一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法
【专利摘要】本发明涉及动物模型领域，具体地公开了一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法。一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，用4?NQO溶液和NaNO2溶液先后喂养哺乳动物一段时间；每周对其进行常规观察，并随机处死进行HE染色观察和免疫组织化学CK8染色观察；直到该动物舌面产生白色斑块，HE染色观察发现浸润癌，CK8染色发生淋巴结转移。本发明建立了一种利用亚硝酸钠促进舌癌发展和淋巴转移动物模型的构建方法，模拟实际发生的舌癌的进展，为研究亚硝酸钠对舌癌的影响和舌癌的治疗研究等提供了新型有力的工具。
【专利说明】
一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法
技术领域
[0001]本发明涉及动物模型领域，具体地公开了一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法。
【背景技术】
[0002]1.1舌鳞状细胞癌
[0003]舌癌，绝大部分为上皮来源的舌鳞状细胞癌(Tongue tongue squamous cellcarcinomaJSCC)，从解剖学分类可分为舌体癌(舌前2/3)与舌根癌(舌后1/3)两类，其中舌体癌发病率更高。舌头是口腔颂面部的重要组织器官之一，其解剖结构和生理功能极为复杂，它对下咽、说话、尝味有重要意义，舌部的淋巴管和肌肉结构很丰富，使得自身容易受到肿瘤细胞侵犯，舌体运动频繁且具有丰富的淋巴回流，因此极易发生转移。
[0004]舌癌的发生与各种因素致舌粘膜细胞反复损伤、充血、增生等有关，现在普遍认为致舌癌发生的因素主要有槟榔、酒精和烟草。Silvia Franceschi等统计了 102例舌癌患者和104例口腔癌患者的病例，发现烟草摄入频繁的患者是不抽烟的患者的10.5倍(舌癌)和
11.8倍(口腔癌)；摄入酒精量大的是摄入酒精量少的患者的3.4倍(舌癌)和3.0倍(口腔癌)C3Yaoh-Shiang Lin等对台湾地区1986年到1997年的病例进行了流行病学的统计分析，认为咀嚼槟榔是口腔癌可能的诱因，且在十年内患口腔癌的病患中咀嚼槟榔的人数逐年增加。
[0005]1.2亚硝酸钠与肿瘤的关系
[0006]亚硝酸钠(sodium nitrite，NaN02)是一种常见的化学物质，在自然界中广泛存在，常作为防腐剂添加到食品中，也用于工业防腐和医药领域。人体能通过食物和饮水中摄取微量亚硝酸盐，NaN02也可以在体内由一氧化氮(nitric oxide，N0)转化形成。
[0007]从目前的研究进展来看，亚硝酸钠对人体的影响有利有弊。亚硝酸根离子对缺氧性血管扩张、生理血压控制和氧化还原信号等的调节有积极作用，其代谢产物NO是人体内非常重要的信号分子。虽然国际癌症机构(Internat1nal Agency for Research onCancer，IARC)将亚硝酸盐列为可能致癌物，但关于亚硝酸钠与癌的关系并不明确。很多研究者认为亚硝酸盐的潜在毒性体现在它在胃内可与胺类物质化合成强致癌物质亚硝胺，流行病学的部分研究表明摄入过量的亚硝酸盐会提高消化道癌发生和致畸的可能性。在动物实验中仅用亚硝酸钠喂鼠，未发现导致恶性肿瘤发病率增加的结果，尚无证据表明亚硝酸钠单纯起始癌症的证据。但如果将致癌剂与亚硝酸钠先后喂养动物，则可以发现肿瘤发病率明显增加，这表明亚硝酸钠可能是一种促癌剂而不是致癌剂。在体外用亚硝酸钠处理肿瘤细胞，能增强细胞增殖能力，促进细胞的恶性表型转化和上皮细胞-间充质细胞转化。
[0008]1.3化学诱导法建立舌癌模型
[0009]评估化学药物对肿瘤的影响，最简便直接的方法是在动物肿瘤模型中进行研究。建立口腔癌动物模型的主要方法有化学诱导法、移植肿瘤法和转基因动物致癌法，其中化学致癌法是最常用的口腔癌致癌方法。二甲基苯并蒽(10-dime thyl-1，2-benzanthracene，DMBA)是一种强效的直接致癌剂，作用于上皮细胞DNA，强烈的毒性使DNA发生突变。Cavalcante DR等用0.5 %的DMBA溶液涂抹于大鼠舌背，每周三次，涂抹20周后成功在大鼠体内建立了舌癌模型。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-11；[1:1'0911；[1101;[116-1-(?丨(16，4购0)是一种水溶性的喹啉衍生物，作为一种致癌剂，它能在体内4-NQ0还原酶的作用下还原成致癌物4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物(4-AAQ0)，4-AAQ0以共价键的方式与细胞DNA结合并破坏染色体结构，使老鼠7号染色体上H-rasl基因的第12位密码子发生G—A的突变进一步影响相关基因表达，最终导致口腔癌的发生。Fu j ino等通过在小鼠唇部涂布4-NQ0溶液的方法，成功诱导小鼠产生唇癌。除了涂抹口腔黏膜致癌之外，也可通过将4-NQ0混入饮用水中诱导小鼠舌癌的产生，如Ohne M等报道用溶解有4-NQ0的饮用水喂养大鼠，能够成功诱发大鼠的舌癌，并观察到舌鳞状细胞癌的发展情况。
[0010]淋巴管是实体癌转移的重要通路之一，对于上皮来源的恶性肿瘤，前哨淋巴结是肿瘤细胞淋巴结转移的第一个站点，进一步可能会通过淋巴管到其它节点，最后进入血液循环，再到达远处的器官。头颈部有大约400个淋巴结可供转移，和其它肿瘤相比，舌部鳞状细胞癌具有较高的淋巴结转移率，而且容易在早期阶段发生淋巴管转移，有无颈部淋巴结的转移是影响舌癌预后的重要临床指标。因此舌部鳞状上皮细胞癌的淋巴转移是一个很重要的研究方向，目前很少有文献专门研究建立与淋巴转移相关的小鼠模型。4-NQ0的摄入与舌癌的发生有关。单纯饮用4-NQ0，增加实验周期(30周以上)虽然也会有淋巴转移出现，但这是舌癌发展的趋势，与药物的摄入并无直接的相关性。
【发明内容】
[0011]为了克服现有技术存在的问题，本发明提供一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法。
[0012]本发明所采用的技术方案为:
[0013]一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，用4-NQ0溶液和NaNO2溶液先后喂养哺乳动物一段时间；每周对其进行常规观察，并随机处死进行HE染色观察和免疫组织化学CK8染色观察;直到该动物舌面产生白色斑块，HE染色观察发现浸润癌，CK8染色发生淋巴结转移。
[0014]进一步地，所述哺乳动物为小鼠。
[0015]进一步地，所述小鼠为6周龄雌鼠。
[0016]进一步地，用所述4-NQ0和NaNO2的喂养时间均为8周
[0017]进一步地，所述4-NQ0溶液的浓度为100mg/L。
[0018]进一步地，所述NaNO2溶液的浓度为500mg/L。
[0019]进一步地，用NaNO2喂养后，再用纯无菌水喂养8周。
[0020]本发明的内容还包括亚硝酸钠在促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型构建中的应用。
[0021 ]进一步地，所述亚硝酸钠促进4-NQ0致舌癌发展和淋巴转移。
[0022]本发明的有益效果为:本发明建立了一种利用亚硝酸钠促进舌癌发展和淋巴转移动物模型的构建方法，模拟实际发生的舌癌的进展，为研究亚硝酸钠对舌癌的影响和舌癌的治疗研究等提供了新型有力的工具。
[0023]为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【附图说明】
[0024]图1对照组正常小鼠HE染色情况
[0025]图24周实验组小鼠HE染色情况(左:实验组一，右:实验组二)
[0026]图38周实验组小鼠HE染色情况(左:实验组一，右:实验组二)
[0027]图412周实验组小鼠HE染色情况(左:实验组一，右:实验组二)
[0028]图516周实验组小鼠HE染色情况(左:实验组一，右:实验组二)
[0029]图6 20周实验组小鼠HE染色情况(左:实验组一，右:实验组二)
[0030]图7 24周实验组小鼠HE染色情况(左:实验组一，右:实验组二)
[0031 ]图8 24周实验组一小鼠免疫组化CK8染色情况(左:阴性对照，右:CK8/18染色)
[0032]图924周实验组二小鼠免疫组化CK8染色情况(左:阴性对照，右:CK8/18染色)
【具体实施方式】
[0033]本发明的促小鼠舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法:
[0034](I)选取实验动物及分组:取6周龄雌性C57BL/6J小鼠为实验小鼠，并随机分成实验组一、实验组二、实验组三和对照组;实验小鼠的条件为:雌性C57BL/6J小鼠，清洁级，体重为19.15±0.458，在室温18?25°(:、湿度30%?50%、标准饲料喂养、24小时光暗交替条件下饲养；
[0035](2)实验所用药物的配制:将粉末状试剂4-NQ0以无菌水配成lOOmg/l的溶液A，置于水瓶内让小鼠自由饮用;将NaN02以无菌水配成500mg/L的溶液B，置于水瓶内让小鼠自由饮用；
[0036](3)给药周期:首先用溶液A喂养小鼠8周，然后用溶液B继续喂养小鼠8周；对照组小鼠连续用纯无菌水喂养16周;最后实验组和对照组小鼠均继续用纯无菌水喂养8周；
[0037](4)对动物的观察:实验组和对照组喂养0-24周期间，每四周随机处死三只小鼠；并对实验组和对照组进行常规观察、HE染色观察，免疫组织化学CK8染色观察；
[0038]1.—般观察为:实验过程中每天观察小鼠精神状况、进食、饮水、饮药及毛色等情况，每周记录小鼠体重，饮水量，饮药量;每周观察小鼠舌头变化，观察舌表面粘膜色泽和质地等是否发生改变，是否有肿块、斑点等出现；
[0039]2.HE染色观察为:用脱颈椎方法处死小鼠，立即取全舌及食道组织，用福尔马林溶液固定48小时，组织脱水处理，石蜡包埋，5μπι组织切片，苏木素溶液和伊红溶液染色，显微镜下进行组织病理学观察;病理变化分为单纯上皮增生，上皮异常增生(轻度、中度和重度)和癌(原位癌和浸润性癌);
[0040]3.免疫组织化学CK8染色观察为:取颈部淋巴结石蜡组织切片，用CK8抗体(兔抗鼠单克隆抗体，Cell Signaling Technology, 1:100)作为一抗为进行免疫组织化学染色，PBS代替一抗作为阴性对照；结果判定:镜下观察，鳞状上皮细胞表达CK8，阳性反应呈现棕黄色，淋巴结内固有成分无着色;有阳性染色的细胞则为转移的癌细胞。
[0041 ] 观察结果:
[0042]对照组小鼠情况:正常小鼠在实验的24周时间内，一直精神状况良好，进食饮水量基本无变化，毛色有光泽，体重随时间的增加有增加的趋势，舌表面光滑，颜色鲜艳，无泛白或泛黄情况，无异常突起和肿块。HE染色结果可看到舌上皮层次分明，细胞核型正常，基底细胞排列整齐(附图1)。
[0043]实验组一小鼠情况:第4周起，小鼠出现饮药副作用，具体表现为毛色暗沉，活动能力略降低，进食有减少，体重相比正常组有减轻，舌头表面光滑度减少，有出现轻微白色斑块;HE染色情况显示上皮有增生，基底细胞核型有轻微紊乱(附图2)。第8周，小鼠的饮药副作用凸显，肉眼可见小鼠体型比正常小鼠小，体重相差持续增大，舌头血色减少，呈现泛白的颜色，手感粗糙，有明显白色斑块出现;HE染色可以看到上皮有中度异常增生，增生不仅存在于基底层还有棘层，基底紊乱严重(附图3)。第12周，小鼠的体重持续减轻，舌面的白色斑块有蔓延趋势，斑块面积增大，外观粗糙;HE染色结果显示上皮重度异常增生，并有突破基底的趋势(附图4)。第16周，上述斑块面积持续增大，高出粘膜;HE染色观察发现上皮原位鳞状上皮细胞癌形成(附图5)。第20-24周，小鼠活动能力很弱，体重降低明显，体型比正常小鼠小很多，腹部尤其明显；舌表面出现肿物或者溃疡，质地硬;HE染色证实已发生浸润癌(附图6、7)。24周免疫组化CK8蛋白染色观察证实尚未发生淋巴结转移(附图8)。
[0044]实验组二小鼠情况:前八周的情况同实验组一小鼠(附图2、3)。第12周，小鼠体重减轻幅度比实验组一小，体型介于正常组和实验组一之间，舌面白色斑块明显，外观粗糙，有突出的白色斑点；HE染色结果显示原位癌形成明显，而且有突破基底层向纤维和肌肉层进行浸润，形成浸润癌，比同期的实验组一小鼠严重(附图4)。第16周，斑块面积增大增多，舌头表面突起变多;HE染色观察发现浸润癌越发严重(附图5);第20-24周，小鼠精神状况尚可，体重未有明显降低，体型与正常组小鼠比无太大差别；舌表面溃疡和肿物严重，边缘凸出;HE染色发现浸润癌明显，而且在肿瘤组织里出现分化层(附图6、7)。24周免疫组化CK8蛋白染色观察证实已发生淋巴结转移(附图9)，与同期实验组一形成对照。
[0045]实验组一24周淋巴结转移率为O，实验组二小鼠24周淋巴结转移率为100%。
[0046]通过上述实验证明，本发明成功利用亚硝酸钠促进4-NQ0致舌癌发展和淋巴转移动物模型。
[0047]本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
【主权项】
1.一种促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，用4-NQ0溶液和NaNO2溶液先后喂养哺乳动物一段时间；每周对其进行常规观察，并随机处死进行HE染色观察和免疫组织化学CK8染色观察;直到该动物舌面产生白色斑块，HE染色观察发现浸润癌，CK8染色发生淋巴结转移。2.根据权利要求1所述的促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，所述哺乳动物为小鼠。3.根据权利要求2所述的促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为6周龄雌鼠。4.根据权利要求3所述的促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，用所述4-NQ0和NaNO2的喂养时间均为8周。5.根据权利要求4所述的促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，所述4-NQ0溶液的浓度为100mg/L。6.根据权利要求4或5所述的促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，所述NaN02溶液的浓度为500mg/L。7.根据权利要求6所述的促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型的构建方法，其特征在于，用NaNC>2喂养后，再用纯无囷水喂养8周。8.亚硝酸钠在促哺乳动物舌癌发展和淋巴转移模型构建中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述亚硝酸钠促进4-NQ0致舌癌发展和淋巴转移。
【文档编号】A61K33/00GK105853457SQ201610285034
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】张雁, 余姝毅, 郑骏恒, 肖嘉盈
【申请人】中山大学