一种生物靶向纳米基因材料及其制造方法
【专利摘要】本发明提供了一种纳米基因材料，其特征在于：包括具有靶向性的纳米基因基材；所述纳米基因基材由氨基酸聚合物、修饰性聚乙二醇、血管紧张素Ⅱ多肽制备而成；其中，所述氨基酸聚合物和血管紧张素Ⅱ多肽分别与修饰性聚乙二醇两端的修饰基团发生化学反应后获得具有靶向性的纳米基因基材。本发明提供的一种新型的对缺血心肌具有靶向性、对基因具有保护作用、转染效果佳、毒性低的纳米基因材料。
【专利说明】
-种生物卽向纳米基因材料及其制造方法
技术领域
[0001] 本发明设及基因载体领域，具体地，设及一种生物祀向纳米基因材料及其制造方 法。
【背景技术】
[0002] 近年来，屯、血管疾病已经成为世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。尽管 基因治疗已经取得了令人满意的效果，但是安全有效的传递载体仍然是瓶颈所在。常用的 屯、肌转运载体可分为病毒载体和非病毒载体。由于具有较高的转染效率，病毒载体的应用 仍然具有绝对优势。但是，由于病毒载体引起的机体免疫反应较强，使其临床应用受到制 约。作为病毒载体的有效补充，近年来非病毒载体的研究日益深入。
[0003] 非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制， 且易于大量制备，可负载基因，如:反义寡核巧酸，有着病毒载体不可替代的作用。
[0004] 但是，目前的非病毒载体往往存在转染效率低，目的基因多数只能实现瞬间表达， 其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。
[0005] 针对该缺陷，在现有的对非病毒载体的基础研究中，体外转染最常用的载体(媒 介)包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，如:Lipo2000、聚乙締亚胺PEI25000、PEI18000等， 此类产品均是目前公认的对多种细胞具有较高转染效率的商品化转染试剂之一，所W常被 用来作为评价其他siRNA递送载体有效性的标准。
[0006] 然而，研究表明，长期使用Lipofectamine 2000?系列产品递送SiRNA会增加细胞 的自隧水平，诱发体内炎症。此外脂质体的血浆稳定性差，在血液中粒径、表面电位及脂质 成分都有改变的趋势。而PEI系列产品的生物毒性明显。运些都限制了脂质体和PEI在临床 上的应用。
[0007] 因而，目前急需一种转染效果佳，稳定性佳，且无毒性或毒性较低的载体。
[0008] 此外，目前针对屯、血管疾病的治疗产品中，用于负载基因的载体，往往在治疗时无 祀向性，因此，不能解决病变部位富集的情况下的祀向治疗的问题。
【发明内容】
[0009] 本发明旨在克服上述缺陷，提供一种新型的对基因具有保护作用、转染效果佳、毒 性极低、通过在载体上还连接有具有缺血屯、肌祀向性的多肤ATI来实现祀向治疗效果的纳 米基因材料。
[0010] 本发明提供的纳米基因材料，其特征在于:包括具有祀向性的纳米基因载体;上述 纳米基因载体由氨基酸聚合物、修饰性聚乙二醇、血管紧张素 Π 的功能序列多肤制备而成；
[0011] 其中，上述氨基酸聚合物和血管紧张素 Π 的功能序列多肤分别与修饰性聚乙二醇 两端的修饰基团发生化学反应后获得具有祀向性的纳米基因载体。
[0012] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：上述氨基酸聚合物为由赖 氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半脫氨酸、酪氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺中的 一种或多种氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一种或多种。
[0013] 优选自由赖氨酸制备的聚合物，或包含有质量百分比含量为45-80%的赖氨酸的 共聚物。
[0014] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：上述修饰性聚乙二醇的结 构如下所示：
[0015]
[0016] 其中，m为80-500的整数；
[0017] 化为酷胺基、締控基、环締控基、带有双键的杂环基；
[0018] 上述酷胺基的结构式如下所示：
[0019]
旨P、修饰性聚乙二醇的结构如下所示：
[0020]
[0021] R3为締控基、环締控基、带有双键的杂环基；
[0022] 上述締控基的结构式如下所示：
[0023]
[0024] 目P、修饰性聚乙二醇的结构如下所示：
[0025]
[0026] nl和n2为0到20的整数；当链长越长时，该材料的表面活性越好。
[0027] 上述环締控基的结构式如下所示：
[00川 R2为醋基；
[0032] 上述醋基的结构式如下所示：
[0033]
[0034] R4为烷基、芳基、杂环基；
[0035] 上述杂环基的结构式如下所示：
[0036]
[0037] Rx1-2Q选自氨、烷基、烷氧基、氨基或C-Rx1-2Q为幾基；
[0038] Rx1-20优选氨、甲基、乙基、甲氧基、氨基及C-Rx1-20为幾基；
[0039] Y为氮、氧、硫；
[0040] η为0-20的整数，当链长越长时，该材料的表面活性越好。
[0041] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：上述氨基酸聚合物的聚合 度为50-500;优选为80-160;
[0042] 上述氨基酸聚合物的的分子量为10000-100000;优选为15000W上；
[0043] 上述修饰性聚乙二醇的分子量为1000-10000;优选为1500 W上。
[0044] 此外，本发明还提供了上述纳米基因材料的制备方法，其特征在于：
[0045] 步骤一、配置反应物：
[0046] 将氨基酸聚合物溶解于溶剂中配置成溶液Α;
[0047] 将修饰性聚乙二醇溶解于溶剂中配置成溶液Β;
[0048] 将血管紧张素 Π 的功能序列多肤溶解于溶剂中配置成溶液C;
[0049] 步骤二、将溶液Β滴加入溶液A中，于10-50°C的溫度下，反应1-5小时；
[0050] 步骤Ξ、在保护气保护的条件下，加入溶液C，于10-50°c的溫度下，反应8-24小时；
[0051] 步骤四、将获得的溶液透析24-96小时后，冷冻干燥。
[0052] 如权利要求5上述的一种纳米基因材料的制备方法，其特征在于：
[0053] 上述溶剂选自抑为7-8的憐酸缓冲盐溶液、二甲基甲酯胺、二甲基亚讽、四氨巧喃、 醇、酸、醋中的一种或几种；
[0054] 上述聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素 Π 的功能序列多肤的摩尔比为1: 2-100:1-100；
[0055] 优选地，上述聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素 Π 的功能序列多肤的摩 尔比为 1:2-10:2-8。
[0056] 进一步地，本发明提供的上述纳米基因材料的制备方法，还具有运样的特点：即、 在步骤Ξ和四之间，还设有中和步骤；
[0057] 上述中和步骤为:于步骤Ξ的溶液中加入半脫胺等中和用试剂，于10-50°C的溫度 下，反应1-5小时；
[005引上述半脫胺的制备方法为:将半脫胺盐酸盐溶解于二次水中，加入有机碱震荡混 合5-20分钟，冷却后，采用有机溶剂萃取后，蒸除溶剂后获得半脫胺；
[0化9] 上述修饰性聚乙二醇与半脫胺盐酸盐的摩尔比为1:50-150;优选为1: :80-100;
[0060] 上述有机碱与半脫胺盐酸盐的摩尔比为1:0.1-10;优选为1:1-1.5。
[0061] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：即、上述具有祀向性的纳 米基因载体在静电作用下负载基因；
[0062] 上述基因可W选自反义寡核巧酸、反义表达质粒、表达质粒等基因；
[0063] 上述负载的过程为:将具有祀向性的纳米基因载体加入基因中，吹打均匀后于30- 40°C的条件下解育0.5-2小时；
[0064] 上述具有祀向性的纳米基因载体与基因的质量比为1:0.01-15;
[0065] 上述具有祀向性的纳米基因载体与基因的质量比优选为1:1-10。
[0066] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：即、上述聚氨基酸为聚合 度为95-135的树枝状聚赖氨酸；
[0067] 上述修饰性聚乙二醇的分子量为1500-2500,其两端的修饰基团分别为NHS和MAL。
[0068] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：
[0069] 上述基因为用于屯、肌缺血治疗的基因；
[0070] 上述基因为miRNA-1的反义寡核巧酸。
[0071] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：上述具有祀向性的纳米基 因载体在静电作用下负载miRNA-1的反义寡核巧酸；
[0072] 上述负载的过程为:将具有祀向性的纳米基因载体加入miRNA-1的反义寡核巧中， 吹打均匀后于30-40°C的条件下解育0.5-2小时。
[0073] 该具有祀向性的纳米基因载体与基因的质量比为0.01-15:1;优选为0.1-10:1;最 优选为0.5-8:1。
[0074] 进一步地，本发明的纳米基因材料，还具有运样的特点：上述纳米基因材料为具有 缺血屯、肌祀向性的纳米基因载体。
[0075] 该纳米基因材料还可W为未连接有血管紧张素 Π 的功能序列多肤的纳米基因载 体，即、DGL-PEG/AMO-1，其制备方法和原料比例，同于DGL-PEG-ATl/AMO-1。
[007引本发明的作用和效果:
[0077] 在本发明中，提供了一种新型的纳米基因载体，该载体具有缺血屯、肌祀向性的作 用，且毒副作用小。
[0078] 如图1所示，在本发明中，氨基酸聚合物和血管紧张素 Π 的功能序列多肤分别与修 饰性聚乙二醇两端的修饰基团发生化学反应后获得具有祀向性的纳米基因载体，其后，通 过将该纳米基因载体与反义寡核巧酸、反义表达质粒、表达质粒等负载获得具有祀向功能 的纳米基因载体。
[0079] 具体地，氨基酸作为生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有 着密切的关系。它在基体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。而 在在本发明中选用的聚氨基酸，基于氨基酸的基本特性，当应用于载体后，仍能具有良好的 生物相容性等效果，带有电荷的聚氨基酸在本发明中为优选方案，由于自身带有的电荷效 果，可与其他带有反向电荷的物质发生分子间的静电作用力，从而实现类似于自组装的效 果。
[0080] 另外，在本发明中，聚氨基酸选用的最优选案例中的DGL(树枝状聚赖氨酸），是一 种阳离子聚合物，是由赖氨酸(人体必需氨基酸)聚合而成的，其具有良好生物相容性的同 时、其生物可降解性和压缩DNA的能力极佳，其表面有大量的氨基，可被修饰，且带有正电， 当其被其他基团修饰后，由于自身带有的正电荷，可与其他带有负电荷的物质发生分子间 的静电作用力，从而实现负载因子或反义寡核巧酸的效果。
[0081] 此外，本发明中选用聚乙二醇作为反应组分之一，由于其本身为一种优良的表面 活性剂，当其与聚氨基酸上的基团发生取代等反应后，能实现在聚氨基酸的表面形成一层 水化层的效果，从而能减小聚氨基酸的毒性，降低其在体内被巨隧细胞系统吞隧的可能性。
[0082] 另外，在本发明中，选用的PEG为两端均设有修饰基团的PEG,从而使其通过该基团 上的活性基与聚氨基酸等物质发生反应，实现各组分之间的联合的同时，提高产品的表面 张力和兼容性。
[0083] 另外，在本发明的最优选方案中，将其两端分别连接NHS和MAL基团，该NHS基团可 与聚氨基酸表面的氨基发生取代等反应，将D化和PEG连接起来;而MAL基团可与多肤AT1 (血 管紧张素 Π 的功能序列多肤)上的琉基-HS发生加成反应，从而将多肤ATI与PEG连接起来， 进而构建起D(iL和AT1的连接关系。
[0084] 此外，在本发明中使用的AT1，其为：当屯、肌梗死(屯、肌细胞缺血缺氧)时，细胞表面 的血管紧张素 Π 受体-I(ATIR)升高。所W在体外化学合成AT1R的配体中的一段功能序列 (称AT1)连接在纳米材料表面，可祀向结合缺血屯、肌的AT1R，从而对缺血屯、肌具有一定的祀 向作用。
[0085] 在本发明中，体外合成的AT1多肤，其氨基酸序列如下所示：
[00 化]Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe;
[0087] AT1R的配体的功能序列如下所示：
[0088] Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；
[0089] 其中间的Gly-Gly-Gly-Gly为间隔序列，切S是中含有琉基-HS，是化学连接的功能 基团。
[0090] 此外，在本发明中，使用AM〇-l(miRNA-l的反义寡核巧酸)作为负电荷的供电体，与 上述合成基材通过静电实现组装的结果。
[0091] miRNA-1在屯、肌梗死或者细胞缺血缺氧时升高，可促进屯、肌细胞的调亡，是屯、肌细 胞的损害因子。而AM0-1是指miRNA-1的反义寡核巧酸，是化学合成的与miRNA互补的单链 RNA。其在细胞质中可与成熟的miRNA-1发生互补配对，使得miRNA-1的损害作用减弱，上述 各化合物的序列如下所示：
[0092] miRNA-1序列：5 ' -UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3 '
[0093] AM0-1 序列：5 ' -AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3 '
[0094] 在优选方案中，AM0-1带负电，可W与带正电DGL-PEG或DGL-PEG-AT1通过静电作用 形成纳米颗粒。
【附图说明】
[00M]附图1、纳米材料形成和材料结构的示意图；
[0096] 附图2、纳米材料核磁图谱；
[0097] 附图3、纳米材料负载AM0-1后的粒径和电位图；
[0098] 附图4、纳米材料负载AM0-1后的透射电镜图；
[0099] 附图5、纳米材料负载AM0-1凝胶电泳图
[0100] 附图6(a)、纳米材料对H9C2细胞毒性4小时对比图；
[0101] 附图6(b)、纳米材料对H9C2细胞毒性8小时对比图；
[0102] 附图7(al)、激光共聚焦观察4小时对比图；
[0103] 附图7(曰2)、流式细胞检测4小时对比图；
[0104] 附图7化1)、激光共聚焦观察8小时对比图；
[0105] 附图7化2)、流式细胞检测8小时对比图；
[0106] 附图8、活死染色实验结果对比图；
[0107] 附图9、原代屯、肌细胞免疫巧光染色对比图；
[0108] 附图10、原代屯、肌细胞水平治疗实验结果，各处理组miRNA-1量的对比图；
[0109] 其中，对照组：正常细胞(normal组）给予DEPC水、缺氧细胞（control组）给予DEPC 水、缺氧细胞(NC组）给予DGkWG-ATl/AMO-1-NC;实验组:缺氧细胞(PEI组）给予阳I/AM0- 1、缺氧细胞（D化-PEG组）给予DGレPEG/AM0-1、缺氧细胞（D化-PEG-AT1组）给予DGレPEG- AT1/AM0-1。
【具体实施方式】
[0110] 1、原料和设备的准备
[01川 1)原料：
[0112]树枝状聚赖氨酸(Den化igraft pol}fA-lysines，DGL);
[011；3] 端马来酷亚胺端N-径基班巧酷亚胺聚乙二醇（α-Malemidyl - ω -N- hydroxysuccinimidyl polyethylene glycol，NHS-PEG2〇o〇-MAL);
[0114] ATI(祀向多肤序列：
[0115] Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)；
[0116] 半脫胺盐酸盐;二氯甲烧，Ξ乙胺。
[0117] 2)设备：
[011引定容瓶（1000血，2000血），烧杯(5001^，21，51^，2个烧瓶(251^)，磁子，磁力揽拌器 (可显示溫度和转速），1个瓶塞，1个橡皮盖，2个针头(长短），2条橡皮管，MWC0:8000-14000 透析袋。
[0119] 2、试剂准备(根据实际使用的需要还可配置其他浓度和抑的缓冲溶液）
[0120] 1)配置100011110.21的？85原液(抑=7.4)
[0121] 准备：250mL量筒，500mL烧杯，lOOOmL的定容瓶，二次水，胞2册〇4-12此0，N址2P〇4- 2出0
[0122] 具体步骤：
[0123] a)分别称量化抽P04-12出058.01868邑，胞此口04-2出05.92838邑，混合放入500血的烧 杯中，加入500mL的二次水，充分揽拌溶解。
[0124] b)将烧杯中的溶液倒入lOOOmL的定容瓶中，加入二次水定容至lOOOmL。（可将二次 水先加入烧杯中冲洗烧杯壁，再加入到定容瓶中，因为烧瓶壁可能有部分溶质的残留）
[0125] C)用精密抑试纸测抑，确认抑值在7.4左右(7.2-7.4)
[0126] 2)配置500mL的lOmM的PBS缓冲液
[0127] a)取2.5mL原液，定容至化OmL(稀释20倍)一做反应用 [012引 b)取lOOmL原液，定容到2000ml-透析用
[0129] (注:后面透析和反应用的PBS浓度都是lOmM)
[0130] 实施例一、DGL-PEG的合成
[01：31] a)称量 22mg(l 皿 〇1)的 DGL(MW:25000)溶于 5mLPBS 缓冲液（lOmM;
[0132] 抑=7.4)(浓度0.2皿ol/mL)(称量后将固体DGL置于lOmL邱管中）；
[0133] 在本实施例中，还可使用其他分子量的DGL，如:MW= 10000、18000、20000、27000、 30000、50000、80000或100000。
[0134] b)称量 100mg(50 皿 〇1)的畑S-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于 5mL 的 DMS0 中；
[0135] 在本实施例中，还可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：MW=1000、1800、 2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
[0136] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代基团的不同，对于DGL 与NHS-PEG2000-MAL的反应比进行调整，如:D化与NHS-PEG2000-MAL的摩尔比为1: 2、1:5、1: 10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0137] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据反应的需要，对反应液的浓度 进行调整，如:浓度为 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般来说，当 取代反应发生的反应位较多（多于20的取代)的情况下，采用lOOymol/mlW上的浓度进行反 应，当取代反应发生的反应位较少（少于20的取代）的情况下，采用100皿ol/mlW下的浓度 进行反应；
[013引 C)将b)缓慢滴加入a)中（500-1000转/分的混合条件下），55°C反应化；
[0139]在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代数量的不同，其反应溫 度可W调整为10°(：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、40°(：、45°(：不等，其反应时间为0.5小时、1小时、 1.5小时、2小时、2.5小时不等。一般来说，当取代反应发生的反应位较多（多于20的取代)的 情况下，反应时间大于2小时，当取代反应发生的反应位较少（少于20的取代）的情况下，反 应时间小于2小时，进行反应；
[0140] d)称量90.88mg(800皿〇1)半脫胺盐酸盐(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL 二次水，分两次进行超声溶解；
[0141] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，根据需取代基团、取代数量的不同， 对于NHS-阳G-MAL半脫胺盐酸盐的反应比可进行调整，NHS-PEG-MAL:半脫胺盐酸盐的摩尔 比为 1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般来说， 当取代反应发生的反应位较多（多于20的取代）的情况下，摩尔比采用少于1:85的比例，当 取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下，摩尔比采用多于1:85的比例；
[0142] e)待完全溶解后，加入Ξ乙胺(MW:101.19;密度：0.726g/mL)65.如L，充分震荡 5min(用手摇晃即可，巧管会有些发热）。
[0143] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，半脫胺盐酸盐:Ξ乙胺的摩尔比可W 调整为 1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
[0144] f)待反应完全后，加入lOmL二氯甲烧，多次萃取，将获得的萃取液减压蒸除后获得 固体;将得到的固体溶于5mLPBS(1 OmM，pH=7.4)中，加入C的产物中，于55°C反应化。
[0145] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代数量的不同，其反应溫 度可W调整为10°(：、15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、40°(：、45°(：不等，其反应时间为0.5小时、1小时、 1.5小时、2小时、2.5、3小时、4小时、4.5小时、5小时不等。一般来说，当取代反应发生的反应 位较多（多于20的取代）的情况下，反应时间大于2小时，当取代反应发生的反应位较少（少 于20的取代）的情况下，反应时间小于2小时，进行反应；
[0146] g)将d)中最终的溶液加入MWC0 = 8000-14000化的透析袋中在一次水中透析4她。
[0147] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据反应的需要，透析的时间可W 为12小时、36小时、56小时、72小时、96小时不等；
[014引 h)冻干。
[0149] 实施例二、DGL-PEG-AT1 的合成
[0150] 反应方程式如下所示：
[0151]
[0152] a)称量 22mg(l 皿 ol)的 DGL(MW:25000)溶于 5mLPBS 缓冲液 α0mM;pH = 7.4)(浓度 0.2皿ο 1 /mL)(称量后将固体DGL置于1 OmL巧管中）；
[0153] 在本实施例中，还可使用其他分子量的DGL，如:MW=10000、18000、20000、27000、 30000、50000、80000或100000。
[0154] b)称量 100mg(50 皿 〇1)的畑S-PEG2000-MAL(MW:2000)溶于 5mL 的 DMS0 中；
[01巧]在本实施例中，还可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：歷=1000、1800、 2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。
[0156] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代基团的不同，对于DGL 与NHS-PEG2000-MAL的反应比进行调整，如:D化与NHS-PEG2000-MAL的摩尔比为1: 2、1:5、1: 10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0157] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据反应的需要，对反应液的浓度 进行调整，如:浓度为 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般来说，当 取代反应发生的反应位较多（多于20的取代)的情况下，采用lOOymol/mlW上的浓度进行反 应，当取代反应发生的反应位较少（少于20的取代）的情况下，采用100皿ol/mlW下的浓度 进行反应；
[015引 C)将b)缓慢滴加入a)中（500-1000转/分的混合条件下），55°C反应化；
[0159]在本实施例中，，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代数量的不同，其反应 溫度可W调整为10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、40 °C、45 °C不等，其反应时间为0.5小时、1小 时、1.5小时、2小时、2.5小时不等。一般来说，当取代反应发生的反应位较多（多于20的取 代）的情况下，反应时间大于2小时，当取代反应发生的反应位较少（少于20的取代）的情况 下，反应时间小于2小时，进行反应；
[0160] (1)称量35.88111邑(254111〇1)41'1(丽：1377.55，纯度96%)溶于50化10150中；
[0161] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代基团的不同，对于DGL 与ATI的反应比进行调整，如:D化与ATI的摩尔比为1:1、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、 1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100 不等。
[0162] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据反应的需要，对反应液的浓度 进行调整，如:浓度为 1 皿〇l/ml、10 皿 ol/ml、50ymol/ml、100ymol/ml、120ymol/ml、150ymol/ ml、210ymol/ml、650ymol/ml、lOOOymol/ml、1200ymol/ml、1500ymol/ml 不等。一般来说，当 取代反应发生的反应位较多（多于20的取代)的情况下，采用lOOymol/mlW上的浓度进行反 应，当取代反应发生的反应位较少（少于20的取代）的情况下，采用100皿ol/mlW下的浓度 进行反应；
[0163] e)将d)加入C)中，氮气(或氮气、氣气等)保护，室溫反应20h。
[0164] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据反应的需要对其反应时间进 行调整，其反应时间还可W为8小时、10小时、15小时、20小时、24小时不等。一般来说，当取 代反应发生的反应位较多（多于20的取代）的情况下，反应时间大于15小时，当取代反应发 生的反应位较少(少于20的取代）的情况下，反应时间小于15小时，进行反应；
[01化]f)称量90.88mg(800皿〇1)半脫胺盐酸盐(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL 二次水，分两次进行超声溶解；
[0166] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，根据需取代基团、取代数量的不同， 对于NHS-阳G-MAL半脫胺盐酸盐的反应比可进行调整，NHS-PEG-MAL:半脫胺盐酸盐的摩尔 比为 1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般来说， 当取代反应发生的反应位较多（多于20的取代）的情况下，摩尔比采用少于1:85的比例，当 取代反应发生的反应位较少(少于20的取代)的情况下，摩尔比采用多于1:85的比例；
[0167] g)待完全溶解后，加入Ξ乙胺(MW:101.19;密度：0.726g/mL)65.如L，充分震荡 5min(用手摇晃即可，巧管会有些发热）。
[0168] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，半脫胺盐酸盐:Ξ乙胺的摩尔比可W 调整为 1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。
[0169] h)待反应完全后，加入lOmL二氯甲烧，多次萃取，将获得的萃取液减压蒸除后获得 固体;将得到的固体溶于5mLPBS(1 OmM，pH=7.4)中，加入e的产物中，于55°C反应化。
[0170] 在本实施例中，，针对反应条件的科研过程中，还根据需取代数量的不同，其反应 溫度可W调整为10 °C、15 °C、20 °C、25 °C、30 °C、40 °C、45 °C不等，其反应时间为0.5小时、1小 时、1.5小时、2小时、2.5、3小时、4小时、4.5小时、5小时不等。一般来说，当取代反应发生的 反应位较多（多于20的取代)的情况下，反应时间大于2小时，当取代反应发生的反应位较少 (少于20的取代）的情况下，反应时间小于2小时，进行反应；
[0171] i)将f)中最终的溶液加入MWC0 = 8000-14000化的透析袋中在PBS中透析4她，再在 一次水中透析48小时。
[0172] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，还根据反应的需要，两次透析的时间 可W为12小时、36小时、56小时、72小时、96小时、120小时不等；
[0173] f)冻干
[0174] 注:一次水中透析后，会产生少许沉淀，离屯、后取上清，冻干，沉淀弃掉。
[0175] 实施例Ξ、负载反义寡核巧酸
[0176] 在本实施例中，选用AM0-1，纳米材料(NHS-阳G或NHS-PEG-MAL)和AM0-1按照质量 比（20:1)负载。将纳米材料和AM0-1溶于DEPC水，在20化L的ep管中先加入AM0-1，再加入材 料，吹打混匀，满旋80s后置于47°C溫箱中解育1小时。（原理:静电作用;D化带正电，AM0-1带 负电）
[0177] (注l:miRNA-l在屯、肌细胞缺氧时升高，对促进屯、肌细胞的调亡，是屯、肌细胞的损 害因子。AM0-1是指miRNA-1的反义寡核巧酸，是化学合成的与miRNA互补的单链RNA。其在细 胞质中可与成熟的miRNA-1发生互补配对，使得miRNA-1的损害作用减弱。）
[0178] (注2:miRNA-1 序列：5 ' -UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3 '
[01 巧]AM0-1 序列：5 ' -AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3 '）
[0180] 在本实施例中，针对反应条件的科研过程中，根据需求的不同，对于纳米材料： AM0-1的反应比可进行调整，AM0-1:纳米材料的质量比为1:1、1:5、1:8、1:10、1:15、1:25、1: 30、1:40、1:50、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、1:100 不等。
[0181] 实施例四、理化分析和表征
[0182] 本表征的产品为采用实施例一的方法和实施例二的方法获得的载体。
[0183] 其中，DGL-PEG为选用聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇的摩尔比为1:5的产物；
[0184] D化-PEG-AT1为选用聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素 Π 的功能序列多 肤的摩尔比为1:5:2.5的产物；
[0185] (l)iHNMR 检测图谱
[0186] 如图2所示，a( δ = 1-1.8ppm)为赖氨酸上的3个C出上的Η，是D化的特征峰。b (δ = 3.6卵m)为阳G的重复序列0-C出-CH2-0，d为（δ = 6.8ppm)为MAL上的Η，e (δ = 2.6ppm)为Ν服上 的Η，均为MAkWG-N服的特征峰。C为AT 1苯环上的Η，是AT 1的特征峰。D化-PEG中a，b峰存在， 说明阳G和D化连接，e峰消失，说明NHS发生反应;d峰消失，说明半脫胺盐酸盐与MAL发生反 应。D化-PEG-AT1中出现了 C峰，说明AT 1成功连接在DGレPEG-MAL上。由此推断，D化，NHS- PEG-MAL，ATI成功连接在一起。
[0187] (2)粒径和电位
[018引将合成的DGkPEG-AT 1在DEPC水中负载AM0-1后（纳米材料/AM0-1的质量比为8: 1)，如图3所示，用粒度仪检测其粒径约150nm，电位约+3mv。
[0189] (3)电镜
[0190] 如图4所示，电镜结果显示：D化-PEG-AT1/AM0-1(质量比为8:1)非水合粒径为 50nm〇
[0191] (4)材料负载能力的测定
[0192] D化-PEG-AT1/AM0-1分别W质量比为0,0.5，1，2,4,6,8负载在一起。3%琼脂糖凝 胶电泳跑胶，用SYBRn染色。（原理:裸的AM0-1带负电，在凝胶电泳中可跑出，可被SYBRn染 色；当DGkPEG-AT 1包裹AM0-1时，AM0-1表面负电减少，在电泳中跑出的减少，若是完全被包 裹，AM0-1不能跑出加样孔中。）
[0193] 如图5所示:裸的AM0-1跑出了加样孔（白色条带），当DGkWG-AT 1 /AM0-1质量比为 2 :1时，出现了拖带现象，说明AMO-1被材料包裹，但是还没有完全包裹，当DGレPEG-AT1/ AM0-1质量比为8:1时，未看到AM0-1跑出加样孔，加样孔中也未见白色条带，说明AM0-1被完 全包裹。当凝胶电泳跑15min时，可见裸AM0-1组的条带基本消失(可能AM0-1已经降解），但 2:1的孔仍可看到拖带的白色条带，说明材料对AM0-1有一定保护作用，可一定程度减少 AM0-1的降解。
[0194] (5)细胞毒性实验
[01 巧]将枝化PEI(bPEI)，061^，06^?66,06^?66-41'1分别配置成6个浓度：1111旨/1111^， 500ug/mL，200ug/mL，lOOug/mL，50ug/mL，20ug/mL，将其作用于朋C2细胞，地或者化后，用 MTT法检测其对细胞增值的影响(细胞毒性）。
[0196] 如图6(a)和6(b)所示:随着材料浓度和作用时间的增加，细胞活性逐渐降低。bPEI 的毒性明显大于DGL，D化-PEG-MAL，D化-PEG-AT1。材料浓度小于1 OOug/血时，D化-PEG-MAL， D化-PEG-AT1作用的细胞活性均大于80% (毒性较小），材料浓度大于lOOug/mL时，对细胞毒 性明显增加。可选择lOOug/mL作为后续治疗量。
[0197] (6)细胞吞隧实验
[0198] 验证朋C2细胞对阳I(3.9ug/2mL)，D化-PEG(24ug/2mL)，D化-PEG-ATl(24ug/2mL) 负载AM0-1-FAM(3ug/2mL)的吞隧效果。
[0199] 如图7(曰1)、7化1)、7(曰2)和7(曰2)所示:41，81中蓝色为细胞核(04口1染色），绿色为 AM0-1-FAM，位于细胞质或者细胞核位置。激光共聚焦显示，作用化时，PEI，D化-PEG，D化- PEG-AT1负载AM0-1-FAM组的册C2细胞中，绿色巧光均比地时明显增强。
[0200] 化时DGkPEG和DGkPEG-ATl组的绿色巧光较阳I组强。流式细胞检测结果显示结 果与之相符。
[0201] 说明，H9C2细胞对DGkPEG，DGkPEG-AT 1负载的AM0-1吞隧效果较阳I强，即D化- 阳G，DGkWG-ATl组较阳I组进入细胞的AM0-1多。
[0202] (7)活死染色实验
[0203] 如图8所示：红色为死细胞化thidiumhomodimer-l染色），绿色为活细胞(Calcein AM染色）。（由于图8中显示，细胞化时H9C2细胞对DGkWG，D化-PEG-AT1负载的AM0-1吞隧效 果较PEI强，再根据图7的细胞毒性实验结果显示PEI毒性大，推测，细胞对PEI负载的AM0-1 吞隧作用弱可能是由于PEI毒性大，为了进一步验证运一假设，用和材料图8中同样的条件 下，做活死染色。）结果显示，PEI组与06心阳6,06心阳6-41'1相比，细胞稀疏，并且红色巧光 较绿色巧光多，据此推断可能细胞对PEI负载的AM0-1吞隧作用弱的原因是PEI对细胞毒性 大。
[0204] (8)屯、肌原代细胞免疫巧光染色
[0205] 当屯、肌梗死（屯、肌细胞缺血缺氧）时，细胞表面的血管紧张素 Π 受体(AT1R)升高。 所W在体外化学合成AT1R的配体中的一段功能序列连接在纳米材料表面，可祀向结合缺血 屯、肌的AT1R，从而对缺血屯、肌具有一定的祀向作用。
[0206] 为验证SD大鼠原代屯、肌细胞缺血缺氧时AT1R是否升高，将原代屯、肌细胞做缺氧处 理后，进行免疫巧光染色。
[0207] 如图9所示:红色代表AT1R，位于细胞膜表面，蓝色代表细胞核。缺氧细胞表面的红 色巧光明显增加，由此可进一步证实缺氧的SD大鼠原代屯、肌细胞的AT1R升高。
[0208] (9)原代屯、肌细胞水平治疗实验
[0209] 用 PEI(3.9ug/2mL)，D化-PEG(24ug/2mL)，D化-PEG-ATl(24ug/2mL)负载 AM0-1 (3ug/2mL)与缺氧的SD大鼠原代屯、肌细胞（1 % 〇2，24h，低糖DMEM)共培养4h后，在正常条件 下（21%〇2,低糖DMEM)培养2地，提取总RNA,用Real-time PCR检测其miRNA-1的变化。
[0210] 如图10所示:*代表口<0.05，11 = 3，如图，缺氧细胞((3〇11化〇1)组未治疗时，11111?^八-1 较正常细胞（〇〇'111曰1)组明显升高；0化-?66,0化-?66-41'1组的11111?歴-1较缺氧细胞 (contro 1)组明显下降(达到了治疗作用），且DGL-PEG-AT1组较DGL-PEG组miRNA-1降低更明 显（可能由于ATI对缺氧细胞的祀向性作用，使得DGkPEG-ATl负载AM0-1后，被屯、肌细胞摄 取的更多，治疗作用更明显）。然而，PEI组不仅没有下调miRNA-1，使细胞中miRNA-1较缺氧 细胞(contro 1)组增加(可能由于其细胞毒性作用引起）。
[0別。上述实施例的变形例；
[0212] 在上述实施例中，W聚合度为123的聚赖氨酸DGL、聚乙二醇两端修饰基为NHS和 ML为原料进行了基因载体的制备。
[0213] 在实际研发的过程中，还对上述两种原料分别进行了替换的实验，基于其合成的 方法与实施例二至Ξ中的方法雷同，此处不再做具体论述，具体实验组合如下表所示：
[0214] 负载能力指纳米基材与AM0-1的质量比；
[0別引毒性评分为0-10分，从阳1为10分，DGkWG-ATl为1分；
[0216] 细胞吞隧评分为0-10分，W阳I为1分，DGkWG-ATl为10分；
[0217] 治疗效果评分为0-10分，W阳I为1分，DGkWG-ATl为10分；
[021 引
[0219]从上述实施例可W看出，该祀向纳米基因载体可为屯、肌缺血或者屯、肌梗死患者的 基因治疗提供一定的实验基础。该载体可负载AM0-1，也可负载用于屯、肌缺血治疗的其它基 因。
【主权项】
1. 一种纳米基因材料，其特征在于:包括具有革G向性的纳米基因载体； 所述纳米基因载体由氨基酸聚合物、修饰性聚乙二醇、血管紧张素 Π 的功能序列多肽 制备而成； 其中，所述氨基酸聚合物和血管紧张素 Π 的功能序列多肽分别与修饰性聚乙二醇两端 的修饰基团发生化学反应后获得具有靶向性的纳米基因载体。2. 如权利要求1所述的一种纳米基因材料，其特征在于： 所述氨基酸聚合物为由赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一种或多种； 所述氨基酸聚合物优选为赖氨酸和丝氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或多种氨基酸形成的共聚物;其中，赖氨酸占共聚 物的质量百分比含量大于50% ; 所述氨基酸聚合物优选为阳离子氨基酸聚合物。3. 如权利要求1所述的一种纳米基因材料，其特征在于： 所述修饰性聚乙二醇的结构如下所示：其中，m为80-500的整数； Ri为酰胺基、烯烃基、环烯烃基、带有双键的杂环基； 所述酰胺基的结构式如下所示：R3为烯烃基、环烯烃基、带有双键的杂环基； 所述烯烃基的结构式如下所示：nl和n2为0到20的整数； 所述环烯烃基的结构式如下所示： 所述带有双键的杂环基的结构式如下所示：R2为酯基；所述酯基的结构式如下所示：R4为烷基、芳基、杂环基； 所述杂环基的结构式如下所示：Rxl-2Q选自氢、烷基、烷氧基、氨基或C-Rxl-2Q为羰基； Y为氮、氧、硫； η为0-10的整数。4. 如权利要求1所述的一种纳米基因材料，其特征在于： 所述氨基酸聚合物的聚合度为50-500; 所述氨基酸聚合物的的分子量为10000-100000; 所述修饰性聚乙二醇的分子量为1000-10000。5. -种纳米基因材料的制备方法，其特征在于： 步骤一、配置反应物： 将氨基酸聚合物溶解于溶剂中配置成溶液Α; 将修饰性聚乙二醇溶解于溶剂中配置成溶液Β; 将血管紧张素 Π 的功能序列多肽溶解于溶剂中配置成溶液C; 步骤二、将溶液Β滴加入溶液Α中，于10-50 °C的温度下，反应1-5小时； 步骤三、在保护气保护的条件下，加入溶液C，于10-50°C的温度下，反应8-24小时； 步骤四、将获得的溶液透析24-96小时后，冷冻干燥。6. 如权利要求5所述的一种纳米基因材料的制备方法，其特征在于： 所述溶剂选自磷酸缓冲盐溶液、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、醇、醚、酯中的 一种或几种； 所述聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素 Π 的功能序列多肽的摩尔比为1: 2-100:1-100； 优选地，所述聚赖氨酸、修饰性的聚乙二醇与血管紧张素 π的功能序列多肽的摩尔比 为1:2-10:2-8。7. 如权利要求5所述的一种纳米基因材料的制备方法，其特征在于： 在步骤三和四之间，还设有中和步骤； 所述中和步骤为:于步骤三的溶液中加入半胱胺，于10_50°C的温度下，反应1-5小时； 所述半胱胺的制备方法为:将半胱胺盐酸盐溶解于二次水中，加入有机碱震荡混合5-20分钟，冷却后，采用有机溶剂萃取后，蒸除溶剂后获得半胱胺； 所述修饰性聚乙二醇与半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:50-150; 所述有机碱与半胱胺盐酸盐的摩尔比为1 :〇. 1-10。8. 如权利要求1-8任一所述的一种纳米基因材料，其特征在于： 所述具有靶向性的纳米基因载体在静电作用下负载基因； 所述负载的过程为:将具有靶向性的纳米基因载体加入基因中，吹打均匀后于30-40Γ 的条件下孵育0.5-2小时； 所述具有靶向性的纳米基因载体与基因的质量比为0.01-15:1; 所述具有靶向性的纳米基因载体与基因的质量比优选为〇. 1-10:1。 所述具有靶向性的纳米基因载体与基因的质量比最优选为0.5-8:1。9. 如权利要求1-8任一所述的一种纳米基因材料，其特征在于： 所述聚氨基酸为聚合度为95-135的树枝状聚赖氨酸； 所述修饰性聚乙二醇的分子量为1500-2500，其两端的修饰基团分别为NHS和MAL; 所述基因为用于心肌缺血治疗的基因； 所述基因优选为反义寡核苷酸； 所述基因优选为miRNA-1的反义寡核苷酸。10. 如权利要求1-9任一所述的一种纳米基因材料，其特征在于： 所述纳米基因材料为具有缺血心肌革E1向性的纳米基因载体； 所述纳米基因材料还可以为未连接有血管紧张素 Π 的功能序列多肽的纳米基因载体。
【文档编号】A61K48/00GK105920618SQ201610420617
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】何斌, 石学银, 薛晓梅, 董海青, 李永勇
【申请人】上海交通大学医学院附属新华医院