壳聚糖还原敏感体系作为基因药物递送载体的应用
【专利摘要】本发明涉及一种还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其特征在于该载体是在壳聚糖骨架上通过含二硫键的可特异性降解连接臂引入富含氨基的化合物，能够通过静电吸附紧密压缩带负电荷的siRNA，形成纳米粒，并可通过质子海绵效应从内吞体内逃逸，纳米粒到达胞浆后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度的还原性物质谷胱甘肽特异性降解，所负载的siRNA快速释放，作用于靶点，从而显著提高基因药物的沉默效果。该辅料作为基因载体，用于血管内注射、肌肉注射、外用、口服等给药方式，具有高度的安全性。本发明制备方法简单，工艺成熟，适用于大规模连续生产。
【专利说明】
亮聚糖还原敏感体系作为基因药物递送载体的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物制剂领域，设计一种还原敏感型壳聚糖衍生物作为基因药物载 体，本发明还设及该载体的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖是甲壳素的脱乙酷化衍生物，是自然界唯一的碱性天然多糖，来源广泛。壳 聚糖是生物相容性良好、无毒的多聚阳离子，并且有较低的免疫原性。壳聚糖是优良的基因 载体材料，它可通过静电吸附和氨键与带负电荷的基因药物相结合，保护基因药物免受核 酸酶的降解，并且携带基因类型大小不受限制。为了提高壳聚糖水溶性，及增加电荷密度W 提高其压缩基因能力，目前已有多种壳聚糖-富含氨基化合物接枝物的报道，如：壳聚糖- PEI接枝物（J Control Release.，2007，117(2):273-80)，壳聚糖-精胺化ur J Pharm Biopharm，2011，77 (1): 36-42)等，修饰的富含氨基化合物不仅增加了壳聚糖的水溶性，而 且对基因的压缩能力及体内递送稳定性显著提高。但是载体到达祀细胞内，由于过强的壳 聚糖衍生物和基因药物的电荷相互作用导致载体基因药物释放过于缓慢，而造成基因沉默 效果不佳。
[0003] 具有特定结构的药物递送系统能选择性地蓄集于肿瘤组织，经肿瘤部位微环境刺 激(如抑、溫度、超声等），可在祀部位有效释药，从而增加药物的疗效、减轻不良反应。近年 的研究发现，人体细胞内的细胞质、线粒体及细胞核均含有高浓度的还原型谷脫甘肤(GSH) (2~lOmM)，而循环系统及细胞外液由于快速的酶解作用，其含量仅为细胞内的1/100~1/ 1000(2~20μπι)。肿瘤组织，由于代谢异常，其细胞内G細含量进一步增加，至少是正常细胞 内环境G甜浓度的4-10倍W上。肿瘤细胞内高浓度的还原型谷脫甘肤会导致谷脫甘肤转移 酶和谷脫甘肤超氧化物酶含量的显著升高，运种变化已被临床应用于肿瘤的诊断。细胞内 与细胞外G甜浓度的显著性差异是设计还原敏感型药物递送系统的前提条件，鉴于肿瘤细 胞内具有更强的还原性环境，可W构建对肿瘤细胞内还原性环境特异性响应的细胞内触发 式释药体系。
[0004] 针对W上问题，本专利W天然多糖壳聚糖为骨架，在2位径基上连接环氧乙烧使其 在生理抑下能够溶解，并通过含二硫键的可被还原物质特异性降解连接臂引入富含氨基的 化合物，形成还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，该载体具有一下特征:①该载体可 通过静电吸附紧密压缩带负电荷的siRNA，形成纳米粒。②载体可通过质子海绵效应从内吞 体逃脱到达胞浆后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度的还原型物质谷脫甘肤特异性 降解，所负载的siRNA快速释放，作用于祀点，显著提高基因药物的沉默效果。通过含二硫键 的连接臂在壳聚糖上引入富含氨基化合物的抗肿瘤非病毒基因载体尚未见任何文献和专 利报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体。该基因载体 制备工艺简单，能够通过静电吸附紧密压缩带负电荷的siRNA，形成纳米粒。并可通过质子 海绵效应从内吞体逃逸到达胞浆后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度的还原性物质 谷脫甘肤特异性降解，所附载的siRNA快速释放作用于祀点。该基因载体稳定性好，能够显 著提高基因药物的沉默效果，达到有效杀死癌细胞的目的。
[0006] 本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。
[0007] 本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。
[000引为了达到上述目的，本发明提供了一种还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载 体，其化学结构如下列化学式所示：
[0009] 肥 CS-[-(邸2 ) nS-S (邸2 ) m-SPM ] R
[0010] 其中：肥CS为径乙基壳聚糖;n+m为还敏连接臂所含亚烷基的个数;SPM为富含氨基 的化合物;R为径乙基壳聚糖分子上富含氨基化合物的取代个数。
[0011] 所述的还原敏感抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其中连接臂含有病灶部位特异性 降解的二硫键，且两端反应基团均为簇基或一端反应基团为簇基另一端反应基团为氨基， 连接臂亚烷基个数为2~16的整数。
[0012] 所述的还原敏感抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其中富含氨基化合物包括精氨 酸、组氨酸、精胺、聚乙締亚胺、多聚酷胺。
[0013] 所述的还原敏感抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其中壳聚糖分子链上富含氨基化 合物的取代个数为2~300的整数。
[0014] 所述的还原敏感抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其中壳聚糖分子与二硫键连接臂 的一端通过酷胺键相连，连接臂的另一端与富含氨基化合物也通过酷胺键相连。
[0015] 还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体的制备方法详细说明如下：
[0016] 1、径乙基壳聚糖的合成
[0017] 将壳聚糖溶于异丙醇或醋酸水溶液中，NaOH碱化1~12h，冰水浴下加入环氧乙 烧，35-50°C揽拌2~24h，调节pH 6~8，采用透析法纯化，冻干即得水溶性径乙基壳聚糖 (肥 CS)。
[0018] 合成路线化学式如下：
[0019]
[0020] 2、含有二硫键的反应中间体的合成
[0021] ①将一定量的径乙基壳聚糖溶于反应溶剂中，加入过量的含有二硫键且两端为簇 基的连接臂，W径乙基班巧酷亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺化DC)为 活化剂，反应12-24h旋转蒸发除去甲醇，透析冻干即得含有二硫键的反应中间体I。
[0022] 中间体I的合成路线化学式如下：
[0023]
[0024] 其中：皿CS-N此为径乙基壳聚糖;n+m为还敏连接臂所含亚烷基的个数，所述连接 臂亚烷基个数为2~16的整数;R为径乙基壳聚糖分子上含二硫键连接臂取代的个数，所述 含二硫键连接臂取代的个数为2~600的整数。
[0025] ②将一定量的径乙基壳聚糖溶于反应溶剂中，加入过量的含有二硫键且一端为氨 基一端为簇基的连接臂，W径乙基班巧酷亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚 胺巧DC)为活化剂，反应12-24h后使用过量的丙酬将壳聚糖沉淀出来，透析冻干即得含有二 硫键的反应中间体II。
[0026]
[0027]其中：皿CS-N此为径乙基壳聚糖;n+m为还敏连接臂所含亚烷基的个数，所述连接 臂亚烷基个数为2~16的整数;R为径乙基壳聚糖分子上含二硫键连接臂取代的个数，所述 含二硫键连接臂取代的个数为2~600的整数。
[002引3、富含氨基化合物与中间体I、II的反应
[0029] ①将一定量的中间体I溶于反应溶剂中，加入过量富含氨基的化合物，W径乙基班 巧酷亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺化DC)为活化剂，反应12-24h后透 析冻干即得还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体。
[0030] 含多个氨基的化合物与中间体I的反应路线化学式如下：
[0031]
[0032] 其中SPM-N出为富含氨基化合物;n+m为还敏连接臂所含亚烷基的个数，所述连接 臂亚烷基个数为2~16的整数;R为径乙基壳聚糖通过含二硫键连接臂取代富含氨基化合物 的个数，所述取代富含氨基化合物的个数为2~300的整数。
[0033] ②将一定量的中间体II溶于反应溶剂中，加入过量富含氨基的化合物，W径乙基 班巧酷亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺化DC)为活化剂，反应12-24h后 透析冻干即得还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体。
[0034] 富含氨基化合物与中间体II的反应路线化学式如下：
[0035]
[0036] 其中SPM-C00H为富含氨基化合物;n+m为还敏连接臂所含亚烷基的个数，所述连接 臂亚烷基个数为2~16的整数;R为径乙基壳聚糖通过含二硫键连接臂取代富含氨基化合物 的个数，所述取代富含氨基化合物的个数为2~300的整数。
[0037] 载siRNA的还原敏感型抗肿瘤纳米粒的制备方法如下：
[003引按照质量比（载体:基因）为30的比例，将基因加入到载体溶液中，满旋30s，静置 30min即得载siRNA的还原敏感型抗肿瘤纳米粒。
[0039] 还原敏感型抗肿瘤纳米粒的制备原理为静电吸附原理，即还原敏感抗肿瘤壳聚糖 衍生物基因载体在生理pH条件下带正电，SiRNA带负电，二者可通过静电吸附结合形成纳米 粒。
[0040] 本发明的有益效果：
[0041] -、本发明作为非病毒基因载体，采用天然碱性多糖壳聚糖为骨架，具有良好的生 物相容性、生物降解性，毒副作用小。
[0042] 二、本发明在壳聚糖的氨基端W含二硫键的连接臂引入富含氨基的化合物，能够 通过静电吸附紧密压缩带负电荷的siRNA形成纳米粒，并可通过质子海绵效应从内吞体逃 逸到达胞浆，有效防止siRNA被内吞体中的酶所降解。
[0043] Ξ、本发明在壳聚糖的氨基端W含二硫键的连接臂引入富含氨基的化合物，此二 硫键在体循环和内环境中稳定性较高，但易被病灶细胞内高浓度的还原型物质谷脫甘肤降 解，从而载药纳米粒能够在血浆中保持稳定，并在病灶细胞内快速释放，作用于祀点，从而 显著提高基因药物的沉默效果。
[0044] 四、本发明提供的还原敏感型抗肿瘤纳米粒可用于血管内注射给药、肌肉注射、外 用或口服等给药途径，具有高度安全性。
【具体实施方式】
[0045] 下面通过实施例对本发明加 W进一步说明，但下述实施例并不限制本专利的权利 范围。
[0046] 实施例1 :径乙基壳聚糖-组氨酸还原敏感共聚物的制备
[0047] 将Ig壳聚糖溶于异丙醇溶液中，加入10ml 50%化0H溶液，碱化完成后，往反应溶 液中加入10ml环氧乙烧，35-50°C油浴条件下磁力揽拌2~2地，将反应液调节抑至7,透析冻 干即得水溶性径乙基壳聚糖。
[004引将0.3g径乙基壳聚糖溶于水和甲醇（v/v=l:l)的混合溶剂中，加入0.6g S-氨乙 基-3，4-二硫代丙酸、0.547g EDC和0.328g NHS，反应12h，旋转蒸发除去甲醇，透析(MWC0 = 14000)2-3天，冻干即得游离一段为氨基的壳聚糖中间体。
[0049] 将0.25g壳聚糖中间体、0.22g组氨酸、1.36g EDC和0.818g NHS，反应12h，反应结 束后使用过量的丙酬沉淀多糖，过滤并纯化即得径乙基壳聚糖-组氨酸还原敏感共聚物。同 时仅更换连接臂，用相同的方法制备非还敏共聚物作为对照。
[0050] 实施例2:径乙基壳聚糖-精胺还原敏感共聚物的制备
[0051] 将Ig壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入10ml 50%化0H溶液，碱化完成后，往反应溶液 中加入10ml环氧乙烧，35-50°C油浴条件下磁力揽拌2~2地，将反应液调节抑至7,透析冻干 即得水溶性径乙基壳聚糖。
[0052] 将0.3g径乙基壳聚糖溶于水和甲醇(v/v = l:l)的混合溶剂中，加入0.6的，3'-二 硫代二丙酸、0.547g EDC和0.328g NHS，反应12h，旋转蒸发除去甲醇，透析(MWC0= 14000) 2-3天，冻干即得游离一段为簇基的壳聚糖中间体。
[0053] 将0.3g壳聚糖中间体、0.1337g精胺、0.1785g EDC和0.1065g NHS，反应2地，透析 (MW=14000)3天，冻干即得径乙基壳聚糖-精胺还原敏感共聚物。同时仅更换连接臂，用相 同的方法制备非还敏共聚物作为对照。
[0054] 实施例3:径乙基壳聚糖-精氨酸还原敏感共聚物的制备
[0055] 将Ig壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入10ml 50%化0H溶液，碱化完成后，往反应溶液 中加入10ml环氧乙烧，35-50°C油浴条件下磁力揽拌2~2地，将反应液调节抑至7,透析冻干 即得水溶性径乙基壳聚糖。
[0056]将0.3g径乙基壳聚糖溶于水和甲醇（v/v=l:l)的混合溶剂中，加入0.6g S-氨乙 基-3，4-二硫代丙酸、0.547g EDC和0.328g NHS，反应12h，旋转蒸发除去甲醇，透析(MWC0 = 14000)2-3天，冻干即得游离一段为氨基的壳聚糖中间体。
[0057] 将0.3g壳聚糖中间体、0.115g精氨酸、0.154g EDC和0.092g NHS，反应12h，透析 (MW=14000)3天，冻干即得径乙基壳聚糖-精氨酸还原敏感共聚物。同时仅更换连接臂，用 相同的方法制备非还敏共聚物作为对照。
[005引实施例4:载siRNA的还原敏感壳聚糖纳米粒的制备与表征 [0化9] 1、制备工艺
[0060] 分别按照质量比(载体:基因）为20、30、40、50、60的比例，将SiRNA加入到载体溶液 中，满旋30s，静置30min即得载SiRNA的还原敏感型抗肿瘤纳米粒。
[0061] 琼脂糖凝胶电泳结果显示载药质量比(载体:基因）为20的纳米粒在紫外灯下有明 显移动的条带，载药质量比（载体:基因）为30、40、50、60的纳米粒都完全滞留在孔中，因此 确定最佳载药质量比(载体:基因）为30。
[0062] 2、包封率的测定
[0063] W载药质量比(载体:基因）为30制备纳米粒，然后将其置于高速冷冻离屯、机中，在 4°C条件下高速离屯、（转速200(K)r/minnh，然后通过高效液相（十八烷基硅烷柱，流动相： 72/28(v/v)Ξ乙基乙酸锭缓冲液：乙腊)测定上清液中FAM-SiRNA的量，通过计算得出，该纳 米粒的包封率在95 % W上。
[0064] 实施例5:载SiRNA的还原敏感壳聚糖纳米粒的体外释放
[0065] ^载药质量比（载体:基因）为30制备纳米粒，分别将其置于2〇1111、1(^的抑=7.4 的G甜溶液中（20πιΜ、10μΜ分别模拟肿瘤细胞和普通细胞中的GSH浓度），分别过0.化、化、化、 化、地、化、10h、l化、24h、3化后，将其置于高速冷冻离屯、机中，在4°C条件下高速离屯、(转速 2000化/min)比，然后通过高效液相(十八烷基硅烷柱，流动相:72/28( v/v)Ξ乙基乙酸锭缓 冲液:乙腊)测定上清液中FAM-siRNA的量，绘制释放曲线，结果见图1。
[0066] 实施例6:还原敏感壳聚糖载体与载药纳米粒的细胞毒性实验
[0067] 1、还原敏感壳聚糖载体的细胞毒性实验
[006引将人肺腺癌细胞A549接种于96孔板中，解育24h后加入浓度范围在0.00化g/mL到 500yg/mL的壳聚糖还原敏感载体溶液化CSS)，同时加入范围在0.00扣g/mL到5(K)yg/mL的壳 聚糖非还敏载体溶液化CS)作为对照，37°C条件下解育72h，每孔加入20化MTT(浓度为5mg/ mL)，解育4h，每孔加入100μΜ DMS0显色，用全自动定量酶标仪在570nm读取各孔吸光度，换 算后绘制柱形图，结果见图2。
[0069] 2、还原敏感载SiRNA纳米粒的细胞毒性实验
[0070] 将人肺腺癌细胞A549接种于96孔板中，解育2地后加入浓度范围在0.32化g/mL到 3.25yg/mL的壳聚糖还敏载药纳米粒溶液化CSS-siAU服A)，同时加入范围在0.32扣g/mL到 3.25yg/mL的壳聚糖非还敏载药纳米粒溶液化CS-siAU服A)作为对照，37°C条件下解育72h， 每孔加入20化MTT(浓度为5mg/mL)，解育地，每孔加入10化L DMS0显色，用全自动定量酶标 仪在570nm读取各孔吸光度，换算后绘制折线图，结果见图3。
【附图说明】
[0071] 图1为载siRNA的还原敏感壳聚糖纳米粒的体外释放曲线。
[0072] 图2为还原敏感壳聚糖载体的细胞毒性实验结果。
[0073] 图3为还原敏感载SiRNA纳米粒的细胞毒性实验结果。
【主权项】
1. 一种还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其特征在于该载体是在壳聚糖骨架 上通过含二硫键的可特异性降解连接臂引入富含氨基的化合物，能够通过静电吸附紧密压 缩带负电荷的si RNA，形成纳米粒，并可通过质子海绵效应从内吞体内逃逸，纳米粒到达胞 浆后，其二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度的还原性物质谷胱甘肽特异性降解，所负载 的SiRNA快速释放，作用于靶点，从而显著提高基因药物的沉默效果。2. 如权利要求1所述的还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其结构如下列化学 式所示:HECS- [ - (CH2) nS-S (CH2) m-SPM ] R 其中：HECS为羟乙基壳聚糖，n+m为还敏连接臂所含亚烷基的个数，SPM为富含氨基化合 物;R为羟乙基壳聚糖分子上富含氨基化合物取代的个数。3. 如权利要求1所述的还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其特征在于还敏连 接臂所含亚烷基的个数n+m为2~16的整数；4. 如权利要求1所述的还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其特征在于富含氨 基化合物SPM选自精氨酸、组氨酸、精胺、聚乙烯亚胺、多聚酰胺。5. 如权利要求1所述的还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其特征在于富含氨 基化合物取代的个数R为2~300的整数。6. 如权利要求1所述的还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体，其特征在于连接臂 含有病灶部位特异性降解的二硫键，且两端的反应基团均为羧基或一端反应基团为氨基另 一端反应基团为羧基。7. 权利要求1所述的还原敏感型壳聚糖衍生物基因载体的制备方法，其特征包括下列 步骤； (1) 将壳聚糖溶于反应溶剂中，加入环氧乙烷，制得亲水基团修饰的羟乙基壳聚糖 (HECS)。将羟乙基壳聚糖置于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端为羧基的连接臂，以羟基 琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺(EDC)为活化剂进行酰胺化反 应，壳聚糖与连接臂一端的羧基反应得到中间体。将含多个氨基的化合物溶于反应溶剂中， 以羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂，含多个 氨基的化合物与中间体进行酰胺化反应，即得还原敏感型壳聚糖衍生物基因载体。 (2) 将壳聚糖溶于反应溶剂中，加入环氧乙烷，制得亲水基团修饰的羟乙基壳聚糖 (HECS)。将羟乙基壳聚糖置于反应溶剂中，采用含有二硫键且一端为羧基一端为氨基的连 接臂，以羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂进 行酰胺化反应，壳聚糖与连接臂一端的羧基反应得到中间体。将富含氨基的化合物溶于反 应溶剂中，以羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化 剂，富含氨基的化合物与中间体进行酰胺化反应，即得还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基 因载体。8. 权利要求4所述的还原敏感型抗肿瘤壳聚糖衍生物基因载体的制备方法，其特征在 于所述反应溶剂为水、甲醇、水与甲醇的混合溶剂、水与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂或水 与甲酰胺的混合溶剂。9. 权利要求1所述的还原敏感型壳聚糖衍生物基因载体的应用，用于制备肌肉注射、血 管内注射、外用或口服的基因药物的载药载体。10. 如权利要求6所述的应用，其特征在于该负载SiRNA的还原敏感型壳聚糖衍生物纳 米粒的制备方法包括以下步骤：还原敏感型壳聚糖衍生物载体与水按重量比为1~20: 10000的比例溶解，得到还原敏感型壳聚糖衍生物溶液;将siRNA滴加到壳聚糖衍生物溶液 中，祸旋30s，静置30min，制得粒径在10~1000 nm的载药纳米粒。
【文档编号】C08B37/08GK105879056SQ201610194550
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】霍美蓉, 周建平, 秦晨
【申请人】中国药科大学