药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法

药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法
【专利摘要】本发明提供用于将药物递送至脑的囊泡、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法。本发明提供含有药物递送用载体、用于按照施予计划施予至对象的组合物，所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食或已诱发低血糖的对象，并且诱发所述对象的血糖值上升，所述载体的外表面经GLUT1配体修饰。
【专利说明】药物递送用载体、偶联物及含有送些成分的组合物从及它们 的施予方法
[0001] 相关申请的相互参考
[0002] 本申请享受日本特愿2013-242347号（申请日：2013年11月22日）及日本特愿 2014-96935号（申请日：2014年5月8日）的优先权权益，上述申请通过引用整体并入本说明 书中。
技术领域
[0003] 本发明设及药物递送用载体、偶联物及含有运些成分的组合物W及它们的制造方 法和施予方法。
【背景技术】
[0004] 已知在血液与脑之间，存在限制物质交换的血脑屏障。可W认为，其成因是脑血管 内皮细胞形成密合连接，细胞的间隙极其狭窄，W及，细胞自身进行选择性的物质摄入及排 出。
[0005] 血脑屏障的选择透过性高，除了一部分物质（例如，酒精、咖啡因、尼古下及葡萄 糖)之外几乎无法通过。因此，运一现象使得利用脑治疗药的脑疾病治疗、利用脑诊断剂的 脑疾病诊断或利用造影剂的脑造影变得困难。
[0006] 利用葡萄糖通过血脑屏障的特性，开发了将抗体递送至脑的技术(专利文献1)。但 是，该抗体仅设及对抗体进行糖基化的技术，效果有限。
[0007] 现有技术文献 [000引专利文献
[0009] 专利文献 l:W02007/068429

【发明内容】

[0010] 本发明提供药物递送用载体、偶联物及含有运些成分的组合物W及它们的施予方 法。
[0011] 本申请的发明人发现，将其外表面经葡萄糖修饰的胶束等囊泡施予至已诱发了低 血糖的对象、之后使血糖值上升，囊泡将被极其高效地递送至脑。本发明是基于上述见解完 成的。
[0012] 旨P，本发明提供W下的发明。
[0013] (1)-种组合物，其是含有药物递送用载体、用于按照施予计划施予至对象的组合 物，
[0014] 所述施予计划包括:将所述组合物施予至已使其禁食、或已诱发低血糖的对象，并 且，诱发所述对象的血糖值上升，
[0015] 所述载体的外表面经GLUT1配体修饰。
[0016] (2)-种组合物，其是含有药物与化UT1配体的偶联物而成的、用于按照施予计划 施予至对象的组合物，
[0017] 所述施予计划包括:将所述组合物施予至已使其禁食、或已诱发低血糖的对象，并 且，诱发所述对象的血糖值上升。
[0018] (3)如上述(1)或(2)所述的组合物，其是用于将药物递送至脑的组合物。
[0019] (4)如上述(1)或(2)所述的组合物，其是用于使药物通过血脑屏障的组合物。
[0020] (5)如上述（1)或(2)所述的组合物，其是用于使药物通过血神经屏障、血视网膜屏 障或血脑脊液屏障的组合物。
[0021] (6)如上述（1)或（2)所述的组合物，其是用于将药物递送至脑血管内皮细胞的组 合物。
[0022] (7)如上述（1)~（6)中任一项所述的组合物，血糖值上升是通过施予葡萄糖而被 诱发的。
[0023] (8)如上述(7)所述的组合物，其中，组合物的施予与葡萄糖的施予同时进行，或或 者在施予葡萄糖之前施予组合物。
[0024] (9)如上述(1)~(8)中任一项所述的组合物，组合物被输液施予至静脉内，输液施 予持续10分钟W上。
[0025] (10)如上述（1)及(3)~(9)中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡 的高分子中的10~40摩尔％经61^1'1配体修饰。
[0026] (11)如上述（1)及(3)~(9)中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡 的高分子中的40~100摩尔％经61^1'1配体修饰。
[0027] (12)如上述（1)及(3)~（11)中任一项所述的组合物，其中，载体中包封待递送的 药物。
[00%] (13)如上述(1)及(3)~（12)中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，囊泡为直 径400nmW下的囊泡。
[0029] (14)如上述(2)~(9)中任一项所述的组合物，其中，偶联物是药物与GLUT1配体经 由连接体连接而成的。
[0030] (15)如上述(1)~（14)中任一项所述的组合物，其中，GLUT1配体为葡萄糖。
[0031 ] (16)如上述（1)~（15)中任一项所述的组合物，其中，药物为选自生理活性物质、 抗体、核酸、生物相容性巧光色素、及造影剂中的至少巧巾药物。
[0032] (17)、一种偶联物，其是1分子化UT1配体与1分子高分子的偶联物，偶联物能够W 使得GLUT1配体露出囊泡表面的方式形成囊泡。
[0033] (18)如上述(17)所述的偶联物，其中，GLUT1配体为葡萄糖。
[0034] (19)如上述(18)所述的偶联物，其中，葡萄糖经由其6号碳原子与高分子偶联。
[0035] (20)如上述(19)所述的偶联物或其药学上允许的盐，所述偶联物由下述式(I)、下 述式(II)、下述式(III)或者下述式(XVI)表示：
[0043] {式中，山6为5~20,000的整数，mi6为2~5,000的整数。}。
[0044] (21)-种囊泡，其是含有上述(17)~(20)中任一项所述的偶联物而成的药物递送 用囊泡，
[0045] 所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的10~40摩尔％。
[0046] (22)-种囊泡，其是含有上述(17)~(20)中任一项所述的偶联物而成的药物递送 用囊泡，
[0047] 所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的40~100摩尔％。
[004引 （23)GLUT1配体的用于制造上述（1)~（16)中任一项所述的组合物、或上述(21)或 者(22)所述的囊泡的用途。
【附图说明】
[0049] 图1表示外表面被葡萄糖修饰而得的聚离子复合型胶束(PK胶束)与其制备方法。
[0050] 图2表示实施例1中得到的Glc(6)-切5-PIC胶束的粒径分布的动态光散射测定 (化S)的结果和利用透射电子显微镜(TEM)获得的粒子图像。此处，Glc(6)表示经由葡萄糖 的6号碳与形成胶束的高分子结合。
[0051 ]图3是表示实施例1中得到的Glc(6)-切5-PIC胶束向脑中的选择性的且有效的 蓄积的图。
[0052] 图4是表示使葡萄糖经由其3号或6号碳与高分子结合而得的胶束向脑中的蓄积的 图。
[0053] 图5是表示胶束被摄入到脑中时的脑实质部的巧光显微镜图像（图5A)及血糖值和 向脑中的摄入量的推移（图5B)的图。
[0054] 图6是表示直径为1 OOnm的PI Csome向脑中的蓄积的图。
[0055] 图7表示用葡萄糖修饰外表面而得的S i RNA胶束向脑中的蓄积。图7 A表示S i RNA胶 束与其制备方法，图7B表示向脑中的蓄积量的推移。
[0056] 图8表示siRNA胶束向脑细胞内的蓄积的巧光显微镜图像。
[0057] 图9是表示偶联有1分子葡萄糖的高分子向脑中的蓄积的图。
[0058] 图10是表示经由连接体连接有葡萄糖的IgG抗体向脑中的蓄积的图。G-IgG表示 连接有葡萄糖的IgG。
[0059] 图11是表示在腹腔内（i.p.)施予葡萄糖30分钟后，静脉内（i.v.)施予Glc(6)- C巧一PI却交束时的脑实质的巧光强度变化的图。
[0060] 图12是表示Glc(6)-c巧一PK胶束的一部分可W在脑血管内皮细胞中蓄积的图。
[0061] 图13是表示小鼠大脑皮质中的静脉施予后的PK胶束的偏在的图。
[0062] 图14是表示小鼠大脑皮质的切片中的静脉施予后的PK胶束的偏在的图。
[0063] 图15是表示小鼠大脑皮质中的静脉施予后的PK胶束的经时偏在变化的图。
【具体实施方式】
[0064] 本发明中，所谓"药物运送体"，是指用于药物递送的载体，可W举出可W包封药物 的微粒，例如，囊泡、树枝状大分子(den化imer )、水凝胶及纳米球等。药物转运体一般具有 直径为1 Onm~400nm的大小。
[0065] 本说明书中，所谓"囊泡"，是指胶束、中空微粒。囊泡优选具有生物相容性的外壳， 其外表面经GLUT1配体修饰。由此，囊泡能够与GLUT1相互作用。
[0066] 本说明书中，所谓"胶束"，是指由1层分子膜形成的囊泡。作为胶束，可W举出由表 面活性剂等两亲性分子形成的胶束、及由聚离子复合物形成的胶束(PIC胶束）。对于胶束而 言，已知从血中滞留时间的观点考虑，优选用聚乙二醇修饰其外表面。
[0067] 本说明书中，所谓"脂质体"，是指由2层分子膜形成的囊泡。分子膜通常为由憐脂 形成的双层膜。
[0068] 本说明书中，所谓"聚离子复合型聚合物囊泡"（W下也称为"PICsome")，是指由聚 离子复合物形成的中空的微粒。对于PICsome而言，已知从血中滞留时间的观点考虑，优选 用聚乙二醇修饰其外表面。
[0069] 本说明书中，所谓"聚离子复合物"（W下也称为"PIC")，是指通过W下方式形成的 离子层:在水溶液中将PEG与阴离子性嵌段的共聚物和PEG与阳离子性嵌段的共聚物W中和 电荷的方式混合时，在两嵌段共聚物的阳离子性嵌段与阴离子性嵌段之间形成离子层。使 PEG与上述荷电性链结合的意义是，抑制聚离子复合物凝集并沉淀，W及，由此使聚离子复 合物形成粒径为数十nm的具有单分散核一壳结构的纳米微粒。此时，已知由于PEG覆盖纳米 微粒的外壳(壳），因此，从生物相容性高、延长血中滞留时间的方面考虑是合适的。另外，已 经发现在聚离子复合物形成过程中，荷电性嵌段共聚物之一可W不需要PEG部分，而取代为 均聚物、表面活性剂、核酸及/或酶。并且，在聚离子复合物形成过程中，可W是阴离子性聚 合物及阳离子性聚合物中的至少1种与PEG形成共聚物，也可W是上述两者与PEG形成共聚 物。另外，已知如果增加 PEG含量，贝化1C胶束容易被形成，如果减少PEG含量，贝化ICsome容易 被形成。作为广泛用于聚离子复合物的制造的阴离子性聚合物或嵌段，例如，可W举出聚谷 氨酸、聚天冬氨酸及核酸（例如，DNA、mRNA及SiRNA)，作为阳离子性聚合物或嵌段，例如，可 W举出聚赖氨酸及聚（5-氨基戊基天冬氨酸）。此处，所谓mRNA，是指用于通过翻译进行蛋 白质合成的信使RNA，所谓siRNA，是指可W诱导RNA干扰(RNAi)的双链RNA(核酸）DsiRNA不 受特别限定，是由20~30bp组成的双链RNA，优选为21~23bp、2化p、27bp，是具有与祀基因 的序列相同的序列的双链RNA。
[0070] 本说明书中，所谓"药物递送用"，是指具有生物相容性、W及能够将药物包封于囊 泡内。本说明书中，所谓"药物递送用"，有时指利用了使药物的血中滞留时间较之未包封药 物的血中滞留时间而言延长的作用的用途。
[0071] 本说明书中，所谓"诱发低血糖"，是指使对象的血糖值较之如果未实施相应处置 而应呈现的血糖而言进一步降低。作为诱发低血糖的方法，可W举出糖尿病药的施予等。例 如，诱发低血糖时，只要达到诱发低血糖运一目的，例如也可W允许摄取其他药物、或饮用 水等饮料。诱发低血糖也可W伴有实质上不影响血糖的其它处置。
[0072] 本说明书中，所谓"使之禁食"，是指使对象禁食，例如，使之禁食3小时W上、4小时 W上、5小时W上、6小时W上、7小时W上、8小时W上、9小时W上、10小时W上、11小时W上、 12小时W上、13小时W上、14小时W上、15小时W上、16小时W上、17小时W上、18小时W上、 19小时W上、20小时W上、21小时W上、22小时W上、23小时W上、24小时W上、25小时W上、 26小时W上、27小时W上、28小时W上、29小时W上、30小时W上、31小时W上、32小时W上、 33小时W上、34小时W上、35小时W上、36小时W上、37小时W上、38小时W上、39小时W上、 40小时W上、41小时W上、42小时W上、43小时W上、44小时W上、45小时W上、46小时W上、 47小时W上或48小时W上。通过禁食，引起对象的低血糖。禁食时间由医生等根据对象的健 康状态决定，例如，优选采用对象达到空腹时血糖水平的时间W上的时间。对于禁食时间而 言，例如，可W是化UT1在脑血管内皮细胞的血管内表面的表达上升或达到平稳状态W上的 时间。对于禁食时间而言，例如，可W是上述时间中的12小时W上、24小时W上或36小时W 上。另外，禁食可W伴有实质上不影响血糖值、GLUT1在血管内表面的表达的其他处置。
[0073] 本说明书中，所谓"诱发血糖值上升"，是指使已诱发低血糖的对象、或使之维持低 血糖状态的对象的血糖值上升。可w利用本领域技术人员已知的各种方法使血糖值上升， 例如，诱发血糖值上升的物质的施予，例如，葡萄糖、果糖(fructose)、半乳糖等诱发血糖值 上升的单糖的施予、麦芽糖等诱发血糖值上升的多糖的施予、或者淀粉等诱发血糖值上升 的碳水化合物的摄取、或通过进食使血糖上升。
[0074] 本说明书中，所谓"血糖操作"，是指针对对象诱发低血糖，之后，使血糖值上升。在 针对对象诱发低血糖之后，可W将对象的血糖值维持为低血糖。将对象的血糖值维持为低 血糖的时间可W采用例如0小时W上、1小时W上、2小时W上、3小时W上、4小时W上、5小时 W上、6小时W上、7小时W上、8小时W上、9小时W上、10小时W上、11小时W上、12小时W 上、13小时W上、14小时W上、15小时W上、16小时W上、17小时W上、18小时W上、19小时W 上、20小时W上、21小时W上、22小时W上、23小时W上、24小时W上、25小时W上、26小时W 上、27小时W上、28小时W上、29小时W上、30小时W上、31小时W上、32小时W上、33小时W 上、34小时W上、35小时W上、36小时W上、37小时W上、38小时W上、39小时W上、40小时W 上、41小时W上、42小时W上、43小时W上、44小时W上、45小时W上、46小时W上、47小时W 上、48小时W上。之后，可W使血糖值上升。本说明书中，所谓"维持血糖"，只要达到维持对 象的低血糖运一目的，例如也可W允许摄取其他药物、或饮用水等饮料。诱发低血糖也可W 伴有实质上不影响血糖的其他处置。
[0075] 本说明书中，所谓"对象"，是指包括人在内的哺乳动物。对象可W是健康的对象， 也可W是罹患某种疾病的对象。此处作为疾病，可W举出脑神经疾病，例如，精神病性障碍、 抑郁症、情绪障碍、焦虑、睡眠障碍、痴呆症及物质相关障碍。另外，作为痴呆症，不受特别限 定，可W举出阿兹海默症及克罗伊茨费尔特一雅各布病(化eutzfeWt-Jakob)。
[0076] 本说明书中，所谓"血脑屏障"，是指存在于血液循环与脑之间、对于物质的透过持 有选择性的功能性障壁。可W认为，血脑屏障的实体是脑血管内皮细胞等。关于血脑屏障的 物质透过性，存在许多不明之处，但已知葡萄糖、酒精及氧容易通过血脑屏障，脂溶性物质、 小分子(例如，分子量小于500)较之水溶性分子、高分子(例如，分子量为500W上)而言有容 易通过的趋势。多种脑疾病治疗药、脑诊断剂无法通过血脑屏障，运一现象成为脑疾病的治 疗、脑的分析等的巨大障碍。本说明书中，所谓"血神经屏障"，是指存在于血液循环与末梢 神经之间、对于物质的透过持有选择性的功能性障壁。本说明书中，所谓"血脑脊液屏障"， 是指存在于血液循环与脑脊髓液之间、对于物质的透过持有选择性的功能性障壁。本说明 书中，所谓"血视网膜屏障"，是指存在于血液循环与视网膜组织之间、对于物质的透过持有 选择性的功能性障壁。可W认为，血神经屏障、血脑脊液屏障及血视网膜屏障的实体是存在 于各屏障的血管内皮细胞等，其功能与血脑屏障相同。
[0077] 本说明书中，所谓"化UT1配体"，是指与化UT1特异性结合的物质。作为化UT1配体， 已知各种配体，不受特别限定，例如，可W举出葡萄糖及己糖等分子，GLUT1配体均可W在本 发明中代替葡萄糖用于载体或偶联物的制备。对于化UT1配体而言，优选相对于化UT1具有 与葡萄糖等同或其W上的萊和性。已知2 -N-4 -（ 1一叠氮基一2,2,2 -Ξ氣乙基）苯甲酯 基一 1,3 -双(D -甘露糖一4 -基氧基）一2 -丙胺(ATB - BMPA)、6_ (N- (7 -硝基苯基一 2 -氧杂_ 1,3 -二挫一4 -基）氨基）一2 -脱氧葡萄糖（6 - NBDG)、4,6 - 0 -亚乙基一α - D-葡萄糖、2-脱氧一D-葡萄糖及3-0-甲基葡萄糖也与化UT1结合，运些分子也可W作 为GLUT1配体而用于本发明。
[0078] 根据本发明，发现用葡萄糖修饰其外表面而得的上述载体仅通过施予至对象即显 示出向脑中的蓄积。因此，本发明的施予计划中，可W不禁食或者不诱发低血糖，及/或可W 不诱发血糖值上升。另外，本
【申请人】的发明人发现，将用葡萄糖W使得葡萄糖露出表面的方 式修饰其外表面而得的载体(具体而言，胶束或聚离子复合型聚合物囊泡(PICsome)等囊 泡）按照某施予计划施予时，运些载体显著跨越血脑屏障并被递送至脑内（脑实质部）。因 此，本发明的施予计划优选包括将该组合物施予至使之禁食或已诱发低血糖的对象，更优 选的是，本发明的施予计划包括:将该组合物施予至使之禁食或已诱发低血糖的对象，并且 诱发该对象的血糖值上升。本发明的施予计划中，该组合物可W与该对象的血糖值上升的 诱发同时地、连续地或逐次地被施予至该对象。对于施予计划而言，对该对象的组合物的施 予与该对象的血糖值上升的诱发之间可W有间隔，也可W没有间隔。与该对象的血糖值上 升的诱发同时施予该组合物时，所述组合物可与引起血糖值上升的诱发的药物混合的 形态施予该对象，也可与引起该对象的血糖值上升的诱发的药物不同的形态进行施 予。另外，该组合物与该对象的血糖值上升的诱发连续或逐次地被施予至该对象时，该组合 物可W在该对象的血糖值上升的诱发之前被施予至该对象，也可W在之后被施予，优选的 是，该组合物可W在该对象的血糖值上升的诱发之前施予至该对象。在对于该对象施予该 组合物之前诱发该对象的血糖值上升时，优选在诱发该对象的血糖值上升后1小时W内、45 分钟W内、30分钟W内、15分钟W内或10分钟W内将该组合物施予至该对象。另外，在对于 该对象施予该组合物之后诱发该对象的血糖值上升时，优选在将该组合物施予至该对象后 6小时W内、4小时W内、2小时W内、1小时W内、45分钟W内、30分钟W内、15分钟W内或10 分钟W内诱发该对象的血糖值上升。上述的施予计划的循环可W实施2次W上。葡萄糖施予 与样品施予的前后关系可W根据使其通过血脑屏障的时机决定。
[0079] 大脑皮质由6层构成，自表层起，存在分子层(第1层）、外颗粒层(第2层）、外锥体细 胞层(第3层）、内颗粒层(第4层）、内锥体细胞层(第5层)及多形细胞层(第6层），根据本发 明，可W在上述任一层中将载体递送至脑实质。运些层中，特别地，在外锥体细胞层(第3层） 及内颗粒层(第4层）中，本发明的载体的递送显著有效。
[0080] 本发明中，像胶束或PICsome运样的巨大载体(直径为约40nm~lOOnm)可W被极其 高效地递送至脑也是非常出乎意料的。即使是运样的囊泡也能够被递送至脑运一事实是 指，通过将用葡萄糖修饰而得的各种巨大分子及载体按照上述施予计划施予，可W使运些 巨大分子及载体有效地通过血脑屏障。
[0081] W下，对本发明的葡萄糖的血脑屏障的作用进行说明。可W认为，本发明的葡萄糖 的作用是与在脑的血管内皮细胞的血管内表面表达的葡萄糖转运体即GLUT1结合。因此，本 发明中，GLUT1配体也可W起到与葡萄糖相同的作用。另外，本发明中，GLUT1配体可露 出载体外表面的方式与载体结合，从而可W与在脑的血管内皮细胞的血管内表面表达的葡 萄糖转运体结合。因此，可W认为，如果是可W对化UT1呈递化UT1配体的分子、复合体及囊 泡等，则可W与化UT1结合，结合后，在化UT1利用葡萄糖而被摄入细胞内时，被一同摄入血 管内皮细胞内。另外，如果被血管内皮细胞摄入，则被摄入的囊泡通过血脑屏障并移动至脑 实质。如果修饰囊泡的葡萄糖分子多，则到达脑实质的囊泡的比例略微降低。运一现象暗 示，如果修饰囊泡的葡萄糖分子多，则囊泡通过内吞作用被细胞摄入，并直接朝向脑实质通 过细胞，及，囊泡从血管内皮细胞向脑实质移动时，囊泡与血管内皮细胞的分离效率下降。 换言之，通过内吞作用而被细胞摄入的囊泡的一部分没有与脑血管内皮细胞分离，而是在 脑血管内皮细胞中蓄积。因此，本发明的组合物或偶联物可W用于递送至脑血管内皮细胞。 另外，本发明的葡萄糖的作用在血神经屏障、血视网膜屏障及血脑脊液屏障中也相同。特别 地，在血神经屏障、血视网膜屏障及血脑脊液屏障中，GLUT1也在低血糖时的血管内皮细胞 中表达。因此，本发明的组合物或偶联物可W用于使药物通过血神经屏障、血视网膜屏障及 血脑脊液屏障。本发明的组合物或偶联物还可W用于递送至存在于血神经屏障、血视网膜 屏障及血脑脊液屏障的血管内皮细胞中。
[0082] 本
【发明人】还发现，较之使用经由葡萄糖的3号碳偶联有葡萄糖的高分子而得到的 胶束，使用经由葡萄糖的6号碳偶联有葡萄糖的高分子(例如，参见图1(a))而得到的胶束向 脑中的摄入效率更高。已知化UT1与葡萄糖的结合和1号、3号及4号碳原子的取代基即0H基 显著相关。经由不被用于与化UT1的结合的6号碳原子修饰高分子而得的胶束更容易在脑中 高效地蓄积，运一事实掲示了化UT1与脑蓄积的关系。另外，经由被认为是对于与化UT1的识 别而言重要的3号碳原子修饰高分子而得的胶束也显示出向脑中的蓄积。运一事实表明，经 由与和化UT1的结合相关度低的2号碳原子修饰高分子而得的胶束引发了更多胶束向脑中 的蓄积。因此，葡萄糖可W经由其1号、3号及4号碳原子中的任1个碳原子、优选经由其2号碳 或6号碳原子与高分子、药物偶联。在一种实施方式中，偶联的葡萄糖的至少1号、3号及4号 碳的0H基为还原末端。运样，本发明中，GLUT1配体可不丧失其作为配体的功能的方式 修饰其他分子，本领域技术人员可W基于与化UT1的结合形式容易地决定与药物的结合位 置。本说明书中，有时将经由η号碳原子结合的葡萄糖记为"Glc(n)"{其中，η是1~4及6中的 任一个整数}。例如，本说明书中，有时将经由6号碳原子结合的葡萄糖记为"Glc(6)"，将经 由2号碳原子结合的葡萄糖记为"GlcUr，将经由3号碳原子结合的葡萄糖记为"Glc(3)"。
[0083] 本发明中，也可W使用与GLUT1结合的葡萄糖的衍生物代替葡萄糖。
[0084] 本发明中，作为可W用化UT1配体修饰外表面的载体，可W举出药物递送用胶束、 脂质体及PICsome等囊泡、W及树枝状大分子、纳米球及水凝胶。本发明中，使用药物递送用 载体的优点在于，例如，将药物包封于载体内部，提高在祀部位的药物浓度，或者，减轻在祀 部位W外的由药物导致的副作用。本发明中使用的载体不受特别限定，例如，其直径为 400nmW下、200nmW下、150nmW下、lOOnmW下或80nmW下，例站I，为20nmW上、30nmW上或 40nm W上。本发明中使用的载体具有例如30nm~150nm、或、例如30nm~1 OOnm的直径。
[0085] 作为本发明中使用的胶束，可W举出药物递送用胶束。作为药物递送用胶束，已知 由嵌段共聚物形成的胶束。形成胶束的嵌段共聚物不受特别限定，为PIC胶束时，可W采用 荷电性聚合物嵌段(例如，聚阴离子嵌段或聚阳离子嵌段)与生物相容性嵌段(例如，聚乙二 醇嵌段)的共聚物或其药学上允许的盐。另外，作为嵌段共聚物，优选使用生物降解性的嵌 段共聚物，作为运样的共聚物，已知各种共聚物，原理上均可W使用。例如，作为生物相容性 高、为生物降解性的嵌段共聚物，例如，可W使用聚乙二醇一聚天冬氨酸、聚乙二醇一聚谷 氨酸、及聚乙二醇一聚（巧一氨基戊基）一天冬氨酸)嵌段共聚物等。作为聚离子复合型胶束 (PIC胶束），已知具有聚离子复合物层的胶束，所述聚离子复合物层通过聚阴离子和聚阳离 子的静电相互作用而形成。从在胶束内部使疏水性部分之间稳定化的观点考虑，可W使各 荷电性嵌段在与形成外壳的PEG不同的末端与胆酱締基等疏水性部分连接(例如，参见实施 例的siRNA胶束）。用巧光色素对嵌段共聚物的标记可W通过用巧光色素修饰嵌段共聚物的 与聚乙二醇侧相反的末端来进行（例如，图1(a)的化合物的N出末端KPIC胶束中，通过使 GLUT 1配体连接至PEG侧的末端，GLUT 1配体露出至胶束的外表面。
[0086] 作为本发明中使用的聚离子复合型聚合物囊泡，可W举出药物递送用PICsome。作 为药物递送用PICsome，已知由嵌段共聚物形成的PICsome。作为形成PICsome的嵌段共聚 物，可W举出PEG嵌段与聚阳离子嵌段的嵌段共聚物及均聚阴离子，或PEG嵌段与聚阴离子 嵌段的嵌段共聚物及均聚阳离子。作为嵌段共聚物，优选使用为生物降解性的嵌段共聚物， 作为运样的共聚物，已知各种共聚物，原理上均可W使用。例如，作为生物相容性高、为生物 降解性的嵌段共聚物，例如，可W使用聚(天冬氨酸一四亚乙基五胺(Asp-TEP))嵌段共聚 物、及聚乙二醇一聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸)嵌段共聚物。PICsome中，通过使化UT1配 体连接至PEG侧的末端，GLUT1配体露出至PICsome的外表面。
[0087] 根据本发明，分别提供下述式(I)~(XV)表示的化合物或其盐。盐优选为药学上允 许的盐。
[00则 Glc(6)-PEG-聚天冬氨酸
[0089]
[0090] {式中，山及虹分别为5~20,000。}
[0091] Glc(6)-PEG-聚谷氨酸
[0092]
[0093] {式中，Π 2及m2分别为5~20,000。}
[0094] Glc(6)-PEG-聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸)
[0095]
[0096] {式中，Μ及邮分别为5~20,000。}
[0097] PEG-聚天冬氨酸
[009引
[0099] {式中，114及1114分别为5~20,000。}
[0…0] PEG-聚谷氨酸
[0101]
[0102] {式中，η日及邮分别为5~20,000。}
[。…引 PEG-聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸)
[0104]
[010引 {式中，邮及邮分别为5~20,000。} 陶]聚天冬氨酸
[0107]
[010 引{式中，1117为5~20,000。}
[0…9] 聚谷氨酸
[0110]
[0111] {式中，邮为5~20,000。}
[0112] 聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸)
[0113]
[0114] {式中，1119为5~20,000。}
[0115] Glc(3)-PEG-聚天冬氨酸
[0116]
[0117] {式中，山〇及虹〇分别为5~20,000。}
[011引 Glc(3)-PEG-聚谷氨酸
[0119]
[0120] {式中，山成虹汾别为5~20,000。}
[0。。Glc(3)-PEG-聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸)
[0122]
[012；3] {式中，山2及虹2分别为5~20,000。}
[0124] Glc(2)-PEG-聚天冬氨酸
[0125]
[0126] {式中，山3及虹3分别为5~20,000。}
[0127] Glc(2)-PEG-聚谷氨酸
[012 引
[0129] {式中，山4及虹4分别为5~20，000。}
[0。0] Glc(2)-PEG-聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸)
[0131]
[om] {式中，山日及虹日分别为5~20,000。}
[0133]上述式（I)~式(XV)的化合物或其盐可W用于形成其外表面被葡萄糖修饰的PIC 胶束或PICsome。为了使上述式（I)~式(XV)的化合物的盐形成聚离子复合物，ηι、η2、η3、Π 4、 115、]16、117、118、119、111日、]111、]112、山3、1114及111日各自独立并可^为5~20,000的整数，优选为10~5, 000的整数，较优选为40~500的整数，更优选为5~1,000的整数，进一步优选为10~200的 整数。另外，1111、1]12、1113、1114、111日、1]16、1117、邮、1119、1111日、1]111、1]112、11113、11114及1111日各自独立并可^为2~20, 000的整数，优选为2~5，000的整数，较优选为40~500的整数，更优选为5~1，000的整数， 进一步优选为10~200的整数。盐优选为药学上允许的盐。
[0134] 在一种实施方式中，PIC胶束可W通过将式(I)的化合物或者其盐、式(X)的化合物 或者其盐或式(XIII)的化合物或者其盐、W及式（IV)的化合物或者其盐、W及式(VI)的化 合物或者其盐。在PIC胶束的更具体的实施方式中，上述式中111、]11日、]113、114及116为44，1]11、1]110、 mi3、及IM为80，m6为72。盐优选为药学上允许的盐。
[0135] 在一种实施方式中，PICsome可W通过将W下成分混合而得到：式（I)的化合物或 者其盐、式(X)的化合物或者其盐或式(XIII)的化合物或者其盐、W及式（IV)的化合物或者 其盐、W及式（IX)的化合物或者其盐。在PICsome的更具体的实施方式中，上述式中m、m〇、 山3、114及119为44，1]11、1]11日、1]113、及1]14为80，1]19为72。盐优选为药学上允许的盐。
[0136] 在一种实施方式中，siRNA胶束可W通过将W下成分混合而得到:偶联有胆固醇的 siRNA、W及偶联有式(XVI)所示的胆固醇的Glc(6)-PEG-聚(Asp-TEP)或其盐。盐优选为 药学上允许的盐。偶联有胆固醇的siRNA不受特别限定，是在RNA链的5'末端或3'末端偶联 有胆固醇的siRNA，该siRNA可W由本领域技术人员W合适的方式合成，或可W通过定制合 成购买获得，并在本发明中使用。SiRNA不受特别限定，优选可W使胆固醇偶联至有义链的 3 '末端或反义链的5 '末端或者3 '末端。
[0。7] Glc(6)_PEG_ 聚(Asp-TEP)-Chol [013引【化20】
[0139]
[0140] {式中，山6及虹6分别为5~20，000。}
[0141 ] 1116为5~20，000的整数，优选为10~5，000的整数，较优选为40~500的整数，更优 选为5~1，000的整数。mi6为2~20,000的整数，优选为2~5,000的整数，较优选为40~500的 整数，更优选为5~1，000的整数，进一步优选为10~200的整数。SiRNA胶束的更具体的实施 方式中，上述中ni6为440，mi6为60。
[0142] 作为本发明中使用的脂质体，不受特别限定，可W举出由憐脂，例如，二肉豆違酷 憐脂酷胆碱(DMPC)形成的脂质体。一直W来已知多种脂质体，本领域技术人员可合适 的方式进行制备。本领域技术人员可W使药物W合适的方式包封于脂质体内。
[0143] 利用化UT1配体的囊泡的修饰不受特别限定，例如，可W在利用化UT1配体修饰形 成囊泡的高分子后形成囊泡而进行。从露出囊泡的外表面的观点考虑，高分子的修饰部位 可W设为形成囊泡时位于外表面的部位。被运样的GLUTl配体修饰的高分子可W由本领域 技术人员适当制备。作为一例，W下对被葡萄糖修饰的高分子(特别地，Glc(6)-PEG-聚 (阴离子)嵌段共聚物或Glc(6)-PEG-聚（阳离子)嵌段共聚物）的制备方法的例子进行说 明。例如，Glc(6)-PEG-聚（阴离子)嵌段共聚物或Glc(6)-PEG-聚（阳离子)嵌段共聚物 可W在保护葡萄糖的6号W外的碳上的径基的基础上，使葡萄糖与嵌段共聚物聚合而得到。
[0144] 合成路径1A列举了式(I)的化合物的合成路径，其中，山为44,虹为80。
[0145] 合成路径1A
[0146]
[0147] 合成路径ΙΑ中，EO表不环氧乙烧;Κ-化地表不糞化钟（Potassium naphthalene); TEA表不Ξ乙胺;MsCl表不甲横酷氯;NHsaq.表不氨水;NCA -BLA表不L -天冬氨酸一β -节 醋一Ν-簇酸酢。
[0148] W下，简单地说明合成路径1Α。对于葡萄糖的保护基的导入而言，例如，利用1，2 - 0-异亚丙基5,6-0-亚苄基一a-D-巧喃葡萄糖下也称为"BIG")达成。例如，制造 PIC 胶束或PICsome时，使环氧乙烧聚合至BIG,合成BIG-PEG-OH。对于BIG而言，例如，可W通 过用苄基保护1，2-0 -异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖（W下也称为"MIG")的3号和5号碳的 取代基即0H基而得到。具体而言，BIG可W通过使MIG与苯甲醒反应，并用乙酸乙醋提取而得 到。接着，从使PEG的分子量统一为一定数值的观点考虑，优选W下操作:在聚合反应前，在 反应容器内用苯使BIG-OH冷冻干燥，之后，使其减压干燥(例如，于70°C过夜减压干燥），使 BIG-0啡巧着于容器壁面。另外，聚合度可W通过添加的环氧乙烧的量进行适当调节。聚合 后，将BIG-阳G-OH的0H基进行氨基化得到BIG-阳G-N此，进一步地，通过使W下成分聚 合至BIG-阳G-N出的畑盛，可W得到BIG-阳G-聚（阴离子)或BIG-阳G-聚（阳离子）：聚 阳离子或聚阴离子或者其被保护的前体(例如，作为聚天冬氨酸的被保护的单体的L-天冬 氨酸一β-节醋一N-簇酸酢(BLA-NCA)或者作为聚谷氨酸的被保护的单体的L-谷氨酸一 丫 一节醋一Ν-簇酸酢(BLG-NCA))。聚合度可W通过聚阳离子或聚阴离子或者其被保护的 前体的量进行适当调节。最后，将葡萄糖及阴离子或阳离子的保护基脱保护，可W得到葡萄 糖一PEG-聚（阴离子)或葡萄糖一PEG-聚（阳离子）。结合有葡萄糖的共聚物可W用于PIC 胶束或PICsome的制备。具体而言，如果在水溶液中W中和电荷的比率将具有聚阳离子嵌段 的聚合物和具有聚阴离子嵌段的聚合物混合，贝化1C胶束或PICsome自发地形成。通过上述 操作，可W得到PIC胶束或PICsome，其中，聚离子复合物被生物相容性部分覆盖，所述生物 相容性部分被葡萄糖修饰。
[0149] 同样地，Glc(3)-阳G-聚（阴离子)及Glc(3)-阳G-聚（阴离子何W通过用例如 1，2,5,6 -二一0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖(DIG)代替上述中的BIG作为起始物质而 合成，其他部分与上述完全相同（参见合成路径1B)。另外，同样地，Glc(2)-PEG-聚（阴离 子)及Glc(2)-PEG-聚（阴离子)也可W由本领域技术人员适当合成。
[0150] 合成路径1B中，列举了式(X)的化合物的合成路径，其中，m为44，mi为80。对于合成 路径1B而言，除了用DIG代替BIG作为起始物质W外，与合成路径1A相同。
[0151] 合成路径1B
[0152]
[0153] 合成路径IB中，EO表示环氧乙烧;Κ-化地表示糞化钟；TEA表示Ξ乙胺;MsCl表示 甲横酷氯;NHsaq.表示氨水;NCA-BLA表示L-天冬氨酸一β-节醋一N-簇酸酢。
[0154] 根据本发明，提供式(I)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括W 下步骤：
[01W] (i)使式（la)表示的的1,2-0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖与苯甲醒反应，得 到式(扣)表示的1,2-0-异亚丙基5,6-0-亚苄基一a-D-巧喃葡萄糖(BIG);
[0156] (ii)使式（Ib)表示的BIG与环氧乙烧反应，得到式（Ic)表示的BIG-聚乙二醇 (BIG-PEG-OH)；
[0157] (iii)将式（Ic)表示的BIG-PEG-OH进行氨基化，得到式（Id)表示的BIG-阳G- 畑2;
[015引（iv)使L-天冬氨酸一0-节醋一N-簇酸酢与式（Id)表示的BIG-阳G-N此聚合， 之后，将保护基脱保护。
[0159]
[0160] {式中，山及虹分别为5~20,000。}
[0165] 根据本发明，提供式（II)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括 W下步骤：
[0166] (i)使式（la)表示的1,2-0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖与苯甲醒反应，得到 式(扣)表不的1,2-〇 -异亚丙基5,6-〇 -亚苄基一α-D -巧喃葡萄糖(BIG);
[0167] (ii)使式（Ib)表示的BIG与环氧乙烧反应，得到式（Ic)表示的BIG-聚乙二醇 (BIG-PEG-OH)；
[016引 （iii)将式（Ic)表示的BIG-PEG-OH进行氨基化，得到式（Id)表示的BIG-阳G- 畑2;
[0169] (iv)使BIG-阳G-N此与L-谷氨酸一丫 一节醋一N-簇酸酢反应，之后，将保护基 脱保护。
[0173] {式中，山7与Π 2相同。}
[0174]
[0175] 根据本发明，提供式(III)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括 W下步骤：
[0176] (i)使式（la)表示的1,2-0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖与苯甲醒反应，得到 式(扣)表示的1,2-0-异亚丙基5,6-0-亚苄基一a-D-巧喃葡萄糖(BIG);
[0177] (ii)使式（Ib)表示的BIG与环氧乙烧反应，得到式（Ic)表示的BIG-聚乙二醇 (BIG-PEG-OH)；
[017引（iii)将式（Ic)表示的BIG-PEG-OH进行氨基化，得到式（Id)表示的BIG-阳G- 畑2;
[0179] (iv)使式(Id)表示的BIG-PEG-N出与L-天冬氨酸_β_节醋一N-簇酸酢聚合；
[0180] (V)使得到的化合物与1，5 -二氨基戊烧(DAP)反应，之后，将保护基脱保护。
[0181]
[0182] {式中，Π3及邮分别为5~20,000。}:
[0183]

[0187] 根据本发明，提供式(X)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括W 下步骤：
[0188] (i)使式(Xa)表示的1，2,5,6 -二一0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖(DIG)与环 氧乙烧反应，合成式(甜)表示的DIG-聚乙二醇(DIG-PEG-OH);
[0189] (ii)将式(Xb)表示的DIG-阳G-OH的0H基取代为氨基，得到式(Xc)表示的DIG- 阳G-N出；
[0190] (iii)使L-天冬氨酸一β-节醋一N-簇酸酢聚合到DIG-阳G-N出的氨基，之后， 将保护基脱保护。
[0191]
[01W] {式中，山〇及虹0分别为5~20,000。}
[0193]

[0197] 根据本发明，提供式(XI)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括 W下步骤：
[0198] (i)使式(Xa)表示的1，2,5,6 -二一0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖(DIG)与环 氧乙烧反应，合成式(甜)表示的DIG-聚乙二醇(DIG-PEG-OH);
[0199] 。。将式(乂6)表示的016-阳6-0哺勺細基取代为氨基，得到式^(3)表示的016- 阳G-N出；
[0200] (iii)使L-谷氨酸一丫 一节醋一N-簇酸酢与DIG-PEG-N此的氨基反应，之后， 将保护基脱保护。
[0201]
[020^ {式中，山成虹1分别为5~20,000。}
[0206] 根据本发明，提供式(XII)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括 W下步骤：
[0207] (i)使式(Xa)表示的1，2,5,6 -二一0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖(DIG)与环 氧乙烧反应，合成式(甜)表示的DIG-聚乙二醇(DIG-PEG-OH);
[020引（ii)将式(Xb)表示的DIG-阳G-OH的0H基取代为氨基，得到式(Xc)表示的DIG- 阳G-N出；
[0209] (iii)使L-天冬氨酸_β_节醋一N-簇酸酢聚合至化IG-PEG-N出的氨基；
[0210] (iv)使得到的化合物与1，5 -二氨基戊烧(DAP)反应，之后，将保护基脱保护。
[0217]同样地，Glc(2)-PEG-聚（阴离子)及Glc(2)-PEG-聚（阴离子)也可w由本领域 技术人员适当合成。Glc(2)-PEG-聚（阴离子)及Glc(2)-PEG-聚（阴离子)不限于W下， 可W将取代2号碳的0H基W外的0H基被保护的葡萄糖用作起始物质而合成，例如，将1，3,4， 6-四一0-乙酷基一β-D-化喃甘露糖用作起始化合物，利用苄基保护取代2号碳的0H基， 之后，将乙酷基碱性水解为0H基，利用甲娃烷基系化保护基(例如，TBS基)进行保护后，利用 钮催化剂或白金催化剂和氨气将苄基脱保护，通过光延反应使取代2号碳的0H基立体性反 转，可W得到取代2号碳的0H基W外的0H基被保护的葡萄糖。并且，本领域技术人员可W容 易地理解，可W将该分子用于代替BIG、DIG，此夕h通过与制造 Glc(3)、Glc(6)-阳G-聚（阴 离子)及Glc(2)-PEG-聚（阴离子)相同的方法进行合成。
[0218] 根据本发明，提供式(XVI)表示的偶联物的制造方法，其包括W下步骤：
[0219] (i)使式（la)表示的1,2-0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖与苯甲醒反应，得到 式(扣)表不的1,2-〇 -异亚丙基5,6-〇 -亚苄基一α-D -巧喃葡萄糖(BIG);
[0220] (ii)使式（Ib)表示的BIG与环氧乙烧反应，得到式（Ic)表示的BIG-聚乙二醇 (BIG-PEG-OH)；
[0221] (iii)将式（Ic)表示的BIG-PEG-OH进行氨基化，得到式（Id)表示的BIG-阳G- 畑2;
[0222] Qv)使L-天冬氨酸一β-节醋一N-簇酸酢聚合到式(Id)表示的BIG-阳G-N此， 得到 BIG-PEG-PBLA;
[0223] (V)使BIG-PEG-PBLA与4-胆酱締基氨基一4-下酸反应，得到式(XVIa)表示的 BIG-PEG-PBLA-Chol;
[0224] (vi)使BIG-PEG-PBLA-Chol与四亚乙基五胺(TEP)反应，得到式(XVIb)表示的 BIG-PEG-聚(Asp-TEP)-chol，之后，将保护基脱保护。
[0225]
[0226] {式中，山6及虹6分别为5~20,000。}
[0227]

[0231]
[0232] 囊泡可W用上述聚合物通过公知的方法形成。一般而言，囊泡可W通过揽拌W - 定浓度W上的浓度溶解有上述那样的聚合物的溶液而得到。另外，对于基于聚离子复合物 而形成的囊泡的情况而言，可W将具有聚阳离子部分的高分子和具有聚阴离子部分的高分 子W相同比例混合而得到。将药物包封于囊泡的方法为本领域技术人员所公知，在本发明 中也可W使用公知的方法。例如，为了将药物包封于PIC胶束，在胶束形成后，在胶束溶液中 添加药物即可。药物可W通过其电荷自发地包封于PIC胶束中。另外，例如，对于PICsome的 情况而言，制备形成PICsome的高分子和药物的混合液，揽拌混合即可将药物包封于 PICsome。对于脂质体而言，制备形成脂质体的高分子和药物的混合液，揽拌混合即可将药 物包封于脂质体。也可W将聚离子复合物的阴离子性嵌段与阳离子性嵌段交联。作为用于 该目的的交联剂，不受特别限定，例如，可W优选使用可W使氨基与簇基缩合的1-乙基一 3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐化DC)。
[0233] 构成囊泡的高分子中的葡萄糖结合高分子的比例为10~40%时，组合物向脑实质 的递送效率尤其高，形成囊泡的高分子中的葡萄糖结合高分子的比例可W设为10~40%， 优选为20~30%，较优选为22~28%，更优选为24~26% (例如，约25% )。另外，构成囊泡的 高分子中的葡萄糖结合分子的比例为40% W上时，组合物向脑血管内皮细胞的递送效率尤 其高，形成囊泡的高分子中的葡萄糖结合高分子的比例可W设为40~100%，例如，40~ 60%。为了用化UT1配体修饰囊泡的外表面，可W W囊泡为对象进行化UT1配体修饰(例如， 糖基化），从控制囊泡表面上的化UT1配体修饰的比例的观点考虑，优选事先使构成囊泡的 高分子分别与化UT1配体结合，调节与未被化UT1配体修饰的高分子的配合比，继而使高分 子形成囊泡。
[0234] 本发明中，药物与化UT1配体的偶联物也可W通过本发明的血糖操作向脑递送。可 W经由连接体使药物与化UT1配体偶联。连接体可W采用生物相容性的连接体，例如，可W 使用聚乙二醇。药物可W与2分子W上的化UT1配体偶联。2分子W上的化UT1配体优选可W 经由连接体与药物偶联。将2分子W上的化UT1配体经由连接体偶联至药物时，例如，可W用 在侧链上结合有多个GLUT1配体的聚氨基酸(例如，聚天冬氨酸)进行偶联。在药物和聚氨基 酸之间，也可W经由阳G等连接体。作为在侧链上结合有多个化UT1配体的聚氨基酸（例如， 聚天冬氨酸），例如，可W使用下述式(XIX)表示的化合物。
[0235]
[OZ36] {式中，山9为5~20,000的整数，及虹9为2~5,000的整数。}
[0237] 1119为5~20，000的整数，优选为10~5，000的整数，较优选为40~500的整数，更优 选为5~1，000的整数，进一步优选为10~200的整数。mi9为2~20,000的整数，优选为2~5， 000的整数，较优选为40~500的整数，更优选为5~1，000的整数，进一步优选为10~200的 整数。某实施方式中，山9为273，mi9为48。
[0238] PEG与结合有多个GLUT1配体的聚天冬氨酸的共聚物可W如下合成。 脚9] 合成路径2
[0240]
[0241] DMF表示N，N'_二甲基甲酯胺，化表示苄基，EDC表示1-乙基一3-(3-二甲氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐。其他简称与上述合成路径相同。
[0242] W下，简单地说明合成路径2。作为合成路径2的起始化合物，式(XlXa)表示的化合 物可W如W下运样得到：
[0243]
[0244] {式中，山9为5~20,000的整数。}。
[0245] 使2-(2-?基乙氧基）四氨化喃与环氧乙烧反应，得到THP-阳G-OH。接着，用甲 横酷氯等将ΤΗΡ-阳G-OH的OH基进行甲横酷化。使得到的MsO-阳G-THP与叠氮化钢反应， 得到在一个末端具有叠氮基的四氨化喃基的聚乙二醇(化一PEG-THP)。之后，将THP保护基 脱保护，得到式(XlXa)表示的一个末端带叠氮基的3-径丙基的聚乙二醇(化一PEG-OH)。 聚合度可W通过添加的环氧乙烧的量适当调节。
[0246] 像上述那样操作，得到式(XlXa)表示的化合物后，将化一PEG-OH的0H基氨基化而 得到化一PEG-N此，进一步地，使L-天冬氨酸一β-节醋一N-簇酸酢（BLA-NCA)与化一 阳G-N此的Ν此基反应，得到化一阳G-PBLA。通过碱性水解将保护基脱保护，之后，在抓C的 存在下使其与保护的氨基葡萄糖即6 -氨基一6 -脱氧一1,2:3,5 -二一〇 -异亚丙基一α - D-巧喃葡萄糖(Ρ-氨基葡萄糖)反应，使氨基葡萄糖的氨基与天冬氨酸残基的簇基之间缩 合。之后，通过将保护基脱保护，可W得到一个末端为叠氮基的聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段 共聚物(化一阳G-P(Asp))。
[0247] 6_氨基_6_脱氧_1,2:3,5_二_0_异亚丙基一α -D_巧喃葡萄糖(P -氨基 葡萄糖）可W基于例如Carbohydr.Res.19,197-210(1971)的记载制造。根据 Carbohy化.Res. 19,197-210(1971)，P-氨基葡萄糖可W通过W下的合成路径3得到。
[024引合成路径3
[0249]
[0250] TsCl表示甲苯横酷氯。
[0251] W下，简单地说明合成路径3。首先，将1,2-0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖（1) 进行甲苯横酷化，得到1,2-0-异亚丙基一6-0-对甲苯横酷基一a-D-巧喃葡萄糖(2)。 接着，使得到的1,2-0-异亚丙基一6-0-对甲苯横酷基一a-D-巧喃葡萄糖(2)与2,2 - 二甲氧基丙烷反应，得到1,2:3,5-二一0-异亚丙基一6-0-对甲苯横酷基一a-D-巧喃 葡萄糖(3)。之后，使1,2:3,5-二一0-异亚丙基一6-0-对甲苯横酷基一a-D-巧喃葡萄 糖(3)与邻苯二甲酯亚胺钟反应，得到6-脱氧一1,2:3,5-二一0-异亚丙基一6-邻苯二 甲酯亚胺一a-D-巧喃葡萄糖(4)。使6-脱氧一1,2:3,5-二一0-异亚丙基一6-邻苯二 甲酯亚胺一a-D-巧喃葡萄糖(4)与阱水合物反应，可W得到6-氨基一6-脱氧一1,2:3， 5-二一0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖(P-氨基葡萄糖）（5)。
[0252] 本发明中，提供式(XIX)表示的多葡萄糖聚合物(multiglucose polymer)的制造 方法，其包括w下步骤：
[0巧3] (i)将式(XlXa)表示的化一阳G-OH的0H基进行氨基化，得到式(XlXb)表示的化一 阳G-N出；
[0254] (ii)使得到的N3-PEG-N出与L-天冬氨酸一β-节醋一N-簇酸酢反应，得到式 (XIXc)表示的化一阳G-PBLA;
[0255] (iii)将得到的化一阳G-PBLA的保护基通过碱性水解脱保护；
[0巧6] (iv)使得到的化一PEG-聚天冬氨酸的簇基与6-氨基一6-脱氧一1,2:3,5- 二一0-异亚丙基一a-D-巧喃葡萄糖的氨基缩合，之后，将0H基的保护基脱保护。
[0 巧 7]
[0巧引 {式中，山9为5~20,000的整数，及虹9为2~5,000的整数。}
[0%1] {式中，Bn表示作为保护基的苄基。}
[0262]作为本发明中使用的药物，不受特别限定，可W使用生理活性物质、抗体、核酸、生 物相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂。本发明中，可W将药物高选择 性地递送至脑。因此，作为药物，不受特别限定，例如，可W使用提高脑的生理功能的生理活 性物质、可W处置脑的疾病的生理活性物质、识别脑疾病的特征性抗原的抗体、调节脑疾病 相关基因的表达的核酸、可W将脑染色的生物相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造 影剂等造影剂。例如，使用了作为药物提高脑的生理功能的生理活性物质、可W处置脑的疾 病的生理活性物质、识别脑疾病的特征性抗原的抗体、调节脑疾病相关基因的表达的核酸 的本发明的组合物可药物组合物的形式提供。使用了作为药物可W将脑染色的生物相 容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂的本发明的组合物可诊断剂的 形式提供。
[0263] 本发明的组合物或偶联物可W直接施予对象，也可W基于本发明的施予计划施 予。本发明的施予计划中，优选的是，首先，使对象禁食、或诱发对象的低血糖，之后，将该组 合物施予该对象。本发明的施予计划中，更优选的是，首先，使对象禁食、或诱发对象的低血 糖，之后，将该组合物施予至该对象及诱发该对象的血糖值上升。此处，本发明的施予计划 中，该组合物对该对象的施予与该对象的血糖值上升的诱发同时、连续或逐次地实施。可W 认为，低血糖状态的诱发对于使化UT1在血管内皮细胞(例如，脑血管内皮细胞)的内表面表 达有用。但是，根据本发明，对于本发明的组合物或偶联物而言，施予对象的血糖值上升对 于运些成分向脑的递送极其有效。根据本发明，当使之禁食、或已诱发低血糖的对象的本发 明的组合物(载体等)或偶联物的血中浓度为一定值W上时，通过使血糖值上升，可W将本 发明的组合物(载体等)或偶联物极其有效地递送至脑内。另外，根据本实施例，在诱发对象 的血糖值上升后的短时间内，本发明的组合物(载体等)或偶联物也会被递送至该对象的脑 内。
[0264] 从将本发明的组合物(载体等)或偶联物的血中浓度保持为一定值W上的观点考 虑，优选将本发明的组合物或偶联物输液施予至对象。通过运样操作，即使是血中滞留时间 短的组合物或偶联物，也容易确保一定的血中浓度。例如，如果将包封血中滞留时间短的 siRNA的siRNA胶束通过输液施予至对象，则效果容易提高。输液施予可W优选实施10分钟 W上、15分钟W上、30分钟W上、45分钟W上、60分钟W上、90分钟W上、或2小时W上。输液 施予优选W-定的输液速度进行。例如，如果使用精密施予累，则可W按照一定的输液速度 施予。输液施予可W与对象的血糖值上升的诱发同时实施，也可W在输液施予过程中诱发 对象的血糖值上升。
[0265] 对于本发明的组合物或偶联物而言，如果基于本发明的施予计划施予，则向脑的 递送效率会选择性提高。因此，本发明的组合物或偶联物可W用于将药物递送至脑。本发明 的组合物或偶联物还可W使药物通过血脑屏障。因此，本发明的组合物或偶联物可W用于 将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等造影 剂等药物递送至W往难W递送到达的脑实质。本发明的组合物或偶联物还可W使药物在脑 血管内皮细胞蓄积。因此，本发明的组合物或偶联物可W用于将生理活性物质、抗体、核酸、 生物相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物递送至W往难W递送 到达的脑血管内皮细胞。另外，本发明的组合物或偶联物也可W用于将减弱或破坏脑血管 内皮细胞间的连接的药物递送至脑血管内皮细胞。同样地，本发明的组合物或偶联物可W 用于将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等 造影剂等药物递送至视网膜、末梢神经及/或脊髓液。本发明的组合物或偶联物还可W用于 将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等造影 剂等药物递送至各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮细胞。 本发明的组合物或偶联物也可w用于将减弱或破坏各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障 或血脑脊液屏障的血管内皮细胞间的连接的药物递送至脑血管内皮细胞。通过减弱或破坏 血管内皮细胞间的连接，可W减弱屏障的功能，使各种药物通过屏障。
[0266] 本发明的组合物及偶联物可W通过口服施予及非口服施予（例如，静脉内施予或 腹腔内施予)施予。
[0267] 本发明提供一种祀向脑组织的方法，所述方法包括将外表面被化UT1配体修饰的 药物递送用载体按照施予计划施予至对象。本发明还提供一种祀向脑血管内皮细胞的方 法，所述方法包括将外表面被GLUT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施予至对象。 本发明的施予计划优选包括将该载体施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的 是，本发明的施予计划包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该 对象的血糖值上升。同样地，本发明提供一种祀向末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液的方 法，所述方法包括将外表面被GLUT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施予至对象。 本发明还提供一种祀向各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮 细胞的方法，所述方法包括将外表面被化UT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施 予至对象。
[0268] 根据本发明，可W将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性巧光色素、W及超声 波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物包封于载体，由此，可W将包封于载体的药物有效地 递送至脑、末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液。
[0269] 本发明提供一种祀向脑组织的方法或将药物递送至脑组织的方法，所述方法包括 将药物与化UT1配体的偶联物或药物与化UT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予 计划施予至对象。本发明还提供一种祀向脑血管内皮细胞的方法，所述方法包括将药物与 GLUT1配体的偶联物或药物与化UT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予 至对象。本发明的施予计划优选包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象， 更优选的是，本发明的施予计划包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象 及诱发该对象的血糖值上升。同样地，本发明提供一种祀向末梢神经组织、视网膜及/或脊 髓液的方法，所述方法包括将药物与化UT1配体的偶联物或药物与GLUT1配体经由连接体连 接而成的偶联物按照施予计划施予至对象。本发明还提供一种祀向各自存在于血神经屏 障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮细胞的方法，所述方法包括将药物与GLUT1配 体的偶联物或药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至对象。
[0270] 根据本发明，作为偶联物中含有的药物，可W使用生理活性物质、抗体、核酸、生物 相容性巧光色素、W及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物，由此，可W将药物有效地 递送至脑、末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液。
[0271] 根据本发明，作为药物，可W使用脑疾病治疗药或预防药。运种情况下，本发明提 供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将药物递送用载体按照施予计划施予至需 要的对象，所述药物递送用载体的外表面被GLUT1配体修饰，且包封有脑疾病治疗药或预防 药。同样地，本发明提供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将药物递送用载体按 照施予计划施予至需要的对象，所述药物递送用载体的外表面被化UT1配体修饰，且包封有 末梢神经疾病治疗药或预防药。同样地，本发明提供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方 法包括将药物递送用载体按照施予计划施予至需要的对象，所述药物递送用载体的外表面 被化UTl配体修饰，且包封有视网膜疾病治疗药或预防药。本发明的施予计划优选包括将该 组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括将该 组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该对象的血糖值上升。
[0272] 根据本发明，作为药物，可W使用脑疾病治疗药或预防药。运种情况下，本发明提 供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将脑疾病治疗药或者预防药与化UT1配体 的偶联物或脑疾病治疗药或者预防药与化UT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予 计划施予至需要的对象。同样地，本发明提供一种末梢神经疾病的治疗或预防方法，所述方 法包括将末梢神经疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体的偶联物或末梢神经疾病治疗药或 者预防药与化UT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至需要的对象。同 样地，本发明提供一种视网膜疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将视网膜疾病治疗药 或者预防药与GLUT1配体的偶联物或视网膜疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体经由连接 体连接而成的偶联物按照施予计划施予至需要的对象。本发明的施予计划优选包括将该组 合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括将该组 合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该对象的血糖值上升。
[0273] 因此，本发明提供一种用于处置或预防脑疾病的药物组合物，所述组合物是含有 脑疾病治疗药或预防药而成的。根据本发明可知，药物向脑中的摄入提高，本发明的药物组 合物对于脑疾病的治疗或治疗有用。本发明还提供一种用于处置或预防末梢神经疾病的药 物组合物，所述药物组合物是含有末梢神经疾病治疗药或者预防药而成的。根据本发明可 知，药物向末梢神经中的摄入提高，本发明的药物组合物对于末梢神经疾病的治疗或预防 有用。本发明还提供一种用于处置或预防视网膜疾病的药物组合物，所述组合物是含有视 网膜疾病治疗药或者预防药而成的。根据本发明可知，药物向视网膜中的摄入提高，本发明 的药物组合物对于视网膜疾病的治疗或预防有用。根据本发明，上述治疗药或预防药可W W包封于载体的形态包含在组合物中，或者，可W经由或未经由连接体而与GLUT1配体进行 偶联的形态包含在组合物中。
[0274] 作为脑疾病，可W举出可W通过使脑疾病治疗药通过血脑屏障来治疗的脑疾病， 例如，焦虑、抑郁症、睡眠障碍、阿兹海默症、帕金森病及多发性硬化症等。因此，本发明中， 为了治疗运些脑疾病，可W使用抗焦虑剂、抗抑郁药、睡眠诱导剂、阿兹海默症治疗药、帕金 森病治疗药及多发性硬化症治疗药等脑疾病治疗药或预防药。作为阿兹海默症治疗药，例 如，已知Αβ抗体，作为帕金森病治疗药，例如，已知多己胺受体激动剂及左旋多己，作为多发 性硬化症治疗药，例如，已知肾上腺类固醇剂、干扰素 e(iF她）、及免疫抑制剂，运些治疗药 可W用于本发明。作为末梢神经疾病，可W举出可W通过使末梢神经疾病治疗药通过血脑 屏障治疗的末梢神经疾病，例如，吉兰一己雷综合征、菲希尔综合征及慢性炎性脱髓銷性多 发性神经根神经病。作为视网膜疾病，可W举出可W通过使视网膜疾病治疗药通过血脑屏 障治疗的视网膜疾病，例如，视网膜色素变性症、脉络膜视网膜环状萎缩、无脉络膜症、结晶 样视网膜病变、先天性黑朦、先天性静止性夜盲、小口病、白点状眼底、白点状视网膜炎、色 素性静脉旁视网膜脉络膜萎缩、斯特格(Stargardt)病、卵黄状黄斑营养不良、青年性视网 膜分离症、中屯、性轮状脉络膜萎缩、隐匿性黄斑营养不良、家族性渗出性玻璃体视网膜病变 及眼底血管样条纹。
[0275] 实施例 脚引 实施例l:Glc(6)-PIC胶束的制造
[0277]实施例1中，进行了形成胶束所需要的高分子的合成。 脚引 l-l.Glc(6)-PEG-P(Asp)的合成
[02巧]首先，合成了 1,2 - 0 -异亚丙基一5,6 - 0 -亚苄基一a - D -巧喃葡萄糖（W下也 称为"BIG-OH")。具体而言，在烧瓶中将lOg 1,2 -0-异亚丙基一α -D -巧喃葡萄糖（W下 也称为"MIG")(和光纯药工业公司制）、40mL苯甲醒混合，一边在旋转式蒸发器中旋转一边 混合4小时，使之反应。反应后，添加66mL乙酸乙醋，用120mL蒸馈水清洗，仅回收有机层（乙 酸乙醋层），于〇°C添加500mL己烧进行重结晶，得到9.2g BIG-〇m收率为85% )。
[0280]接着，由得到的BIG-OH合成BIG-聚乙二醇(BIG-PEG-OH)。具体而言，为了使 BIG均匀地附着于反应容器的玻璃壁面，将苯冷冻干燥后于70°C过夜减压干燥而得的0.72g BIG-0田容解于5mL四氨巧喃(THF)。由此，得到具有分子量统一的单峰性的峰的凝胶渗透色 谱图（数据未示出）。在BIG-0田容液中滴入含有0.3M的糞化钟的THF溶液3.3mL，在氣气气氛 下添加2.2mL环氧乙烧化0)并于常溫使之反应48小时。之后，在反应液中添加 ImL的甲醇，用 含有10%甲醇的冷却酸使之再沉淀，回收2.8g BIG-PEG-〇m收率为89% )。
[0%1]进一步地，将得到的BIG-PEG-OH的0H基进行氨基化，合成具有氨基乙基的BIG- PEG-N此。具体而言，在溶解有0.8mL的Ξ乙胺的THF溶液20mL中溶解2. Og经过苯冷冻干燥 的BIG-阳G-OH。在将570mg甲横酷氯溶解于20mL冷THF中而得的溶液中，添加上述的BIG- PEG-OH溶液，于室溫使之过夜反应。通过过滤除去沉淀的盐，用包含含有10%甲醇的乙酸 的制冷剂500mL使滤液再沉淀，过滤后，减压干燥。将得到的粉末溶解于100mL25%氨水溶 液，于室溫使之反应2天。用透析膜(截留分子量为1，000)在稀释2000倍的氨水溶液中透析， 之后，在纯水中透析。之后，用S邱hadex C-25(GE healthcare)除去未进行氨基化的馈分， 实施冷冻干燥，回收1.6g BIG-阳G-N出川欠率为85%)。纯化后的BIG-阳G-N出的hInMR谱 图中未观察到由杂质引起的峰(数据未示出）。
[0282] 进一步地，由得到的BIG-阳G-N此合成BIG-PEG-聚化一天冬氨酸一β-节醋） (W下也称为"BIG-阳G-PBLA")。具体而言，在3.5mL DMF中溶解1.7g L-天冬氨酸一β- 节醋一Ν-簇酸酢m下也称为"BLA-NCA")，用30mL的二氯甲烧稀释。在4mL的二氯甲烧中 溶解苯冷冻干燥后的BIG-PEG-N出200mg，在化A-NCA溶液中添加该溶液，在氣的存在 下，于35°C聚合40小时。通过IR分析确认到聚合反应结束后，在500mL己烧/乙酸乙醋= 6:4 中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚合物，真空干燥，得到1.39g BIG-PEG-PBLA (收率为58%)。得到的BIG-PEG-PBLA显示了具有分子量统一的单峰性的峰的凝胶渗透色 谱图(数据未示出）。
[0283] 进一步地，由得到的BIG-PEG-PBLA合成BIG-PEG-聚天冬氨酸下也称为 "BIG_PEG_P(Asp.r)。一边在0.5N氨氧化钢中悬浊500mg BIG-PEG-PBLA,-边于室溫 水解苄基醋。共聚物溶解后，用透析膜(截留分子量为1，〇〇〇)在水中透析。将膜内的溶液冷 冻干燥，得到 132mg BIG-PEG-P(Asp. K收率为68% )。
[0284] 之后，由 BIG-阳 G_P(Asp.)合成 Glc(6)_ 阳 G_P(Asp.)。此处，Glc(6)是指葡萄 糖通过其6号碳与阳6结合。在1〇1^^氣乙酸/纯水(8:2)中溶解10〇111邑616-阳〇-?^3口.）， 使之反应1小时。用透析膜(截留分子量为l，〇〇〇)W〇.〇lN NaOH、纯水的顺序进行透析。将膜 内的溶液冷冻干燥，得到70mg Glc(6) -PEG-P(Asp. K收率为70% )。
[02 化]l-2.PEG-P(Asp)及PEG-P(Asp.-AP)的合成
[0286] 首先，通过L-天冬氨酸一β-节醋一N-簇酸酢(BLA-NCAK委托中央化制品公司 审雌而得)的聚合得到聚乙二醇一聚化一天冬氨酸一β-节醋)嵌段共聚物(PEG-PBLA)。具 体而言，将18.9g BLA-NCA溶解于20mL Ν，Ν'一二甲基甲酯胺(DMF)中。在20mL DMF中溶解 2. Og具有甲氧基末端和氨基乙基末端的聚乙二醇(PEG-N出）（分子量为2，000)，在化A- NCA溶液中加入该溶液。一边使混合溶液保持为35°C，一边聚合40小时。通过红外吸收光谱 (IR)分析确认到聚合反应结束之后，在化乙酸中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的 聚合物，用乙酸清洗后真空干燥，得到15.51 g阳G -PBLA(收率为79 % )。
[0287] 接着，由阳G-PBLA合成聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物(PEG-P(Asp.)。具体 而言，一边在0.5N氨氧化钢中悬浊1. Og PEG-PBLA，一边于室溫水解苄基醋。共聚物溶解 后，用透析膜（截留分子量为6,000-8,000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到 654mg PEG-P(Asp.K收率为78%)。
[0288] 接着，由PEG-PBLA合成聚乙二醇一聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸）嵌段共聚物 (PEG - P (Asp . - AP))。具体而言，在1 OmL DMF中溶解1 g经过苯冷冻干燥的PEG - PBLA。在 PEG-PBLA溶液中加入8mL 1，5 -二氨基戊烧(DAP)。一边将混合溶液保持为5°C，一边使之 反应1小时。之后，在反应液中添加15.2mL 20重量％的乙酸水溶液，用透析膜(截留分子量 为6，000 - 8，000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到954mg PEG - P (Asp. - AP K收 率为81%)。
[0289] 1-3.巧光标记化聚合物切5-PEG-P(Asp.)的合成
[0巧0] 将500mg通过上述得到的阳G-PBLA溶解于20mL二甲基亚讽(DMS0)。在PEG-PBLA 溶液中添加25mg横酸基型Cy5 - N -径基班巧酷亚胺醋化umiprobe公司制，制品编号： 43320)，于常溫使之反应2天。之后，添加75mL 0.5N氨氧化钢，于室溫水解苄基醋。用透析膜 (截留分子量为6,000-8,000)W乙醇、水的顺序透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到456mg 切5_PEG_P(Asp. K收率为86% )。
[0291] l-4.Glc(3)-PEG-P(Asp)的合成
[0292] 首先，由经过苯冷冻干燥的1，2,5,6_二_0_异亚丙基_a_D_巧喃葡萄糖 (DIG)得到DIG-阳G-OH。具体而言，在5mL THF中溶解0.72g DIG(TCI公司制），得到DIG- 0田容液。之后，在得到的DIG-0田容液中滴入3.5mL含有0.3M的糞化钟的THF溶液，在氣气气 氛下添加2.5mL环氧乙烧化0)，于常溫使之反应48小时。之后，在反应液中添加 ImL的甲醇， 用使用制冷剂充分冷却的含有10%甲醇的酸使之再沉淀，回收3.2g DIG-PEG-〇H(收率为 86%)。
[0巧3] 接着，将得到的DIG-阳G-OH进行氨基化，得至化IG-阳G-N此。具体而言，在32mL 溶解有0.8mL的Ξ乙胺的THF溶液中溶解3.2g经过苯冷冻干燥的DIG-PEG-OH。在上述的 DIG-PEG-0田容液中添加将912mg甲横酷氯溶解于32mL冷THF而得的溶液，于室溫使之过夜 反应。通过过滤除去沉淀了的盐，用500mL包含含有10%甲醇的乙酸的制冷剂使滤液再沉 淀，过滤后减压干燥。在lOOmL 25%氨水溶液中溶解得到的粉末，于室溫使之反应2天。用透 析膜（截留分子量为1，000) W稀释2000倍的氨水溶液中、纯水的顺序透析。之后，用 sephadex C - 25(GE healthcare)除去未进行氨基化的馈分，实施冷冻干燥，回收2.95g DIG-阳G-NH2川欠率为89% )。
[ο巧4] 进一步地，由得到的DIG-阳G-N此合成DIG-阳G-PBLA。具体而言，在3.5mL DMF 中溶解1.7g BLA-NCA，用30mL的二氯甲烧稀释。在4mL的二氯甲烧中溶解苯冷冻干燥后的 DIG-阳G-N此200mg，在BLA-NCA溶液中添加所述溶液，在氣的存在下，于35°C聚合40小 时。通过IR分析确认到聚合反应结束后，在500mL己烧/乙酸乙醋（己烧/乙酸乙醋= 6:4)中 滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚合物，真空干燥，得到1.32g DIG-PEG-PBLA 川欠率为70%)。
[0巧5] 进一步地，由得到的DIG-PEG-PBLA合成DIG-PEG-聚天冬氨酸(DIG-PEG-P (Asp.))。具体而言，一边在0.5N氨氧化钢中悬浊500mg DIG-PEG-PBLA，一边于室溫水解 苄基醋。共聚物溶解后，用透析膜(截留分子量为1，〇〇〇)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干 燥，得到 145mg DIG-PEG-P(Asp. K收率为54% )。
[0 巧 6]进一步地，由得到的 DIG_PEG_P(Asp.)合成 Glc(3)_PEG_P(Asp.)。此处，Glc (3)是指葡萄糖通过其3号碳与PEG结合。具体而言，在lOmLS氣乙酸/纯水(Ξ氣乙酸：水= 8:2)中溶解lOOmg DIG-阳G-P(Asp.)，使之反应1小时。用透析膜(截留分子量为1，000)W 0.01N化OH、纯水的顺序透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到75mg Glc(3)-PEG-P(Asp.) 川欠率为86%)。
[0巧7] 1-5.C巧一PIC胶束的制备
[0 巧引在501^10111]\0溝酸缓冲液。6，口^.4,〇111]\1化(：1)中溶解5〇111邑切5_?66_口^3口.）， 制备 Img/mL 的切 5-PEG-P(Asp.)溶液。同样地，在 50mL PB 中溶解 50mg PEG-P(Asp.- AP)，制备Img/mL的阳G-P(Asp.-AP)溶液。在50mL的离屯、管中分别添加4mL切5-PEG-P (Asp.)和7.0mL PEG-P(Asp.-AP)运巧巾水溶液，用縱满混合器（Votrex)揽拌2分钟 (200化口111)。之后，加入含有水溶性缩合剂即1-乙基一3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐 酸盐化DC)(10mg/mL)的PB溶液5.6mL，过夜静置并将聚离子复合物的核交联。之后，用附有 截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与胶束形成无关的聚合物及邸C的副产物等。
[0巧9] 1-6.得到的C巧一PIC胶束的表征
[0300] 用Ze化sizer(Malvern)测定得到的切5-PIC胶束的大小（Z平均粒径)及多分散指 数(PDI)。关于大小，测定通过布朗运动移动的粒子的扩散，将其测定结果利用斯一爱氏 (Stokes-Einstein)方程转换为粒径和粒度分布。此外，用透射电子显微镜（TEMJEM- iAOO) 评价胶束的形状。此处，所谓 Z 平均粒径，是指将粒子分散物等的动态光散射法的测定 数据用累积量(cumulant)解析法解析而得的数据。累积量解析中，得到粒径的平均值和多 分散指数(PDI)，本发明中，将该平均粒径定义为Z平均粒径。严格而言，将使多项式拟合在 测定中得到的G1相关函数的对数的操作称为累积量解析，W下式：
[0301] LN(Gl)=a+bt+ct2+化3+et4+……中的常数b被称为二次累积量或Z平均扩散系数。 用分散介质的粘度和几个装置常数将Z平均扩散系数的值换算为粒径而得的值为Z平均粒 径，其作为分散稳定性的指标适于品质管理目的。
[030。1 -7 .Glc(6)-切 5-PIC 胶束的制备
[030；3]在6〇1111^1〇111]\0溝酸缓冲液。8,9町.4,〇111]\〇^(：1)中溶解2〇111旨61。（6)-?66-? (Asp.)和40mg 切5_PEG_P(Asp.)，制备Img/mL的切5_Glc(6)_阳G_P(Asp.)与阳G-P (ASP .)的混合溶液。同样地，在5OmL PB中溶解5Omg PEG - P (ASP . - AP)，制备1 mg/mL的 PEG_P(Asp._AP)溶液。在50mL的离屯、管中分别添力日切5_PEG_P(Asp.)与PEG_P(Asp.) 的混合液4mL PEG-P(Asp . -AP)溶液和7 . OmL运巧巾水溶液，利用縱满混合器揽拌2分钟 (200化pm)。之后，添加5.6mL含有水溶性缩合剂邸C( lOmg/mL)的PB溶液，过夜静置并将聚离 子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与胶束形成无关 的聚合物、EDC的副产物等。
[0304] 1-8.61(；(6)_〔巧_?1却$束的表征
[030日]用Ze1:asize;r(Malve;rn)测定得到的Glc(6)-切5 -PIC胶束的大小（Z平均粒径）及 多分散指数(PDI)。其结果表明，得到了平均粒径为40nm、粒径均匀的胶束（图2A)。另外，对 于胶束的形状而言，使用透射电子显微镜(TEM，JEM-1400)，在用乙酸双氧轴染色后进行观 察（图2B)。
[0306] l_9.Glc(3)_ 切 5-PIC 胶束的制备
[0307] 在60mL抑为7.4的lOmM憐酸缓冲液(PB，0mM化C1)中溶解20mg Glc(3)_阳G-P (Asp.)和40mg 切5_PEG_P(Asp.)，制备Img/mL的切5_Glc(3)_阳G_P(Asp.)与阳G-P (Asp .)的混合溶液。同样地，在5OmL PB中溶解5Omg PEG - P (ASP . - AP)，制备1 mg/mL的 PEG_P(Asp. -AP)溶液。在50mL的离屯、管中分别添加4mL C巧_PEG_P(Asp. )、PEG_P (Asp.)的混合液和4.3mL PEG-P(Asp. -AP)溶液运巧巾水溶液，用縱满混合器揽拌2分钟 (200化pm)。之后，添加5.6mL含有水溶性缩合剂即抓C( lOmg/mL)的PB溶液，过夜静置并将聚 离子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与胶束形成无 关的聚合物、EDC的副产物等。用Ze1:asize;r(Malve;rn)测定得到的Glc(6) - 切5 - PIC胶束的 大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。另外，用透射电子显微镜(TEM JEM -1400)评价胶束 的形状。得到的胶束的直径为32nm(PDI = 0.043)(数据未示出）。
[030引实施例2. PK胶束的体内动态评价实验
[0309] 将实施例1中制造的胶束静脉施予至小鼠，调查其体内动态。施予胶束时，也对血 糖操作的效果进行评价。
[0310] W下的实施例中，向脑中的蓄积基于相对于总施予量而言每Ig脑中蓄积的量（％ ) 进行评价。
[0311] 对24小时未喂食的禁食小鼠（Balb/c罕6周龄）与自由喂食的小鼠分别静脉施予 (1.乂.）200化上述的各胶束溶液（即，61。（6)-切5-?1却交束、61。（3)-切5-?1却交束或 切5 -PIC胶束的溶液(浓度为Img/mL))。此处记载的Img/mL是通过用化no化op测定源于与 各自的聚阴离子结合的切5的巧光的结果求得的值。需要说明的是，禁食的小鼠组在胶束溶 液施予6小时后重新开始喂食。待经过规定的时间后，对小鼠实施麻醉开腹后，从腹部大动 脉采集血液，继而取出脑、肝脏、脾脏、肾脏、屯、脏、肺及大腿肌肉。于4°(：、15,00化口111将采集 的血液离屯、5分钟，制备血浆，分注于96孔板（Thermo Fisher，美国），通过使用Tecan Infinite M1000 PRO的巧光测定根据血浆的巧光强度定量血中的胶束浓度。此时，作为对 照，使用了未施予样品的小鼠的血液。另外，假定小鼠的全血为2mL、其中血浆的量为55%， 评价药物的体内动态。分别对脑、肝脏、脾脏、肾脏、屯、脏、肺及大腿肌肉添加溶解缓冲液和 金属锥(metal cone)，粉碎并制成悬浊液，分别注入96孔板(Thermo Fisher,美国），通过使 用Tecan Infinite M1000PR0的巧光测定定量胶束向各脏器中的蓄积效率（％)。
[0312] 其结果是，将外表面经由葡萄糖的6号碳而被修饰的胶束(Glc(6)-PIC胶束)在使 小鼠禁食后施予至小鼠时，向脑中的蓄积量与喂食的重新开始同时显著增大，相对于Ig脑 而言最多蓄积了总施予胶束量的约3.8% (图3A)。此时，血中胶束浓度与喂食的重新开始同 时减少(数据未示出）。在未用葡萄糖修饰其外表面的胶束中，未观察到上述向脑中的胶束 的蓄积量的增大。因此，由该结果可见，对于Glc(6)-PIC胶束向脑中的蓄积而言，通过禁食 使小鼠的血糖值降低、及在胶束施予前后使该小鼠的血糖值上升是重要的。但是，将胶束施 予使之禁食的小鼠后，即使在喂食重新开始前，一部分胶束也被脑摄入（图3A的黑色方块）。 另外，将胶束施予未使之禁食的小鼠后，一部分胶束也被脑摄入（图3A的白色方块）。另外， 评价了胶束向各脏器中的累积量，其结果是，血糖操作导致向脑中的蓄积量选择性地增大 (图3B)。因此，由血糖操作导致的蓄积量的增大可W理解为是脑特异性的。需要说明的是， 对于肝脏、肾脏而言，无论有无血糖操作，均分别显示了约8%及4%的蓄积(数据未示出）。 另外，如果将制备其外表面经由葡萄糖的6号碳而被修饰的胶束(Glc(6)-PIC胶束)时使用 的阳离子性高分子全部设为Glc(6)-PEG-P(Asp.)，则可W得到葡萄糖导入率为50%的胶 束，如果将一半设为Glc(6)-PEG-P(Asp.)，则可W得到葡萄糖导入率为25%的胶束。若通 过上述方法施予得到的胶束，则葡萄糖导入率为25%的胶束显示了大于3%的向脑中的蓄 积，相对于此，葡萄糖导入率为50 %的胶束显示了约1.3 %的向脑中的蓄积。
[0313] 进一步地，比较了其外部表面经由葡萄糖的3号碳而被修饰的胶束(Glc(3)-PIC 胶束与Glc(6)-PIC胶束）的向脑中的蓄积量。具体而言，通过上述的方法将Glc(6)-切5- PIC胶束和Glc(3)-切5-PIC胶束i.v.施予至禁食小鼠，在6小时后重新开始喂食，在施予 起8小时后(喂食重新开始起2小时后)摘取脑，通过上述的方法算出各自的样品向脑中的累 积量。结果，Glc(6)-PK胶束显示了较之Glc(3)-PK胶束更多的向脑中的蓄积（图4B)。
[0314] 为了更详细地调查胶束向脑内的蓄积部位，实施了In vivo共焦显微镜观察。具体 而言，首先，在2.5%异氣烧麻醉下实施24小时禁食后的小鼠（Balb/c，罕，6周龄)的开烦。接 着，一边维持麻醉，一边在微静脉内设置用于样品的i.v.施予的导管，另外，在腹腔内设置 用于葡萄糖溶液的腹腔内施予(i.P.)的导管，并置于共焦显微镜(Nikon A1R)的载物台。在 观察开始5分后将Glc(6)-切5-PIC胶束（lmg/mL、200化)通过导管i.v.施予(示意图5B的0 分钟为样品施予的时机）。接着，在样品施予30分钟后将20v/v%葡萄糖溶液通过导管i.P. 施予。用激发波长为638nm的激光在约3小时内实时观察脑内的样品的巧光变化(巧光波长 为662~737nm)。结果，观察到原本仅在血管内观察到的巧光随着时间经过渗出至脑实质 (例如，虚线部）的现象（图5A)。根据上述的观察中得到的视频，W观察经过的时间作为横 轴，W与脑血管不重叠的5个区域（图5A所示脑实质的虚线部）的R0K感兴趣区域，region of interest)的巧光强度的平均值作为纵轴进行绘图。结果，胶束的向脑实质中的摄入追 随血糖值的上升而上升（图5B)。需要说明的是，小鼠的血糖值是通过W下方法求得的：分别 在即将i.P.施予葡萄糖溶液之前、施予20分钟后、30分钟后、50分钟后或90分钟后通过微静 脉采集5化血液，用实验动物用血糖值测定仪测定血糖值（图5B)。由于胶束向脑中的摄入伴 随血糖值上升后的血糖值的降低而发生，可W认为，胶束的施予也可W在血糖值上升之后。
[0315] 接着，确认到即使在血糖值上升之后实施胶束的施予，胶束也会移动至脑实质。具 体而言，首先，在2.5%异氣烧麻醉下实施24小时禁食的小鼠（Balb/c，罕，6周龄)的开烦。接 着，一边维持麻醉，一边在腹腔内设置用于葡萄糖溶液的腹腔内施予（i.P.)的导管，并设置 于共焦显微镜(N化on A1R)的载物台。通过导管i.P.施予20v/v%葡萄糖溶液，接着，在葡萄 糖施予30分钟后，通过导管i.v.施予Glc(6)-切5-PIC胶束（lmg/mL，200化），或不使用导 管而进行i.P.施予，开始观察(示意图IIB的ο分钟表示样品施予的时机）。关于巧光，用激发 波长为638nm的激光在约3小时内W巧光强度为指标实时观察图11Α所示的4个脑实质区域 中的样品的蓄积（巧光波长为662~73化m)。结果，如图11B表示的那样，样品的i.v.施予之 后立刻观察到向脑实质内的样品的摄入，随着时间经过，摄入量稳定地增大，在3小时内持 续摄入。通过改变葡萄糖施予与样品施予的前后关系，样品向脑实质中的摄入量的经时模 式变化。运意味着，通过改变葡萄糖施予与样品施予的前后关系，可W控制通过血脑屏障的 时机。
[0316] 由此可见，本发明的组合物可W利用血糖操作而通过血脑屏障，有效地到达脑实 质。
[0317] 实施例3.PICsome的审Ij造与体内云力态评价实验
[0318] 作为直径为约lOOnm的中空载体，制造 PICsome，通过体内动态评价验证对于脑的 革己向效果。
[0319] 3-1.均 P(Asp.-AP)的合成
[0320] 首先，通过化A-NCA的聚合得到聚化一天冬氨酸一β-节醋KPBLA均聚物）。具体 而言，在33.3mL Ν,Ν'一二甲基甲酯胺(DMF)、300血二氯甲烧中溶解20g L-天冬氨酸一β - 节醋一Ν-簇酸酢(BLA-NCA)。在上述BLA-NCA溶液中添加89.0化Ν-下胺。一边将混合溶 液保持为35°C，一边聚合40小时。通过红外吸收光谱（IR)分析确认聚合反应结束之后，在1L 己烧/乙酸乙醋溶液（己烧：乙酸乙醋= 6:4)中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚 合物，用乙酸清洗后真空干燥，得到14.82g(79 % )PBLA均聚物。
[0321] 接着，通过得到的PBLA均聚物合成聚（（5-氨基戊基）一天冬氨酸）（均P(Asp.- AP))。具体而言，在10血N-甲基一2 -化咯烧酬(NMP)中溶解1 g经过苯冷冻干燥的均PBLA。 在17.21^醒？中溶解17.2血04?，然后添加至均?81^\溶液。一边将混合溶液保持为5°(：，一 边反应40分钟。之后，在反应液中添加10mL20重量％的乙酸水溶液，用透析膜(截留分子量 为6，000 -8，000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到0.76g(82 % )P(Asp. -AP)。 [0：3。] 3_2.Glc(6)_ 切 5-PICsome 的制备
[0323] 在1 OmM憐酸缓冲液（PB、pH7.4、OmM化C1)6OmL中溶解2Omg实施例1中得到的G1C (6)_PEG_P(Asp.)和40mg 切5-阳G_P(Asp.)，制备Img/mL的Glc(6)_阳G_P(Asp.)与 切5-阳G-P(Asp.)的混合溶液。另外，同样地，在50mL PB中溶解50mg均P(Asp.-AP)，制备 Img/mL的均P(Asp.-AP)溶液。接着，在50mL的离屯、管中分别混合4.0mL Glc(6)-阳G-P (Asp.)与切5-阳G-P(Asp.)的混合液及5.0血均P(Asp. -AP)溶液运巧巾水溶液，利用縱满 混合器揽拌2分钟（200化pm)。之后，添加5.6mL含有水溶性缩合剂即抓C( lOmg/mL)的PB溶 液，过夜静置并将聚离子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤 管除去与PICsome形成无关的聚合物、EDC的副产物等。用Zetasizer (Malvern)测定得到的 Glc(6)-切5-PICsome的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。另外，对于胶束的形状而 言，使用透射电子显微镜(TEM，JEM-1400)，在用乙酸双氧轴染色后观察。结果表明，得到了 直径为l〇〇nm(PDI = 0.086)的PICsome(数据未示出）。
[0扣4] 3-3.体内动态评价
[0325]除了施予得到的PICsome代替PIC胶束W外，用与实施例2完全相同的方法，将 PICsome施予小鼠，观察PICsome的向脑中的蓄积。结果，观察到仅有其外表面被葡萄糖修饰 的PICsome在喂食后在脑内急剧蓄积（图6)。其外表面被葡萄糖修饰的PICsome的每Ig脑的 蓄积量为约2% (图6)。
[03%]由此可见，囊泡即使直径为lOOnm也可W毫无问题地通过血脑屏障。
[0327] 进一步地，用2光子显微镜（高速共焦激光显微镜用多光子激发激光Nikon A1RMP-1S-S33)观察囊泡在脑(大脑皮质）深部的偏在。得到的结果如图13所示。即，较之 脑表层，在脑深部观察到更强的源于PK胶束的巧光。
[0328] 观察自脑的表层起0皿、60皿、200皿、300皿、500皿或600皿的位置的切片的巧光图 像。结果，在任一深度均确认到PIC胶束向脑实质的移动，特别地，在200μπι~500μπι，大量的 巧光偏在于脑实质（图14)。
[0329] 进一步地，确认到大脑皮质中的经时性巧光强度变化。如图15所示，在1日后~1周 后期间，大量的巧光偏在于脑实质。
[0330] 由此可见，若用葡萄糖修饰其表面而得的PIC胶束伴随本发明的血糖操作被施予 至对象，则即使在脑深部(例如，60皿~600皿)也可W使胶束在脑实质蓄积。另外，所述蓄积 即使在施予1星期后也持续。对于脑而言，自表层起，存在分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、 内颗粒层、内锥体细胞层及多形细胞层(例如，参见图13~图15)，在上述任一层中均实现了 将载体递送至脑实质。运些层中，特别地，在外锥体细胞层及内颗粒层中的载体的递送显著 有效。
[0扣1] 实施例4: S iRNA胶束的制造与体内动态评价
[0332]本实施例中，用血中滞留时间短且递送效率低的siRNA与实施例2及3同样地实施 了体内动态评价。更具体而言，本实施例中，使用了由偶联有葡萄糖的PEG-聚阳离子和巧 光标记SiRNA形成的胶束评价SiRNA向脑中的蓄积。
[。扣引 4-l.Glc(6)-PEG-P(Asp.-TEP)-Chol 的合成
[0334] 首先，由通过实施例1所述的方法得到的BIG-PEG-PBLA合成BIG-PEG-PBLA- 化〇1。具体而言，在lOmL NMP中溶解120mg BIG-阳G-PBLA，添加相对于PBLA的末端的氨基 而言为10当量的4-胆酱締基氨基一4-下酸及催化剂量的二甲基氨基化晚，之后，于室溫 揽拌6小时。在乙酸/2-丙醇(9:1)溶液中滴入反应溶液，使目标物沉淀。过滤沉淀物使之减 压干燥，得到130mg BIG-阳G-PBLA-Ch〇K收率为95%)。
[0335] 接着，由得到的(BIG)_PEG_PBLA_Chol 合成 BIG_PEG_P(Asp_TEP)_Chol。具 体而言，在5mL醒P中溶解lOOmg BIG-PEG-PBLA-化〇1，在用匪P稀释的四亚乙基五胺 (TEP)溶液中滴入聚合物溶液，之后，于20°C反应1小时。在冰冷却的1N盐酸中滴入反应溶 液，于4°C用截留分子量为12,000-14,000的透析膜透析。作为透析外液，使用0.01N盐酸， 之后，将纯水用作透析外液进行透析后，将得到的溶液冷冻干燥，回收56mg的BIG-PEG-P (Asp-TEP) -ChoK收率为73% )。
[0336] 最后，由 BIG-阳 G_P(Asp_TEP)_Chol 得到 Glc(6)_ 阳 G_P(Asp_TEP)_Chol。 具体而言，在8血Ξ氣乙酸/纯水(8:2)溶液中溶解56mg BIG -阳G - P (Asp - TEP)-化01，使 之反应1小时。用透析膜(截留分子量为1，〇〇〇)使用0.01N化0H作为透析外液进行透析，继 而在纯水中透析。将得到的溶液冷冻干燥，得到67mg的G1C (6)-阳G - P (Asp - TEP)-化01 川欠率为82%)。
[0：337] 4-2.Glc(6)-siRNA胶束的制备
[033引按照图7A的合成路径制备Glc(6) -siRNA胶束。具体而言，用437.5化肥PES缓冲 液稀释262.5化溶解有Glc(6) _阳G_P(Asp. - TEP) - Choi (2mg/mL)的lOmM 肥阳S缓冲液。 用1121化肥阳S缓冲液稀释279化切5-siRNA-chol(75皿）（北海道System Science公司 制的随机序列（scramble )siRNA)。将得到的巧巾溶液混合并吹吸(pipetting) 10次，得到Glc (6)-siRNA胶束。在In vivo实验即将开始之前在2. ImL的胶束溶液中添加 65化的5M化Cl 溶液，通过吹吸制成等渗溶液后用于施予。用Zetasizer (Malvern)测定得到的Glc (6) - 切5-siRNA胶束的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。另外，对于胶束的形状而言，使用 透射电子显微镜（TEM，JEM-1400)，用乙酸双氧轴染色后观察。结果表明，得到了直径为 80nm(PDI = 0.104)的siRNA 胶束。
[0扣9] 4-3.体内动态评价
[0340] 将得到的Glc(6)-切5-siRNA胶束W200化/2小时的速度使用注射累化arvard公 司）通过静脉施予在30分钟或2小时内进行精密持续静注，在施予开始5分钟后腹腔内施予 20%葡萄糖溶液。在SiRNA胶束的施予结束起1小时后摘取脑，在用多珠振荡器(Multi ? beads 化 ocker) 粉碎后 ，使 用商用 IVIS 成像系统 (Xenogen公司） 评价各自 的亮度 。结果 ，如 果静脉施予的时间变长，则脑的亮度上升，2小时的静脉施予导致的向脑中的蓄积多于30分 钟的静脉施予导致的向脑中的蓄积（图7B)。另外，算出向脑中的蓄积量，结果表明，就SiRNA 胶束而言，在2小时的静脉施予过程中，可W将其施予量的1.3%递送至脑(每Ig)。进一步 地，在施予结束6小时后摘取脑，用共焦显微镜化SM510)实施观察，测定脑实质的巧光强度。 结果表明，S iRNA胶束在脑细胞内蓄积（图8)。
[0341] 由实施例4的结果可见，即使是血中滞留时间短、递送效率低的SiRNA运样的物质， 通过本发明的方法也可W极其有效地递送至脑。根据本发明的血糖操作，即使通过急速静 注也可W实质上将SiRNA胶束递送至脑实质，本实施例中表明，通过持续静注，可W大幅度 改善SiRNA胶束向脑实质中的递送量。
[03创实施例5:葡萄糖修饰而得的嵌段共聚物的体内动态评价
[0343] 本实施例中，将未形成胶束的Glc(6)-PEG-聚天冬氨酸施予小鼠并评价其体内 动态。
[0344] 作为Glc(6)-PEG-聚天冬氨酸，使用了实施例1中合成的Glc(6)-PEG-聚天冬 氨酸。作为对照，使用了 PEG -聚天冬氨酸。
[0345] 对Ba化/c小鼠（罕，6周龄，n = 3)分别静脉内施予200化的3mg/mL的Glc(6)-阳G- 聚天冬氨酸及对照。W-定速度实施2小时施予。在施予开始5分后腹腔内施予20%葡萄糖 溶液。在Glc(6)-PEG-聚天冬氨酸及对照的施予结束1小时后分析葡萄糖修饰而得的嵌段 共聚物的体内动态。
[0346] 结果如图9所示。如图9所示，未偶联有葡萄糖的PEG-聚天冬氨酸未显示向脑中的 蓄积，相对于此，偶联有葡萄糖的Glc(6)-PEG-聚天冬氨酸显示了每Ig脑中总施予量的 0.4%的脑的蓄积。运样，上述聚合物只要被1分子葡萄糖修饰，则向脑中的递送充分。而即 使是被认为极其容易突破血脑屏障的盐酸多奈赃齐，相对于总施予量而言每Ig脑也只蓄积 0.13%(Drug Metabolism and Disposition,1999,27(12):1406-1414)。
[0347] 实施例6:葡萄糖偶联物抗体的制备和体内动态评价
[0348] 本实施例中，使葡萄糖偶联至抗体，评价体内动态。结果，抗体通过血糖操作也显 示了向脑中的蓄积。
[0349] 作为抗体，使用了市售的小鼠 IgG、同型对照（Southern Biotechno logy Associates Inc.)。如下制造了抗体与葡萄糖的偶联物。
[0巧0] 6-1.DyLi曲t488巧光标记葡萄糖导入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物的合成 惦51] 首先，合成THP-PEG-OH。具体而言，在lOOmL四氨巧喃(THF)中溶解0.104mL 2- (2 -径基乙氧基）四氨化喃(THP)。在THP溶液中滴入2.8mL含有0.3M的糞化钟的THF溶液，在 氣气气氛下添加8.9mL环氧乙烧化0)，于40°C使之反应1天。之后，用乙酸使反应液再沉淀， 得到8.56g-个末端为四氨化喃基、一个末端为3-径丙基的聚乙二醇(THP-阳G-OH)(分 子量为12,000Κ收率为95%)。
[03对接着，将得到的ΤΗΡ-阳G-0Η的0Η基进行甲横酷化。具体而言，在20血THF中溶解 19.7化甲横酷氯(13(：1)。另夕1'，在101^四氨巧喃(1'邸）中溶解1.4邑1'册一阳0-0^分子量为 12，000)，在该溶液中添加89化Ξ乙胺。在用水浴冷却的MsCl溶液中滴入ΤΗΡ-PEG-0Η溶 液，揽拌3小时30分钟。在200mL乙酸中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀的聚合物，用乙 酸清洗后真空干燥，由此，得到1.50g-个末端为3-甲横酷基、一个末端为四氨化喃基的聚 乙二醇(MsO-PEG-THPK收率为 100% )。
[0；353] 接着，由得到的MsO-PEG-THP合成化一阳G-THP。具体而言，在lOOmL N，N'_二 甲基甲酯胺(DMF)中溶解15g MsO-PEG-THP(分子量为12,000)。一边于室溫揽拌反应溶 液，一般添加1.6：3g叠氮化钢。一边将混合溶液保持为45 °C，一边揽拌71小时。使混合溶液恢 复室溫后，添加200mL纯水。对于混合溶液，使用分液漏斗，用二氯甲烧200mL提取6次，将得 到的有机层利用旋转式蒸发器浓缩至150mL。在化乙醇中滴入浓缩液，通过抽滤回收沉淀的 聚合物后，真空干燥，得到14.3g-个末端为叠氮基、一个末端为四氨化喃基的聚乙二醇 (化一阳G-THPK收率为95%)。
[0354] 接着，将化一PEG - THP脱保护，得到化一PEG - THP。具体而言，在200mL甲醇中溶解 14.1g化一阳G-THP(分子量为12,000)。于室溫下在混合溶液中加入24mLlN肥l水溶液。 一边将反应溫度保持为25°C，一边揽拌4小时。在2.化乙酸中滴入反应混合物，通过抽滤回 收沉淀的聚合物，用乙酸清洗后真空干燥，由此，得到13.7g-个末端为叠氮基、一个末端为 3-径丙基的聚乙二醇(化一阳G-OHK收率为96%)。
[0巧日]接着，将化一阳G-OH进行氨基化，得到化一阳G-N此。具体而言，在30mL四氨巧喃 (THF)中溶解1.02gN3-阳G-OH(分子量为12,000)，在该溶液中添加47.4化^乙胺。在201^ 1'册中溶解19.7化甲横酷氯，一边用室溫水浴冷却化一阳6-0扣容液，一边加入至化一?66 - 0田容液中。于室溫将混合溶液揽拌6小时。通过过滤除去沉淀的盐，在950mL乙酸与50mL 2 - 丙醇的混合溶液中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀的聚合物，用乙酸清洗后真空干燥。 在8mL 28%氨水溶液中溶解得到的粉末，于室溫使之反应3天。用透析膜(截留分子量为 6000-8000)在纯水中透析。之后，用S邱hadex C-25(GE healthcare)除去未氨基化的馈 分，实施冷冻干燥，回收620mg-个末端为叠氮基、一个末端为3 -氨基丙基的聚乙二醇 (化一阳G-NH2K收率为61 % )。
[0巧6] 接着，由化一阳G-N此合成化一阳G-P化A。具体而言，在5.4mL的二氯甲烧中溶解 苯冷冻干燥后的化一阳G-NH2(分子量为12,000)150mg。在0.6mLDMF中溶解218mgL-天冬 氨酸一β-节醋一N-簇酸酢，在化一PEG-N出溶液中添加所述溶液，在氣存在下于35°C聚合 2天。通过IR分析确认聚合反应结束后，在150mL乙酸中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀 的聚合物，真空干燥，得到250mg-个末端为叠氮基的聚乙二醇一聚化一天冬氨酸一β-节 醋)嵌段共聚物(Ν3-阳G-PBLA)(分子量为12,000Κ收率为91%)。
[0巧7] 接着，由化一阳G-PBLA得到化一PEG-P(Asp)。具体而言，在4mL乙腊中溶解250mg 化一阳G-PBLA，在该溶液中加入5.5mL 0.5N氨氧化钢水溶液，于室溫揽拌1小时。用透析膜 (截留分子量为6000 - 8000)在水中透析反应液。将膜内的溶液冷冻干燥，得到189mg-个末 端为叠氮基的聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物(化一PEG-P(Asp))(分子量为12,000) 川欠率为89%)。
[0巧引接着，合成了6 -氨基一6 -脱氧一1,2:3,5 -二一0 -异亚丙基一a - D -巧喃葡萄 糖(P -氨基葡萄糖）。？一氨基葡萄糖基于化rbohy化.Res. 19,197-210( 1971)的记载合成。
[0359] 合成了导入了保护葡萄糖的聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物。具体而言，在4mL N，N'_二甲基甲酯胺（DMF)中溶解137mg6_氨基一6-脱氧_1，2:3,5_二_0_异亚丙 基一a-D-巧喃葡萄糖(P-氨基葡萄糖）。在4mL DMF及ImL水的混合溶剂中溶解40mg-个 末端为叠氮基的聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物（化一PEG-P(Asp))(分子量为12， 000)，在上述P-氨基葡萄糖溶液中加入该溶液。之后，进一步添加203mg 1-乙基一3- (3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。于室溫下将得到的混合溶液揽拌13小时。之后，用透 析膜(截留分子量为6,000-8,000)在DMS0中透析混合溶液，继而在水中透析。将膜内的溶 液冷冻干燥，得到49mg导入了保护葡萄糖的聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物（收率为 96%)。
[0360] 接着，将葡萄糖的保护基脱保护，得到葡萄糖导入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共 聚物。具体而言，对于49mg保护葡萄糖导入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物，添加将18mL Ξ氣乙酸及2mL水混合而得的溶液，于室溫揽拌20分钟。之后，使用透析膜(截留分子量为6， 000-8,000)，一边保持为4°C 一边在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到40mg葡萄糖导 入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物(收率为87%)。
[0361] 进一步地，用巧光色素 DyLi曲t488标记了得到的共聚物。具体而言，在lOmL二甲基 亚讽(DMS0)中溶解40mg葡萄糖导入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物。另外，在5mL DMS0 中溶解DyLi曲t488N-班巧酷亚胺醋，在葡萄糖导入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物溶 液中加入所述溶液。于室溫下将混合溶液揽拌48小时。接着，用透析膜(截留分子量为6， 000-8,000)在水中透析混合溶液。将膜内的溶液冷冻干燥，得到黄色的固体。利用PD-10 柱(GE化althcare社）纯化得到的固体。用透析膜(截留分子量为6,000-8,000)在水中透 析溶出液。将膜内的溶液冷冻干燥，得到33mg DyLi曲t488巧光标记的葡萄糖导入聚乙二 醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物。
[0362] 6-2.葡萄糖导入抗体的制备
[0363] 接着，使得到的DyLi曲t488巧光标记葡萄糖导入聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚 物与抗体偶联，得到葡萄糖导入抗体。具体如下。
[0364] 首先，用Cy5标记IgG抗体。具体而言，将市售的小鼠 IgG、同型对照（Southern Biotechnology Associates Inc. K5mg/mL)溶液5血注入VIVASPIN(截留分子量为 10,000) 的上部部件。此处，在添加 O.IM憐酸缓冲液(p册.4)后，重复于4°C、200化pm离屯、操作，将溶 剂置换为0.1M憐酸缓冲液(P册.4)，之后，浓缩直到溶液量变为2.5mL。接着，在切5N-班巧 酷亚胺醋（切5-N服醋Klmg蛋白质标记用）（GE Healthcare公司）中添力日300化N，N-二甲 基甲酯胺，实施吹吸，在IgG溶液中添加所述溶液中的250化。之后，于室溫将混合溶液平稳 震荡4小时。并且，用VIVASPIN(截留分子量为10，000)反复于4°C、200化pm进行超滤，在实施 IgG溶液的精制的同时，将溶剂置换为D-PBS (-)，得到被Cy5标记的IgG (Cy5 - IgG) (0.9mg/mL)溶液 SmL。
[0365] 接着，为了得到抗体与6-1中得到的共聚物的偶联物，将二苄基环辛烘(DBCO)导 入抗体。具体而言，将2血切5-IgG 0.9mg/mL溶液注入VIVASPIN(截留分子量为10,000)的 上部部件。在上部部件中添加0.1M憐酸缓冲液(P册.4)后，反复于4°C、20(K)rpm重复进行超 滤，将溶剂置换为0.1M憐酸缓冲液(P册.4)，之后，浓缩直到溶液量变为2mL。接着，在IgG溶 液中加入二苄基环辛烘一N-班巧酷亚胺醋(DBC0-N服醋）的0.41mg/mL DMF溶液200化。将 混合溶液于室溫下平稳震荡4小时。反应结束后，将反应液注入VIVASPIN(截留分子量为10， 000)的上部部件，在添加 D-PBS(-)后，反复于4°C、20(K)巧m进行超滤，在进行IgG溶液的精 制的同时，将溶剂置换为D-PBS(-)，得到4mL的导入了 DBC0的Cy5标记一IgG(Cy5标记 DBCO-IgG)溶液。
[0366] 进一步地，通过使DBC0与6-1中得到的共聚物的叠氮基反应，得到抗体与共聚物 的偶联物。具体而言，首先，在800化D-PBS(-)中溶解3.5mg葡萄糖导入DyLi曲t488巧光 标记聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物。在2mL切5标记DBCO-IgG溶液中加入得到的溶 液。于一30°C将混合溶液静置36小时，之后，于4°C静置4小时，使之缓慢融解。将得到的反应 液注入VIVASPIN(截留分子量为50,000)的上部部件。在上部部件中添加 D-PBS(-)，反复 于4°C、200化pm进行超滤，实施IgG溶液的精制，得到相对于1分子抗体而言平均结合2分子 DyLi曲t488巧光标记聚乙二醇一聚天冬氨酸嵌段共聚物而得的切5标记IgG(Glc-polymer con化gated IgG)溶液（0. llmg/mL)3mL。
[0化7] 6 - 3.抗体的体内动态评价
[036引对8只6周龄的Balb/C罕小鼠停止喂食24小时。将8只小鼠分为A组、B组及对照组 (分别为3只、3只及2只）。对于A组的小鼠、B组的小鼠分别静脉内注射200化各为750nM的 Glc -polymer con化gated IgG和切5 -IgG，在5分钟后腹腔内施予200化20%葡萄糖溶液。 需要说明的是，各抗体的源于切5的巧光强度相同。在对A组及B组的小鼠各3只施予抗体后 57分钟后施加乙酸麻醉，在3分钟后实施采血和脏器摘取(脑、肝脏、肾脏、肺、屯、脏、脾脏及 大腿肌肉）。对于对照组的2只也另行实施采血和脏器摘取。将通过采血得到的血液分别于4 °C、15,0(K)rpm离屯、，回收上清。将8只小鼠的摘取的脏器首先测定总重量之后，分别切去一 半脑、约200mg肝脏，另外，取得一侧的肾脏，实施重量的测定，在多珠振荡器用的管中加入 脏器和金属锥。另外，分别在除了对照组中的1只W外的7只脑及肝脏的样品中加入600化1 X化ssive Lysis Buffer，在脾脏、屯、脏及大腿肌肉的样品中加入300化，在肾脏及肺的样 品中加入400化。另一方面，对于对照组中剩下的1只小鼠（100%对照）的脏器的样品，计算 假定静脉内注射的样品全部累积于对应脏器时的样品量，在脏器的样品中加入对应量的 切5 -IgG溶液，并进一步添加1 X化ssive Lysis Buffer，使添加的溶液量的合计与其他7 只小鼠相同。利用多珠振荡器将全部脏器样品W2000rpm操作30秒，反复5次，将脏器均化。 从脏器的管中除去锥后，在多孔板的各孔中加入100化各样品，用多孔板检测仪 (Multiplate Reader) W激发波长643nm、巧光波长667nm实施巧光强度的测定。将对照组中 未加入切5-IgG溶液的样品作为空白，将加入溶液的样品作为100%，计算各脏器的抗体的 累积率，除了血液W外，算出将得到的累积率除W脏器的重量(g)而得的值。
[0369] 结果，偶联有葡萄糖的抗体突破血脑屏障，到达了脑实质。抗体向脑实质中的到达 量为对照(C巧一IgG)的2倍（图10)。
[0370] 根据上述实施例1~6,将用葡萄糖修饰外表面而得的PIC胶束(实施例2)、PICsome (实施例3)、siRNA胶束(实施例4)、葡萄糖偶联物高分子(实施例5)及葡萄糖偶联物抗体(实 施例6)伴随血糖操作施予小鼠后，通过血脑屏障，在脑中显著蓄积。血脑屏障的物质透过性 是限定性的，许多药物无法通过血脑屏障，无法呈现其本来的效果。根据本发明，用葡萄糖 修饰药物、或用葡萄糖修饰包封药物的囊泡，并伴随血糖操作施予后，即使是胶束、PICsome 运样的巨大的囊泡也可W通过血脑屏障。该成果提供了将W往不能通过血脑屏障的分子递 送至脑的划时代性手法，可W适用于各种现存或今后研发的脑疾病药及脑图像诊断剂，开 拓了脑疾病治疗或脑图像诊断的新途径。
[0巧1] 实施例7.向血管内皮细胞的递送
[0372] 根据上述实施例2,葡萄糖导入率为25%的胶束显示了大于3%的向脑中的蓄积， 相对于此，葡萄糖导入率为50%的胶束显示了约1.3%的向脑中的蓄积。可W认为，运一现 象意味着葡萄糖的导入率增加导致了被脑血管内皮细胞摄入的胶束和脑血管内皮细胞的 分离降低。于是，本实施例中，确认了葡萄糖导入率与胶束向脑血管内皮细胞中的蓄积的关 系。
[0373] 首先，如实施例1-7及实施例2所述，调节Glc(6)-阳G-P(Asp.)与阳G-P(Asp.) 的混合量，制备葡萄糖导入率为10%的胶束、葡萄糖导入率为25%的胶束或葡萄糖导入率 为50 %的胶束。
[0374] 在将得到的胶束分别i.v.施予小鼠2日后，通过通常方法制作脑的组织切片（厚 度：14皿），通过免疫巧光染色将脑血管内皮细胞染色，观察胶束的巧光的偏在。对于脑血管 内皮细胞而言，将抗PECAM-1抗体（Santa Cruz公司制，制品编号：SC18916，Rat monoclonal)用作一级抗体，将Alexa488偶联一山羊抗大鼠 IgG(H+L)抗体（Invitrogen公司 审IJ，制品编号:A11006)用作二次抗体进行检测。另外，利用C巧的巧光检测胶束。
[0375] 结果，如图12A所示，在施予了葡萄糖导入率为50%的胶束的小鼠的脑中，特别频 繁地观察到脑血管内皮细胞与胶束的共偏在（图12A内的箭头）。另外，如图12B所示，葡萄糖 导入率为10 %、25 %及50 %的胶束也均观察到了脑血管内皮细胞的与胶束的共偏在，但葡 萄糖导入率为50 %时，胶束在脑血管内皮细胞中的偏在频率显著增加。
[0376] 实施例1~6显示，可W将表面覆盖有葡萄糖的胶束等囊泡、偶联有葡萄糖的抗体 等化合物通过脑血管内皮细胞极其高效地递送至脑实质内，另一方面，也暗示了在脑血管 内皮细胞内蓄积一部分囊泡、化合物的可能性。特别地，对于表面覆盖有葡萄糖的胶束而 言，葡萄糖的导入率越高，从脑血管内皮细胞脱离而进入脑实质的胶束的量越低，由此表 明，胶束也可W在脑血管内皮细胞中部分蓄积。实施例7进一步确认了运一事实，结果表明， 胶束确实也在脑血管内皮细胞中蓄积。另外，在葡萄糖导入率为50%时，也显示出胶束在脑 血管内皮细胞中显著蓄积。
【主权项】
1. 一种组合物，其是含有药物递送用载体、用于按照施予计划施予至对象的组合物， 所述施予计划包括:将所述组合物施予至已使其禁食或已诱发低血糖的对象，并且，诱 发所述对象的血糖值上升， 所述载体的外表面经GLUTl配体修饰。2. -种组合物，其是含有药物与GLUTl配体的偶联物、用于按照施予计划施予至对象的 组合物， 所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食、或已诱发低血糖的对象，并且， 诱发所述对象的血糖值上升。3. 如权利要求1或2所述的组合物，其是用于将药物递送至脑的组合物。4. 如权利要求1或2所述的组合物，其是用于使药物通过血脑屏障的组合物。5. 如权利要求1或2所述的组合物，其是用于使药物通过血神经屏障、血视网膜屏障或 血脑脊液屏障的组合物。6. 如权利要求1或2所述的组合物，其是用于将药物递送至脑血管内皮细胞的组合物。7. 如权利要求1~6中任一项所述的组合物，血糖值上升是通过施予葡萄糖而被诱发 的。8. 如权利要求7所述的组合物，其中，组合物的施予与葡萄糖的施予同时进行，或者在 施予葡萄糖之前施予组合物。9. 如权利要求1~8中任一项所述的组合物，组合物被输液施予至静脉内，输液施予持 续10分钟以上。10. 如权利要求1及3~9中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡的高分子 中的10~40摩尔％被61^1' 1配体修饰。11. 如权利要求1及3~9中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡的高分子 中的40~100摩尔％被61^1' 1配体修饰。12. 如权利要求1及3~11中任一项所述的组合物，其中，载体中包封待递送的药物。13. 如权利要求1及3~12中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，囊泡为直径400nm 以下的囊泡。14. 如权利要求2~9中任一项所述的组合物，其中，偶联物是药物与GLUTl配体经由连 接体连接而成的。15. 如权利要求1~14中任一项所述的组合物，其中，GLUTl配体为葡萄糖。16. 如权利要求1~15中任一项所述的组合物，其中，药物为选自生理活性物质、抗体、 核酸、生物相容性荧光色素、及造影剂中的至少1种药物。17. -种偶联物，其是1分子GLUTl配体与1分子高分子的偶联物，偶联物能够以使得 GLUTl配体露出囊泡表面的方式形成囊泡。18. 如权利要求17所述的偶联物，其中，GLUTl配体为葡萄糖。19. 如权利要求18所述的偶联物，其中，葡萄糖经由其6号碳原子与高分子偶联。20. 如权利要求19所述的偶联物或其药学上允许的盐，所述偶联物由下述式（I )、下述 式(II)、下述式(III)或者下述式(XVI)表示：式(XVI)中，n16为5~20, OOO的整数，m16为2~5, OOO的整数。21. -种囊泡，其是含有权利要求17~20中任一项所述的偶联物的药物递送用囊泡， 所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的10~40摩尔％。22. -种囊泡，其是含有权利要求17~20中任一项所述的偶联物的药物递送用囊泡， 所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的40~100摩尔％。
【文档编号】A61K47/34GK105899192SQ201480063806
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月21日
【发明人】片冈则, 片冈一则, 安乐泰孝, 西山伸宏, 宫田完二郎, 石井武彦, 松本有, 福里优, 沟口明祐, 横田隆德, 桑原宏哉, 仁科隆, 仁科一隆, 水泽英洋
【申请人】国立大学法人东京大学, 国立大学法人东京医科齿科大学