物反应一定时间;再加上一定的电压使酶、未反应底物及产物根据其电 泳淌度的不同来实现分离。酶活用230nm处产物的峰面积表示，根据产物峰面积的变化来判 断抑制酶的活性。
[0138] (六)体内纳米脑靶向制剂对阿尔茨海默病的改善作用及其作用机制
[0139] 1)对东莨菪碱所致记忆获得障碍的改善作用
[0140] (1)小鼠跳台法
[0141]取健康小白鼠，随机分为5组，分别为石蒜生物碱原药组(原药组）；未组装LDL的负 载石蒜生物碱的纳米粒组(实验1组）；组装LDL后的负载石蒜生物碱体系组(实验2组）；空白 载体PA-CS-CH0(空白组）；模型对照组。空白组和模型对照组灌服等溶剂的蒸馏水，其余各 组分别灌服相应的药剂，连续给药7天。末次给药后20min，除正常对照组腹腔注射生理盐水 外，其余各组均腹腔注射东莨菪碱，l〇min后进行跳台法训练。24小时后测试，记录5min内小 鼠的跳下潜伏期和错误次数。
[0142] (2)小鼠避暗法
[0143] 方法同（1)，记录3min内小鼠进入暗室的潜伏期。
[0144] 2)对KA致大鼠痴呆模型的改善作用
[0145] 取健康大鼠随机分为石蒜生物碱原药组(原药组）；未组装LDL的负载石蒜生物碱 的纳米粒组（实验1组）；组装LDL后的负载石蒜生物碱体系组（实验2组）；空白载体PA-CS-CH0(空白组）；模型对照组。将大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，固定在脑立体定位仪上，沿颅 骨中线剪开皮肤。在颅骨上钻一小孔，直径约l〇min，用微量注射器分别将海人藻酸在5min 内注入两侧基底核，空白对照组注入等量的磷酸缓冲液(pH 7.4)，注射完毕，停针5min。术 后牙托粉封固颅骨，缝合皮肤，3天内每天给予青霉素，术后第二天开始灌服药物，空白对照 组与模型对照组灌服等容积的蒸馏水，连续灌服14天。自第9天开始进行Morris水迷宫测 试，记录每天的训练成绩，连续训练5天。第14天给药lh后处死大鼠，测定脑内Ach，AchE。
[0146] (1)大鼠学习记忆行为学实验
[0147] Morris水迷宫学习测试：即定位航行实验，历时5天，每天共训练8次，系统自动记 录大鼠入水后找到平台的时问即逃避潜伏期，取
[0148] 每天逃避潜伏期的平均值作为该天的学习成绩。
[0149] Morris水迷宫记忆测试：即空间搜索实验，第5天下午给药lh后撤出平台，记录大 鼠在120S内初次找到原平台的时间和穿越原平台的次数。
[0150] (2)大鼠脑组织中Ach含量的测定
[0151] 取大鼠大脑皮质0.5g，匀浆后室温放置2h，取上清液按lg脑组织用5ml 10%三氯 醋酸的比例，混勾，3000 X g离心10min，用lmol/L强氧化钠调pH值至7.0，最后以洛氏液调至 lg脑组织容量为8ml，供测定用。
[0152] 水蛭背肌的制备:将水蛭背位固定于解剖板上，用盐水使其放松至自然长度，用眼 科剪刀沿腹背交接处剪开两侧，掀开腹肌，剪去白色的内脏和神经以及黑色葡萄状组织，然 后用手术刀切成1-2毫米宽，10毫米长的肌条，丝线结扎两端，备用。肌条始终用稀释的洛氏 液湿润。
[0153]肌条在浴槽内避免贴壁，上端接肌张力换能器，其下端加0.3g的负荷。肌条挂入浴 槽后，以稀释洛氏液灌流，稳定后开始测定。测定时，交替加入与浴槽等容量的标准品和样 品。最后用等效比值的方法计算样品中Ach的含量(nmol/g脑组织）。
[0154] (3)大鼠脑组织中AchE含量的测定
[0155] KA痴呆大鼠实验中，在行为学实验结束第二天，给药后将大鼠快速断头处死，取脑 组织(0.2-lg)，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，用0.86%的冷生理盐 水制成10 %匀浆液。按AchE试剂盒进行AchE含量测定。
[0156] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换 和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种石蒜生物碱靶向缓释制剂，其特征在于:所述的制剂是由石蒜生物碱、丙炔酰化 壳聚糖和具有叠氮探针的低密度脂蛋白组成，三者的摩尔比为1: (〇. 1~1): (〇. 1~2)。2. 如权利要求1所述的石蒜生物碱靶向缓释制剂，其特征在于:石蒜生物碱、丙炔酰化 壳聚糖和具有叠氮探针的低密度脂蛋白的摩尔比为1:0.5:1.5。3. -种制备如权利要求1或2所述的石蒜生物碱靶向缓释制剂的方法，其特征在于： 通过点击化学反应在20-60°C的条件下丙炔酰化壳聚糖上的炔基与具有叠氮探针的低 密度脂蛋白上的叠氮发生反应2-24小时后合成LDL靶向端作为疏水端的两亲性分子，该分 子与石蒜生物碱自组装形成LDL靶向端裸露在外面的石蒜生物碱纳米脑靶向制剂。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的丙炔酰化壳聚糖的合成路线如 下： (1) 醛化壳聚糖(CS-CHO)的合成：(2) 丙炔酰化壳聚糖(PA-CS-CHO)的合成：5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于:所述合成方法的具体步骤如下： (1)醛化壳聚糖(CS-CHO)的合成： 氮气气氛下，壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液与高碘酸钾在4°C下搅拌反应24~48h后， 然后向溶液中加入乙二醇溶液来中止反应，产物经旋转蒸发浓缩后分别在NaCl水溶液和去 离子水中透析以除去杂质，最后产物冷冻干燥，备用；其中，所述壳聚糖、醋酸-醋酸钠缓冲 溶液、高碘酸钾、乙二醇之间的摩尔体积比为1: (1~5): (0.1~1): (0.1~1); (2)丙炔酰化壳聚糖(PA-CS-CHO)的合成： 在氮气保护下，丙炔酸水溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后逐滴滴入CS-CHO水溶液中，搅拌均匀后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCL)，醛 化壳聚糖、丙炔酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩 尔比为1: (1~4): (1~3): (1~3)，混合物反应10~72h后，转移至透析袋中，在NaCl水溶液 和去离子水中透析除去未反应的小分子，冷冻干燥得到产物，备用。6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述的具有叠氮探针的低密度脂蛋白的 合成方法的具体步骤如下： (1)叠氮探针的合成： 合成路线如下：(1 · 1 )Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2〇H(NHEP)的合成： 棕榈酸、羟基乙氧基乙胺和三乙胺在氮气气氛下，加入二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解， 置入冰浴中，冷却后加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU) 和N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，室温反应，薄层层析确定反应终点，反应物溶液逐滴滴入搅拌 中的冷水中，用氯仿萃取，收集到的氯仿溶液依次用柠檬酸溶液，碳酸氢钠溶液，饱和氯化 钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后旋蒸去氯仿得到粗产物，粗产物在乙醇中重结晶纯化，真空 干燥，干燥器保存;其中，所述棕榈酸、2-(2-氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰胺、苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸盐和N-羟基苯并三氮唑的摩尔比为1:(1~1.5):(1 ~3):(1~5):(1~4.5):(1~6); (1 · 2) C15H31CONHCH2CH2OCH2CH2OTS (PEMBS)的合成： NHEP溶于氯仿中，加入吡啶，降温后，加入对甲基苯磺酰氯，回复至室温，搅拌过夜，薄 层层析确定反应终点，产物滴入盐酸溶液中，离心出去上清液后得到产物，产物分别用盐酸 和水冲洗，在室温下真空干燥，干燥器储存;其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、对甲基苯磺酰氯的 摩尔比为1: (1~6): (4~5.6): (1~1.4); (1 · 3 )Ci5H3iCONHCH2CH2〇CH2CH2N3(NAEP)的合成： PEMBS在氮气保护下溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入叠氮钠(NaN3)，缓慢加热，回流10 ~72h后降至室温，产物溶液在搅拌中滴入冰水中，过滤，用水反复冲洗滤饼后，室温真空干 燥，通过柱层析纯化得到最终产物，在室温下真空干燥，干燥器储存，其中，所述PEMBS、二甲 基甲酰胺、叠氮钠的摩尔比为1:(1~5): (4~5.6); (2)LDL的探针标记： 采用密度梯度法从人血浆中提取LDL，NAEP与LDL在共溶溶剂中混合，通过自组装反应 得到表面具有叠氮探针的LDL(NAEP-LDL，标记为N3-LDL)。7.如权利要求1或2所述的石蒜生物碱靶向缓释制剂用于制备治疗老年性痴呆的药物 的用途。
【文档编号】A61K47/36GK105853392SQ201610038656
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年1月20日
【发明人】吴正治, 段丽红
【申请人】深圳市老年医学研究所