骨硬化病相关跨膜蛋白在治疗或预防ev71感染药物中的应用
【专利摘要】本发明公开骨硬化病相关跨膜蛋白在治疗或预防EV71感染药物中的应用，其步骤为：首先利用昆虫杆状病毒表达系统在昆虫细胞（SF9）中表达Ostm1蛋白，然后使用镍柱亲和层析的方法对Ostm1蛋白进行纯化，最后在感染EV71的恶性胚胎横纹肌瘤细胞（RD细胞）中来验证Ostm1蛋白的抗病毒效果。实验结果证明：纯化后的Ostm1蛋白在一定浓度时可以在mRNA水平和蛋白水平抑制EV71病毒的复制。本发明从蛋白纯化以及细胞核分子层面对骨硬化病相关跨膜蛋白（Ostm1）抗EV71病毒作用进行了评价，为其进一步开发和应用奠定了基础。该蛋白可以在适当的浓度直接抑制EV71病毒的复制，并且效果明显，对细胞没有副作用，使用简单方便。表明该药物具有开发成为抗EV71病毒的有效药物而应用于临床的前景。
【专利说明】
骨硬化病相关跨膜蛋白在治疗或预防EV71感染药物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及抗病毒药物领域，涉及一种骨硬化病相关跨膜蛋白（Osteopetrosis associated transmembrane protein 1)的新用途，更具体涉及一种骨硬化病相关跨膜蛋 白在治疗或预防EV71感染药物中的应用。
【背景技术】
[0002]
[0003] 人类肠道病毒71型（Hu-man enterovirus)属于小RNA病毒科(Picomaradae)肠道 病毒属(Enterovirus) JV71病毒颗粒为正二十面体对称球形结构，没有包膜和刺突，其直 径在24-30nm左右。病毒基因组全长为7408bp，为单链正义RNA，基因组中只有一个开放阅读 框(0RF)，在0RF的两侧为5'和3'的非编码区（UTRs)，在基因组的3'端末尾还有一个长度可 变的多聚腺苷酸尾巴(P〇ly-A)。病毒基因组中的0RF可以编码2194个氨基酸，这些氨基酸组 成的多聚蛋白可以产生P1、P2和P3-共3个前体蛋白。其中P1前体蛋白编码4个病毒外壳蛋 白，分别为VP1、VP2、VP3和VP4;P2和P3前体蛋白一共编码7个非结构蛋白。其中，VP1蛋白是 最主要的衣壳蛋白，含有EV71主要的抗原决定簇，其编码的基因序列与病毒的血清学有很 高的相关性，因此常常被用来作为病毒型别的鉴定和基因的进化分析。病毒粒子的衣壳有 60个亚单位组成，每一个亚单位都有VP1-VP4形成的五聚体样结构，其抗原决定簇基本上都 位于VP1-VP3上。
[0004] EV71病毒以人体的上呼吸道、咽喉以及肠道为侵入对象，先在局部的黏膜和扁桃 体及咽等淋巴组织和肠道淋巴结集合并初步的扩增，然后将EV71病毒释放入血液，形成第 一次病毒血症，EV71病毒随血液扩散到带有其受体的靶组织，再次增殖从而引起第二次病 毒血症和一些临床症状。EV71的感染会造成长期的后遗症，例如神经系统后遗症以及认知 功能的延迟和降低。肺水肿和出血是儿童感染EV71后引起死亡的主要原因。
[0005] 目前并没有有效的抗病毒药物来治疗重症的EV71感染，也没有进入临床阶段的疫 苗可以使用，所以，避免接触感染的患者和疑似感染患者是预防EV71感染的主要方法。在抗 EV71病毒药物的研究方面，吡啶基咪唑啉酮是一类新型粘合剂类的药物，它可以与EV71的 VP1蛋白的相互作用，通过使VP1基因的疏水区域的扩大，从而干扰VP1与其受体结合的方法 来抑制EV71的复制。另外，细胞因子介导的方法可以用来治疗EV71感染所引起的水肿，例如 像利巴韦林就能通过降低感染小鼠组织中的病毒载量来降低EV71感染的死亡率和后续的 麻痹后遗症。最后，我们可以通过接种疫苗的方法来预防EV71的感染，目前EV71的候选疫苗 主要包括减毒活性疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒以及转基因疫苗，这些疫苗已 在动物实验中得到评估但是临床试验尚未进行。
[0006] 骨硬化病相关跨膜蛋白（Ostml)具有338个氨基酸，具有一个单一的跨膜结构域， 一个短的胞质尾区，一个长的含有多个高糖基化位点的细胞腔结构域和一个可以剪切的信 号肽。Ostml蛋白的细胞腔结构域含有一个微弱的RING-finger蛋白。该蛋白最初始的功能 可能与E3泛素连接酶类似。
[0007] Os tml蛋白可以在破骨细胞、造血干细胞以及其他的造血细胞家族例如B细胞、NK 细胞和肥大细胞中表达。Ostml基因可以独立于CIC-7基因在造血干细胞的分化中起着重要 的作用，此外，Ostml蛋白也可以调控典型的Wnt信号通路，从而在骨内稳态中起到重要的作 用。在骨硬化病患者的Ostml基因上的突变产生了一个截短的蛋白，这个蛋白缺乏跨膜区和 胞质尾区从而使该蛋白可以分泌，该突变蛋白可以抑制Wnt信号通路并且可以结合到破骨 细胞前体的抑制子上从而抑制破骨细胞的产生。Ostml蛋白是多能干细胞中miR-140的靶位 点，具有抗脂肪形成的功能，Ostml蛋白也具有连接骨形态发生蛋白（BMP)和Wnt信号通路的 潜力。但是，目前还没有Ostml蛋白和病毒性疾病以及相关病毒之间关系的文献报道，也没 有该病毒对现在大规模流行并且致病性比较高的肠道病毒(EV71)的预防与治疗作用的报 道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是在于提供了一种人骨硬化病相关跨膜蛋白在制备治疗和预防人 肠道病毒EV71感染药物中的应用，从细胞和分子层面对骨硬化病相关跨膜蛋白（Ostml)抗 EV71病毒的作用进行了评价，为其进一步的开发和应用奠定了良好的基础，该蛋白可以在 适当的浓度直接抑制EV71病毒的复制，并且效果明显，对细胞没有副作用，使用简单方便。
[0009] 为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现： 一种骨硬化病相关跨膜蛋白在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应 用，其步骤是： (1) 将Ostml基因（GenBank NP054747)的C端连接上His标签，然后将其克隆到pFastBac Dual载体(Invitrogen)的PH启动子(质粒上面)下，通过测序从而得到正确的克隆pFastBac Dual-〇stml； (2) 将pFastBac Dual-Ostml转化大肠杆菌(DH10P)(购于克劳宁生物科技有限公司）， 通过Tn7转座子(DH10P)，基因重组得到携带有Ostml基因的杆状病毒Bacmid-Ostml; (3) 将Bacmid-Ostml转染SF9细胞(来自于中国典型培养物保藏中心)得到P1代重组病 毒，经过病毒扩增得到活性最高的P3代重组杆状病毒，并且证明了Ostml蛋白的成功表达； (4) 用P3代病毒感染SF9悬浮细胞来进行大规模的蛋白表达，然后利用镍柱亲和层析法 成功得到了纯化的Ostml蛋白； (5) 将纯化后的Ostml蛋白以不同的浓度作用于感染EV71病毒(GenBank JN230523.1) 的RD细胞，于8h后提取总RNA，以病毒的VP1结构蛋白作为检测EV71病毒复制的标志物，分别 在RNA和蛋白水平来检测该蛋白的抗病毒效果。
[0010] 上述实验结果表明：纯化后的Ostml蛋白在一定浓度时可以明显的抑制EV71病毒 VP1的mRNA水平，免疫印迹结果也显示该蛋白可以在相同浓度时抑制VP1蛋白水平的表达。 从而证明了该蛋白就用抗E71病毒复制的功能。
[0011] 本发明发现了骨硬化病相关跨膜蛋白新的药用价值，为抗肠道病毒71型、治疗和/ 或预防EV71感染提供了新有效药物。
[0012] 所述的一种骨硬化病相关跨膜蛋白在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染 药物中的应用，具体应用为将纯化的Ostml蛋白以合适的浓度直接作用于感染EV71的细胞， 该蛋白可以明显的抑制EV71的复制(如图5所不） 目前并没有有效的抗病毒药物来治疗重症的EV71感染，也没有进入临床阶段的疫苗可 以使用，所以，避免接触感染的患者和疑似感染患者是预防EV71感染的主要方法。在抗EV71 病毒药物的研究方面，吡啶基咪唑啉酮是一类新型粘合剂类的药物，它可以与EV71的VP1蛋 白的相互作用，通过使VP1基因的疏水区域的扩大，从而干扰VP1与其受体结合的方法来抑 制EV71的复制。另外，细胞因子介导的方法可以用来治疗EV71感染所引起的水肿，例如像利 巴韦林就能通过降低感染小鼠组织中的病毒载量来降低EV71感染的死亡率和后续的麻痹 后遗症。最后，
【申请人】可以通过接种疫苗的方法来预防EV71的感染，目前EV71的候选疫苗主 要包括减毒活性疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒以及转基因疫苗，这些疫苗已在 动物实验中得到评估但是临床试验尚未进行。
[0013]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 本发明从蛋白纯化以及细胞和分子层面对骨硬化病相关跨膜蛋白（Ostml)抗EV71病毒 作用进行了评价，为其进一步开发和应用奠定了基础。表明该药物具有开发成为抗EV71病 毒的有效药物而应用于临床的前景。
[0014]最终，通过实验
【申请人】发现骨硬化病相关跨膜蛋白在浓度为13.5ng/ml时可以对 EV71病毒的复制有很明显的抑制作用，这提示
【申请人】可以将该蛋白制成相关药物，从而在 EV71病毒的预防和感染后治疗的过程中发挥其抗病毒的效果。
[0015]【附图说明】： 图1为一种P3代杆状病毒表达Ostml蛋白的时间以及表达环境鉴定的示意图。
[0016] 结果证明P3代病毒感染昆虫细胞(sf9)第三天OStml蛋白表达效果最好，且该蛋白 是胞内表达。
[0017] 图2为一种利用镍柱亲和层析法来纯化蛋白的不同咪唑浓度梯度洗脱图。
[0018] 结果证明在咪唑浓度为112mM时，Ostml蛋白可以被大量的洗脱下来，并且杂蛋白 很少，从而可以得到纯化的蛋白。
[0019] 图3,4为一种不同浓度的Ostml蛋白抑制EV71病毒mRNA水平的示意图。
[0020] 结果显示在Ostml蛋白浓度为13.5ng/ml和337.5ng/ml时，EV71病毒的VP1蛋白的 mRNA水平与不加病毒的对照组相比有明显的下降，说明当蛋白在此浓度时对EV71病毒的 mRNA的产生有比较明显的抑制作用。
[0021]图5为一种不同浓度的Ostml蛋白抑制EV71病毒蛋白水平的示意图。
[0022] 结果显示当蛋白的浓度为189ng/ml和360ng/ml时，与只加入病毒的对照组相比， V P1的蛋白水平有明显的下降，说明在此浓度时，0 s t m 1蛋白对于E V 71病毒的复制有比较明 显的抑制作用。 【具体实施方式】 [0023] 实施例1: 一种骨硬化病相关跨膜蛋白在制备预防和/或治疗EV71感染药物中的应用，其步骤是： 1. Ostml蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及纯化： 首先
【申请人】以HepG2细胞(来自于中国典型培养物保藏中心）的cDNA为模板，用特异性 的引物(序列如下）来扩增目的基因，然后将其连接在质粒载体pCAGG-HA(Invitrogen)上 面。引物序列如下：
接着再用特异性的引物从上述质粒上面来扩增目的基因，将其克隆到pFastBac Dual 载体上。引物的序列如下：
然后将pFastBac Dual-Ostml质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH10P，将其涂布在加有卡 那霉素、四环素、庆大霉素，x-gal以及IPTG的LB固体平板上，然后将其放在37°C恒温生化培 养箱中避光培养72h。然后挑取3个白色菌落，重新划线培养于上述固体平板，72h后挑取单 克隆菌落，将其接种到含有卡那霉素、四环素和庆大霉素的LB液体培养基里，200rpm，37°C 震荡培养过夜。次日提取质粒，并用M13引物鉴定Ostml基因的插入。M13引物序列如下
从液氮罐中取出冻存的SF9细胞(来自于中国典型培养物保藏中心），迅速放入37 °C水 浴锅中，快速解冻，复苏细胞。然后加入4ml的SF900魏培养基于T25细胞瓶中，放入27°C无 二氧化碳的细胞培养箱中培养。待细胞可以很好的传代时，将得到的穿梭质粒Bacmid-Ostml(见技术方案中2)转染到SF9细胞中，转染72h或者等到细胞出现病变后，收集培养基 上清，转移到无菌的15ml离心管中，lOOOrpm离心10min，即可得到P1代杆状病毒，然后将其 继续感染生长状态良好的SF9细胞，即可得到P2代杆状病毒，以此方法得到P3代杆状病毒， 若是长期保存病毒应该将病毒放置于_80°C保存。
[0024] 为了验证Ostml蛋白在SF9细胞中的表达情况，
【申请人】分别取P1代，P2代，P3代以及 P3代病毒感染SF9细胞ld、2d、3d的细胞以及培养基上清来做Western-blot实验，通过实验 结果
【申请人】得到P3代病毒在感染第三天时表达Ostml蛋白效果最好，并且该蛋白为非分泌 型表达。
[0025]在确定了Ostml蛋白成功表达后接着就是蛋白的纯化。首先是SF9悬浮细胞的培 养:从液氮罐中取出冻存的SF9悬浮细胞，将其接种到无菌的摇瓶中（一般接种量是摇瓶体 积的1/3)。1 lOrpm，27°C震荡培养;每天观察和测定细胞的个数和存活率，待其细胞的浓度 达到4X106个/ml，且其存活率在95%以上时，就可以进行细胞的传代;在原培养瓶瓶中添加 适量的新鲜培养基，使细胞的浓度达到2 X106个/ml，然后分装到两个无菌在摇瓶中。 110rpm，27°C条件下继续震荡培养。待SF9悬浮细胞的密度达到2X10 6个/ml时，加入M0I=1 的P3代病毒，继续培养3d后丢弃培养基，收集细胞。称取昆虫细胞的湿重，然后按照1:10的 比例加入昆虫细胞裂解液。将细胞放置在超声波破碎仪下，设置超声的时间和频率(一般是 超声2s间隔2s，超声30min左右）。整个超声的过程中需要将细胞一直置于冰盒上，超声结束 后收集上清液。在这里
【申请人】使用的是BI0-RAD公司的BioLogic DuoFlow蛋白纯化仪来进 行蛋白的纯化，其具体实验步骤为（1)用去离子水清洗镍柱:A栗(上述机器上自带的）和B (上述机器上自带的）都放入水中，流速1.5ml/s，清洗20min;(2)平衡镍柱:A栗放入平衡缓 冲液，B栗放入水中，此步骤只有A栗工作，流速1.5ml/s，平衡20min;(3)上样:A栗放入样品 中，B栗放入水中，此步骤也是只有A栗工作，流速1.5ml/s，时间由样本体积决定，收集部分 流出液；（4)漂洗:A栗放入漂洗缓冲液，B栗放入水中，此步骤中也是只有A栗工作，流速 1.5ml/s，漂洗20min，收集漂洗液;（5)线性梯度洗脱:A栗放入高浓度的咪唑中（200mM)，B栗 放入水中，此步骤两栗同时工作，设置收集的管数。洗脱液的浓度就是从0_200mM线性梯度 变化，收集每管洗脱液;（6)高浓度漂洗:将A栗放入高浓度咪唑(200mM)，B栗放入水中，此步 骤只有A栗工作，流速2ml/s，漂洗15min，用以洗去镍柱上残存的蛋白；（7)清洗系统:将A栗 和B栗同时放入含有浓度为20%的乙醇中，流速2ml/s，清洗30min。使整个系统处于20%的乙 醇环境中，最后将两栗保存在20%的乙醇溶液中。
[0026]注意:A栗在调换的过程中都要用去离子水清洗干净。
[0027] 2.纯化的Ostml蛋白的抗EV71病毒活性研究： 2.1细胞和病毒： 人横纹肌肉瘤细胞系RD来自于中国典型培养物保藏中心(CTCC)(武汉大学），并且由本 实验室保存。
[0028] EV71病毒株由本实验室分离获得。
[0029] 2.2实验方法： 将处于对数期的RD细胞铺12孔板，待RD细胞贴壁并且细胞基本铺满每个孔时，换用无 血清培养基，然后只留一个孔作为对照，不加病毒，其余每个孔加入M0I = 1的EV71病毒。 90min后，弃去原培养基，然后添加新鲜的无血清培养基，每个孔中加入不同质量的纯化后 的Ostml蛋白，8h后收取细胞，使用Trizol法提取细胞中的中总RNA，逆转录成为cDNA，然后 使用荧光定量PCR的方法来检测EV71病毒中VP1蛋白在RNA水平上的变化情况。引物序列如 下：
因为不知道〇stml蛋白抑制病毒复制的最佳浓度范围，所以在前期的实验中
【申请人】放 大加入细胞中的Ostml蛋白的质量范围（6.75ng-1350ng)，用来筛选其最合适的作用浓度。 实验结果如图3所示。
[0030] 由图3可知：在加入Ostml蛋白质量为6.75叫、33.751^以及270叫时，￥?1蛋白的 mRNA水平与只加病毒的对照组相比较下降比较明显，说明0stml蛋白在此浓度时对EV71病 毒的mRNA的产生有比较明显的抑制作用。但是当继续提高Ostml蛋白的浓度时，发现其对 EV71病毒的复制没有抑制作用。为了进一步验证上述的实验结果，在接下来的实验中，申请 人将加入细胞中蛋白的质量范围进一步缩小（13.5ng-405ng)，实验结果如图4所示： 由图4可知，在加入Ostml蛋白的质量为13.5ng和337.5ng时，EV71病毒的VP1蛋白的 mRNA水平与不加病毒的对照组相比有明显的下降，说明当蛋白在此浓度时对EV71病毒的 mRNA的产生有比较明显的抑制作用。这与图4的实验结果基本相符，由此
【申请人】可以得出 Ostml蛋白在合适的浓度范围内可以抑制EV71病毒mRNA的产生。
[0031 ]将处于对数期的RD细胞铺六孔板，待细胞完全贴壁且长满六孔板。弃去原培养基， 换用无血清培养基。其中一个孔作为对照不加病毒，其余每孔加入EV71病毒MOIzljOmin 后，弃去原培养基，换用新鲜的无血清培养基。每个孔加入不同质量的Ostml蛋白。12h后收 集细胞，超声波破碎细胞。然后通过Western-blot实验来检测不同蛋白浓度下EV71病毒中 VP1蛋白的变化情况。实验结果如图5所示： 图5中，所添加的Ostml蛋白的质量依次为7ng、21ng、63ng、189ng、360ng和567ng。由图5 可知当加入蛋白的质量为189ng和360ng时，与只加入病毒的对照组相比，VP1的蛋白水平有 明显的下降，说明在此浓度时，Ostml蛋白对于EV71病毒的复制有比较明显的抑制作用。 [00 32] 通过在mRNA水平和蛋白水平的双重验证，证明了Ostml蛋白在一定的浓度范围内 对EV71病毒的复制确实有抑制作用，从而也证明了通过杆状病毒表达系统表达并且纯化出 来的Ostml蛋白是具有活性的。
【主权项】
1. 一种骨硬化病相关跨膜蛋白在制备治疗或预防EV71感染药物中的应用。
【文档编号】A61K38/17GK105853998SQ201610216836
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】吴建国, 邬开朗, 马春强, 潘攀, 刘映乐, 刘芳
【申请人】武汉大学