托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用

托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用
【专利摘要】本发明公开了一种用托吡酯在治疗心肌梗死中的应用。该药物作为一种新型的抗癫痫药，因其不良反应少，耐受性佳，广泛应用于临床。本发明在心肌梗死后早期应用托吡酯治疗，其通过激活单核/巨噬细胞表面的GABAA受体，调节炎症反应和修复作用之间的平衡，进而通过减少梗死面积，增加胶原沉积，改善心功能，以减轻心室重构，最终降低心血管相关的临床不良事件(死亡、心室破裂)的发生率。由于目前临床上主要治疗心肌梗死的药物(ACEI、ARB、β受体阻滞剂)都受到其本身降低血压的药理学特性限制，本发明为心肌梗死后血压值无法稳定地达到90/60mmHg以上的患者，提供了新的治疗策略。
【专利说明】
托口比醋在治疗心肌梗死的药品中应用
技术领域
[0001] 本发明设及治疗屯、肌梗死领域，具体地指一种托化醋在治疗屯、肌梗死的药品中应 用。
【背景技术】
[0002] 屯、肌梗死(myocardial in化;rction，MI)是冠状动脉血流突然中断所导致，其引起 的高死亡率和严重的临床并发症成为近年来威胁全球人类健康的严峻问题。MI后所致的屯、 力衰竭和屯、室破裂是冠屯、病致残和致死的主要原因。大量研究发现，MI后的炎症反应是修 复过程中坏死组织清除和癒痕组织生成的基础，且适当调控炎症反应的时程和强度有利于 上述两者的平衡，而MI后屯、肌组织的修复质量是影响远期预后的决定性因素。
[0003] 自上市W来，W下Ξ种药物由于显著的降压作用及广泛的应用范围而成为高血压 治疗的基石：血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin conve;rting enz;yme inhibitors, ACEI)和血管紧张素 II受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers,ARB)通过阻断肾素- 血管紧张素-醒固酬（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)系统降压，β受体阻 滞剂除此之外，还可W通过括抗交感神经系统的过度激活发挥降压效应。随后，通过大量的 循证医学证据进一步显示了它们在屯、肌梗死中的应用。
[0004] 2015 年急性 ST段抬高型屯、肌梗死（ST-Segment Elevation Myocardial Infarction, STEMI)诊断和治疗指南将ACEI和β受体阻滞剂列为I类推荐（即已证实和/或一 致公认某治疗措施或操作有益、有效，应该采用），且示所有STEMI患者出院后均应在监测血 压、屯、率的情况下，长期服用ACEI和β受体阻滞剂，不能耐受ACEI的患者可改用ARB类药物。 同时，指南中强调，血压值在90/60mmHgW上的患者，应用上述两种药物较为安全。
[0005] 业已证实，MI后，由于屯、肌坏死，引起左室射血分数下降，左室舒张末压增高，左室 顺应性下降，冠脉灌注压下降，非梗死相关冠脉狭窄，远端屯、肌缺血和收缩功能减退，左屯、 室总体累血功能减低，因此，低血压状态是MI患者常见的症状，尤其MI后早期患者血压波动 较大。MI患者的低血压症状，一方面使得冠状动脉的血液灌注不足加重，甚至进一步诱发或 加重屯、肌缺血;另一方面，低血压症状引起的外周有效循环血量不足可引发低血压性休克， 直接危害患者的生命安全。
[0006] 综上所述，当MI患者的血压值无法稳定地达到90/60mmHgW上时，具有降压作用的 ACEI、ARB和β受体阻滞剂的使用受到了限制，即该类患者丧失了使用上述Ξ种药物相关的 治疗方案。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是提供托化醋在治疗屯、肌梗死的药品中应用，解决了现有ACEI、ARB 和β受体阻滞剂在血压值低于90/60mmHg条件下使用受限制缺陷。
[000引为解决上述技术问题，本发明提供的一种托化醋在治疗屯、肌梗死的药品中应用。
[0009] 托[tt醋(topiramate)，商品名妥泰(Topamax)，化学名为2,3:4,5-双-0-(l-甲基亚 乙基)-β-0-化喃果糖氨基横酸醋。它是由美国强生制药公司（Johnson&Johnson)开发，并于 1995年在英国上市，抑A于1996年批准用于治疗成人原发性部分性癒痛，于2000年批准用于 儿童癒痛治疗。2004年FDA又批准该药用于成人偏头痛的预防。2012年7月FDA批准了美国 Vivus制药公司的含有托化醋和苯下胺的复方减肥药Qsymia上市，是美国13年来通过的第2 个减肥新药。
[0010] 临床上，托化醋作为一种新型抗癒痛药，通过其阻断电压依赖性钢离子通道、在 GABA受体非苯二氮草类位点增加 GABA活性、括抗红藻氨酸/AMPA-谷氨酸受体、轻度抑制碳 酸酢酶等药理学特性，已广泛用于成人和儿童的部分发作、原发性全面性强直阵李发作及 Lennox-Gastaut综合征的添加治疗，其不良反应较少，耐受性佳。同时，托化醋也被作为特 异性的GABAa受体激动剂广泛应用于神经内科学，内分泌学和免疫学等领域的科学研究中， 但在屯、血管领域中的相关研究，并无报道。
[0011] 本发明中托化醋应用于MI后的早期治疗，首先，由于其可通过激活单核/巨隧细胞 表面的GABAa受体W调节Ly6Chigh/Ly6Ci?型Mo、Μ1 /M2型Μ Φ、化1 /化2细胞之间的平衡，而减 轻ΜΙ后早期Ml型ΜΦ所介导的促炎反应的强度，增强M2型ΜΦ所介导的修复作用，最终改善 炎症反应和修复作用失衡所引起的梗死面积增大、胶原密度减少和屯、功能恶化等屯、室不良 重塑的表现，并降低死亡率和屯、室破裂率等临床不良事件的发生率。
[0012] 综上所述，托化醋通过激活单核/巨隧细胞表面的GABAa受体减少梗死面积、增加 胶原密度、改善MI后屯、功能并最终降低MI后死亡率和屯、室破裂率，与此同时，托化醋已被证 实，在治疗癒痛的同时不改变患者治疗中和治疗后的血压值，故应用托化醋药理学特性使 其能应用于MI后血压值无法稳定地达到90/60mmHgW上的患者，并使该类患者获益。
[0013] 本发明的有益效果在于：
[0014] 在MI后早期，本发明的托化醋通过激活单核/巨隧细胞表面的GABAa受体，调节炎 症反应和修复作用之间的平衡，进而通过减少梗死面积，增加胶原沉积，改善屯、功能，W减 轻屯、室重构，最终降低屯、血管相关的临床不良事件(死亡、屯、室破裂)的发生率。
【附图说明】
[0015] 图1为不同药物处理方式对小鼠 MI术后生存率和屯、室破裂率的影响图；
[0016] 图中，图1A为小鼠 MI术后各组生存率(Survival)曲线图，纵坐标表示生存率，单位 为％，横坐标表示天数，单位为化y;
[0017] 图1B为小鼠 MI术后各组屯、室破裂率(Rupture rate)曲线图，纵坐标表示屯、室破裂 率，单位为％，横坐标表示天数，单位为化y;
[0018] 图2为不同药物处理方式对小鼠 MI术后屯、脏功能的影响图；
[0019]图中，图2A为小鼠 MI术后14天各组B型超声图，
[0020] 图2B为小鼠 MI术后14天各组乳头肌(Mid)水平Μ型超声图，其中实线表示舒张期， 虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；
[0021] 图2C为小鼠 ΜΙ术后14天各组屯、尖(Apical)水平Μ型超声图，其中实线表示舒张期， 虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；
[0022] 图3为不同药物处理方式对小鼠 ΜΙ术后左室重构的影响图；
[0023] 图中，图3Α为小鼠 ΜΙ术后14天各组屯、脏Masson染色图（低倍镜），图中灰色区域为 正常屯、肌组织，黑色区域为梗死区；
[0024] 图3B为小鼠 MI术后14天各组屯、脏Masson染色图（高倍镜），图中灰色区域为正常屯、 肌组织，黑色区域为梗死区胶原；
[0025] 图3C为小鼠 MI术后14天各组屯、脏梗死面积图（infarct size)，其中纵坐标表示屯、 脏梗死面积百分比，单位为％，横坐标表示切片位置距离结扎线长度，
[00%] 图3D为小鼠 MI术后14天各组屯、脏梗死区胶原密度图（collagen density),其中纵 坐标表示屯、脏梗死区胶原密度百分比，单位为％，横坐标表示分组；
[0027]图4为屯、肌组织和免疫细胞上托化醋作用受体即GABAa受体α1和防亚基表达的情 况图；
[002引图中，图4Α为GABAa受体α 1亚基在小鼠屯、脏和脾脏巨隧细胞中的表达情况图，其中 304bp为α1亚基片段长度，Br为脑组织，My为屯、肌组织，ΜΦ为巨隧细胞，NCM为乳鼠屯、肌细 胞，NCF为乳鼠屯、肌成纤维细胞，ACM为成鼠屯、肌细胞，ACF为成鼠屯、肌成纤维细胞，AEC为成 鼠内皮细胞；
[0029] 图4B为GABAa受体盼亚基在小鼠屯、脏和脾脏巨隧细胞中的表达情况，其中35化P为 03亚基片段长度，图4C为GABAa受体α1亚基在小鼠免疫细胞中的表达情况，其中304bp为α1 亚基片段长度，Br为脑组织，ΜΦ为巨隧细胞，Mo为单核细胞，CD4+T为CD4+T细胞；图4D为 GABAa受体防亚基在小鼠免疫细胞中的表达情况，其中35加 P为防亚基片段长度，化为脑组 织，ΜΦ为巨隧细胞，Mo为单核细胞，CD4+T为CD4+T细胞；
[0030] 图5为不同药物处理方式对小鼠 MI术后单核细胞生成的影响图；
[0031] 图中，图5A为小鼠 MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中Ly6Chigh和Ly6Ci?单核细胞 (monocytes)的流式图和数目，其中左图为流式图，CDUb和Ly6C为单核细胞标记物，流式图 中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型单核细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单 位为1 X 1〇5个，横坐标表示天数，单位为化y;
[0032] 图5B为小鼠 MI术后1、3、7天各组外周血（peripheral blood)中Ly6Chigh和Ly6Ci? 单核细胞(monocytes)的流式图和数目，其中左图为流式图，CDl lb和Ly6C为单核细胞标记 物，流式图中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型单核细胞数目，纵坐标表示细 胞数目，单位为1 X 104个，横坐标表示天数，单位为化y;
[0033] 图5C为小鼠 MI术后1、3、7天各组骨髓(bone marrow)中Ly6Chigh和Ly6Ci?单核细胞 (monocytes)的流式图和数目，其中左图为流式图，CDUb和Ly6C为单核细胞标记物，流式图 中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型单核细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单 位为1 X 1〇6个，横坐标表示天数，单位为化y;
[0034] 图加为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化ead)、外周血(peripheral blood)、骨髓 (bone marrow)和脾脏(spleen)中IL-Ιβ的水平图，其中屯、脏、骨髓和脾脏中检测比-IftiRNA 水平，纵坐标表示Act =目的基因 Ct值一管家基因 Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表 threshold, Ct值的含义是每个反应管内的目的DM实时监测扩增时的巧光强度达到指数扩 增时的循环数，单位为2 X 103，横坐标表示天数，单位为化y;外周血中检测血清IL-Ιβ蛋白 水平，纵坐标表示比-10含量，单位为pg/mL，横坐标表示天数，单位为化y;
[0035] 图祀为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化eart)中MCP-1的mRNA水平，纵坐标表示Δ ct=目的基因 Ct值一管家基因 Ct值，Ct值:C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是每 个反应管内的目的DM实时监测扩增时的巧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2 X 1〇3，横坐标表示天数，单位为化y;
[0036] 图6为不同药物处理方式对小鼠 MI术后巨隧细胞极化的影响图；
[0037] 图中，图6A为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化eart)中Ml型和M2型巨隧细胞 (macrophages,简写符号ΜΦ)的流式图和数目，其中左图为流式图，F4/80和CDllc为巨隧细 胞标记物，流式图中方框内的数字表示两型细胞的比例，右图为两型巨隧细胞数目，纵坐标 表示细胞数目，单位为1 X 1〇3个，横坐标表示天数，单位为化y;
[0038] 图6B为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化ead)中巨隧细胞(F4/80+macrophages)的 总数，纵坐标表示细胞数目，单位为1 X 1〇3个，横坐标表示天数，单位为化y;
[0039] 图6C为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏中Mac-3的免疫组化图和巨隧细胞 (macrophages)总数，上方为Mac-3的免疫组化图，其中黑色为Mac-3,下方为巨隧细胞总数， 纵坐标表示细胞数目，单位为个/mm2，横坐标表示天数，单位为化y;
[0040] 图抓为小鼠 MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中化2细胞的流式图和数目，其中左 图为流式图，CD4和IL-4为化2细胞标记物，流式图中方框内的数字表示化2细胞所占比例， 右图为化2细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1 X 103个，横坐标表示天数，单位为化y; [0041 ] 图6E为小鼠 MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中GATA3的mRNA水平图，纵坐标表示 ACt=目的基因 Ct值一管家基因 Ct值，Ct值:C代表切cle，t代表thresholcUCt值的含义是 每个反应管内的目的DNA实时监测扩增时的巧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2X 1〇3，横坐标表示天数，单位为化y;
[0042] 图6F为小鼠 MI术后1、3、7天各组脾脏(spleen)中Thl细胞的流式图和数目，其中上 方为流式图，CD4和IFN-丫为化1细胞标记物，流式图中方框内的数字表示化1细胞所占比 例，下方为化1细胞数目，纵坐标表示细胞数目，单位为1 X 1〇3个，横坐标表示天数，单位为 Day；
[0043] 图7为不同药物处理方式对小鼠 MI术后Ml相关细胞因子表达情况的影响图；
[0044] 图中，图7A为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化eart)中TNF-a，化-6，MMP-9的mRNA水 平图，纵坐标表示Act =目的基因 Ct值一管家基因 Ct值，Ct值：C代表Cycle，t代表 threshold, Ct值的含义是每个反应管内的目的DM实时监测扩增时的巧光强度达到指数扩 增时的循环数，单位为2 X 103，横坐标表示天数，单位为化y;
[0045] 图7B为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化eart)中匪P-9的蛋白印迹图和明胶酶谱 图，上方为蛋白印迹图，中间为内参(GAPDH)，下方为明胶酶谱图；
[0046] 图7C为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化ead)中MMP-9的蛋白相对表达量图 (protein relative e邱ression)，纵坐标表示蛋白相对表达量，横坐标表示天数，单位为 Day；
[0047] 图7D为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化eart)中MMP-9的蛋白相对活性图（protein relative activity)，纵坐标表示蛋白相对表达量，横坐标表示天数，单位为化y;
[0048] 图8为不同药物处理方式对小鼠 MI术后M2相关细胞因子表达情况的影响图；
[0049] 图中，图8A为小鼠 MI术后1、3、7、14天各组屯、脏化ead)中血管内皮生长因子 (VEGF)，转化生长因子m(TGF-f31)和白细胞介素10(比-10)的mRNA水平图，纵坐标表示Δ Ct =目的基因 Ct值一管家基因 Ct值，Ct值:C代表切cle，t代表thresholcUCt值的含义是每个 反应管内的目的DM实时监测扩增时的巧光强度达到指数扩增时的循环数，单位为2X103， 横坐标表示天数，单位为化y;
[0050] 图8B为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中CD31的免疫巧光图，其中白色为CD31;
[0051 ] 图8C为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中a-SMA的免疫组化图，其中黑色为a-SMA;
[0052] 图8D为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中I型胶原的免疫组化图，其中黑色为I型胶 原；
[0053] 图8E为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏的苦味酸天狼星红染色图，其中白色为提高梗 死区修复质量的相关胶原；
[0化4] 图8F为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中毛细血管数目（capilla巧numbers)，纵坐 标表示毛细血管数目，单位为个/mm2，横坐标表示天数，单位为化y;
[0055] 图8G为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中a-SMA所占比例（％ )，纵坐标表示a-SMA所占 比例，单位为％，横坐标表示天数，单位为化y;
[0化6] 图細为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中I型胶原所占比例（％ )，纵坐标表示I型胶原 所占比例，单位为％，横坐标表示天数，单位为化y;
[0057] 图81为小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中提高梗死区修复质量相关胶原所占比例 (% )，纵坐标表示提高梗死区修复质量相关胶原所占比例，单位为％，横坐标表示天数，单 位为化y。
【具体实施方式】
[0058] 为了更好地解释本发明，W下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于W下实施例。
[0化9](一）屯、梗(MI)手术及分组 [0060] 1、实验对象
[0061 ] 300只8~10周龄巧7BL/6雄性小鼠，体重22~25g，购于北京大学动物中屯、（由美国 Jackson实验室引进繁殖），依照2011年美国国家科学院所颁布的《实验动物饲养和使用指 南》，动物饲养于华中科技大学动物实验中屯、SPF级实验动物房；
[0062] 2、手术及分组
[0063] 假手术组/Sham组:按照MI小鼠模型方法，只穿线不结扎，样本为6只；
[0064] 屯、梗组/MI组：按照MI小鼠模型方法，结扎冠状动脉左前降支，随机分为W下3组， 每组样本为12只，MI对照组即PBS组(con化〇1) ;MI干预组即托化醋干预组(topiramate)和 荷包牡丹碱干预组(bi州州lline);
[0065] 3、给药剂量、频率及途径
[0066] 剂量:PBS 8mL/Kg、托化醋35mg/Kg、荷包牡丹碱2mg/Kg;
[0067] 频率:MI术后6小时开始给药，每24小时给药一次；
[0068] 途径:腹腔注射。
[0069] (二)托化醋对小鼠 MI术后生存率及屯喧破裂率的影响
[0070] 1、材料
[0071] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0072] 1.2实验仪器:小动物呼吸机(AL-V8S，上海奥尔科特生物技术有限公司，中国）、小 动物手术器械(上海医疗器械厂，中国）、小动物屯、电图（Bk420F生物机能实验系统）；
[0073] 2、动物及手术分组：
[0074] Siam 组：6只，Control 组：12只，
[0075] Topiramate 组：12 只，Bi 州州 lline 组：12 只；
[0076] 3、实验步骤
[0077] 1)于MI术后每天记录各组小鼠的生存数量至14天，统计并通过Kaplan-Meier生存 分析和Log-rank检验，绘制Kaplan-Meier生存曲线；
[0078] 2)于MI术后每天观察各组小鼠的死亡情况并进行尸体解剖死因分析，记录屯、室破 裂数量至14天，统计并通过Fisher检验，绘制屯、室破裂率曲线；
[0079] 3)统计学分析：
[0080] 数据W均数±标准误表示，采用Kaplan-Meier生存分析、Log-rank检验和Fisher 检验，m组与sham组相比有统计学意义，呼《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意 义，*P《0.05;
[0081] 四、实验结果
[0082] 如图1A所示，与sham组比较，MI组各组MI术后生存率均下降，与MI对照组相比，托 化醋干预组MI术后生存率上升33.33 % (80.0 %比60.0 % )，荷包牡丹碱干预组MI术后生存 率下降(44.4% 比 60.0%);
[0083] 如图1B所示，与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后屯、室破裂率下降80.56% (11.1 %比57.1 % )，荷包牡丹碱干预组MI术后屯、室破裂率上升(88.0 %比57.1 % );
[0084] 由图1A和图1B结合分析可知:托化醋降低小鼠 MI术后屯、室破裂率，增加生存率。
[0085] (Ξ)托化醋对小鼠 MI术后屯、功能的影响
[0086] 1、材料
[0087] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0088] 1.2实验器材:小动物超声仪(Vevo2100型，Visualsonics，加拿大）
[0089] 2、动物及手术分组：
[0090] Siam 组：6只，Control 组：12只，
[0091 ] Topiramate 组：12只，Bi 州州 lline 组：12只；
[0092] 3、实验步骤
[0093] 3.1超声检测实验步骤
[0094] 1)于MI术后14天，麻醉小鼠，置于加热垫上，维持溫度36.5到37.5°C ;
[0095] 2)通过小动物超声仪检测B型超声和乳头肌及屯、尖水平的Μ型超声，记录各组小鼠 屯、率(皿），左室舒张末期内径化VIDED)、左室收缩末期内径化VIDES)、前壁厚度(AW)、后壁 厚度(PW)和左室内径(LVD)等；
[0096] 3)计算各组小鼠缩短分数FS( % ) = [(LVID抓-LVIDESVLVIDED] X 100%，射血分 数LVEF( % )=[化DV-ESV)/邸V] X 100%，比较各组小鼠屯、脏功能差异；
[0097] 4)统计学分析：
[0098] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0099] 3.2血流动力学检测实验步骤
[0100] 1)将上述小鼠行颈动脉插管；
[0101] 2)通过化werlab系统检测各组小鼠左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压化VEDP)，左 室压力最大上升速率(+化/dtmax)和左室压力最小下降速率(-化Mtmax)等，比较各组小鼠屯、 脏功能差异；
[0102] 3)统计学分析：数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行 8〇]^日祥〇]1；[两两比较检验，]\0组与311日1]1组相比有统计学意义，呼《0.05，]\0干预组与11对照 组相比有统计学意义，*P《〇.05;
[0103] 如图2A所示:小鼠MI术后14天各组B型超声图，
[0104] 如图2B所示：小鼠 MI术后14天各组乳头肌(Mid)水平Μ型超声图，其中实线表示舒 张期，虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；
[0105] 如图2C所示:小鼠 ΜΙ术后14天各组屯、尖(Apical)水平Μ型超声图，其中实线表示舒 张期，虚线表示收缩期，箭头表示左室内径；
[0106] 如表1所示：与sham组比较，ΜΙ组各组ΜΙ术后第1天EF、FS减少，EDV、ESV增加，屯、率 没有统计学差异；
[0107] 如表2所示:与sham组比较，MI组各组MI术后第14天EF、FS减少，EDV、ESV增加，屯、率 没有统计学差异，与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第14天E巧曽加22.49 %、Papi 11a巧 FS增加32.75%，ApicalFS增加24.92%，EDV、ESV减小，荷包牡丹碱干预组结果相反;MI组 各组MI术后第14天屯、率没有统计学差异；
[0108] 如表3所示：与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第14天LVDEP减少40.23 %， LVSP增加11.02%、+化Altmax、-化Altmin增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0109] 由图2A~C和表1~3结合分析可知:托化醋提高了小鼠MI术后的屯、功能；
[0110] Table 1.Echoc曰rdiogr曰phic parameters on day 1 post MI
[0111] 表1小鼠 MI术后第1天超声参数表
[0112]
[0113] 注:为射血分数，EDV为左室舒张末期容积，ESV为左室收缩末期容积，Papil la巧 FS为乳头肌水平缩短分数，Apical FS为屯、尖水平缩短分数，HR为屯、率;MI组与sham组相比 有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P《0.05
[0114] Table 2.Echoc曰rdiogr曰phic parameters on day 14 曰fter MI
[0115] 表2小鼠MI术后第14天超声参数表
[0116]
[0117] 注:为射血分数，EDV为左室舒张末期容积，ESV为左室收缩末期容积，Papil la巧 FS为乳头肌水平缩短分数，Apical FS为屯、尖水平缩短分数，HR为屯、率;MI组与sham组相比 有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，午《0.05
[0118] Table 3.Hemodynamics on day 14 post MI
[0119] 表3小鼠 MI术后第14天血流动力学参数表
[0120]
[0121] 注:LVSP为左室收缩压，LVDEP为左室舒张末压，+化/dtmax表示左室压力最大上升 速率，-化/dtmin表示左室压力最大下降速率;MI组与sham组相比有统计学意义，#P《0.05， MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，中《0.05
[0122] (四）托化醋对小鼠 MI术后屯、脏形态的影响
[0123] 1、材料
[0124] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS; 1.2其他试剂:水合氯醒、PBS、肝素、多 聚甲醒、石蜡；
[01巧]2、动物及手术分组：
[0126] 化 am 组：6只，Control 组：12只，
[0127] Topiramate 组：12 只，Bi 州州 lline 组：12 只；
[012引 3、实验步骤
[0129] 1)于MI术后14天，麻醉小鼠，屯、尖注射ImLlO%氯化钟，使屯、脏停在舒张期；
[0130] 2)迅速取出屯、脏，用预冷的PBS和肝素冲洗干净；
[0131] 3)沿结扎线结下方横切，取屯、室组织，置于4%多聚甲醒中，固定24小时，石蜡包 埋；
[0132] 4)左屯、室石蜡包埋切片，从线结下方每间隔500μπι留取一张贴片，约扣m/片，共计4 张，记为0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm，进行 Masson染色；
[0133] 5)计算各组小鼠屯、脏梗死面积（％ )=总梗死面积/左屯、室周长X 100%;胶原密度 (% )=胶原面积/左屯、室容积X 100%，比较各组小鼠屯、脏形态差异；
[0134] 4、统计学分析：
[0135] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0136] 如图3A所示：小鼠 MI术后14天各组屯、脏Masson染色图（低倍镜），图中灰色区域为 正常屯、肌组织，黑色区域为梗死区；
[0137] 如图3B所示：小鼠 MI术后14天各组屯、脏Masson染色图（高倍镜），图中灰色区域为 正常屯、肌组织，黑色区域为梗死区胶原；
[0138] 如图3C所示：与sham组比较，MI组MI术后14天屯、脏梗死面积增加，与MI对照组相 比，1.5mm，2.0mm层面托化醋干预组MI术后14天屯、梗面积分别减少21.85%和22.4%，荷包 牡丹碱干预组屯、梗面积增加；
[0139] 如图3D所示：与sham组比较，MI组屯、脏梗死区胶原密度增加，与MI对照组相比，托 化醋干预组屯、脏梗死区胶原密度增加22.90%，荷包牡丹碱干预组屯、脏梗死区胶原密度减 少；
[0140] 由图3A~图3D结合分析可知：托化醋通过减少MI后梗死面积，增加梗死区胶原密 度，减轻MI后左室重塑。
[0141] (五)免疫细胞上托化醋作用受体的表达检测
[0142] 1、材料
[0143] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0144] 1.2其他试剂：青霉素、链霉素、肝素、PBS、台氏液(mmol/UNaCl 135，KC1 5.4， MgCb 1.0，CaCl2 1.8，化出P〇4 0.33,肥阳S 5.0,葡萄糖10.0,充分混匀，用PH仪调节PH值 至7.4)、无巧液（臟〇1/1:胞(：1120，1((：114.7，1(出口〇4〇.6，胞2册〇4〇.6，]\%5〇4-7出0 1.2，船 肥口68 1〇，化肥〇3 4.6、1日111'；[]10 3〇，13111:日]16(1;[0]10 1]1〇]1〇^;;[1116 10，邑111。036 5.5，充分混匀， 用抑仪调节抑值至7.4KDMEM培养基、DMEM/12培养基、MEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛 血清、胶原酶Π 、膜蛋白酶、Dispasell、牛血清白蛋白、谷氨酷胺、Trizol、氯仿、异丙醇、琼 脂糖、了46、旨01(1￥16讯等；
[0145] 1.3实验器材:Heal Force超净工作台（力康公司，中国）、化曰1 Force超纯水系统 (力康公司，中国）、化ermo二氧化碳培养箱（Thermo公司，美国）、HIRAYAMA HVE-50灭菌器 (平山公司，日本）、低溫高速离屯、机化ppendo计公司，德国）、化ermo IEC化3R低溫离屯、机 (Thermo公司，美国）、台式高速离屯、机TGkl6G(上海精密仪器仪表有限公司，中国）、L8-M型 低溫超高速离屯、机(Beckman公司，美国）、细胞计数板XB-K-25(玉环求精医用仪器厂，中 国）、紫外仪WD-9403F(北京市六一仪器厂，中国）、紫外分光光度计72-1 (上海浦东荣丰科学 仪器有限公司，中国）等
[0146] 2、细胞分离及培养
[0147] 腹腔巨隧细胞、乳鼠屯、肌细胞、乳鼠屯、肌成纤维细胞、成鼠屯、肌细胞、成鼠屯、肌内 皮细胞、单核细胞、CD4+T细胞
[0148] 3、实验步骤
[0149] 3.1细胞分离与培养
[0150] 3.1.1腹腔巨隧细胞分离培养
[0151] 1) C57化/6小鼠腹腔注射3 %硫胶质4天；
[0152] 2)麻醉小鼠，无菌条件下腹腔注射含有青霉素、链霉素和肝素的PBS，用21号针头 注射器吸出液体；
[0153] 3)室溫下离屯、，200g，lOmin;
[0154] 4)弃上清，重悬细胞，计数，调整细胞密度为IX ΙΟ6/孔，接种入含有10%胎牛血清 和1 %青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于5%C〇2，37°C培养箱静置培养；
[0155] 5)化后弃非贴壁细胞，贴壁细胞继续培养至铺满培养板；
[0156] 3.1.2乳鼠屯、肌细胞和乳鼠屯、肌成纤维细胞分离培养
[0157] 1)取1或2日龄的巧7BL/6乳鼠麻醉；
[0158] 2)无菌条件下迅速开胸摘取屯、脏，PBS冲洗干净，眼科剪剪碎屯、肌组织；
[0159] 3)37Γ下，置于含有0.06%(W/V)膜蛋白酶和0.025%(巧八)胶原酶11的无巧化证8 缓冲液中震荡消化；
[0160] 4川欠集消化液，加入含有10 %胎牛血清的DMEM培养基终止消化；
[0161] 5)上述3.4步骤不断重复直至组织完全被消化；
[0162] 6)消化液通过40皿滤网过滤，收集滤液，室溫下离屯、，100g，10min;
[0163] 7)弃上清，重悬细胞，接种于含有10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的培养板中， 于5 % C〇2，37 °C培养箱静置培养；
[0164] 8)90分钟后取非贴壁细胞即屯、肌细胞，计数，调整细胞密度为3X105/孔，接种入 含有10%胎牛血清和1 %青霉素、链霉素的DMEM培养基中，加入漠脱氧尿巧，培养3天直到使 用；
[0165] 9)贴壁细胞即屯、肌成纤维细胞继续培养4至6天；
[0166] 3.1.3成鼠屯、肌细胞分离培养
[0167] 1)取8~10周龄的雄性巧7BL/6小鼠麻醉；
[0168] 2)无菌条件下迅速开胸摘取屯、脏，置于含有120mmol/L NaCl，14.7mmol/L KC1， 0.6mmol/L KH2P〇4,0.6mmol/L Na2册〇4，1.2mmol/L MgS〇4-7出0，10mmol/L 化皿PES、 4.6mmol/L NaHC〇3、30mmol/L taurine，lOmmol/L butanedione monoxime，5.5mmol/L glucose的无巧灌流缓冲液中冲洗干净，清理残余肺叶及多余组织；
[0169] 3)用22号灌流针迅速行主动脉插管，将屯、脏悬于Langendo计f灌流装置上，W37 °C，110cm出0恒溫恒压下行恒流逆行灌流；
[0170] 4)无巧缓冲液灌流4min，3mL/min;
[0171] 5)无巧缓冲液中加入胶原酶Π ，灌流lOmin;
[0172] 6)消化缓冲液中加入化CI2至浓度为100ymol/L，灌注8~lOmin;
[0173] 7)取下屯、脏，置于2.5mL的消化液中，眼科剪剪碎屯、肌组织，轻轻揽拌至完全消化， 加入含有10%胎牛血清和12.化Cl2的无巧灌流液7.5mL终止消化；
[0174] 8)消化液通过40皿滤网过滤，收集滤液，室溫下离屯、，40g，3min;
[0175] 9)弃上清，重悬细胞，分四次逐步增加化CI2浓度直到
[0176] 10)计数，调整细胞密度为1 X lOVcm2，接种入含有5%胎牛血清，1 %青霉素-链霉 素的MEM培养基的粘连蛋白包被的培养皿中，于5 % C〇2，37 °C培养箱静置培养；
[0177] 11)化后更换为含有Img/mL牛血清白蛋白和2mM谷氨酷胺的MEM培养基，每4化换液 一次；
[0178] 3.1.4成鼠屯、肌成纤维细胞分离培养
[0179] 1)取8~10周龄的雄性巧7BL/6小鼠麻醉；
[0180] 2)无菌条件下迅速开胸摘取屯、脏，用PBS冲洗干净；
[0181] 3)置于抑7.2的预冷K皿缓冲液中，眼科剪剪碎屯、肌组织；
[0182] 4)加入0.1 %膜蛋白酶和胶原酶Π 50U/mL，37°C下不断揽拌；
[0183] 5)消化液通过40皿滤网过滤，收集滤液，室溫下离屯、，200g，5min;
[0184] 6)弃上清，重悬细胞，计数，调整细胞密度为5 X 10^孔，接种入含有10 %小牛血清 和1 % PS的DMEM培养基中，于5 % C〇2，37 °C培养箱静置培养；
[0185] 7)化后弃非贴壁细胞，培养于含有10 %胎牛血清、1 %青霉素-链霉素和lOng/mL成 纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中，直到7~10天铺满细胞板；
[0186] 3.1.5成鼠屯、肌内皮细胞分离培养
[0187] 1)取8~10周龄的雄性巧7BL/6小鼠麻醉；
[0188] 2)无菌条件下迅速开胸摘取屯、脏，用PBS冲洗干净；
[0189] 3)置于含有500U/mL胶原酶II，0.6u/mL Dispase Π 和1 %BSA的化nk' S平衡盐溶液 中，在37°C轻轻震荡45~60min;
[0190] 4)消化液通过40皿目滤网过滤，收集滤液，室溫下离屯、，400g，5min;
[0191] 5)弃上清，重悬细胞，用抗CD31抗体解育，经过磁珠分选；
[0192] 6)将细胞置于含有10%胎牛血清，l%P-S，50yg/mL的内皮细胞生长因子和2mM谷 氨酷胺的DMEM培养基中，每3天换液一次；
[0193] 3.1.5单核细胞分离培养
[0194] 1)取8~10周龄的雄性巧7BL/6小鼠麻醉，
[01M] 2)无菌条件下迅速开腹摘取脾脏，用PBS冲洗干净；
[0196] 3)置于含有1%FBS皿SS的培养皿中，使用注射器忍研磨脾脏到无肉眼可见的组 织团块；
[0197] 4)细胞悬液通过40皿目滤网过滤，收集滤液，室溫下离屯、，400g，lOmin;
[0198] 5)弃上清，加入红细胞裂解液，用含1 %胎牛血清的皿SS洗涂两次；
[0199] 6)用抗CDUb抗体解育，通过磁珠分选，将得到的溶液离屯、300g，5min，
[0200] 7)弃上清，重悬细胞，调整细胞密度为5X106/孔，接种入含有10%FBS和1%PS的 RPMI-1640培养基中；24h后换液一次；
[0201] 3.1.6 CD4+T细胞分离培养
[0202] 1)小鼠脾脏单个核细胞悬液和红细胞去除如上所述；
[0203] 2)用抗CD4抗体解育，通过磁珠分选细胞；
[0204] 3)调整细胞密度为1 X 106/孔，接种入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中， 24h后换液一次；
[02化]3.2逆转录-聚合酶链反应(31'斗〇0
[0206] 1)分别取脑组织，屯、肌组织及上述培养细胞于高压灭菌的研磨器中，加入 ImLTrizol，冰上匀浆；
[0207] 2川欠集裂解液到1.5mL高压灭菌去RNAase的EP管中，加入0.2mL氯仿，上下倒置EP 管，使两种液体充分混合即呈粉色乳液状，常溫静置至分层；
[0208] 3)12000r/min，15min，4°C 离屯、；
[0209] 4)离屯、后混合物分为；层:上层无色水相为RNA层，中层白色膜状为DNA层，下层粉 红色酪-氯仿相为蛋白质层，分次小屯、吸取无色水相层(400~6(Κ)μυ至新的EP管中，加入等 体积的冰浴异丙醇上下倒置混匀，常溫静置10~15min; 惦10] 5)12000;r/min，10min，4°C 离屯、；
[0211] 6)离屯、后应可见EP管侧壁附有白色膜状物即为RNA，小屯、吸弃上清液。加入冰浴无 水乙醇ImL，轻柔震荡洗涂；
[0212] 7)50〇1'/111；[]1，5111；[]1，4°[离屯、；
[0213] 8)吸弃上清液，避免误吸管侧壁附着的白色膜状RNA;
[0214] 9)每管加入1祉L去RNAase水，溶解RNA;
[0215] 10)取化L RNA加入99化去RNAase的蒸馈水，采用紫外分光光度仪测0D260、0D280 数值，通过0D260/0D28化k值评价RNA纯度；
[021 W 11)计算RNA浓度，按照PrimeScript反转录试剂盒使用说明书，在冰上配制反转录 体系并进行反转录反应；
[0217] 12)按照化kara化q TM试剂盒说明，冰上配制PCR反应体系并进行PCR扩增程序；
[0218] 13)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，配制1.5%的琼脂糖凝胶：0.9g琼脂糖溶于 60mL TAE中，加入goldview 3.化L，摇匀沸腾后倒入制模板自然冷却；
[0219] 14)扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，加样量为化L，电泳120V，电泳完毕后在 紫外灯下观察结果并照相。
[0220] 如图4A所示:小鼠屯、脏组织和脾脏巨隧细胞表达GABAa受体αι亚基，屯、肌细胞、屯、肌 成纤维细胞、屯、肌内皮细胞不表达GABAa受体αι亚基；
[0221] 如图4Β所示:小鼠屯、脏组织和脾脏巨隧细胞表达GABAa受体抗亚基，屯、肌细胞、屯、肌 成纤维细胞、屯、肌内皮细胞不表达GABAa受体抗亚基；
[0222] 如图4C所示：单核细胞和CD4+T细胞表达GABAa受体αι亚基，巨隧细胞表达GABAa受 体αι和03亚基；如图4D所示：单核细胞和CD4+T细胞表达GABAa受体日1亚基，巨隧细胞表达 GABAa雙体〇1和03亚基。
[0223] 由图4A~图4D结合分析可知:托化醋在巧7小鼠的屯、脏组织中，特异性地作用于巨 隧细胞上GABAa受体的抗亚基。
[0224] (六)托化醋对小鼠 MI术后单核细胞生成的影响
[0225] 1、材料
[02%] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0227] 1.2其他试剂:PBS、淋己细胞分离液、台酪蓝、抗Ly6C、CDUb抗体等；1.3实验器材： 容声冰箱BCD-575WYM(容声公司，中国）、化ermo化rma-86°C冰箱(Thermo公司，美国）、低溫 高速离屯、机化ppendorf公司，德国）Jhermo IEC化3R低溫离屯、机（Thermo公司，美国）、台 式高速离屯、机TGレ16G(上海精密仪器仪表有限公司，中国）、L8-M型低溫超高速离屯、机 (Beckman公司，美国）、细胞计数板XB-K-25 (玉环求精医用仪器厂，中国）等；
[0228] 2、动物及手术分组：
[0229] Siam 组：6只，Control 组：12只，
[0230] Topiramate 组：12 只，Bi 州州 lline 组：12 只；
[0231] 3、实验步骤
[0232] 3.1小鼠外周血单核细胞流式检测 [023引1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；
[0234] 2)通过屯、脏穿刺收集外周血1.5mL，加入到含有50mM邸TA抗凝管中；
[02巧]3)分别于室溫下静置化，4°C下静置lOmin，室溫下离屯、，400g，25min;
[0236] 4)离屯、后，血液分为Ξ层，弃上层淡黄色澄亮血清，加入PBS到1.5mL重悬；
[0237] 5)将细胞悬浮液轻轻加入到事先盛有1.5mL淋己细胞分离液的10ml无菌离屯、管 中，使细胞悬液位于淋己分离液上层，室溫下Ficol 1密度梯度离屯、400g，25min;
[0238] 6)离屯、后，液体分为Ξ层，取中间淡黄色云雾状层为淋己细胞层，转移入lOmL无菌 离屯、管中，室溫下离屯、，300g，8min，弃上清液，PBS洗涂一次，得到细胞悬浮液；
[0239] 7)台吩蓝检测分离细胞的活性大于97%。细胞计数，调整细胞密度为lOVmL;
[0240] 8)4°C下抗Ly6C、CDUb抗体避光解育30分钟，PBS洗涂两次；
[02川 9)通过流式细胞术检ii，分析各组小鼠 Ly6Chigh型（CD1 lb+Ly6C+)和Ly6Ci°w型 (CDUb+Ly6C-)单核细胞所占比例；
[0242] 10)统计学分析：
[0243] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0244] 3.2小鼠脾脏单核细胞流式检测
[0245] 1)无菌条件下将上述小鼠迅速开腹摘取脾脏，置于平皿中，加入3mLPBS;
[0246] 2)脾脏置于40WI1滤网上，用注射器末端研磨脾脏直至无肉眼可见的组织，收集网 下细胞于培养皿中，再次40皿滤网过滤，PBS冲洗滤网；
[0247] 3)收集淡红色脾细胞悬液于lOmL无菌离屯、管中，4°C下离屯、，300g，8min;
[0248] 4)弃上清液，加入3mlPBS，重悬，将细胞悬浮液轻轻加入到事先盛有3ml淋己细胞 分离液的10ml无菌离屯、管中，使细胞悬液位于淋己分离液上层，室溫下Ficoll密度梯度离 屯、400g，25min;
[0249] 5)步骤同外周血单核细胞表型检测的6.7.8.9
[0250] 6)统计学分析：
[0251] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0252] 3.3小鼠骨髓单核细胞流式检测
[0253] 1)无菌条件下将上述小鼠的股骨迅速剥离，剔除多余组织，PBS冲洗干净，剪去干 號端；
[0254] 2)将股骨置于3mLPBS中，用ImL注射器吹出骨髓并将其吹散；
[0巧日]3)收集淡红色骨髓细胞悬液于lOmL无菌离屯、管中，4°C下离屯、，300g，8min;
[0256] 4)步骤同前;5)统计学分析：
[0257] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[025引3.4酶联免疫吸附实验化LISA)
[0259] 1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；
[0260] 2)通过屯、脏穿刺收集外周血，加入50mM邸TA抗凝；
[0%1] 3)分别于室溫下静置化，4度下静置lOmin，析出上层的淡黄色澄亮血清；
[0262] 4川欠集上清液，根据说明书检测血清中IL-Ιβ水平；
[0%3] 5)统计学分析：
[0264]数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[02化]3.5实时定量聚合酶链反应(9脚斗〇0
[0266] 1)根据上述方法分别提取屯、脏，脾脏，骨髓和血清RNA;
[0267] 2)照PrimeScript反转录试剂盒使用说明书，在冰上配制反转录体系并进行反转 录反应；
[0%引 3)按照SYBR Green MasteH式剂盒使用说明书，配制PCR反应体系，使用CFX96实时 定量系统进行测定；
[0269] 4)利用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件获取并分析样本化-ie、MCP-l及内参的Ct 值；
[0270] 5)计算方法:待测样品mRNA相对值=
[0271] ACt=目的基因 Ct值一管家基因 Ct值
[0272] Ct值:C代表切cle，t代表thresholcLCt值的含义是每个反应管内的目的DNA实时 监测扩增时的巧光强度达到指数扩增时的循环数；
[0273] 6)统计学分析：
[0274] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0275] 如图5A所示：与MI对照组相比，托化醋和荷包牡丹碱干预组MI术后对脾脏中两型 单核细胞的变化趋势没有影响，目化ySChigh单核细胞均在屯、梗后第3天达峰，Ly6Ci?单核细 胞均在屯、梗后第7天达峰；与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后降低脾脏Ly6Chigh单核细 胞数目，MI术后第3、7天分别降低8.64%(11.42±0.35 X 105比12.50±0.20 X 105)和 12.05 % (8.83 ± 0.29 X 1〇5比10.04 ± 0. ：34 X 1〇5)，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0276] 如图5B所示：与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后降低外周血中Ly6Chigh单核细 胞数目，MI 术后第3、7 天分别降低 18.84%(3.49±0.23X 104比4.30±0.21X104)和21.77% (3.09 ±0.21 Xl〇4比3.95 ±0.21 Xl〇4);荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0277] 如图5C所示：与MI对照组相比，托化醋和荷包牡丹碱干预组MI术后不改变骨髓中 单核细胞总数和Ly6Chigh单核细胞数目.
[0278] 如图加所示:与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天IL-Ιβ水平增加;与MI对照 组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天屯、脏、外周血、骨髓、脾脏中IL-Ιβ水平降低，荷包牡丹 碱干预组结果相反；
[02巧]如图祀所示:与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天MCP-1水平增加，但MI组各 组之间MCP-1水平没有统计学差异；
[0280] 由图5A~图5E结合分析可知:托化醋调节小鼠 MI后的脾脏单核细胞生成。
[0281] (屯)托化醋对小鼠 MI术后巨隧细胞极化的影响
[0282] 1、材料
[0283] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0284] 1.2其他试剂:PBS、淋己细胞分离液、台酪蓝、抗F4/80、CD 11C、CD4、IFN- 丫、IL-4抗 体等；
[0285] 1.3实验器材：容声冰箱BCD-575WYM(容声公司，中国）、Thermo Forma-86°C冰箱 (Thermo公司，美国）、低溫高速离屯、机化ppendcrf公司，德国）、The;rmo IEC化3R低溫离屯、 机(Thermo公司，美国）、台式高速离屯、机TGkl6G(上海精密仪器仪表有限公司，中国）、L8-M 型低溫超高速离屯、机(Beckman公司，美国）、细胞计数板XB-K-25(玉环求精医用仪器厂，中 国）等；
[02化]2、动物及手术分组：
[0287] Siam 组：6只，Control 组：12只，
[0 巧引 Topiramate 组：12 只，Bi 州州 lline 组：12 只；
[0289] 3、实验步骤
[0290] 3.1小鼠屯、梗局部两种巨隧细胞流式检测
[0291] 1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；
[0292] 2)无菌条件下迅速开胸摘取屯、脏，PBS冲洗干净，剪取包括梗死边缘区在内的梗死 屯、脏组织并剪碎；
[0293] 3)置于含有450U/mL胶原酶I，12抓/mL胶原酶XI，60U/ml面ase巧日60U/mL的透明 质酸酶中37°C震荡化；
[0巧4] 4)通过40皿滤网过滤，收集滤液，4°C下离屯、，400g，10min;
[0295] 5)弃上清，加入PBS重悬，将细胞悬浮液轻轻加入到事先盛有1.5mL淋己细胞分离 液的10ml无菌离屯、管中，使细胞悬液位于淋己分离液上层，室溫下Ficoll密度梯度离屯、 400g，25min;
[0296] 6)离屯、后，液体分为Ξ层，取中间淡黄色云雾状层为淋己细胞层，转移入10ml无菌 离屯、管中，室溫下离屯、，300g，8min，弃上清液，PBS洗涂一次，得到细胞悬浮液；
[0297] 7)台吩蓝检测分离细胞的活性大于97%。细胞计数，调整细胞密度为lOVmL;
[0巧引 8) 4Γ下抗F4/80、CD11C抗体避光解育30分钟，PBS洗涂两次；
[0巧9] 9)通过流式细胞术检测，分析各组小鼠 Ml型M〇(F4/80+CDllc+)和M2型M〇(F4/80+ CDllc-)所占比例；
[0300] 10)统计学分析：
[0301] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0302] 3.2小鼠外周两型T细胞流式检测：
[0303] η收集上述脾脏单个核细胞悬浮液，计数，调整细胞密度为lOVmL;
[0304] 2)4°C下抗CD4抗体避光解育30分钟，PBS洗涂两次，室溫下离屯、，300g，8min;
[0305] 3)弃上清液，重悬细胞，接种于6孔板，加入cocktai 1刺激，37 °C下解育4h，收集细 胞；
[0306] 4)常溫下离屯、，300g，8min，PBS洗涂两次；
[0307] 5)每管加入50化1细胞固定液，静置30min;室溫下，离屯、300g，8min;
[0308] 6)弃上清液，加入50化L细胞破膜液，静置5min;室溫下，离屯、300g，8min，重复操 作，共破膜两次；
[0309] 7)弃上清液，PBS洗涂两次，重悬细胞，4°C下抗IFN- 丫、比-4抗体避光解育30分钟， PBS洗涂两次；
[0310] 8)通过流式细胞术检测，分析各组小鼠 Thl(CD4+IFN-丫+)和Th2(CD4+化-4+)所占 比例。
[0311] 9)统计学分析：
[0312] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0313] 如图6A所示：与MI对照组相比，托化醋和荷包牡丹碱干预组MI术后对脾脏中两型 单核细胞的变化趋势没有影响，即Ml型巨隧细胞均在屯、梗后第3天达峰，M2型巨隧细胞均在 屯、梗后第7天达峰，与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天Ml型巨隧细胞数目或百 分比降低，分别为 0.61±0.07X 103比0.88±0.07X 103/47.02±3.43%比66.25±1.31%， 0.53±0.05 Xl〇3比0.75±0.06X 10^/:34.38±1.92%比48.61 ±2.79%，托化醋干预组MI术 后第3、7天M2型巨隧细胞数目或百分比增加，分别为0.67 ±0.06 X 103比0.47 ±0.06 X 10^ 52.98±3.43%比33.75±1.31%，0.98±0.06X 103比0.78±0.05X10シ65.62±1.92%比 51.39 + 2.79%，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0314] 如图6B所示：为小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏（head)中巨隧细胞（F4/80 + macrophages)的总数，纵坐标为细胞数目，单位为1 X 103个，横坐标为天数，单位为化y，与 MI对照组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天不改变屯、脏中巨隧细胞总数；
[0315] 如图6C所示：与sham组相比，MI组各组术后第1、3、7天巨隧细胞的总数增加;但MI 组各组之间巨隧细胞总数没有统计学差异；
[0316] 如图抓所示：与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天Th2细胞数目增加，荷 包牡丹碱干预组结果相反；
[0317] 如图6E所示：与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天组GATA3的mRNA水平 增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0318] 如图6F所示：与MI对照组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天托邮醋或者荷包牡丹碱 干预组不改变脾脏中化1细胞数目；
[0319]由图6A~图6F结合分析可知:托邮醋促进小鼠 MI后巨隧细胞向M2型分化。
[0320] (八)托化醋对小鼠 MI术后Ml型相关细胞因子表达的影响
[0321] 1、材料
[0322] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0323] 1.2 RT-PCR相关试剂:Trizol、氯仿、异丙醇、琼脂糖、TAE、goldview;
[0324] western blot相关溶液:A液(30%丙締酷胺储存液，100血）：丙締酷胺29.2g，双丙 締酷胺0.8g，纯水充分溶解并定容至lOOmL，4°C避光保存;B液(4 X分离胶缓冲液，lOOmL): Tris-Base 18.165g，SDS 0.4g，纯水充分溶解并定容至100mL，HCl调节pH值至8.8,4°C保 存;C液(4 X浓缩胶缓冲液，lOOmL): Tris-Base 6.005g，SDS 0.4g，纯水充分溶解并定容至 1 OOmL，肥1调节pH值至6.8，4 °C保存；10 % AP的配制:AP 1 g，纯水10血，充分混匀，4 °C可W保 存一周；电泳缓冲液（10 X )的配制:Tris-Base 15g，甘氨酸72g，SDS 5g，纯水充分溶解并定 容至500血，调节抑值至8.3，4°C保存;转膜缓冲液（10 X )的配制:Tris-Base 9.65g，甘氨酸 45g，纯水充分溶解并定容至500mL，调节抑值至8.1~8.4，4°C保存，使用时稀释为1 X转膜 缓冲液，加入20 %的甲醇；5 X SDS上样缓冲液的配制：Tris-Base (pH 6.8 )0.6mL，β-琉基乙 醇0.5mL，SDS 0.2g，漠酪蓝0 . Olg，甘油2.5mL，纯水充分溶解并定容至lOmL，调节pH值至 6.8，-20°C保存;Tris缓冲盐溶液(TBS，10 X )的配制:化Cl 43.875g，Tris-Base 6.055g，纯 水充分溶解并定容至500mL，调节抑值至7.5，4°C保存;0.3 % TBS-T缓冲液的配制：1 X TBS缓 冲液1 OOOmL，Tween-20 3mL，充分混匀后，置于4°C保存;封闭液的配制:0.3 %TBS-T缓冲液 1 OOmL，脱脂奶粉5g，充分混匀后，4 °C保存；
[03巧]明胶酶谱相关溶液：匀浆缓冲液(RIPA):Tris-肥1 Imol/L，化C1 0.5mol/L，调节 pH值至7.0;样本缓冲液（5*LB，100ml) :Tris 4.86g(0.4M)，SDS 5.0g(5%)，甘油20ml (20%)，化omo地enol blue 30mg(0.03%)，调节抑值至8.0;洗脱液IL Triton X-100 25ml (2.5%)，化13-肥16.06邑（50臟〇1/1)，〔曰(：12 0.56邑（5臟〇1/1)，化(：12 0.136邑（化111〇1/1)，调 节抑值至7.6;漂洗液:1'^3-肥16.06邑(50臟〇1/1)，化(：12 0.56邑巧臟〇1/1)，211(：12 0.136111邑 (1皿〇1/1)，调节抑值至7.6;解育液:化13-肥16.06邑(50臟〇1/1)，〔曰(：12 0.56邑巧111111〇1/1)， 2〇(：12 0.136111旨（化111〇1几），8'。'-35 0.2旨（0.02%)调节9制直至7.6;考马斯亮蓝染色液 (200mL):考马斯亮蓝R-2500.1 g，甲醇60mL，乙酸20mL，加去离子水至200ιΛ;脱色液A:甲醇 60mL(30%)，乙酸20mL(10%)，去离子水 120mL，脱色液B:甲醇40mL(20%)，乙酸20mL (1〇%)，去离子水14〇1^;脱色液。甲醇2〇1111(10%)，乙酸1〇1^(5%)，去离子水17〇1^;
[0326] 1.3实验器材：容声冰箱BCD-575WYM(容声公司，中国）、Thermo Forma-86°C冰箱 (Thermo公司，美国）、低溫高速离屯、机化ppendcrf公司，德国）、The;rmo IEC化3R低溫离屯、 机(Thermo公司，美国）、台式高速离屯、机TGkl6G(上海精密仪器仪表有限公司，中国）、L8-M 型低溫超高速离屯、机(Beckman公司，美国）、Type 70Ti转头（Beckman公司，美国）、紫外仪 WD-9403F(北京市六一仪器厂，中国）、紫外分光光度计72-1(上海浦东荣丰科学仪器有限公 司，中国）、ELX800型酶标仪(Bio-Tek公司，美国）、SYC-2101水平摇床(南京杨翔设备有限公 司）、满縱振荡器(深圳天南海北有限公司，中国）、电子pH计(Mettler-Toledo公司，瑞±) 等；
[0327] 2、动物及手术分组：
[032 引 Siam 组：6只，Control 组：12只，
[0329] Topiramate 组：12 只，Bi 州州 lline 组：12 只；
[0330] 3、实验步骤
[0331] 3.1 RT-PCR
[0332] 1)根据上述步骤检测屯、脏中TNF-a，比-6，MMP-9mRNA水平；
[0333] 2)统计学分析：
[0334] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0335] 3.2蛋白质印迹(western blotting)
[0336] 1)将上述得到的屯、脏C、D层面提取屯、肌组织的蛋白；
[0337] 2)提取的蛋白用BCA法测蛋白浓度；
[0338] 3)每孔取80yg蛋白上样于10%SDS聚丙締酷胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋 白至硝酸纤维素膜上；
[0339] 4)将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中室溫摇动封闭2.5小时，加^1:1000-抗4°C 解育过夜；
[0340] 5)用TBST洗膜3次，每次15min，加入K1000 OHRP标记羊抗兔二抗室溫解育化，TBST 洗膜3次，每次15min，浸入增强化学发光试剂，条带显色后暗室X线压片曝光30秒，洗片，烘 干；
[0%1] 6)统计数据并进行分析：
[0342]数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0：343] 3.2明胶酶谱
[0344] 1)分别于MI术后1、3和7天，麻醉小鼠；
[0345] 2)无菌条件下迅速开胸摘取屯、脏，PBS冲洗干净，剪取左屯、室梗死组织，于液氮中 迅速冷冻；
[0346] 3)取lOOmg的冷冻组织裂解得到蛋白匀浆液，4度下离屯、12000g，10min;
[0347] 4)每孔取80yg蛋白上样于含有Img/mL明胶的10%SDS聚丙締酷胺凝胶进行电泳， 电泳后用2.5%的TritonX-100在37度下冲洗凝胶2次，每次15min;
[0348] 5)凝胶在37Γ缓冲液（mmol/L:Tris Base 10、Tris-肥 1 40、化C1 200、CaCl2 10、 0.02%化。'35)中解育2地；
[0349] 6)0.25%(巧八)考马斯蓝3-250进行凝胶染色化；
[0350] 7)含有30%甲醇溶液、10%冰醋酸、60%水的脱色液脱色，扫描凝胶并拍照；
[0351] 8)统计数据并进行分析：
[0352] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0353] 如图7A所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天TNF-a、比-6、MMP-9mRNA水 平增加，与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天TNF-a、化-6、MMP-9mRNA水平下降， 荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0354] 如图7B所示：小鼠 MI术后1、3、7天各组屯、脏化eart)中MMP-9的western blot图和 明胶酶谱图，上方为样本western blot图，中间为内参(GAPDH)，下方为明胶酶谱图；
[(X3对如图7C所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天MMP-9蛋白表达水平增加， 与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天MMP-9蛋白表达水平减少，荷包牡丹干预组 结果相反；
[0巧6] 如图7D所示:与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7天MMP-9蛋白相对活性增加， 与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7天MMP-9蛋白相对活性减少，荷包牡丹干预组 结果相反；
[0357] 由7A~图7D结合分析可知:托化醋降低小鼠 MI后Ml相关细胞因子的表达并适当减 轻MI后多度的炎症反应强度。
[0358] (九)托化醋对小鼠 MI术后M2型相关细胞因子表达的影响
[0；359] 1、材料
[0360] 1.1实验药物:托化醋、荷包牡丹碱购自美国Sigma-Aldrich公司，托化醋溶于5% 的簇甲基纤维素溶液，荷包牡丹碱溶于0.01M的PBS;
[0361] 1.2其他试剂:抗CD31免疫巧光抗体、抗a-SMA、I型胶原α抗体、苦味酸天狼星红染 液等2、动物及手术分组：
[0362] Siam 组：6只，Control 组：12只，
[0363] Topiramate 组：12 只，Bi 州州 lline 组：12 只；
[0364] 3、实验步骤：
[03 化]3.1 RT-PCR
[0366] 1)根据上述步骤检测屯、脏中VEGF、TGF-化and比-10水平，
[0367] 2)统计学分析：
[0368] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0369] 3.2免疫组化和免疫巧光
[0370] 1)于11术后1、3、7和14天，麻醉小鼠；
[0371] 2)迅速取出屯、脏，用预冷的PBS和肝素冲洗干净；
[0372] 3)沿结扎线结下方横切，取屯、室组织，置于4%多聚甲醒中，固定24小时，石蜡包 埋；
[0373] 4)左屯、室石蜡包埋切片，约如m/片；
[0374] 5)通过抗CD31免疫巧光抗体，检测各组小鼠屯、脏组织切片梗死边缘区的高倍镜视 野中毛细血管数目，分析比较各组小鼠差异。
[0375] 6)通过抗a-SMA抗体，检测各组小鼠屯、脏组织切片梗死边缘区的高倍镜视野中肌 成纤维细胞数量，分析比较各组小鼠差异；
[0376] 7)通过抗I型胶原α抗体，检测各组小鼠屯、脏组织切片梗死局部的高倍镜视野中胶 原沉积情况，分析比较各组小鼠差异；
[0377] 8)通过苦味酸天狼星红染色和偏光显微镜观察，检测各组小鼠屯、脏组织切片梗死 局部提高梗死区修复质量相关胶原数量，分析比较各组小鼠差异；
[0378] 9)统计学分析：
[0379] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI组与sham组相比有统计学意义，咕《0.05，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P 《0.05;
[0380] 如图8A所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第1、3、7、14天VEGF、TGF-ei and IL- lOmRNA水平增力日，与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第3、7、14天VEGF、TGF-f31and IL- lOmRNA水平增加，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[03川如图8B所示:小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中CD31的免疫巧光图，其中白色为CD31;
[0382] 如图8C所示：小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中α-SMA的免疫组化图，其中黑色为α- SMA;
[0383] 如图8D所示：小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏中I型胶原的免疫组化图，其中黑色为I 型胶原；
[0384] 如图8E所示：小鼠 MI术后7、14天各组屯、脏的苦味酸天狼星红染色图，其中白色为 提高梗死区修复质量的相关胶原；
[03化]如图8F所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第7、14天梗死边缘区毛细血管数量 减少；与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第7、14天梗死边缘区毛细血管分别增加 17.14%和18.10%，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[03化]如图8G所示：与sham组相比，MI组各组术后第7、14天梗死边缘区a-SMA阳性屯、肌成 纤维细胞增加;与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第7、14天梗死边缘区a-SMA阳性屯、肌 成纤维细胞分别增加32.38 %和70.53 %，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0387] 如图細所示：与MI对照组相比，托化醋干预组术后第7、14天梗死区I型胶原分别增 加27.52 %和26.51 %，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0388] 如图81所示：与sham组相比，MI组各组MI术后第7、14天提高梗死区修复质量相关 胶原所占比例增加；与MI对照组相比，托化醋干预组MI术后第7、14天提高梗死区修复质量 相关胶原所占比例分别增加51.68%和33.55%，荷包牡丹碱干预组结果相反；
[0389] 由图8A~81结合分析可知:托化醋增加小鼠 MI后M2相关细胞因子的表达并增强MI 后的修复作用。
[0390] (十)托化醋治疗窗的确定
[0391] 1、材料
[0392] 实验药物:托化醋、簇甲基纤维素购自美国Sigma-Al化ich公司。
[0393] 2、动物及手术分组：
[0394] Control 组：12只，
[0395] 20mg/kg Topiramate组：12只，25mg/kg Topiramate组：12只，
[0396] 30mg/kg Topiramate组：12只，35mg/kg Topiramate组：12只，
[0397] 40mg/kg Topiramate组：12只；
[039引 3、实验步骤：
[0399] 1)配制溶剂:0.15mg的簇甲基纤维素溶于30mL双蒸水，于满旋混合器上充分混匀， 配制成0.5%的簇甲基纤维素作为溶剂；
[0400] 2)配制托化醋溶液:托化醋粉末溶于0.5%的簇甲基纤维素，配制五种给药浓度， 充分混匀；
[0401] 3)MI术后6小时开始给药，每间隔24h给药一次直至MI术后第14天，每次给药前，称 量小鼠体重，并按20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg腹腔注射托R比醋，对照组腹 腔注射PBS;
[0402] 4)MI术后14天超声检测屯、功能，步骤同前；
[0403] 5)统计学分析：
[0404] 数据W均数±标准误表示，采用单因素方差分析并进行Bonferroni两两比较检 验，MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，*P《0.05;MI干预组中各组与35mg/kg Topiramate组相比有统计学意义，￥《0.05;
[0405] 如表4所示：与MI对照组相比，托R比醋干预组25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg MI术后第14天EF、Papilla巧FS增加，EDV、ESV减小，屯、率没有统计学差异，20mg/kg组各项 参数没有统计学差异；与托化醋干预组35mg/kg相比，25111肖/4肖、3〇111肖/1^、4〇111肖/4肖组11术后 第14天各项参数没有统计学差异；
[0406] Table 4.Echoc曰rdiogr曰phic parameters on day 14 post MI
[0407] 表4小鼠 MI术后14天超声参数表 [040引
[0409] 注:为射血分数，EDV为左室舒张末期容积，ESV为左室收缩末期容积，Papil la巧 FS为乳头肌水平缩短分数，皿为屯、率;MI干预组与MI对照组相比有统计学意义，中《0.05; MI干预组中各组与35mg/kg Topiramate组相比有统计学意义，￥《0.05。
[0410] 由表4分析可知:25mg/kg~40mg/kg为小鼠 MI后托化醋有效治疗剂量。
[0411] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可W根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，运些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用。
【文档编号】A61K31/7048GK105920025SQ201610348002
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】黄诗媛, 刘坤, 王朝晖, 盛玉玲, 范澄, 李婷, 金晶, 刘琳玲, 靳楠, 杨勇, 王珏
【申请人】华中科技大学同济医学院附属协和医院