一种美洲大蠊制剂及其在制备治疗胃癌药物中的应用

文档序号:10521056阅读:623来源:国知局
一种美洲大蠊制剂及其在制备治疗胃癌药物中的应用
【专利摘要】本发明提供了一种美洲大蠊制剂及其在制备治疗胃癌药物中的应用。所述的美洲大蠊是通过提取工艺或超低温粉碎实现的。本发明研究表明,美洲大蠊提取物与美洲大蠊药粉能够有效的抑制胃癌细胞SGC-7901中VEGF的表达,对胃癌细胞或胃癌肿瘤的增殖抑制作用效果明显。本发明研究还表明,美洲大蠊提取物和美洲大蠊药粉分别与5-氮杂-2’-脱氧胞苷联用后,对体外培养的胃癌细胞SGC-7901增殖抑制率更高,分别为75.1%和83.9%;分别与TNP-470联合用药后,对荷瘤小鼠移植瘤的抑瘤率分别为75.3%和86.5%。
【专利说明】
-种美洲大喊制剂及其在制备治疗胃癌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及中药领域,特别是一种美洲大赚制剂及其在制备治疗胃癌药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国其发病率居各类肿瘤的首位,每年约 有17万人死于胃癌,几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4,且每年还有2万W上新的胃癌 病人产生出来,胃癌确实是一种严重威胁人民身体健康的疾病。胃癌可发生于任何年龄,但 W40~60岁多见,男多于女,约为2 :1。胃癌可发生于胃的任何部位,但多见于胃窦部,尤 其是胃小弯侧。未经治疗者平均寿命约为13个月。近年来,有众多的学者致力于胃癌发生 机制的研究,也取得了很大进展,但其发病机制仍然不清,亦缺乏早期诊断和早期治疗的药 物。
[0003] 恶性肿瘤最常见的转移途径包括淋己道转移和血行转移,而血管生成是肿瘤生长 和转移的关键因素。VEGF是目前已知作用较强的血管生成因子,是由肿瘤细胞分泌并特异 性作用于血管内皮细胞的一种生长因子。VEGF可W通过与血管内皮细胞表面特异性受体结 合从而发挥生物学效应。
[0004] 美洲大赚(Periplanetaamericana)属昆虫纲董赚目董赚科,俗称蜂卿、偷油婆等。 原产于南美洲,食性广泛,喜食糖和淀粉等,污染食物、传播病菌和寄生虫,是世界性卫生害 虫。而作为传统中药材,美洲大赚常W干燥或鲜成虫入药。国内目前罕见关于研究美洲大 赚对胃癌的报道。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种美洲大赚制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0006] 进一步,所述的抗肿瘤药物为抗胃癌的药物。
[0007] 进一步,所述的抗胃癌的药物为抗胃癌细胞SGC-7901的药物。
[0008] 进一步,所述的抗胃癌药物具有抑制胃癌细胞SGC-7901中VEGF的表达。
[0009] 所述的制剂是W美洲大赚为原料,经过提取加工工艺或超低溫粉碎工艺,再加上 药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0010] 所述的制剂是通过W下步骤制备得到的: 称取美洲大赚,粉碎,加入70~90%的乙醇在一定溫度下回流提取3次,时间为1~3 小时,过滤,滤液减压浓缩至比重为1. 10~1. 20 (60~65°C测),浓缩液中加入纯水,70~ 80°C下揽拌20分钟,冷藏静置,上层油脂用滤纸吸去,将下层液离屯、,上清液液经减压浓 缩、干燥、粉碎,即为美洲大赚提取物。
[0011] 其中,所述的溫度为70~95°C。
[0012] 其中,所述乙醇的加入体积量为美洲大赚原药材质量的10~12倍。
[0013] 其中,所述纯水的加入量为浓缩液质量的12倍。
[0014] 其中,所述的离屯、条件为10000~15000r/分钟,离屯、时间20~40分钟。
[0015] 所述的制剂是通过W下制备方法实现的: 曰、将美洲大赚成虫置于放置于真空干燥器中,在20~55°C下干燥至含水量为2~5%, 得干燥的美洲大赚成虫; b、将步骤a中得到的干燥的美洲大赚成虫置于超低溫粉碎机中粉碎至100目W上,即 得美洲大赚细粉。
[0016] C、向步骤b中得到的美洲大赚细粉中加入气相二氧化娃,混匀,即得美洲大赚药 粉。
[0017] 其中,步骤b中,所述的粉碎粒度优选为200目。
[0018] 其中,步骤b中,所述的超低溫粉碎机的溫度设置在-200°C~-50°C。
[0019] 其中,步骤C中,所述的气相二氧化娃的加入量为美洲大赚成虫的0~3%。
[0020] 本发明所述的抗肿瘤药物为所述的制剂与5-氮杂-2'-脱氧胞巧联合用药。
[0021] 本发明所述的抗肿瘤药物为所述的制剂与TNP-470联合用药。
[0022] 本发明研究表明,美洲大赚提取物对胃癌细胞SGC-7901的抑制率高达62. 9%,美 洲大赚药粉对胃癌细胞SGC-7901的抑制率高达72. 4%。
[0023] 本发明研究还表明,所述的美洲大赚提取物和美洲大赚药粉分别与5-氮 杂-2'-脱氧胞巧联合用药,对体外培养的胃癌细胞SGC-7901的抑制率分别为75. 1% 和83. 9%,比单独使用同浓度的美洲大赚提取物和美洲大赚药粉对体外培养的胃癌细胞 SGC-7901的抑制率要高出17. 6%和15. 8%,具有统计学意义。
[0024] 本发明研究还表明,所述的美洲大赚提取物和美洲大赚药粉分别于TNP-470联合 用药,对荷瘤小鼠体内移植瘤的抑瘤率分别为75. 3%和86. 5%,比单独使用同浓度的美洲大 赚提取物和美洲大赚药粉对荷瘤小鼠体内的移植瘤的抑瘤率高出22. 2%和20. 3%,具有统 计学意义。
[0025] 本发明研究还表明,所述的美洲大赚提取物和美洲大赚药粉具有明显抑制胃癌肿 瘤W及胃癌细胞SGC-7901中VEGF的表达的作用,具体体现在荷瘤小鼠体内移植瘤体积增 长速度得到抑制、小鼠体内血清中的VEGF含量降低W及移植瘤组织中的VEGF相对灰度值 减少;美洲大赚提取物和美洲大赚药粉分别与TNP-470联合用药后,使得荷瘤小鼠血清中 的VEGF含量与单独使用相比,具有明显降低的趋势,W及移植瘤组织中的VEGF的相对灰度 值也具有明显减少的趋势。
[0026] 综上,本发明所述的美洲大赚制剂具有明显的抑制胃癌细胞增殖W及胃癌细胞 中SGC-7901中VEGF的表达的作用,尤其是美洲大赚制剂分别与5-氮杂-2'-脱氧胞巧、 TNP-470联合用药后,效果更佳。
[0027] 显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和手段,在不脱离本发 明上述基本技术思想前提下,还可W做出其他多种形式的修改、替换或变更。
[0028] W下通过具体实施例的形式,对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不 应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现 的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1本发明所述的美洲大赚提取物 称取美洲大赚干燥的虫体lOOOg,粉碎,过80目筛,加入12L 85%乙醇在80°C、75°C、 70°C下分别回流1次,时间为3小时、2小时、1小时。过滤,滤液减压浓缩至比重为1. 15 (65°C测),浓缩液中加入浓缩液质量12倍的纯水,在75°C下揽拌20分钟,2°C下冷藏24小 时,上层油脂用滤纸吸去,下层液过滤后的滤液在13000r/分钟下离屯、30分钟,上清液经减 压浓缩、干燥、粉碎,即得美洲大赚提取物。
[0030] 实施例2本发明所述的美洲大赚提取物 称取美洲大赚干燥的虫体2000g,粉碎,过80目筛,加入20L 90%乙醇在90°C、8(rC、 70°C下分别回流1次,时间为3. 5小时、1. 5小时、1. 5小时。过滤,滤液减压浓缩至比重为 1. 10 (60°C测),浓缩液中加入浓缩液质量12倍的纯水,在70°C下揽拌20分钟,2°C下冷藏 24小时,上层油脂用滤纸吸去,下层液过滤后的滤液在lOOOOr/分钟下离屯、40分钟,上清液 经减压浓缩、干燥、粉碎,即得美洲大赚提取物。
[0031] 实施例3本发明所述的美洲大赚提取物 称取美洲大赚干燥的虫体lOOOg,粉碎,过80目筛,加入12L 70%乙醇在90°C、85°C、 75°C下分别回流1次,时间为2小时、2小时、1小时。过滤,滤液减压浓缩至比重为1. 20 (60°C测),浓缩液中加入浓缩液质量12倍的纯水,在80°C下揽拌20分钟,2°C下冷藏24小 时,上层油脂用滤纸吸去,下层液过滤后的滤液在15000r/分钟下离屯、20分钟,上清液经减 压浓缩、干燥、粉碎,即得美洲大赚提取物。
[0032] 实施例4本发明所述的美洲大赚药粉 称取lOOOg美洲大赚成虫放置于真空干燥器中,在45°C下干燥至含水量为3%后,然后 将干燥后美洲大赚成虫置于溫度设置为-150°C的超低溫粉碎机中粉碎至200目,最后加入 lOg的气相二氧化娃,混匀,即得美洲大赚药粉。
[0033] 实施例5本发明所述的美洲大赚药粉 称取2000g美洲大赚成虫放置于真空干燥器中,在20°C下干燥至含水量为5%后,然后 将干燥后美洲大赚成虫置于溫度设置为-200°C的超低溫粉碎机中粉碎至400目,即得美洲 大赚药粉。
[0034] 实施例6本发明所述的美洲大赚药粉 称取lOOOg美洲大赚成虫放置于真空干燥器中,在55°C下干燥至含水量为2%后,然后 将干燥后美洲大赚成虫置于溫度设置为-55°C的超低溫粉碎机中粉碎至100目,最后加入 30g的气相二氧化娃,混匀,即得美洲大赚药粉。
[0035] W下将通过实验例对本发明的美洲大赚提取物W及美洲大赚药粉在胃癌中的应 用做进一步说明。
[0036] 实验例1本发明所述药物对胃癌细胞增殖活性W及细胞中VEGF表达的研究 一、本发明所述的美洲大赚提取物与美洲大赚药粉对胃癌细胞SGC-7901增殖活性的 影响 1.主要试剂 实施例1制备的美洲大赚提取物;实施例4制备的美洲大赚药粉;5-氮杂-2'-脱氧胞 巧(5-Aza-CdR,购自于北京瑞博奥生物科技有限公司)。
[0037] 2. RPMI-1640培养液的配置: 1640 粉 1 包,化肥〇3 2g,10〇i7ml 青霉素 0. 5ml,10〇i7ml 链霉素 0. 5ml,加 &0 至 1 L, 磁力揽拌器上揽拌地,过滤器过滤,4°C保存备用。
[0038] 3.胃癌细胞SGC-7901的培养 从液氮罐中取出人胃癌细胞株SGC-7901冻存管,迅速放入37°C水浴中,不断摇动冻 存管,速融冻存液;吸出冻存液,注入无菌离屯、管,加入适量RPMI-1640培养液无血清,1000 巧m,离屯、5min ;弃上清,加入含10%胎牛血清RPMI-1640培养液,转入培养瓶,于37°C、湿度 适宜、5%C02恒溫解育箱中培养;次日观察有无污染、培养液的颜色变化、细胞贴壁、生长情 况等,3~4天更换培养液;待细胞贴壁达瓶底的80%,用0. 25%膜酶消化传代。
[0039] 4.实验方法 取对数生长期细胞,膜酶消化后W IX l〇5/ml接种,待过夜贴壁后,实验组细胞分别 加入含有本发明所述药物的RPMI-1640培养液,使其药物终浓度分别为5ng/ml、25ng/ml、 125ng/ml、25化g/ml ;每24 h更换新鲜药液,浓度同前不变,连续作用3 d后弃去药液,W 含10%胎牛血清RPMI-1640培养液继续培养5山对照组不加药物,仅加含10%胎牛血清 RPMI-1640 培养液。
[0040] 取上述经处理后的实验组细胞及对照组细胞,W每孔2 X lOVml的密度接种于96 孔板,每组设3个复孔。另设空白组,仅为含10%血清RPMI-1640培养液。待细胞过夜贴壁 后48小时取出96孔板,每孔内加入浓度为5g/L的四甲基偶氮挫盐(MTT) 20 μ L重新放置 于培养箱内解育4 h;用移液抢小屯、吸去每孔内培养液后加入150μΙ DMS0,置微量振荡器 上15min混匀;置酶标仪上,于490皿波长处读取吸光度(Α)。
[0041] 5.实验结果 5. 1细胞增殖抑制率的计算公式 细胞增殖抑制率=(对照组A值-空白组A值)-(药物组A值-空白组A值)/(对照 组A值-空白组A值)。
[0042] 5. 2本发明所述的药物对胃癌细胞SGC-7901增殖活性的影响结果 表1本发明所述药物在不同浓度下对胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用
注:与对照组比较* P<〇. 05,叩<0. 01 ; 由表1中的结果看出:(1)实施例1制备的美洲大赚提取物对胃癌SGC-7901细胞的抑 制作用是随浓度的增大而变大;与对照组比较,随着美洲大赚提取物的浓度的增大,差异越 显著。(2)实施例4制备的美洲大赚药粉对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用是随浓度的增大 而增大;与对照组比较,随着美洲大赚药粉的浓度的增大,差异越显著。
[0043] W上结果综合说明本发明所述的药物对胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用具有明 显的效果,同浓度作用结果相比,美洲大赚药粉的效果始终比美洲大赚提取物的效果好。
[0044] 二、联合用药对胃癌细胞株SGC-7901的增殖活性的影响 1分组 对照组:含10%胎牛血清RPMI-1640培养液; 5-Aza-CdR 组:5-Aza-CdR+RPMI-1640 培养液; 美洲大赚提取物组:实施例2制备的美洲大赚提取物+RPMI-1640培养液; 美洲大赚药粉组:实施例5制备的美洲大赚药粉+RPMI-1640培养液; 美洲大赚提取物巧-Aza-CdR组:实施例1制备美洲大赚提取物 巧-Aza-CdR+RPMI-1640 培养液; 美洲大赚药粉巧-Aza-CdR组:实施例5制备的美洲大赚药粉巧-Aza-CdR+RPMI-1640 培养液。
[004引 2.实验方法 在本实验中,根据分组情况同上述试验方法进行细胞培养(各组培养液中药物浓度如 表2中),实验完后收集药物处理后的细胞进行后续实验。
[0046] 检测方法同上,整个实验重复3次,取平均值,记录每一组的吸光度(A)。
[0047] 3.实验结果 表2联合用药对胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制作用
注:与对照组相比^表示P<〇. 05, "^表示P<0. 01 ;与美洲大赚提取物组相比,#P<0. 05 ; 与美洲大赚药粉组相比,&P<〇. 05 ;与5-Aza-CdR组相比,中<0. 05。
[0048] 由表1中的实验数据可W得到:本发明所述的美洲大赚提取物和美洲大赚药粉 对胃癌细胞的增殖抑制率明显高于使用5-Aza-CdR对胃癌细胞SGC-7901增殖抑制率,抑 制率分别为57. 5%和68. 1%,具有显著的差异,P<0. 05 ;美洲大赚提取物或美洲大赚药粉与 5-Aza-CdR联合用药后对胃癌细胞SGC-7901的抑制作用明显高于单独使用美洲大赚提取 物或美洲大赚药粉,抑制率分别为75. 1%、83. 9%,为临床提供了有力的依据。
[0049] Ξ、半定量RT-PCR检测药物处理前后SGC-7901细胞VEGFmRNA的表达 1. Trizol细胞裂解法提取细胞总RNA 取出上述实验结束后的细胞,0. 25%膜酶消化悬浮分别收集细胞于15ml离屯、管,1000 巧m,离屯、10 min;弃上清,悬起,移入EP管,加入600 μ L Trizol,吹打混匀,室溫静止5 min ;加入120 μL Ξ氯甲烧(1/5体积Trizol),振荡混匀,室溫静止5 min,4°C,12000巧m, 离屯、15 min,上清分别移入另一干净的EP管;加入与上清等体积的异丙醇,混匀,室溫静止 10 min, 4°C,12000;rpm,离屯、10 min,弃上清,加入 1ml 预冷 75% 乙醇;4°C,12000;rpm,离屯、 5 min;弃上清,超净工作台吹干,约10 min,加入DEPC水30 μ L,溶解约30 min,即得模板 RNAo
[0050] 2. RNA完整性的检测 取10 μ 1上述模板RNA加适量6xloading buffer混匀,于2%琼脂糖凝胶电泳,观看条 带情况,W确定提取样本中RNA的纯度W及DNA和蛋白质的混杂程度。28S和18S真核细胞 RNA比值约为2 : 1,表明无 RNA降解。如该比值逆转,则表明有RNA降解。此外可取少量 提取的RNA,经紫外线分光计测定0D值,根据孤26。/〇〇28。比值再次验证RNA纯度,根据公式 RNA浓度(ug/ml) =0〇26。值X 40ug/ml X稀释倍数计算出所提取RNA浓度,一般在1. 7-2. 0 之间。
[0051] 3.逆转录-聚合酶链反应 逆转录反应体系: A :
反应条件:65°C水浴5min (变性,使RNA二级结构打开),迅速置于冰盒上,冷却2 min (退火,使引物与RNA结合)。
[0052] B : B加到Λ里,混匀(冰盒上^^^
[0053] 反应条件:42°C水浴比(反转录,W RNA为模板合成cDNA)。70°C水浴15min (酶 失活,cDNA二级结构打开),置冰盒上迅速冷却(避免cDNA重新形成二级结构),所得cDNA溶 液可直接用于PCR扩增。-20°C保存备用。
[0054] 4. PCR 扩增 4.1引物序列 (1) VEGF mRNA : 上游引物序列:5'- GATGGCAGGCAATGACGA -3' ; 下游引物序列:5'- TGCTGAAGTGGCTTGTGGTGCTGA -3' ; VEGF扩增产物353bp。
[005引 (2)用G3P畑mRNA做为内参照: 上游引物序列:5'- ACGCATTTGGTCGTATTGGG -3' ; 下游引物序列:5'- TGATTTTGGAGGGATCTCGC -3' ; G3PDH扩增产物230bp。
[005引 4. 2 PCR反应体系

4. 3 PCR扩增条件: 94°C 5min预变性
52°C 50sec退火35个循环 72°C 45sec 延伸 72°C 7min 延伸 4°C保存备用 PCR扩增产物取10μ1 120V、90mA条件下在2%琼脂糖凝胶上进行电泳约40min,用凝胶 成像分析系统照相并用软件进行灰度值分析。计算各个样本VEGF表达水平,表达量的相对 值(Relative expression value)=待测基因扩增条带的灰度值/G3PDH基因扩增条带的灰 度值。
[0057] 5.实验结果:见表3 表3药物组细胞Runx3 mRNA的相对表达量(+S)
由表3中的结果可W得出,与对照组相比,美洲大赚提取物组和美洲大赚药粉组中,胃 癌细胞SGC-7901中VEGFmRNA均无表达,具有显著的差异,P<0. 05 ;所述的美洲大赚提取物 或美洲大赚药粉与5-Aza-CdR联合用药后,胃癌细胞SGC-7901中VEGFmRNA无表达。说明 本发明所述的药物具有抑制胃癌细胞SGC-7901中VEGF的表达的作用。
[0058] 综上实验结果说明,(1)本发明所述的美洲大赚提取物和美洲大赚药粉均具有对 胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用,且效果明显,抑制率随着使用药物浓度的增大而增大, 具有临床意义;(2)美洲大赚提取物或美洲大赚药粉与5-Aza-CdR联合用药后对胃癌细胞 SGC-7901增殖抑制作用具有意想不到的效果,比单独使用同浓度的美洲大赚提取物或美洲 大赚提取物或5-Aza-CdR的抑制率都高,可W达到83. 9% ; (3)同时上述实验还说明了本发 明所述的药物具有抑制胃癌细胞SGC-7901中VEGF的表达的作用,通过抑制VEGF的表达从 而达到抑制胃癌细胞增殖的作用。
[0059] 实验例2本发明所述美洲大赚提取物对荷瘤小鼠血清与移植瘤组织中VEGF表达 的研究 1.建立裸小鼠移植瘤模型 将已培养好基本长满瓶壁的SGC-7901胃癌细胞弃培养瓶内培养基,用PBS液冲洗培 养瓶2次,加入0. 25%膜蛋白酶数滴消化,将消化好的细胞吸入离屯、管内,600 r/min离屯、 6 min,弃上清,加入不含小牛血清的RPMI1640培养基3 ml,吸管吹打混匀(取适量计数细 胞),再离屯、(600;r/min,6min),弃上清,按每只裸小鼠皮下接种细胞数5X106/0. 2 ml,即 2. 5 X 107/ml,再加入无血清RPMI1640培养基,供裸小鼠皮下接种用。准备好的SGC-7901胃 癌细胞悬液经苔吩蓝染色活细胞数>95%,将60只裸小鼠(雌雄各半,体重在18~20g)按每 只0. 2 ml SGC-7901细胞悬液注射于消毒后的皮下后,观察小鼠成瘤情况,最后共有59只 建模成功。
[0060] 6. 2实验分组 将上述的建模成功的裸小鼠随机分成6组,对照组9只,其余组各10只。在裸小鼠接 种SGC-7901细胞后第15天开始用药。此时测量并记录裸小鼠体内的移植瘤大小,各组之 间无显著差异。各组用药情况如下: ① 对照组:纯水,0.2 ml/次,隔日腹腔注射1次,共8次; ② TNP-470组:TNP-470 30 mg/kg/次,隔日腹腔注射1次,共8次; ③ 美洲大赚提取物组:实施例3制备的美洲大赚提取物lOOmg/kg/次,隔日腹腔注射 1次,共8次; ④ 美洲大赚药粉组:实施例6制备的美洲大赚药粉80mg/kg/次,隔日腹腔注射1次,共 8次; ⑥TNP-470+美洲大赚提取物组:(TNP-47030 mg/kg+实施例3制备的美洲大赚提取物 lOOmg/kg) /次,隔日腹腔注射1次,共8次; ⑧TNP-470+美洲大赚药粉组:(TNP-47030 mg/kg+实施例6制备的美洲大赚药粉 80mg/kg) /次,隔日腹腔注射1次,共8次。
[0061] 上述TNP-470为长春天诚药业有限公司产品。
[0062] 给药期间,每隔4天,测量一次小鼠体内移植瘤体积,按最后一次测量体积计算药 物的抑瘤率(抑瘤率%=(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)X 100%)。
[0063] 6. 3VEGF 表达检测 皮下移植瘤标本分别进行肥染色和VEGF免疫组化染色分析;利用VEGF ELISA检测试 剂盒检测各实验组血清中VEGF的含量。
[0064] 6.4 VEGF表达的半定量分析(免疫组化) 将染色结果用MIG 2000图像分析软件进行分析。各组标本分别1张切片,在10X20 倍视野下随机选择背景和阳性组织区域各10处,测其灰度值并取均值。计算阳性组织相对 灰度值(阳性组织灰度值/背景灰度值,relative grey value, RGV ),并统计分析。
[0065] 7.统计方法及实验结果 实验数据采用SPSS17. 0统计软件作处理,计量数据描述用"± S"表示,多组间均数 比较采用单因素方差分析。P <0.05表示差别有统计学意义。
[0066] 7. 1实验前后荷瘤小鼠体内移植瘤体积大小 表4各组荷瘤小鼠移植瘤实验前后体积大小(皿3) (+S)

注:与对照组相比,冲<0. 05, *冲<0. 01 ;与TNP-470组相比,胖<0. 05 由表4中数据的可W得出,在给药期间,荷瘤小鼠体内的移植瘤体积增长明显得到了 抑制,与对照组相比,具有显著的差异;与TNP-470组相比,美洲大赚提取物组、美洲大赚药 粉组、美洲大赚提取物巧NP-470组、美洲大赚药粉巧NP-470组中荷瘤小鼠移植瘤体积明显 比TNP-470组小,具有显著的差异,P<0. 05。由上表数据还可W得到联合用药组的抑瘤率明 显高于单独用药组,所W本发明所述的药物具有明显的抗胃癌肿瘤的作用。
[0067] 7.2各组荷瘤小鼠移植瘤组织中VEGF的表达 VEGF呈栋黄色细颗粒状,定位于肿瘤细胞及部分成纤维细胞胞质内,各组移植瘤组织 中VEGF相对灰度值如表5中: 表5各组荷瘤小鼠移植瘤组织中VEGF相对灰度值(+S)_
注:与对照组相比,*表示P<〇. 05, **表示P<0. 01。
[006引 由表5中的结果得到,与对照组相比,对照组VEGF相对灰度值(RGV )明显高于 TNP-470组、美洲大赚提取物组(实施例3)、美洲大赚药粉组(实施例6)、美洲大赚提取物 巧NP-470组、美洲大赚药粉巧NP-470组,均具有显著的差异性;美洲大赚提取物组(实施例 3)、美洲大赚药粉组(实施例6)与TNP-470组相比VEGF的RGV无显著差异,不具有统计学 意义。而美洲大赚提取物和美洲大赚药粉分别与TNP-470联用后,荷瘤小鼠移植瘤组织中 VEGF相对灰度值比单独使用TNP-470、美洲大赚提取物、美洲大赚药粉后荷瘤小鼠移植瘤 组织中VEGF相对灰度值要低。进一步说明本发明所述的药物都具有抑制胃癌细胞中VEGF 的表达的作用,且联合用药效果更为明显。
[0069] 7. 3各实验组裸小鼠血清中VEGF的含量 表6各组中裸小鼠血清中VEGF的含量
注:与对照组相比,*表示P<〇. 05, **表示P<0. 01。
[0070] 由表6中结果得到,与对照组相比,TNP-470组、美洲大赚提取物组(实施例3)、美 洲大赚药粉组(实施例6)、美洲大赚提取物巧NP-470组、美洲大赚药粉巧NP-470组的VEGF 含量均明显低于对照组,具有显著性差异;美洲大赚提取物组(实施例3)、美洲大赚药粉组 (实施例6)与TNP-470组VEGF含量相比无显著差异,不具有统计学意义;美洲大赚提取物 和美洲大赚药粉分别与TNP-470联用后的裸小鼠血清中VEGF含量明显低于TNP-470、美洲 大赚提取物、美洲大赚药粉单独使用后裸小鼠血清中VEGF含量。表6中的结果进一步说明, 本发明所述的药物对胃癌细胞VEGF的表达有明显的抑制作用,联合用药效果更显著。
[007。 综上所述,本发明所述的药物具有明显抑制胃癌细胞SGC-7901中VEGF的表达的 作用,对体外培养的胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用明显,特别是所述药物中的美洲大赚 药粉与5-氮杂-2'-脱氧胞巧联合用药后对胃癌细胞SGC-7901抑制率可W高达83. 9%,比 单独使用5-氮杂-2'-脱氧胞巧的抑制率高出38. 3%,比单独使用美洲大赚药粉的抑制率 高出15. 8%。本发明所述的美洲大赚提取物或美洲大赚药粉与TNP-470联合用药后作用于 荷瘤小鼠,对移植瘤的抑瘤率可W高达86. 5%,比单独使用TNP-470的抑瘤率高出53. 2%,比 单独使用美洲大赚药粉的抑瘤率高出20. 3%。
[0072] 本发明中所述的胃癌细胞SGC-7901 W及实验所用的试剂在市场上均有售。
【主权项】
1. 一种美洲大蠊制剂在制备治疗胃癌药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的应用为在制备治疗抗胃癌细胞 SGC-7901的药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用为在抑制胃癌细胞SGC-7901中 VEGF表达的应用。4. 一种美洲大蠊制剂,其特征在于,所述的制剂是以美洲大蠊虫体为原料,经过提取加 工工艺或者超低温粉碎工艺,最后加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。5. 根据权利要求4所述的制剂,其特征在于,所述的制剂是由如下方法制备得到:称 取美洲大蠊虫体,粉碎,加入70~90%的乙醇在70~95°C下回流提取3次,时间为1~3 小时,过滤,滤液减压浓缩至比重为1. 10~1. 20,浓缩液中加入浓缩液质量12倍的纯水, 70~80°C下搅拌20分钟,冷藏静置,上层油脂用滤纸吸去,将下层液离心,上清液液经减压 浓缩、干燥、粉碎,即得美洲大蠊提取物; 其中,所述乙醇的加入体积量为美洲大蠊原药材质量的10~12倍; 其中,所述的离心条件为10000~15000r/分钟,离心时间20~40分钟。6. 根据权利要求4所述的制剂,其特征在于,所述的制剂是由如下步骤实现的:a、将美 洲大蠊成虫置于放置于真空干燥器中,在20~55°C下干燥至含水量为2~5%,得干燥的美 洲大蠊成虫; b、 将步骤a中得到的干燥的美洲大蠊成虫置于超低温粉碎机中粉碎至100目以上,即 得美洲大蠊细粉; c、 向步骤b中得到的美洲大蠊细粉中加入气相二氧化硅,混匀,即得美洲大蠊药粉; 其中,步骤b中,所述的超低温粉碎机的温度设置在-200°C~_50°C ; 其中,步骤c中,所述的气相二氧化硅的加入量为美洲大蠊成虫的0~3%。7. 根据权利要求6所述的制剂,其特征在于,步骤b中所述的粉碎粒度优选为200目。8. 根据权利要求1~3中任意一项所述的应用,其特征在于,所述的药物为权利要求4 所述的制剂与5-氮杂-2' -脱氧胞苷联合用药。9. 根据权利要求1~3中任意一项所述的应用,其特征在于,所述的药物为权利要求4 所述的制剂与TNP-470联合用药。
【文档编号】A61K31/7068GK105878289SQ201510389994
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年7月6日
【发明人】耿福能, 沈咏梅
【申请人】四川好医生攀西药业有限责任公司
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