用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物，以及使用该组合物治疗和预防良性前列腺增生的方法。更具体地，本发明涉及一种用于有效治疗和预防良性前列腺增生的包含来源于端粒酶的肽的组合物和使用该组合物治疗和预防良性前列腺增生的方法。所述组合物包含根据本发明的肽，其在治疗和预防良性前列腺增生方面表现出卓越的有效性。
【专利说明】
用于治疗和预防良性前列腺増生的组合物
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物。更具体地，本发明设 及一种包含来源于端粒酶的肤的组合物并且所述组合物用于治疗和预防良性前列腺增生。
【背景技术】
[0002] 良性前列腺增生(BPH)是男性老年性疾病中最常见的疾病，其伴有下尿路症状。相 关的症状从40岁开始出现，但大部分临床症状在50多岁后期出现。由于生活质量的下降， BK1可引起性功能障碍，对于的治疗及手术可影响性功能。
[0003] 导致增生的BPH依赖于雄性激素。特别是雄性激素对前列腺的正常细胞增殖和正 常调亡的抑制是必需的。最众所周知的内因是衰老。前列腺由于衰老和正常睾丸功能而变 大。作为前列腺依赖的雄性激素，睾酬在前列腺的生长和分化中发挥重要的作用，并且通过 5α-还原酶代谢产生二氨睾酬(DHT)，其在前列腺生长和前列腺基因的表达中发挥重要作 用。
[0004] 作为引起前列腺增长的外因，有雄性激素、雌激素、糖皮质激素和与内分泌酶有关 的物质，其通过饮食和环境诱导。运些外因的生理学效应经由多种生长因子肤出现。
[0005] ΒΡΗ发生在20多岁早期到40多岁晚期，其由组织学变化引起，此时，雄性激素和雌 激素协同作用引起ΒΡΗ。随着年龄增长，雌激素/DHT比例增加，然后ΒΡ出曽加。
[0006] 同时，众所周知，前列腺生长直至20多岁早期，并且保持其大小直到50岁，其依赖 于使前列腺保持其平衡的非常复杂的相互作用，如内源生长因子、信号通路、细胞周期调 节、细胞分裂和调亡。如果细胞周期调节因子发生转变，ΒΡΗ可能被诱发。
[0007] 遗传因素是影响ΒΡΗ的一个主要因素。据报道，具有ΒΡΗ家族史的患者显示超过 60%的ΒΡΗ增加，同时也报道5α-还原酶抑制剂的治疗在具有ΒΡΗ家族史的患者是不太有效 的。其原因在于，在运种情况下，ΒΡΗ依赖于非雄激素依赖性途径。
[000引对于治疗ΒΡΗ，可W使用手术和药物治疗。对于药物治疗，药物施用根据患者的年 龄和临床进程而调节。最近，大量的ΒΡΗ患者在韩国和全球范围内显著增加并且年轻患者的 患病率也在增加。大量的药物被用于治疗但是它们的使用因为副作用而受到限制。
[0009] 舒必利（sulpiride)是2型多己胺受体括抗剂，其常用作治疗抑郁症的药物。多己 胺是一种肾上腺素和去甲肾上腺素合成过程中产生的中间产物，是一种抑制性神经递质。 舒必利抑制多己胺与其受体结合，运抑制作为多己胺能作用的催乳素分泌，并且提高血液 内催乳素的浓度。通过舒必利的连续施用而增加的催乳素会引起高催乳素血症。
[0010] 据报道催乳素与前列腺的增生、前列腺癌和BPH的发展及调节有关。同时已知催乳 素与雄激素协同提高前列腺的增殖。作为另一个机制，也已知催乳素作为应激激素提高5α- 还原酶的表达并且诱发前列腺的增生。催乳素是一种非酱体类因子，其与前列腺的增生和 ΒΡΗ的诱发有关。随着年龄的增长，催乳素增加而睾酬水平下降。据报道催乳素在老年人中 诱发ΒΡΗ。对于大鼠和人类，报道催乳素与前列腺的增生和分化有关。根据此报道，认为催乳 素通过信号传导通路由受体所诱导。
[0011]现有技术文件 [0012]专利文件
[0013] KR 2011-0062943 A
[0014] KR 2011-0057049 A
[001 引 EP 1020190 A3
[0016] 非专利文件
[0017] MCC0N肥化，John D.，等"The effect of finasteride on the risk of acute urinary retention and the need for surgical treatment among men with benign prostatic hyperplasia"，New England Journal of Medicine，1998,338卷，第9其月，557- 563 页。
[001引发明详述 [0019] 技术问题
[0020] 于是，本发明人尝试开发一种用于治疗和预防的组合物，其具有最小的副作用 和优异的治疗效果，并且完成了本发明。
[0021] 本发明的发明人已经发现了来源于端粒酶的肤用于治疗和预防BPH可W具有卓越 的效果并且完成了本发明。
[0022] 本发明的目的是提供一种在治疗和预防BPH方面有效的组合物。
[00剖技术方案
[0024] 为了解决上述技术问题，根据本发明，提供一种用于治疗和预防BPH的包括肤或肤 的片段的组合物，所述肤或肤的片段包含SEQ ID N0:1的序列下为"PEPr、"GV10〇r或 %r)或与沈Q ID NO: 1具有80% W上同源性的序列。
[0025] 在根据本发明的用于治疗和预防BPH的组合物中，所述片段可包含3个W上的氨基 酸。
[0026] 在根据本发明的用于治疗和预防BPH的组合物中，所包含的肤的浓度可为O.Olmg 至 Img，优选0.56mg (4nmo 1 肤/kg体重）。
[0027] 在根据本发明的用于治疗和预防BP哺勺组合物中，所述组合物可W是药物组合物。 [00%]在根据本发明的用于治疗和预防BP哺勺组合物中，所述组合物可W是食物组合物。
[0029] 根据本发明的另一个实施方式，提供通过给需要的受试者施用治疗和预防BPH的 组合物来治疗和预防BPH的方法。
[0030] 在根据本发明用于治疗和预防BP哺勺方法中，所述组合物的施用可一周进行3次。
[0031] 发明效果
[0032] 根据本发明的组合物，包含具有SEQ ID NO: 1的序列的肤或者具有与SEQ ID NO: 1 具有80% W上同源性的序列的肤对于治疗和预防WH具有卓越的效果和较少的副作用。
[0033] 附图描述
[0034] 图1示出移除祀标器官W测量其重量的过程的照片。
[0035] 图2示出在验证阳P1对BPH的治疗作用的实验中的电泳照片，通过使用RT-PCR，其 显示每个实验组的腹侧前列腺中对5α-还原酶表达的影响的结果。
[0036] 图3示出在验证ΡΕΡ1对ΒΡΗ的治疗作用的实验中的显示在每个实验组中测量的精 囊重量的结果的图。
[0037]图4示出在验证PEPl对ΒΡΗ的治疗作用的实验中的显示在每个实验组中测量的前 列腺重量的结果的图。
[003引图5示出显示在ΒΡΗ诱发动物模型的基质细胞系(WPMY-1)中用ΡΕΡ1处理后细胞增 殖量的图。
[0039] 图6示出显示在ΒΡΗ诱发动物模型的上皮细胞系（RWPE-1)中用ΡΕΡ1处理后细胞增 殖量的图。
[0040] 图7示出显示在ΒΡΗ诱发动物模型的基质细胞系(WPMY-1)中通过使用ΡΕΡ1-門TC (异硫氯酸巧光素)缀合物测量ΡΕΡ1对雄激素受体的结合能力的图。
[0041 ] 图8示出显示在ΒΡΗ诱发动物模型的表皮细胞系（RWPE-1)中通过使用ΡΕΡ1-門TC (异硫氯酸巧光素)缀合物测量ΡΕΡ1对雄激素受体的结合能力的图。
[0042] 图9示出显示ΡΕΡ1对PCNA(增殖细胞核抗原读达巧在ΒΡΗ诱发模型中增加)影响 的电泳照片。
[0043] 图10示出一幅显示阳Ρ1对Ki67(MK67)表达影响的免疫染色照片，所述Ki67表达在 BPH被诱发时在BP出秀发模型中增加。
[0044] 图11示出在BPH动物模型的实验中通过H&E染色方法显示出阳P1对BPH组织相关细 胞的影响的结果的照片。
[0045] 图12示出在BPH动物模型的实验中通过MassonS色染色方法显示出PEP1对BPH组 织相关细胞的影响的结果的照片。
[0046] 图13示出显示在测定PEP1在BPH动物模型中的影响的实验中所述动物体重的变化 的图。
[0047] 图14示出显示在测定PEP1在BPH动物模型中的影响的实验中所述动物模型的前列 腺重量的变化的图。
[0048] 图15示出显示在测定PEP1在BPH动物模型中的影响的实验中所述动物的精囊重量 的变化的图。
[0049] 发明的最佳实施方式
[0050] 因为本发明可适用于多种应用领域和进行多种变化，接下来对本发明进行更详细 的描述。然而，运并不意味着限定了实际应用的形式;应该理解，主旨在于包括所有的变化 形式、等同形式或替代形式中的概念和技术程度。在本发明的描述中，如果任何关于现有技 术的详细描述被认为会破坏本发明的基本原则，则忽略该描述。
[0051] 端粒已知是在染色体末端发现的遗传物质的重复序列，其防止染色体损伤或合并 到其它的染色体。端粒的长度在每次细胞分裂时缩短，并且在一定次数的细胞分裂后，端粒 长度极度缩短W致细胞停止分裂并且死亡。另一方面，已知端粒的延长会延长细胞寿命。例 如，癌细胞制造一种称为端粒酶的酶，其阻止端粒的缩短，因此导致癌细胞的繁殖。本发明 的发明人鉴定出一种来源于端粒酶的肤，其有效治疗和预防BPH并且完成了本发明。
[0052] 在本发明的一个实施方式中，SEQ ID NO: 1氨基酸序列的肤、上述肤的肤片段或具 有与上述肤的氨基酸序列的80% W上序列同源性的肤包括端粒酶，特别是来源于人类的端 粒酶。本文公开的肤可包括包含与沈Q ID NO: 1的肤具有至少80%、至少85%、至少90%、至 少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同源性的氨基酸序列的肤或其片 段。另外，本发明公开的肤可包括与SEQ ID N0:1或其片段在至少1个氨基酸、至少2个氨基 酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个转化氨基酸、至少6个转化氨基酸或至少7个氨 基酸上存在差异的肤。
[0053] 在本发明的一个实施方式中，氨基酸的变化包括肤的物理和化学性质的修饰。例 如，可W进行氨基酸修饰W提高肤的热稳定性，改变底物特异性，及改变最优pH。
[0054] 本文中的术语"氨基酸"不仅包括天然组成肤的22种标准氨基酸，也可W是D-异构 体和修饰的氨基酸。因此，在本发明的具体的实施方式中，此处的肤包括具有D型氨基酸的 肤。另一方面，肤可包括非标准氨基酸，诸如那些被翻译后修饰的氨基酸。翻译后修饰的实 例包括憐酸化、糖基化、酷基化(包括乙酷化、豆違酷化、栋桐酷化）、烷基化、簇基化、径基 化、糖化、生物素化、泛素化、化学性质的修饰(例如β-消除脱酷胺化、脱酷胺化)和结构修饰 (例如二硫键的形成）。同时，氨基酸的变化包括由于在用于形成肤缀合物的采用交联剂的 结合过程中的化学反应而发生的氨基酸变化，如氨基、簇基和侧链的变化。
[0055] 本文公开的肤可为从天然来源被鉴定和分离出的野生型肤。另一方面，当与SEQ ID NO: 1或其片段比较时，本文公开的肤可W为人工变体，其包含一个或多个氨基酸取代、 删除和/或插入。野生型多肤(不仅人工变体)的氨基酸变换包括不会显著影响活性的蛋白 的折叠和/或氨基酸的保守取代。保守取代的实例可在W下的组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖 氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸(谷氨酷胺和天冬酷胺）、疏 水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、鄉氨酸和甲硫氨酸）、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪 氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸）。通常不改变特定活性的氨基酸取代 是本领域已知的。最常发生的变换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/ Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、 Ala/Glu和Asp/Gly，及其反向变换。保守取代的其它实例显示在下表1中：
[0化6][表1]
[0化7]
[0058]通过在下述功效中选择进行显著不同的取代来进行肤的生物性质的显著转化： (a)在取代区域保持多肤骨架的结构(如片状或螺旋状的Ξ维结构）的功效，（b)在祀标区域 保持分子的电荷或疏水性的功效，或(C)保持侧链的体积的功效。天然残基通过一般侧链性 质分为W下几组：
[0化9] (1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile;
[0060] (2)中性亲水性：cys，se;r，t虹；
[0061] (3)酸性:曰39，邑111;
[0062] (4)碱性：日311，邑1]1，1113，173，日1'邑；
[0063] (5)影响链取向的残基:gly，p;ro;及
[0064] (6)芳香族：t;rp，ty;r，phe。
[0065] 非保守取代可W通过将上述类组的成员交换为不同类组的成员来进行。与保持合 适的肤Ξ维结构无关的任何半脫氨酸残基通常可W被取代为丝氨酸，W此增加分子的氧化 稳定性和避免不合适的交联。相反，可W通过对肤添加半脫氨酸键获得稳定性的提高。
[0066] 另一种类型的肤的氨基酸变体为那些具有改变的肤糖基化模式的肤。本文的术语 "改变"意味着删除在肤中存在的至少一个糖残基和/或添加至少一个在肤中不存在的糖基 化残基。
[0067] 肤的糖基化通常为N连接或者0连接。本文的术语"N连接"指糖残基与天冬酷胺残 基的侧链相连。作为Ξ肤序列，天冬酷胺-X-丝氨酸和天冬酷胺-X-苏氨酸(其中X为除了脯 氨酸的任何氨基酸)为用于W酶促方式将糖残基连接至天冬酷胺侧链的识别序列。因此，在 多肤中存在运样的Ξ肤序列中之一时，创立了潜在的糖基化位点。"0连接糖基化"意味着将 作为糖的N-乙酷半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个连接至径基氨基酸。所述径基氨基酸最 典型为丝氨酸或苏氨酸，但也可W使用5-径基脯氨酸或5-径基赖氨酸。
[0068] 通过改变氨基酸序列W包含上述的Ξ肤序列（对N连接糖基化位点而言），可方便 地添加多肤的糖基化位点。所述变化可W通过将来自丝氨酸或苏氨酸的至少一个残基添加 至第一抗体序列或通过用运些残基进行取代来进行(对0连接糖基化位点而言）。
[0069] 同时，根据本发明包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肤、包含与上述序列具有大于 80%同源性的氨基酸序列的肤、或上述肤的片段在有生命物质中具有低毒性和高稳定性的 优势。本文使用的SEQ ID No: 1是源自端粒酶的由16个氨基酸组成的肤。
[0070] 沈Q ID N0:1EARPALLTSRLRFIPK
[0071] 在本发明的一个实施方式中，提供用于治疗和预防ΒΡΗ的组合物，其包含含有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肤、包含具有与上述序列大于80%同源性的氨基酸序列的肤、或上 述肤的片段。
[0072] 在本发明的一个实施方式中，所述组合物可具有包含人、狗、鸡、猪、牛、绵羊、豚鼠 和猴的所有动物的应用。
[0073] 在本发明的一个实施方式中，提供用于治疗和预防WH的药物组合物，其包含含有 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肤、包含具有与上述序列大于80%同源性的氨基酸序列的肤、 或上述肤的片段。在根据本发明的一个实施方式的药物组合物，其可通过口服、直肠、经皮、 静脉内、肌内、腹膜内、骨髓内、硬膜外或皮下途径施用。
[0074] 口服施用的形式可W为但不限于：片剂、丸剂、软胶囊或硬胶囊、颗粒、粉末、溶液 或乳液。非口服施用的形式可W为但不限于:注射剂、滴剂、洗剂、软膏、凝胶、乳膏、悬浮液、 乳剂、栓剂、贴剂或喷雾。
[0075] 在本发明的一个实施方式中，在必要时，所述药物组合物可包含添加剂，如稀释 剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂或甜味 剂。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可通过本领域的传统工业方法制造。
[0076] 在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物的活性成分的剂量可根据患者的年 龄、性别、体重、病理学和状态、施用路径或处方者的判断而改变。根据所述因素的剂量可在 本领域技术人员的水平内确定，且每日剂量例如可为但不限于：0.0 lyg/kg/天至lOg/kg/ 天，特别是0.化g/kg/天至Img/kg/天，更特别是化g/kg/天至0.1 g/kg/天，更特别是化g/kg/ 天至lOmg/kg/天，优选是化g/kg/天至Img/kg/天，优选是0.005mg/kg/天至0.05mg/kg/天， 最优选是O.Olmg/kg/天，但是如果根据施用剂量的效果不同其可W进行调整。对于成人，优 选施用剂量是0.1 mg至Img，优选是0.4mg至0.6mg，特别是最优选的剂量是0.56mg。
[0077] 在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物可W但不限于每天施用1至3次。
[0078] 在本发明的一个实施方式中，所述组合物可包含O.Olg/L至Ikg/L、特别是O.lg/L 至lOOg/L、更特别是Ig/L至lOg/L的肤，所述肤包含SEQ ID N0:1、包含具有与上述序列至少 80%同源性的氨基酸序列的肤、或上述序列的片段中的至少一种的氨基酸序列。当所述肤 的含量在上述范围内时，组合物的安全性和稳定性均可被满足，且所述范围在成本效益方 面是合适的。
[0079] 在本发明的一个实施方式中，提供用于治疗和预防的食物组合物，其包含含有 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肤、包含具有与上述序列大于80%同源性的氨基酸序列的肤、 或上述肤的片段。
[0080] 在本发明的一个实施方式中，食物组合物不限于特别形式，但是例如可为片剂、颗 粒、粉末、液体和固体形式。除活性成分外，每种形式可通过本领域技术人员选择合适的工 业常用成分形成，并可与其它成分组合产生协同效应。
[0081] 本文使用的术语旨在用于描述实施方式，但不限制本发明。在术语前面没有数字 并非限制数量，而是表明可W使用多于一个该术语的事物。术语"包含"、"具有"、"包括"、 "含有"应该理解为开放式（即"包括但不限于"）。
[0082] 数值作为范围被提及的原因仅是因为W范围描述比个体的数字来描述方便。除非 另外提出，每个个体的数值可被理解为分别描述并被整合到说明书中。所有范围的阔值都 包括在内并且可W独立地组合。
[0083] 除非另外提出或语境中明显矛盾，本文提出的所有方法均W适当的顺序进行。除 非其被包含在权利要求中，使用"任何一个实施方式"和"所有实施方式"或者示例性语言 (例如，"诸如"、"如"）是用来更清楚地描述本发明，而不是限制本发明的范围。本文中除了 权利要求W外的任何语言均不应该被解释为本发明的必要条件。除非另外限定，此处使用 的科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
[0084] 本发明优选的实施方式包括发明人所知的本发明的最佳实施方式。优选实施方式 的变化形式在本领域技术人员阅读上述说明后可变得显而易见。本发明发明人希望本领域 技术人员可W充分利用所述变化形式，并且本发明可除了本文所列出W外的其它方式 进行实施。因此，本发明在专利法允许的情况下包括权利要求中所陈述的本发明的关键点 的等同形式、修改形式和变化形式。另外，在上述成分的任何组合内的所有可能的变化形式 都包括在本发明之内，除非另有明确声明或与上下文相惇。虽然已通过示例性实施方式描 述并展示了本发明，本领域技术人员可W清楚知晓，在不脱离本发明的主旨和后文权利要 求所限定的范围的情况下，可W进行形式和细节方面的各种变化。
[0085] 用于建立本发明的实施方式
[0086] 在下文中，将通过实施例和测试例详细描述本公开。但是，下列的实施例和测试例 仅W说明为目的，并且对于领域普通技术人员显而易见，本公开的范围不受所述实施例和 测试例所限制。
[0087] 实施例1.肤的合成
[008引SEQ ID N0:1的肤根据固相肤合成的传统已知方法合成。更具体地，利用ASP48S (Peptronjnc.，Daejeon R0K)，通过Fmoc固相肤合成（SPPS)从C端偶联每个氨基酸来合成 所述肤。如下使用其第一个氨基酸在C端连接到树脂的那些肤：
[0089] N肥-Lys(Boc)-2-氯Ξ苯甲基树脂
[0090] N肥-Ala-2-氯Ξ苯甲基树脂
[0091] N肥-4巧。6門-2-氯^苯甲基树脂
[0092] 用W合成肤的所有氨基酸在N端通过化OC保护，所述氨基酸残基通过能溶解在酸 中的化t、Boc、t-Bu(t-下醋）、饥f(2,2,4,6,7-五甲基二氨苯并巧喃-5-横酷基)保护。实例 包括W下：
[0093] 化〇(；-41日-0山尸1]1〇(3-4巧。6;1^ )-OH、Fmoc-Glu(0tBu)-OH、Fmoc-P;r〇-OH、Fmoc-Leu- OH、F'moc-Gln(T;rt)-〇H、F'moc-T;rp(Boc)-〇H、F'moc-Met-〇H、F'moc-Asn(T;rt)-〇H、F'moc-Tyr (1:Bu) -OH、Fmoc-Ahx-〇H、Tr t-琉基乙酸。
[0094] 作为偶联试剂，使用了皿TU[2-( IH-苯并Ξ挫-1-基)-1，1，3，3-四甲基脈六氣憐酸 醋]/册Bt [ N-径基苯并Ξ挫]/NMM[ 4-甲基吗嘟]。使用在20 % DMF中的赃晚溶液W移除Fmoc。 为了从残基上移除保护基或者将合成的肤从树脂上分离，使用了切割混合物[TFA(S氣乙 酸)/115(^异丙基硅烷)/出0 = 92.5/2.5/2.5]。
[0095] 肤的合成通过使用固相支架进行并重复下面过程氨基酸保护起始，每个氨基 酸的分离反应，用溶剂冲洗和脱保护。每个肤的合成通过使用固相支架W结合至具有氨基 酸保护基的起始氨基酸，分别使对应的氨基酸反应，用溶剂冲洗和脱保护，并重复此过程。 在从树脂释放之后，合成的肤通过HPLC纯化，通过质谱验证，冻干，通过MS来验证合成，然后 冻干。
[0096] 通过高效液相色谱法发现制备的肤的纯度在95%或更高。
[0097] 阳P 1的具体合成过程可W如下：
[009引1)偶联
[0099] 用N出-Lys(Boc)-2-氯Ξ苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)与融化于DMF中的偶联 试剂皿TU(8当量)/册化(8当量)/NMM(16当量)一起混合，并在室溫(RT)溫育2小时。溫育后， 反应混合物依次用DMF、MeOH和DM巧中洗。
[0100] 2)Fmoc 去保护
[0101] 添加在20%DMF中的赃晚溶液并在RT溫育5分钟，进行2次，然后依次用DMF、MeOH和 DM巧中洗。
[0102] 3)通过重复上述的反应1)和2)来制造肤的基本框架，N此斗(0*811)-4-1?。6門斗- AAA-T (tBu) -S UBu) -R (Pbf 化-R (Pbf) -F-I-P-K (Boc) -2-氯Ξ苯甲基树脂。
[0103] 4)切割：向完成合成的肤添加切割混合物，W此从树脂上切下肤。
[0104] 5)将预冷的乙酸添加至获得的混合物中，然后离屯、W使收集的肤沉淀。
[0105] 6)在通过Prep-HPLC纯化后，通过LC/MS确认分子量，并且冻干W制造成粉末形式。
[0106] 实施例2.通过使用BPH诱发动物模型的实验验证阳P1对BPH的作用
[0107] 制备BP出秀发动物模型
[0108] 1)作为雄激素，睾酬是最常使用的体内激素。但是与前列腺发育相关的雄激素中 最有效的激素是5α-二氨睾酬（DHT)，其通过结合睾酬和5α-还原酶产生。在大鼠中，当W 40mg/kg浓度施用舒必利30天，其在体内抑制2型多己胺受体增加催乳素的浓度并且诱发高 催乳素血症W激活5α-还原酶，并且其通过与睾酬反应表现出协同效应。据报道，通过高催 乳素血症产生的DHT在前列腺的侧叶比背叶或腹叶产生更多的重量增加。基于运个事实，仅 使用根据实施例1的ΡΕΡ1或与其它的测试材料共同施用给ΒΡ出秀发动物模型的实验如下进 行。成熟Sprague-Dawley雄性大鼠（6周龄)购自Jae-il实验动物中屯、并且抚养一周（7周龄， 49天）用于纯化，然后用于实验。为了诱发BPH，每天一次口服施用舒必利(40mg/kg)30天。每 次实验都跟踪在在先实验的结果(Van Coppenolle等，2001)。每只动物每日早10点开始施 用测试材料。在施用测试材料后，每天观察每只动物的一般状态和特殊症状。同时施用测试 材料前，测量并记录每只动物的体重。
[0109] 2)施用的测试材料和剂量
[0110] 作为测试材料的舒必利购自Sigma化emical仿.（5*丄〇1113，10，美国）并且用于 实验。本发明人通过每日一次连续腹膜内注射施用舒必利(40mg/kg)60天W通过高催乳素 血症诱发BPH。每次施用所述测试材料前，舒必利首先溶解在0.1N HC1溶液中，然后通过使 用0.1N化0田容液中和至抑7.0。对于联合施用组，在施用舒必利后通过腹膜内注射施用根 据实施例1的PEP1和非那司提。阳？1(0.01111旨/1^，0.1111旨/1^，1111旨/1^和10111旨/1^)在使用前新 鲜配置，并且通过皮下注射施用。非那司提通过使用15%乙醇/玉米油（v/v)作为载体每天 制备。施用的剂量基于〇.5ml/kg的浓度计算，反应每天测量的体重。均遵循下表2完成对于7 组的施用W验证阳P1对BPH的作用。
[0111] [表 2]
[0112]
[0113] (i.p =腹膜内，s.c =皮下）
[0114] 1)对于BP出秀发模型，在施用PEPl和测试材料的实验之后，收集动物器官，保存所 述器官并测量其重量
[0115] 在施用所述测试材料60天的24小时后，所有动物通过乙酸麻醉，然后从腹主动脉 收集的血液分离为血清。分离的血清在-80°C保存W分析激素。
[0116] 对于所有动物，在测试包皮分离(PPS)的出口后，将诸如阴茎头型(Gp)、精囊和凝 固腺（SV)、腹侧前列腺（VP)、尿道球腺（CpG)、肛提肌和球海绵体肌（levator aniplus bu化ocavernosus muscle，LABC)的附属生殖腺从动物体依次分离。分离的详细过程遵循 OECD规程。
[0117] 如图1中提及，对于分离Gp，通过使用綴子错住Gp部分并且剪下包皮分离线。如图1 中提及，对于肺，在从腹部肌层分离膀脫后，暴露被脂质层覆盖的肺左侧和右侧小叶，暴露 膀脫至SV，通过使用綴子从肺左侧和右侧小叶分离脂质，通过使用微綴拨离，从尿道剪下肺 左侧小叶，通过使用手术错，在从尿道暴露后剪下肺右侧小叶。如图1中提及，对于包含凝固 腺的SV，在SV下准备纸毛巾W给肌肉、脂质层和腺体分类。通过使用夹子固定包含与尿道相 连的曲细精管的SV的底部，W防止在精囊移除过程中的渗漏。在移除脂质后，清理相关的附 属器官，移除所述夹子并将精囊放置在盘上W测量其重量。
[011引2)在BP出秀发动物测试模型中，施用阳P1对5α-还原酶表达的影响
[0119] 在施用舒必利和测试材料60天并且收集腹侧前列腺后，通过RT-PCR测定其对5α- 还原酶表达的影响。具体地，总RNA从腹侧前列腺(25mg)分离，并且通过添加 DEPC处理的水 重悬。其后通过使用分光光度计对RNA进行定量。通过使用Torres和化tega(2004)的方法合 成第一链 cDNAePCR 程序为:94°C 变性(30sec)，55°C 退火(30sec)，72°C 延伸（30sec)，进行 30 至35个循环。使用对照GAPDH，在电泳中定量，其表达水平不会因为使用其它药物而改变。作 为结果，通过施用舒必利，5α-还原酶水平的增加在PEP1施用组中W剂量依赖方式被抑制， 并且在高剂量阳Ρ1施用组(GVlOaOmg阳Ρ1施用组）中所述抑制作用高于非那司提施用组 (参见图2)。因此PEP1可W提供剂量依赖性的治疗并且通过抑制5α-还原酶提高其对BPH的 作用。
[0120] 3)阳Ρ1施用对ΒΡ出秀发测试动物模型器官的影响
[0121] 在下表3中，报道了肤PEPl在每组实验中影响精囊的重量、前列腺重量和前列腺指 数。表3中描述的前列腺指数通过使用公式"体重/最终前列腺重量"计算。
[0122] [表 3]
[0123]
[0124] 表3中描述的结果转化成图片，即，在BP出秀发动物模型中，在施用PEP1和非那司提 (5mg/kg)并随后施用舒必利后，观察精囊的测量结果，图片显示在高剂量PEP1施用（lOmg/ kg)情况下，精囊重量显著减少(参见图3)。同时，在BP出秀发动物模型中，在舒必利和PEP1共 施用的情况下，显示出前列腺重量的显著减少(参见图4)。如果P值小于0.05,表示其为显著 性结果。
[0125] 因此，通过实施例2的结果，通过施用PEP1至舒必利诱发的BPH动物模型可剂 量依赖方式有效地减少5α-还原酶的表达、减少精囊重量和减少前列腺重量。因此，施用 ΡΕΡ1可有效治疗和改善5α-还原酶的表达和生殖器官的重量所致的ΒΡΗ相关疾病症状。 [01%]实施例3:通过观察DHT对前列腺基质细胞和上皮细胞的改变来验证ΡΕΡ1对ΒΡΗ的 作用
[0127] 1)测试细胞制备和实验过程
[0128] 睾酬在注射到身体内后被5α-还原酶转变为DHT，其诱导前列腺细胞增殖而引起 ΒΡΗ。基于此，通过使用根据实施例1中ΡΕΡ1的施用进行实验W观察其对前列腺细胞系增殖 的影响。作为细胞系，使用来自动物模型的WPMY-1 (前列腺基质细胞系)和RWPE-1 (前列腺上 皮细胞系）。对于所述实验，将WPMY-U2.5X 103个细胞)和RWPE-U1 X 104个细胞)接种到具 有如表4中的不同实验组的96孔板，W观察增殖变化。在吸出培养基后，所述增殖变化通过 注入每ΙΟμΙ CCK-8溶液到培养基的每个孔中，然后在450nm波长测量光密度1至4小时。
[0129] 2)确认观察结果和影响
[0130] 在非DHT处理组（1-3组）中，在WPMY-1和RWPE-1中未施用PEP1Q组）和施用阳Pl(2 和3组)之间均没有显著性差异。在DHT处理组(4-6组），未施用阳P1 (4组)和施用阳P1 (5和6 组)之间具有显著性差异，通过PEP1处理的组对增殖显示显著地抑制（参见表4和图5、6)。因 此，PEP1可W有效抑制前列腺细胞的增殖，其影响DHT诱导的BPH。
[0131] [表 4]
[0132] 每组细胞系的处理条件
[0133]
[0134] 实施例4:验证PEP1对雄激素受体的结合能力和抑制BPH的机制
[0135] 1)测试细胞的制备和实验过程
[0136] 通过5α-还原酶产生的DHT通过结合雄激素受体促进前列腺细胞的增殖并引起 ΒΡΗ。基于此，通过使用根据实施例1中ΡΕΡ1的施用进行实验W观察其对前列腺细胞系增殖 的影响。作为细胞系，使用来自动物模型的WPMY-1和RWPE-1 dWPMY-1和RWPE-1分为抗雄激素 受体组和同型对照组，通过放置PEP1-FITC(异硫氯酸巧光素)在其中，与每种抗体溫育进行 竞争测试，并且测量巧光值的结果。巧光值通过使用流式细胞术方法测量。
[0137] 2)确认观察结果和影响
[0138] 对于每个WPMY-1和RWPE-1，测定W下情形的巧光值:一种情形为首先与抗雄激素 受体同型对照抗体反应(与抗体竞争，最右边的峰），另一种情形为与抗雄激素受体抗体反 应(与抗体竞争，中间的峰），而再一种情形为不与均未结合FITC的两种抗体反应(最左边的 峰）（参见图7和图8)。在与抗雄激素受体同型对照抗体竞争的情况下，PEP1结合抗雄激素受 体，所WPEP1-FITC结合物的巧光值增加（图中峰值位移至直方图右侧）。与抗雄激素受体竞 争的情况下，PEP1较弱地结合抗雄激素受体，所W巧光值减少（图中峰值位移至直方图左 侦U)。因此，考虑阳P1抑制了结合抗雄激素受体的DHT所诱导的ΒΡΗ,ΡΕΡΙ可W通过直接结合 抗雄激素受体而影响ΒΡΗ。
[0139] 实施例5:通过使用ΒΡ出秀发动物模型验证阳Ρ1在体内对ΒΡΗ的有效性
[0140] 1)准备测试动物
[0141] 实验使用6至8周龄雄性巧7BL/6(n= 10/组)小鼠，所述小鼠在首尔大学医学院实 验动物实验室的SPF(无特定病原体）区域饲养。用于注射的50mg庚酸睾酬(TE，购自EVER Pharma Hena GmbH,德国）和0.5mg戊酸雌二醇(购自EVER Pharma Hena GmbH,德国）分别混 合至70μ1体积的微渗透累(Alzet pump,购自DURECT Co巧oration,美国），所述累在麻醉下 植入小鼠背部。所述累经设计W每小时Ο.??μL的浓度在28天(2周）中通过利用渗透现象释 放激素给小鼠。
[0142] 2)测试材料和施用剂量
[0143] 作为测试材料，使用睾酬和非那司提。制备动物模型，每一个受试者（25g小鼠模 型）分别每天皮下（注射)施用25化g实施例1所述的PEP1和2500yg非那司提(在DMS0或环糊 精中，购自Sigma A1化ich，美国）。注射测试材料2周后(植入所述累至动物模型4周后），从 眶上静脉收集血液并在1400化pm于4°C离屯、30分钟W分离血清，并且提取前列腺并在-70°C 液氮中冻存或固定在固定液中。实验测试组在下表5中描述。
[0144] 敵]
[0145]
[0146] 3)测量诱发BK1的因子的减少
[0147] 诱发BPH增加前列腺组织中的PCNA(增殖细胞核抗原，复制的必需蛋白）和Ki67 (MK167,细胞增殖的必需蛋白）。基于此，在BP出秀发小鼠模型中进行测试测定PEP1抑制PCNA 和Ki67表达的有效性。使用2D-凝胶电泳用从前列腺组织细胞提取的蛋白测定PCNA，通过免 疫染色方法检测组织中的表达水平W测定Ki67。作为结果，PCNA和Ki67的表达在BP出秀发动 物的前列腺组织中增加，在用阳P1处理的组中减少(参见图9和图10)。因此，PEP1抑制BP出秀 发因子并且对于治疗和改善是有效的。
[0148] 4)测量与诱发BPH相关的组织的变化
[0149] 已知BPH由组成前列腺腺体的基质细胞和上皮细胞的异常增殖所诱发。基于此，为 了检测PEP1在BP出秀发动物模型的前列腺组织中引起的变化，对BP出秀发动物模型进行组织 学分析。使用H&E染色方法检测一般组织中的变化，并且使用Masson^色染色方法测定炎性 反应水平并更清晰检测细胞核的形状。作为结果，表明BP出秀发组的上皮层比对照组的上皮 层要厚，但是在PEP1处理组，表明上皮层W与对照组类似的常规顺序排列，且上皮的厚度比 BP出秀发组的薄（参见图11和12)。因此，PEP1可W有效恢复BP出秀发组织的变化并且将所述 组织转化为不显示出BPH的正常组织。
[0150] 5)测量BP財目关器官的变化
[0151] BPH可W通过前列腺和精囊重量的变化检测。基于此，为了检测PEP1对前列腺和精 囊重量的影响（其直接显示相关症状），在BP出秀发动物模型中测量体重、前列腺重量和 精囊重量。测量结果作为图表通过分组显示在表5中（参见图13、14和15)。没有显示出整体 体重的变化，但是与激素处理组相比，显示出PEP1处理组的前列腺重量显著性减少，且PEP1 处理组的减少与施用非那司提组（已知为BPH的治疗药物）的结果相当，所W运证实阳P1处 理组中的减少具有显著性。对于精囊，PEP1处理组的精囊重量比激素处理组的重量小。因 此，PEP1可W有效地显著性减少具有BPH症状的器官重量。
[0152] 在上述所有的实施例中，通过BPH诱发动物模型的体外和体内实验，表明PEP1对 BPH相关诱发因子、激素受体和实质生殖器官具有良好的治疗效果。因此，认为PEP1对于治 疗、改善和预防BPH具有有效性，而将PEP1开发为用于BPH治疗的组合物和治疗BPH的方法有 很大可能性。
[0153] 序列列表自由文本
[0154] 全端粒酶序列的1132个氨基酸
[0155] MPRAPRCRAVR化LRSHYREV…LATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCL KELVARVL弧LCERGAKNVLAFGFALLDGARGGP阳AFTTSTRSYLPNTVTDALRGSGAWG化LRRVG孤VLVHLLA RCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVEEAGVPLGLPAPGARRRGGSASRS LPLPKRPRRGAAPEP 邸 TPVGQGSWAHPGRTRGPSDRCFCVVSPARPAEEATSLEGALSGT 畑甜 PSVGRGHHAGPP STSRPPRPWDTPCPPVYAETKH 化 YSSGD 邸化 RPSF 化 SSLRP 化 TGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLP 化 PQR YWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAA 阳邸 DTDPRRLVQ 化 RQ 服 SPWQVY GFVRA 化版LVPPGLWGS 畑肥 RRFLRNT 邸FI 化GKHAKL 化犯 LTWKMSV畑 CAWLRRSPGVGCVPAA邸化 REE ILAKFLHWLMSVYVVE化RSFFYVTETTFQKNRLFFY服SVWSKLQSIGIRQHLKRV化RELSEAEVRQHREARPAL ITS化REIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAE化TSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGU)DIHRAWRTF 化RVRAQDPP阳LYFVKVDVTGAYDTIPQD化TEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAA服HV服AFKSHVSTLTDLQ PYMRQFVAHL 犯 TS 化畑 AVVIEQSSSL肥 ASSGL抑 V化 RFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLC 化 CYG DMENKLFAGIR 畑化化 RLV 孤化 LVTPHLTHAKT 化 RTLVRGV 阳 YGCVV 化服 TVVNFPV 抓 EALGGTAFVQMPA 服LFPWCG化LDTRTLEVQSDYSSYARTSIRA化TFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVN化QTVCTNI YKIL 化 QAYRFHACVL 化 PF 册 QWKNPWFLRVISDTA 化 CYSILKAKNAGMSLGAKGAAGP。沈 AVQWLC 册 AF LLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQT化S服LPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
【主权项】
1. 一种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物，其中所述组合物包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、具有与所述肽具有80%以上同源性的氨基酸序列的肽、或所述氨 基酸序列的片段。2. -种用于治疗和预防良性前列腺增生的组合物，其中所述组合物包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、具有与所述肽具有80%以上同源性的氨基酸序列的肽、或所述氨 基酸序列的片段。3. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种选自下组的添加剂:稀 释剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂或甜味 剂。4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含0 .Olmg至Img的所述肽。5. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含0.56mg的所述肽。6. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。7. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是食物组合物。8. -种用于治疗和预防良性前列腺增生的方法，其中所述方法包含给需要治疗的受试 者施用权利要求1至7中任一项所述的组合物的步骤。9. 如权利要求8所述的方法，其中所述组合物以每次0.005mg/kg至0.05mg/kg施用。10. 如权利要求8所述的方法，其中，在总共12周时长的治疗中，将所述组合物每2周施 用，其中所述施用在第〇周、第2周、第4周、第6周、第8周、第10周和第12周的一天完成，并且 每次施用的组合物为〇.56mg，其相当于4nmol肽/kg体重。
【文档编号】A61K38/17GK105899224SQ201480058285
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月23日
【发明人】金商在
【申请人】杰姆维克斯&凯尔有限公司, 金商在