一种黄连素葡聚糖微胶囊及其制备方法和应用

一种黄连素葡聚糖微胶囊及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开一种黄连素葡聚糖微胶囊，其特征在于，包括黄连素和葡聚糖，所述葡聚糖形成微胶囊，黄连素被包封在葡聚糖微胶囊内部，所述微胶囊为1～6μm×1～6μm的球体或椭球体。黄连素葡聚糖微胶囊将黄连素包封于葡聚糖内，不仅提高了黄连素的稳定性，增强了黄连素的吸收，而且提高了黄连素的肿瘤靶向能力，为临床提供了胰腺癌靶向治疗的药物备选。
【专利说明】
一种黄连素葡聚糖微胶囊及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及本发明涉及生物医药领域。更具体地，涉及一种黄连素新剂型。
【背景技术】
[0002]世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》显示，中国的癌症新增病例和死亡人数的绝对数值依然位居世界首位。其中包括胰腺癌等恶性消化道肿瘤的威胁最为显著。胰腺癌，多发生于胰头部，恶性程度高，是恶性肿瘤中最常见的，平均生存期不足6个月，五年生存率不足5%，难以治愈，死亡率极高，近年来已逐渐成为被医学界称为“癌中之王”。一般而言，化疗是杀伤肿瘤最为常见的有效方式之一，但是在临床上，胰腺癌对放化疗均不敏感而极大地限制了临床疗效的发挥。其中原因在于胰腺组织，作为腹膜后位器官，“潜藏”在胃的后面，腹部的深处，被大量胶原蛋白及脂肪组织包裹，传统化疗药物很难渗透进入肿瘤组织及其微环境，并深达肿瘤内部组织，相反，药物在其它非肿瘤器官中会大量分布，增加正常组织的毒副作用。所以即便是增加药物浓度，也会相应增加药物对其它组织脏器的损害，而肿瘤部位的药物浓度依旧没有明显的提高。因此增加化疗药物的浓度，反而加剧了病人的痛苦和机体的不适。对于胰腺癌而言，给予传统的化学治疗对于胰腺癌的控制与治疗并无显著的提高。
[0003]过去常用的药物5-氟尿嘧啶(541]，？111(^011作(^1)，但其反应率很少超过25%。吉西他滨在1998年被美国食品药物管理局(FDA)第一个批准用于胰腺癌治疗的一线药物。因为临床胰腺癌的治疗并没有真正有效的药物可用，目前转移性胰腺癌的一线治疗标准是使用单一药物吉西他滨，建议剂量是1000mg/m2。但吉西他滨并无特别突出的反应率，也不能根治胰腺癌，其主要作用只是在于改善生活品质，显示出它低毒的特点和减轻疼痛，稍稍延长患者存活期。2005年11月美国食品药物管理局推荐使用靶向药物埃罗替尼(特罗凯)与吉西他滨联用治疗晚期胰腺癌，虽然在存活期及反应率方面具有统计学差异，但是治疗上并不能发现其带来的明显好处。近年，从一些重要临床试验中发现吉西他滨与其他药物联合治疗的方案，并没有体现协同作用等临床意义，包括在2007年ASCO会议上报道的联合贝伐单抗及西妥昔单抗，都无法看到其联合治疗的优势。此外，2007年ASCO会议上也报道了两项重要临床研究，试图找出除了吉西他滨以外联合其他一线化疗药，如伊立替康、多西他赛和奥沙利铂等，均没有很好的临床提高与突破。至于临床胰腺癌二线化疗药物，更缺乏有意义的结果及对胰腺癌患者终末期生活质量的改善。
[0004]综上所述，胰腺癌化疗效果差的根本原因在于，化疗药物通过全身给药，进入胰腺癌组织的药物成分太少，而其他非相关组织的药物含量相对较高，毒副作用较大。如何能够提高药物在提高胰腺癌肿瘤组织分布量的同时，减少全身组织脏器的药物分布和降低毒副作用提高临床疗效的关键瓶颈。因此，选择合适的药物载体，实现各类药物靶向胰腺癌的输送与释放，进而实现对胰腺癌微环境的协同抑制和逆转化疗耐药是临床亟需解决的问题。
[0005]黄连素又叫盐酸黄连素，其分子式为C20H18C1N04(H20)，价格低廉，来源于黄连、黄柏、三颗针等植物，具有显著的抑菌作用。在临床上一直作为非处方药用于治疗腹泻与肠炎，同时现代药理学进一步研究证实黄连素具有显著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低胆固醇、抗制血管平滑肌增殖、改善胰岛素抵抗、抗血小板、抗炎，降糖，降脂等作用，因而在心血管系统、内分泌系统和神经系统疾病方面将可能有广泛、重要的应用前景，日益受到重视。用中医方面，黄连性味归经:苦，寒。归心、胃、肝、大肠经。具有厚肠胃、清热燥湿，泻火解毒之功效，用于胃肠湿热，呕吐，泻痢，高热神昏，心烦不寐，血热吐衄，疮疡肿毒，脓耳，湿疮，胃火牙痛，心律失常。黄连素是一种已经商业化的口服药物，被临床应用于肠炎等疾病的治疗。不仅如此，在体外实验证实了黄连素对各种肿瘤细胞，如前列腺癌、胰腺癌细胞等具有较强的抑制作用，但是其在肿瘤治疗方面的临床应用与转化一直没有获得开发，其主要原因在于:黄连素溶解性随温度及溶剂极性变化很大，不容易获得稳定药物体系;黄连素及其衍生物口服利用效率极低，这一点大大限制了其在肿瘤防治中的临床应用。因此，需要提供一种新的黄连素的剂型，该黄连素的剂型能够改善了黄连素药物的稳定性、吸收效率和肿瘤靶向能力。

【发明内容】

[0006]本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种黄连素葡聚糖微胶囊，该黄连素的剂型能够改善了黄连素药物的稳定性，吸收效率和肿瘤靶向能力。
[0007]本发明解决的第二个技术问题在于提供一种黄连素葡聚糖微胶囊的制备方法。
[0008]本发明解决的第三个技术问题在于提供一种黄连素葡聚糖微胶囊的应用。
[0009 ]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案:
[0010]一种黄连素葡聚糖微胶囊，包括黄连素和葡聚糖，所述葡聚糖形成微胶囊，黄连素被包封在葡聚糖微胶囊内部，所述微胶囊为直径为I?6μπι的球体或长径X短径为I?6μπιΧI?6μηι的椭球体。
[0011]在一个实施方案中，所述微胶囊为直径为2?4μπι的球体或长径X短径为2?4μπιX2?44!11捕球体。
[0012]所述黄连素葡聚糖微胶囊的制备方法，包括如下步骤:配制黄连素在10?100°C的饱和溶液，优化温度为40?700C ;向所述黄连素的饱和溶液中加入葡聚糖微胶囊;孵育，即获得黄连素葡聚糖微胶囊溶液。
[0013]在溶胀葡聚糖微胶囊的过程中，由于黄连素在葡聚糖胶囊内外的浓度差，致使黄连素分子向葡聚糖微胶囊内部扩散直至达到平衡。所述黄连素和葡聚糖胶囊的质量比为
0.001?50:1，优选为0.5?5:1。调整黄连素与微胶囊的比例，可获得黄连素包封量不同的黄连素葡聚糖微胶囊。
[0014]所述黄连素葡聚糖微胶囊的制备方法进一步包括向黄连素葡聚糖微胶囊溶液中加入乙醇，其中乙醇与溶液体积比不高于20%。
[0015]所述黄连素葡聚糖微胶囊的制备方法进一步包括干燥所述黄连素葡聚糖微胶囊溶液，获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。
[0016]所述干燥的方法为冻干或旋转蒸干。在冻干或旋转蒸干的过程中，外围液体成分消失或减少，药物被动装入葡聚糖微胶囊内，进一步增加黄连素药物进入葡聚糖微胶囊的包封量，当液体成分完全消失后即可获得黄连素葡聚糖微胶囊粉末制剂。
[0017]使用上述制备方法可得到黄连素葡聚糖微胶囊的溶液(即液态制剂)或黄连素葡聚糖微胶囊的干粉制剂，其中所述黄连素葡聚糖微胶囊的干粉制剂在储存过程中具有更好的稳定性。
[0018]黄连素的溶解度随着温度的改变而不同，在O?100°C的温度范围内，黄连素的溶解度会随着温度的升高而提高。配制黄连素饱和溶液，温度较高时黄连素的溶解度会更高。在O?100°C的温度范围内都可以实现连素葡聚糖微胶囊的制备，但是当黄连素溶液浓度高时，黄连素在葡聚糖微胶囊内的包封率会显著提高，因而在较高温度下配制黄连素溶液，黄连素饱和溶液中黄连素的浓度较高，能够获得良好的包封率。因而本申请采用在40?70 0C下配制黄连素的饱和溶液，黄连素在葡聚糖微胶囊内的包封率大于92%。
[0019]将葡聚糖微胶囊在黄连素饱和溶液中孵育的时间为I小时以上，以实现充分孵育，在孵育过程中，葡聚糖微胶囊发生溶胀，使得溶液中的黄连素分子充分扩散进入葡聚糖微胶囊内部。
[0020]在一个实施方案中，将葡聚糖微胶囊在黄连素饱和溶液中孵育的时间为0.01?100小时，优化为0.5?10小时;在另一个实施方案中，将葡聚糖微胶囊在黄连素饱和溶液中孵育的时间为3?10小时。
[0021]为提高葡聚糖微胶囊中黄连素的负载量，所述制备方法可以进一步包括提高葡聚糖微胶囊外黄连素的浓度。当葡聚糖微胶囊内外黄连素的浓度达到平衡时，葡聚糖微胶囊外的黄连素不再向葡聚糖微胶囊内扩散，当葡聚糖微胶囊外的黄连素浓度提高，平衡被打破时，葡聚糖微胶囊外的黄连素再次向葡聚糖微胶囊内扩散，进而提高葡聚糖微胶囊内的黄连素浓度。
[0022]所述提高葡聚糖微胶囊外黄连素的浓度包括向黄连素葡聚糖微胶囊溶液中再次加入黄连干粉或高浓度黄连素溶液，或者溶解黄连素葡聚糖微胶囊的干粉制剂，并再次冻干或旋转蒸干黄连素葡聚糖微胶囊溶液，其中溶解黄连素葡聚糖微胶囊的干粉制剂所用溶液的体积小于制备黄连素葡聚糖微胶囊溶液的体积。
[0023]葡聚糖在酵母、灵芝、香菇或谷物等多种作物生物体中广泛存在，其是一种具有生物活性的碳水化合物，具有通过刺激巨噬细胞活动，激发机体非特异性防御机制，进而增强机体免疫功能的功效，在肿瘤、感染、创伤、美容等领域中具有潜在的应用价值，因而并被美国FDA认证为绿色安全有效的保健美容产品和免疫增强剂。
[0024]本申请所述的葡聚糖微胶囊来源于真菌的细胞壁。因为用于包封黄连素分子，所以需要保证葡聚糖微胶囊结构的完整性，而不是市面上经破碎后的葡聚糖粉末添加剂。然而所述葡聚糖微胶囊也可以来源于其他国外商业化制备的具有相同或类似结构的葡聚糖。
[0025]所述黄连素葡聚糖微胶囊作为胰腺癌靶向治疗药物的应用。
[0026]体外实验结果表明，所述黄连素葡聚糖微胶囊在细胞水平上可以杀死胰腺癌细胞。体内实验结果表明，所述黄连素葡聚糖微胶囊在动物水平上可以靶向传输至胰腺癌肿瘤，进而达到抑制胰腺癌的功效。
[0027]祖国医学认为胰腺癌的病机系脾胃虚弱、肝气郁结致气滞、血瘀、湿热为患，久而结成肿块，即胰腺癌多为湿热为主。而根据中药理论，黄连性味归经:苦，寒。归心、胃、肝、大肠经。具有厚肠胃、清热燥湿，泻火解毒之功效，用于胃肠湿热，呕吐，泻痢，高热神昏，心烦不寐，血热吐衄，疮疡肿毒，脓耳，湿疮，胃火牙痛，心律失常，因而黄连素的清热燥湿符合中医胰腺癌的病机辩证治疗。
[0028]本申请将黄连素包封于葡聚糖微胶囊内，提高了黄连素的分散稳定性和肿瘤靶向及抗肿瘤能力。所述黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂具有安全稳定性、可储存性、便于运输性。所述的粉状制剂溶解后可水化后，用于体内抗肿瘤时，由于其具有肿瘤体内靶向能力，而能明显降低毒副作用，提高其抗癌效果。细胞毒实验结果显示，所述黄连素葡聚糖微胶囊对胰腺癌细胞系SW1990在48小时内的IC5q为42.5μΜ，而单纯用温水溶解黄连素溶液(游离黄连素溶液)对细胞的IC5Q为138.3μΜ，黄连素葡聚糖微胶囊对胰腺癌细胞系的
[0029]显著优于黄连素溶液;同样在另一株胰腺癌细胞系MIAPaca-2中黄连素葡聚糖在48小时内的IC5Q为34.6μΜ，而游离黄连素溶液对该细胞的IC5Q为144.7μΜ。在体内抗肿瘤(皮下与原位)的研究发现，黄连素葡聚糖微胶囊在肿瘤部位的富集性增强，从而降低了游离黄连素的副作用(游离组黄连素体重减轻了 15%)，降低了肿瘤的远端转移，增强了黄连素的抗肿瘤效果，这种免疫剂型的改良具有十分重要的临床意义。
[0030]本发明的有益效果如下:
[0031]本申请的黄连素葡聚糖微胶囊药物制备过程不涉及非Π)Α批准材料的使用，避免了相关材料的安全风险。黄连素包封率可以达80%以上。同时将黄连素包封于葡聚糖内，不仅提高了黄连素的稳定性，增强了黄连素的吸收，而且提高了黄连素的肿瘤靶向能力，最终为临床提供了胰腺癌靶向治疗的药物备选。
[0032]本发明的黄连素葡聚糖微胶囊对胰腺癌切实有效，且制备工艺简单易行，重复性好，在胰腺癌领域具有新的临床治疗价值和应用前景。
【附图说明】
[0033]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0034]图1示出黄连素葡聚糖微胶囊共聚焦显微镜照片。
[0035]图2示出黄连素葡聚糖微胶囊的表面电荷及包载前后的最大发射波长的比较。
[0036]图3示出黄连素葡聚糖微胶囊对胰腺癌细胞SW1990的MTT结果。
[0037]图4示出黄连素葡聚糖微胶囊对胰腺癌细胞MIAPaCa-2的MTT结果。
[0038]图5示出黄连素葡聚糖微胶囊进入胰腺癌细胞SW1990的流式结果比较。
[0039]图6示出黄连素葡聚糖微胶囊进入胰腺癌细胞MIAPaCa-2的流式结果比较。
[0040]图7示出黄连素葡聚糖微胶囊体外抑制胰腺癌细胞SW1990的克隆形成与转移。
[0041]图8示出黄连素葡聚糖微胶囊体外抑制胰腺癌细胞MIAPaCa-2的克隆形成与转移。
[0042]图9示出黄连素葡聚糖微胶囊体内抑制SW1990胰腺癌细胞皮下荷瘤的动物实验。
[0043]图10示出黄连素葡聚糖微胶囊体内抑制MIAPaCa-2原位胰腺癌动物实验和远端转移，裸鼠体内的灰白荧光为肿瘤的增殖与转移的实时活体分析。
[0044]图11示出黄连素葡聚糖微胶囊体内抑制MIAPaCa-2原位胰腺癌的增殖。
[0045]图12示出黄连素葡聚糖微胶囊体内抑制MIAPaCa_2远端脏器的转移白色箭头为肿瘤的转移灶。
【具体实施方式】
[0046]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0047]实施例1:黄连素葡聚糖微胶囊的制备
[0048]60 °C下，制备黄连素的饱和溶液。取该溶液Iml，向其中加入葡聚糖微胶囊20mg，充分孵育8小时，溶胀葡聚糖微胶囊。在此过程中，黄连素分子向葡聚糖微胶囊内部扩散并达到平衡。
[0049]平衡后，向此体系中边搅拌边滴加2ml乙醇(速度小于0.4ml/分钟)，滴加完毕后，继续搅拌10分钟后冻干或旋转蒸干溶剂，即获得包封率在92%以上的黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。
[0050]实施例2:黄连素葡聚糖微胶囊的制备
[0051 ] 60 °C下，制备黄连素的饱和溶液。取该溶液1ml，向其中加入葡聚糖微胶囊200mg，充分孵育8小时，溶胀葡聚糖微胶囊。在此过程中，黄连素分子向葡聚糖微胶囊内部扩散并达到平衡。冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，用I?3ml水溶解所述黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，或再次进行冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。即可获得包封率92 %以上黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。
[0052]实施例3:黄连素葡聚糖微胶囊的制备
[0053]50°C下，制备黄连素的饱和溶液。取该溶液1ml，向其中加入葡聚糖微胶囊200mg，充分孵育8小时，溶胀葡聚糖微胶囊。在此过程中，黄连素分子向葡聚糖微胶囊内部扩散并达到平衡。冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，用I?3ml水溶解所述黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，或再次进行冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，即可获得包封率92 %以上黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。
[0054]实施例4:黄连素葡聚糖微胶囊的制备
[0055]70 °C下，制备黄连素的饱和溶液。取该溶液1ml，向其中加入葡聚糖微胶囊200mg，充分孵育8小时，溶胀葡聚糖微胶囊。在此过程中，黄连素分子向葡聚糖微胶囊内部扩散并达到平衡。冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，用I?3ml水溶解所述黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，或再次进行冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，即可获得包封率92 %以上黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。
[0056]实施例5:黄连素葡聚糖微胶囊的制备
[0057]55 °C下，制备黄连素的饱和溶液。取该溶液200ml，向其中加入葡聚糖微胶囊5g，充分孵育10小时，溶胀葡聚糖微胶囊。在此过程中，黄连素分子向葡聚糖微胶囊内部扩散并达到平衡。将此体系直接冻干，冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，用5-10ml水溶解所述黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，或再次进行冻干或旋转蒸干溶剂后获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂，即可获得包封率92 %以上黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。
[0058]在另一实施例中，向孵育体系中边搅拌边滴加200ml乙醇(速度小于0.4ml/分钟)，滴加完毕后，继续搅拌10分钟后冻干或旋转蒸干溶剂。也可获得包封率在92%以上的黄连素葡聚糖微胶囊。
[0059]实施例6:黄连素葡聚糖微胶囊的参数检测
[0060]包封于葡聚糖微胶囊内的黄连素为包封的黄连素(BBR-GPs);游离于溶液中为游离的黄连素(BBR-free)。
[0061]将实施例5的黄连素葡聚糖微胶囊用PBS快速洗涤2次后，洗去表面粘附的黄连素成分，用100微升PBS溶液分散，在激光共聚焦平台检测黄连素分子药物在葡聚糖内的分布状况。采用德国莱卡激光共聚焦，激发光488nm，发射光为550nm，可以激发黄连素产生绿色荧光，证实黄连素葡聚糖微胶囊内包封有黄连素小分子药物。通过微粒表面电荷的差异比较进一步分析，黄连素小分子在包载前后的两种溶液介质下颗粒表面的电荷变化，发现包载前黄连素小分子水溶液呈现表面正电荷+10.1mV(BBR-free为正电荷粒子)，与空载葡聚糖(GPs)表面电荷为电中性，电荷为-0.37mV，，当黄连素被葡聚糖包载后，BBR-GPs呈现趋向电中性的状态，电荷为-0.523mV，与GPs表面电荷接近，这说明黄连素小分子从溶液中扩散至葡聚糖微胶囊内，即被包封于葡聚糖，结果见2A。通过最大发射波长的比较，无论是游离抑或包封于葡聚糖内的黄连素，其最大发射波长始终保持一致，包封前后黄连素的最大发射波长为553nm，结果见图2B。葡聚糖包封不影响黄连素小分子荧光的红移或者蓝移，为后期的黄连素小分子药物的荧光检测与分布提供理论依据。
[0062]实施例7:黄连素葡聚糖微胶囊处理胰腺癌细胞
[0063]选用胰腺癌细胞系SW1990和MIA PaCa-2，在96孔板中，每孔铺3000个SW1990或MIAPaCa-2的胰腺癌细胞，待第二天细胞贴壁后，更换培养基，以有效黄连素浓度为ΟμΜ、ΙΟμΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ和500μΜ的黄连素葡聚糖微胶囊(被包封的黄连素的浓度)处理胰腺癌细胞48小时，以MTT方法检测细胞活力，评价不同处理组对上述两株胰腺癌细胞活力的影响(结果见图3和4)。所述有效黄连素浓度是指溶液中包封于葡聚糖微胶囊内的黄连素浓度或者游离黄连素水溶液浓度。
[0064]通过不同浓度的黄连素处理SW1990细胞，48小时后，我们可以看见BBR-GPs组的1〇50为42.54]?，显著低于游离881?(881?-灶66)组138.34]\1。]\04 PaCa_2中黄连素葡聚糖在48小时内的IC5q为34.6μΜ，明显低于游离黄连素溶液对该细胞的IC5q为144.7μΜ。试验结果表明黄连素葡聚糖微胶囊能够有效降低黄连素用量，并提高胰腺癌细胞的杀伤力。
[0065]实施例8黄连素葡聚糖微胶囊处理胰腺癌细胞的荧光流式分布
[0066]配制黄连素游离溶液和黄连素葡聚糖微胶囊溶液。
[0067]将50μΜ同等黄连素小分子的药物浓度(其中黄连素游离溶液中黄连素的浓度与黄连素葡聚糖微胶囊溶液中包封于葡聚糖微胶囊内的黄连素的浓度相同)加入分别到上述2株胰腺癌细胞(SW1990和MIA PaCa-2)，以BD公司的C6流式检测仪分析药物的荧光强度，检测BBR自身荧光(488nm激发，550nm发射，FL-1通道)，发现BBR-GPs组进入2株胰腺癌细胞的黄连素荧光更多，这提示胰腺癌细胞能更加有效地摄入BBR-GPs，图5左图为处理48小时后，BBR-free、BBR-GPs和生理盐水组中SW1990细胞的荧光吞噬强度。结果表明BBR-GPs更容易进入细胞。中图和右图，比较了在Oh、0.5h、3h和6h时，BBR进入细胞的速度，结果表明BBR-free进入细胞的速度慢于BBR-GPs，尤其是BBR-free在6小时才明显进入细胞，BBR-GPs在
0.5小时就显著进入细胞。
[0068]图6左图为处理48小时后，BBR-free、BBR_GPs和生理盐水组中，MIA PaCa_2细胞的荧光吞噬强度。结果表明BBR-GPs更容易进入细胞。中图和右图，比较了在0h、0.5h、3h和6h时，BBR-free进入细胞的速度慢于BBR-GPs，尤其BBR-free在0.5小时进入细胞的BBR的荧光量为14?15，而BBR-GPs在0.5小时进入细胞的BBR荧光药将近15?106。结果显示:BBR-GPs组显著多于BBR-free组。通过流式细胞计数检测发现在短时间内，BBR-GPs较BBR-free进入胰腺癌细胞的分布方式更快更多。
[0069]实施例9:黄连素葡聚糖微胶囊体外抑制胰腺癌细胞的平板克隆与侵袭实验
[0070]在同等50μΜ的BBR的药物浓度下，拟平板克隆形成实验，在每个直径为60mm培养皿的中铺4000个细胞，每3天换液(含不同处理组的药液)，观察到第21天，弃去培养基，以结晶紫方法对细胞克隆进行染色，并对平皿内的细胞克隆数进行计数。图7A结果显示，SW1990细胞平板克隆实验中，游离黄连素(BBR-free，50μΜ)组和黄连素葡聚糖组(BBR-GPs，50μΜ)具有良好的肿瘤克隆抑制能力，在10x镜头下观察5个视野，结果显示，未处理组的平板克隆形成数为432 土 53，GPs组平板克隆形成数为378 土 62，BBR-free组平板克隆形成数为108 土35，BBR-GPs 组平板克隆形成数为 67 土 11 (*P〈0.05，#P〈0.01)。图 8A 结果显示，MIA PaCa-2细胞平板克隆形成实验中，黄连素(BBR-free，50μΜ)组和黄连素葡聚糖组(BBR-GPs，50yM)具有良好的肿瘤克隆抑制能力，在10x镜头下观察5个视野，结果显示，未处理组的平板克隆形成数为 316±47，6?8组为273±32，881?-打66组为188±20，881?-6?8组为97±13(*?〈0.05，**Ρ〈0.01)ο
[0071]同时，购买美国BDmatrigel小室，以15万细胞/孔铺细胞，并进行含有黄连素药物的培养基培养48小时。弃去上下室的培养基，以4%多聚甲醛的PBS溶液进行固定，再用PBS清洗3次，然后以结晶紫染料对上下小室进行染色20分钟，用棉签擦拭掉上室的细胞，将下室贴面的细胞快速用PBS清洗，在倒置显微镜下，以不同的5个视野，对转移细胞进行拍照、计数和统计，结果见图9和10。结果显示BBR-GPs组的细胞克隆形成数最少，侵袭转移的细胞最少，表明BBR-GPs更能有效抑制胰腺癌细胞的克隆增殖和侵袭转移。
[0072]图7B的结果显示，在matrigel的transwell小室中培养SWl990细胞，结果表明，SW1990细胞的侵袭转移能力明显降低。在10x镜头下观察5个视野，转移细胞平均计数为:未处理组为246 ±31，GPs组为217 ±12，BBR-free组为94 ±18，BBR-GPs组为30 ±6(*P〈0.05，**Ρ〈0.01)ο
[0073]图8Β的结果显示，在matrigel的transwell小室中培养MIA Paca-2细胞，结果表明MIA Paca-2细胞的侵袭转移能力明显降低。在10x镜头下观察5个视野，转移细胞平均计数为:未处理组为 272 土 36，GPs 组为 247 ± 31，BBR-free 组为 91 土 19，BBR-GPs 组为 65 土 16(*P〈0.05，**Ρ〈0.01)ο
[0074]实施例10:黄连素葡聚糖微胶囊体内抑制胰腺癌细胞生长的动物实验
[0075]从维通利华公司购买4-周龄雌性Balb-c裸鼠(每组3只)，将事先培养好的MIAPaCa-2细胞(呈现对数增长期)用胰酶消化，PBS清洗2遍后，用Iml注射针在裸鼠臀侧(双侧)分别注射16细胞。待肿瘤长到体积为2mm X 2mm X 2mm后，开始干预给药，(阴性对照生理盐水，20mg/kg游离黄连素水溶液和黄连素葡聚糖微胶囊)，每3天给药，保证一周2次注射，裸鼠称重和肿瘤体积测量均在每次给药前完成，处理到第24天(结果见9A)，皮下荷瘤SW1990细胞后每3天记录肿瘤长径与短径(体积=长径2 X短径/2)，观察肿瘤体积变化，结果表明BBR-GPs组的肿瘤体积长势最慢，说明BBR-GPs的抑瘤效果较好
[0076]24天后，用⑶2窒息法处死动物(按照小动物伦理规范进行安乐死)，剥离皮下肿瘤组织，，观察不同组的皮下肿瘤外观，结果显示BBR-GPs组的肿瘤最小(结果见9B)。对上述肿瘤进行称重(结果见9C)，发现BBR-GPs组的肿瘤重量最小，为200 土 23毫克，而游离BBR(BBR-free)组为382土47毫克，对照组为963土 136毫克(*P〈0.05，#P〈0.01)。对于各组的荷瘤鼠体重进行称量，结果表明，在经过24天的施用，BBR-free处理组引起裸鼠体重的减轻，(*P〈
0.05)。
[0077]实施例11:黄连素葡聚糖微胶囊体内抑制MIAPaCa-2原位胰腺癌的动物实验
[0078]从安泰康生物科技购买MIAPaCa-2-RFP红色荧光的细胞系，先购买2只4-周龄雌性Balb-c裸鼠，进行如实施例11的皮下荷瘤处理，当皮下肿瘤体积大约在500mm3时，处死动物，以无菌方法剥离肿瘤，并切成平均Imm3的肿瘤块，与此同时重新购买4-周龄雌性Balb-c裸鼠，给予腹腔注射麻醉后，施行胰腺组织的肿瘤块埋种，结果以活体荧光成像仪观察小鼠原位胰腺部位的荧光变化，荧光信号的变大变强，说明肿瘤的增殖旺盛甚至发生转移等。在不同时间段，在第I天、5天、7天、9天、10天、12天、15天和21天，对裸鼠进行称重和荧光的拍照记录，结果见图10，结果表明对照组(单纯5%葡糖糖溶液+等量空葡聚糖微胶囊组)随着时间延续，发生荧光肿瘤(灰白色荧光)大量的增多增强，而BBR-free组，肿瘤增加和转移的速度慢于对照组，同时BBR-GPs发生更明显的肿瘤荧光的减弱和转移缓慢。第22天处死小鼠，剥离肿瘤和重要脏器，以活体荧光成像仪分析肿瘤的转移状况和肿瘤的质量分析，结果见图11。对各组小鼠的体型外观，肿瘤和重要脏器进行明场和荧光场观察，其中IlA结果显示，对照组(单纯5%葡糖糖溶液+等量空葡聚糖微胶囊组)具有明显的脾脏，肝脏和肾上腺等转移，而BBR-free组发生少量的脾脏和肝脏被膜转移，BBR-GPs组未见明显的转移灶和微小灶。IlB结果显示在裸鼠体重的测量中发现，BBR-free组可以引起药物性的体重减轻，较BBR处理前，体重减轻了8 % ± 3.5 %，而BBR-GPs组对小鼠体重减轻有保护意义，小鼠体重较处理前增加了 12% ± 3.8% (*P〈0.05)。IIC结果显示原发灶肿瘤重量比较发现，BBR-GPs组显著低于BBR-free组和对照组，具有显著的统计学差异(**P〈0.01)。结果发现BBR-GPs组能有效降低原位胰腺癌的远端转移(如肝脏，脾脏，肾上腺等)。
[0079]实施例12:对各组转移灶荧光肿瘤的HE染色验证
[0080]通过HE染色观察各组重要器官的荧光转移肿瘤的验证，结果如图12表明:对照组发现除了原位胰腺组织有肿瘤外，肿瘤的转移灶在肝脏，脾脏和肾上腺均有转移，在BBR-free 组发生脾脏和肝脏的微小转移灶 ，而在 BBR-GPs 组未见明显微小肿瘤转移。说明， BBR-GPs可以有效降低原位胰腺癌的远端转移(白色箭头指示)。
[0081]以上详细描述了本发明的实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，以及这些改良剂型在慢性肠液和结直肠患者载药方面具有极其安全高效的应用市场，这些均属于本发明的保护范围。
[0082]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0083]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
[0084]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于与上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，制备工艺和对胰腺癌，慢性肠炎，结直肠癌等疑难杂症的新用途的改进、开发和具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种黄连素葡聚糖微胶囊，其特征在于，包括黄连素和葡聚糖，所述葡聚糖形成微胶囊，黄连素被包封在葡聚糖微胶囊内部，直径为I?6μπι的球体或长径X短径为I?6μπιΧ I?6μηι的椭球体。2.如权利要求1所述黄连素葡聚糖微胶囊，其特征在于，所述微胶囊为直径为2?4μπι的球体或长径X短径为2?4μηι X 2?441]1椭球体。3.如权利要求1所述黄连素葡聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:在10?100°C下配制黄连素的饱和溶液；向所述黄连素的饱和溶液中加入葡聚糖微胶囊;孵育，即获得黄连素葡聚糖微胶囊溶液。4.如权利要求2的制备方法，其特征在于，在40?700C下，配制黄连素的饱和溶液。5.如权利要求2的制备方法，其特征在于，所述黄连素和葡聚糖胶囊的质量比为0.001?50:1;优选地，所述黄连素和葡聚糖胶囊的质量比为0.5?5:1。6.如权利要求2的制备方法，其特征在于，进一步包括向黄连素葡聚糖微胶囊溶液中加入乙醇，其中乙醇与溶液体积比不高于20%。7.如权利要求2的制备方法，其特征在于，进一步包括干燥所述黄连素葡聚糖微胶囊溶液，获得黄连素葡聚糖微胶囊粉状制剂。8.如权利要求7的制备方法，其特征在于，所述干燥的方法为冻干或旋转蒸干。9.如权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的葡聚糖微胶囊来源于真菌的细胞壁。10.如权利要求1所述黄连素葡聚糖微胶囊作为胰腺癌治疗药物的应用。
【文档编号】A61K47/36GK105919971SQ201610463953
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】潘元明
【申请人】潘元明