用于抑制组织钙化、组织纤维化和与年龄相关的疾病的物质的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于减少生物的组织钙化和组织纤维化、用于延迟生物与年龄相关的疾病的发病的物质，以及与此相关的方法。
【专利说明】
用于抑制组织钙化、组织纤维化和与年龄相关的疾病的物质
技术领域
[0001] 本发明涉及物质用于减少组织钙化和组织纤维化和用于延迟与年龄相关的疾病 的发病的用途以及与此有关的方法。
【背景技术】
[0002] 生物的衰老过程的典型特征在于疾病和器官机能障碍发生的增加。这样的所谓与 年龄相关的疾病或老年综合征最终导致生物的死亡。在衰老过程中，组织钙化和组织纤维 化发挥关键作用。
[0003]组织钙化尤其在肾功能不全的患者的加速衰老的情况下发挥关键作用。起作用的 器官组织在被结缔组织替代时的终止(纤维化)在肾功能不全、肝硬化、克罗恩病、纤维化胰 腺炎、肺纤维化、心机能不全和瘢痕形成时发挥核心作用。此外，组织纤维化导致损害腹膜 透析的功效。
[0004] 组织钙化和纤维化二者由"转化生长因子" TGFi31刺激，后者也导致阿尔茨海默病 的发生。此外，在组织钙化的信号转导情况下，涉及碱性磷酸酶的活化和转录因子Runx2的 提尚的表达。
[0005] 在Klotho缺陷（klothohm)的小鼠中观察到过度的组织钙化、与年龄相关的疾病的 早期发作和缩短的预期寿命。因此，在对该小鼠施用药剂之后抑制组织钙化以及延长寿命 允许这样的推论:该药剂延缓组织钙化和老化。
[0006] 在现有技术中出现了大量关于用于减少组织钙化和组织纤维化和用于延迟与年 龄相关的疾病的发病的假定物质的建议。然而，关于这些物质的有效性，在大多数情况下缺 少任何科学的证明。
【发明内容】
[0007] 在此背景下，本发明的问题在于找到在生物中减少组织钙化和器官纤维化以及与 年龄相关的疾病的物质。
[0008] 该问题通过提供硫酸铵、氯化铵（NH4C1 )、碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺、氯喹、硝酸 铵、柠檬酸铵或乳酸铵得以解决。
[0009] 本发明人的这些认识是令人惊讶的。
[0010] 硫酸铵是氨与硫酸的盐。在食品技术中将硫酸铵作为添加剂用于调节酸，并且，在 美国食品药品监督管理局通常被认为是安全的（一般认为安全[GRAS])。在欧盟拥有编号 E517。
[0011] 柠檬酸铵是氨与柠檬酸的盐，并且在欧盟的授权编号为E380。
[0012] 乳酸铵是氨与乳酸的盐，并且在欧盟以编号E328作为酸调节剂运用。
[0013] 硝酸铵作为肥料，以及在炸药中使用。
[0014] 氯化铵具有通式NH4C1，其也被称为盐酸铵、氨盐或硇砂并具有CAS编号12125-02-9,其为盐酸的铵盐。它是无色结晶固体。氯化铵在食品技术中作为添加剂使用并且在其中 拥有编号E 510。在药品中，氯化铵作为祛痰药，即作为化痰药使用。
[0015] 氯喹[(RS)-N'-(7-氯喹啉-4-基)-N，N-二乙基-戊烷-1，4-二胺]使溶酶体碱化并 且并用于对抗疟疾、用于免疫抑制、用于治疗病毒疾病和对抗肿瘤。
[0016] 所述碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺抑制碳酸氢盐到二氧化碳的酶促转化并且因此可 以影响局部pH。将其用作利尿剂。
[0017] 已知的是，可以由氯化铵(NH4C1)触发的酸中毒可以抑制组织钙化。此外已知的 是，乙酰唑胺可以降低磷酸盐浓度，由此将减轻组织钙化。在对klotho^M、鼠的试验中，组织 钙化受氯化铵抑制，然而并没有酸中毒的加重，并且组织钙化受乙酰唑胺抑制而没有血浆 磷酸盐浓度的降低(见下文）。
[0018] 现有技术中没有描述硫酸铵、柠檬酸铵、乳酸铵、硝酸铵、氯化铵(NH4C1 )、氯喹或 乙酰唑胺用于抑制信号转导的用途，所述信号转导导致组织钙化和组织纤维化和延迟与年 龄相关的疾病的发生。
[0019] 本发明人可以在所建立的细胞模型中证明，硫酸铵、柠檬酸铵、乳酸铵、硝酸铵和 氯化铵(NH4C1)抑制TGFi31，即组织钙化和组织纤维化的调节中的关键分子，的形成（图1)。 此外，本发明人可以证实，硫酸铵、硝酸铵和氯化铵抑制转录因子Runx2的表达（图2)，以及 硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和氯喹降低碱性磷酸脂酶的表达（图3)，这二者都是组织钙化的已 知刺激剂。最后，本发明人可以在所建立的动物模型中表明，施用氯化铵和乙酰唑胺导致明 显的寿命延长(图19)并且避免或者防止组织钙化和脉管钙化(图12-18)。
[0020] 广泛的研究获得在所参与的细胞机理方面的认识:可以表明，Klotho-缺陷的动物 的主动脉具有转录因子NFAT5的大量表达（图4)。在细胞中，转录因子的表达可以通过升高 的胞外磷酸盐浓度来提高（图5A)。同时提高S0X9(还是促进成骨细胞信号转导的蛋白质）的 表达（图5B)。用NFAT5转染细胞独立于磷酸盐提高了 S0X9、CBFA1/RUNX2和ALP的表达并且防 止了NH4C1对S0X9、CBFA1 /RUNX2和ALP的表达的作用（图6)。用肿瘤生长因子TGF0处理细胞 又独立于磷酸盐提高了NFAT5的表达并且防止了NH4C1对NFAT5的表达的作用（图7)。
[0021] 根据本发明，"用途"理解为至少一种所述物质引起所声称的效果。在此，根据本发 明所述物质的用途在单药治疗的范围内可以完成，其中使用硫酸铵、柠檬酸铵、乳酸铵、硝 酸铵、氯化铵(NH4C1)、氯喹和乙酰唑胺作为有效成分或者唯一的有效成分。然而联合疗法 也是可能的，其中同时使用这些有效成分的两种或更多种。
[0022] 以此完全解决了本发明所提出的问题。
[0023] 根据本发明的一个优选实施方案，与年龄相关的疾病选自：动脉硬化、肺气肿、皮 肤萎缩、肌无力、免疫缺陷、不育、脊柱后凸、CaP0 4-代谢紊乱、骨质疏松症、免疫不全(胸腺 退化)和神经退行性病变。
[0024] 根据本发明的一个优选实施方案，组织纤维化基于选自如下的疾病:肝硬化、克罗 恩病、纤维化胰腺炎、肺纤维化、心机能不全、瘢痕形成、腹膜透析时的纤维化、阿尔茨海默 氏病。
[0025] 所述方案的有利之处在于提供了这样的物质，采用所述物质可以预防和治疗重要 的纤维化疾病。
[0026] 硫酸铵、柠檬酸铵、乳酸铵、硝酸铵、氯化铵(NH4C1 )、氯喹和乙酰唑胺可以是药物 组合物中的有效成分，所述组合物优选成型为用于口服、直肠、肠胃外、腹膜内、局部或透皮 应用。此外，所述药物组合物优选成型为粉末剂、片剂、糖浆(Saft)、滴剂、透析液、胶囊、栓 剂、溶液剂、注射液、气溶胶、软膏剂、洗剂、硬膏剂、丸剂、锭剂或改变释放的剂型。
[0027] 本领域技术人员根据个人情况的需要确定硫酸铵、柠檬酸铵、乳酸铵、硝酸铵、氯 化铵(NH4C1)、氯喹和乙酰唑胺在药物组合物的单位剂型中的绝对量。用于在成人中施用的 组合物可以提供约25g硫酸铵、25g柠檬酸铵、35g乳酸铵、25g硝酸铵、20g氯化铵(NH4C1)、 900mg氯喹和800mg乙酰唑胺的每日单位剂量。然而，本领域技术人员也可以由此提供不同 的其它绝对量。
[0028] 这些措施的有利之处在于，以实现期望的效果的绝对量提供有效成分。
[0029] 所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体和任选的另外的添加剂，其在现有 技术中通常是已知的。它们例如描述于Kibbe A.的专著"药用赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)"，第三版，美国医药协会和制药出版社（American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press)2000中。添加剂包括对于组合 物的根据本发明的用途而言有利的每种化合物或组合物，其中包括盐、粘结剂、溶剂、分散 剂和其它与药物的制剂有关的通常使用的物质。
[0030] 根据本发明，可以将硫酸铵、梓檬酸铵、乳酸铵、硝酸铵、氯化铵(NH4C1)、氯喹和乙 酰唑胺作为一种或多种添加剂用于食品中。
[0031] 这些措施利用了以下有利之处:所述物质部分地已经用于食品技术中并且具有相 容性和很大程度上的无味的特性。根据本发明考虑任一种食品，尤其是饮料以及固体食品。 [0032]有效成分的优选浓度能够借助本领域技术人员已知的方法，例如通过滴定实验 (其中使用不同的浓度)容易地确定。有效量可以单独地确定。在治疗用途的情况下，所述浓 度取决于具体的待治疗的与年龄相关的疾病、病程、严重程度、待治疗的患者，尤其是取决 于其免疫学状态、性别、年龄、病史等。在饮料中使用的情况下，所述浓度为约25g硫酸铵、 25g柠檬酸铵、35g乳酸铵、25g硝酸铵、20g氯化铵(NH4Cl)、800mg氯喹或800mg乙酰唑胺。然 而，本领域技术人员也可以由此提供不同的其它浓度。
[0033]这些措施的有利之处在于，已经以保证期望的效果的那种浓度提供有效成分或者 添加剂。
[0034]本发明的另一主题涉及用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于减少组 织钙化和组织纤维化以及用于延迟与年龄相关的疾病的发病，所述方法包括以下步骤： [0035] 1.提供有效成分，和
[0036] 2.将有效成分配制到药学上可接受的载体中，以获得药物组合物，
[0037]其中所述有效成分选自：硫酸铵、氯化铵(NH4C1)、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸 铵和乳酸铵。
[0038] 此外，本发明的另一主题涉及用于制备食品的方法，所述食品用于减少组织钙化 和组织纤维化以及用于延迟与年龄相关的疾病的发病，所述方法包括以下步骤：
[0039] 1.提供添加剂，和
[0040] 2.将所述添加剂引入食物中，以获得食品，
[0041 ]其中所述添加剂选自：硫酸铵、氯化铵(NH4C1 )、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸铵 和乳酸铵。
[0042] 最后，本发明的另一主题涉及用于减少组织钙化和组织纤维化以及用于延迟与年 龄相关的疾病的发病的方法，所述方法包括向生物施用物质，其中所述物质选自：硫酸铵、 氯化铵(NH4C1)、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸铵和乳酸铵。
[0043] 根据本发明的用途的性质、特征和有利之处，相应地适用于根据本发明的方法。因 此，所述物质单独地作为仅有的有效成分或者添加剂或组合使用。
[0044] 可理解的是，前述和在后还待阐释的特征不仅可以每个给出的组合，而且可以其 它组合或独有地使用，而不脱离本发明的范围。
[0045] 现借助于实施方案进一步阐释本发明，由所述实施方案给出另外的性质和有利之 处。所述实施方案纯为解释性的并且不限制本发明的范围。在此参考附图。
【附图说明】
[0046] 如下在所附的图中示出：
[0047] 图1示出了TGFmmRNA在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC =人主动脉平滑肌细胞）中 在正常的磷酸盐浓度时（白色的柱)和在通过添加2πιΜβ-甘油磷酸盐提高磷酸盐浓度以刺激 成骨细胞信号转导之后在不存在(灰色的柱)和存在(黑色的柱)不同的铵盐(各〇.5mM)下的 表达。***(p〈0.001)显示与正常的磷酸盐浓度的统计上的显著差异；#(p〈0.05)、##(P〈 0.01)显示在不存在铵盐下与提高的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异(Student't检验，η =4)〇
[0048] 图2示出了Runx2mRNA在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC =人主动脉平滑肌细胞）中 在正常的磷酸盐浓度时（白色的柱)和在通过添加2πιΜβ-甘油磷酸盐提高磷酸盐浓度以刺激 成骨细胞信号转导之后在不存在(灰色的柱)和存在(黑色的柱)不同的铵盐(各〇.5mM)下的 表达。#(p〈0.01)显示与正常的磷酸盐浓度的统计上的显著差异;#(p〈0.05)、##(p〈0.01) 显示在不存在铵盐下与提高的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异(Student't检验，n = 6)。
[0049] 图3示出了碱性磷酸酯酶mRNA在人主动脉平滑肌细胞(HA〇SMC =人主动脉平滑肌 细胞）中在正常的磷酸盐浓度时（白色的柱)和在通过添加2πιΜβ-甘油磷酸盐提高磷酸盐浓 度以刺激成骨细胞信号转导之后在不存在（灰色的柱）和存在（黑色的柱）不同的铵盐（图 3Α)(各0.5mM)下以及在添加氯喹（100μΜ)之后（图3Β)的表达。*(ρ〈0.05)、#(ρ〈0.01)、*** (?〈0.001)显示与正常的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异 ;#化〈0.05)、##(?〈0.01)、### (ρ〈0,001)显示在不存在铵盐或者氯喹下与提高的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异 (Student ' t检验，η = 8)。
[0050] 图4示出了NFAT5(经活化的τ-细胞的核因子5)在kl〇th〇+A-小鼠（浅色条）和 klothohm-小鼠（深色条）的大动脉中的表达，各自没有(对照)和用NH4C1-处理。（n=10)**(p 〈0 · 01)显示与klotho+/+-小鼠的显著差异;###(p〈0 · 001)显示与未处理的klothohm-小鼠的 统计学上的显著差异(AN0VA)。
[0051 ] 图5示出了 NFAT5(A)和S0X9(B)在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC =人主动脉平滑肌 细胞）中在正常的磷酸盐浓度时（白色的柱)和在通过添加2πιΜβ-甘油磷酸盐提高磷酸盐浓 度以刺激成骨细胞信号转导之后在不存在(黑色的柱)和存在(灰色的柱)氯化铵(500μΜ)下 的表达。（η = 6-8)**(ρ〈0.01)显示与正常磷酸盐浓度的统计学上的显著差异;#(ρ〈0.05)显 示与不存在氯化铵下与提高的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异(AN0VA)。
[0052] 图6示出了即4了5(六）、3(?9(8)、08?41/冊似2(〇和41^以0)在人主动脉平滑肌细胞 (HA〇SMC =人主动脉平滑肌细胞）中在正常的磷酸盐浓度时(对照)和在通过添加2πιΜβ-甘油 磷酸盐提高磷酸盐浓度以刺激成骨细胞信号转导之后在不存在(Pi)和存在(Pi+NH4C1)氯 化铵(500μΜ)下在对照转染（白色的柱)和用对NFAT5编码构建转染(黑色的柱)之后的表达。 (11 = 6)*(?〈0.01)、林(？〈0.01)、林*(?〈0.001)显示与用对照转染的正常磷酸盐浓度的统计 学上的显著差异以勵￥4)。#(?〈0.05)、##(?〈0.01)、###(?〈0.001)显示在不存在氯化铵下用 对照转染的与提高的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异(AN0VA)4(p〈0.05)、《(p〈0.01)、 $$$(?〈0.001)显示与对照转染的撤〇31(：的统计学上的显著差异(卜检验）。
[0053] 图7示出了 NFAT5在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMCs =人主动脉平滑肌细胞）中在正 常的磷酸盐浓度时(对照），在存在TGF-f3( 10ng/ml; TGFB1)下，在通过添加2mMf3-甘油磷酸盐 提高磷酸盐浓度以刺激成骨细胞信号转导之后在不存在(Pi)和存在(Pi+NH4C1)氯化铵 (500μΜ)下，以及在存在提高的磷酸盐浓度连同Tgf-β和氯化铵(Pi+NH4C1+TGFB1)下的表 达。（11 = 6)*(?〈0.05)、*林(？〈0.001)显示与正常的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异;#(? 〈0.05)、###(?〈0.001)显示在不存在氯化铵下与提高的磷酸盐浓度的统计学上的显著差异 (AN0VA)〇
[0054] 图8示出了kl〇th〇V+-小鼠和klotho1?-小鼠的表现型以及kl 〇th〇V+-小鼠（浅色条） 和klothohm-小鼠（深色条）的体重，各自没有处理(对照)和用NH4C1-处理(C)，η = 5-7; ***(p 〈0 · 001)表明与klotho+/+-小鼠的显著差异;###(ρ〈0 · 001)显示与未处理的klothohm-小鼠的 统计学上的显著差异(AN0VA)。
[0055] 图9示出了kl〇th〇V+-小鼠和klotho1?-小鼠的表现型以及kl 〇th〇V+-小鼠（浅色条） 和klothohm-小鼠（深色条）的体重，各自没有处理(对照）和用乙酰唑胺-处理(C)，n = 4-6;* (?〈0.05)、林*(?〈0.001)表明与1^1(^11〇+/+-小鼠的显著差异 ;###(?〈0.001)表明与未处理的 klotho1?-小鼠的统计学上的显著差异(AN0VA)。
[0056] 图10示出了没有(对照）和具有NH4C1的klotho+/+-小鼠（浅色条)和klothohm-小鼠 (深色条)的血浆中的氨浓度(A)(n = 8)、磷酸盐浓度(B)(n = 7)、Ca+A浓度(C)(n = 7)、1.25 (〇H)2D3浓度(D)(n = 6)、FGF23浓度(E)(n = 5)和甲状旁腺素浓度(F)(n = 5)和基质Gla蛋白 (MGP)浓度(6)(11 = 6)。*(口〈0,05)、**(口〈0,01)、***(口〈0.001)表明与1^1〇七11〇+/+-小鼠的显著 差异;#化〈0.05)，##(?〈0.01)，###(?〈0.001)显示了与未处理的1^1(^11〇 1~-小鼠的统计学上 的显著差异;§&〈0.05)、§§(?〈0.01)、§§§(?〈0.001)显示与经处理的1^1的1 1〇1--小鼠的统计 学上的显著差异(AN0VA)。
[0057]图11示出了没有(对照)和具有乙酰唑胺的kl〇th〇+A-小鼠（浅色条)和klotho hm-小 鼠（深色条)的血浆中的磷酸盐浓度(A) (η = 5-6)、Ca+A浓度(B) (η = 5-6)和1.25 (OH)2D3浓度 (0)(11 = 5)和基质61&蛋白（]\0))浓度(0)(11 = 6)。**(卩〈0.01)，***(卩〈0.001)显;^;与1^1〇七11〇 +/+_小鼠的显著差异;##(P〈〇. 01)、###(P〈〇. 001)显示与未处理的klotho1?-小鼠的统计学上 的显著差异;§§§(Ρ〈〇.〇〇1)显示与经处理的klotho 1?-小鼠的统计学上的显著差异(AN0VA)。 [0058] 图12示出了没有(未处理的）或用(NH4)2S〇4处理(经处理的)klothohm-小鼠的气管、 肺、肾、胃和血管的组织学。
[0059] 图13示出了没有处理（未处理的）或用（NH4)2S〇4处理或用NH4N03处理(经处理的） klotho1?-小鼠的血管。
[0060] 图14示出了没有（未处理的）或用NH4N03处理（经处理的）klothohm-小鼠的气管、 肺、肾、胃和血管的组织学。
[0061 ] 图15示出了没有处理（未处理的）或用NH4N03处理的kl othohm-小鼠的心脏的组织 学。
[0062] 图16示出了没有(未处理的）或用NH4C1处理(经处理的）klothohm-小鼠的气管、肺、 肾、胃和血管的组织学。
[0063]图17示出了没有(未处理的）或用乙酰唑胺处理(经处理的)klothohm-小鼠的气管、 肺、肾、胃和血管的组织学。
[0064] 图18示出了没有(未处理的）或用氯喹二磷酸盐处理(经处理的）klothohm-小鼠的 气管、肺、肾、胃和血管的组织学。
[0065] 图19示出了没有(各黑色圆圈）或(A)用(NH4)2S〇4处理（白色圆圈）或用NH4N03处理 (白色方块）（n = 9_14) (p〈0 · 001 ;Wilcoxon，Log-Rang)，（B)用NH4CI处理（白色圆圈）（n = 14-16) (p〈0 · 001; Wilcoxon，Log-Rang)，（C)用乙酰挫胺处理（白色圆圈）（n = 8_10)(p〈 0 · 001 ;Wilcoxon，Log-Rang)，（D)用氯喹二磷酸盐处理（白色圆圈）（n = 8-12) (p〈0 · 05 ; Wilcoxon，Log-Rang)的 klotho1?-小鼠的存活率。
【具体实施方式】 [0066] 材料和方法
[0067] 进行如下实验工作:将原代人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC，Invitrogen)在添加有 10%FBS(Gibco，Life Technologies)和 100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素（Gibco，Life Technologies)的Waymouth的MB 752/1培养基和Ham的F-12营养混合物（1:1，Gibco，Life Technologies)中培养。在所有的实验中使用铺满的HAoSMC，传代4至11。将细胞用2mMf3-甘 油磷酸盐(Sigma-Aldrich)同时添加0.5mM铵盐或100μΜ氯喹二磷酸盐(Sigma-Aldrich)或 不同时添加〇.5mM铵盐或100μΜ氯喹二磷酸盐(Sigma-Aldrich)处理24小时。定量RT-PCR(实 时聚合酶链反应）如先前描述（Voelkl J，Alesutan I，Leibrock CB, Quintanilla-Martinez L,Kuhn V,Feger M,Mia S, Ahmed MS ,Rosenblatt KP,Kuro 0, Lang F: Spironolactone ameliorates PITl-dependent vascular osteoinduction in klotho-hypomorphic mice. J Clin Invest 2013;2月1 日；123(2) :812-22)进行。为此，洗涤HAoSMC 并将全部RNA借助Trifast试剂(Peqlab)按照制造商数据分离。对于体内实验而言将klotho +/+_小鼠和klo thohm-小鼠的主动脉各自用NH4C1处理或不处理采样且速冻。将全部RNA同样 用Trifast试剂(Peqlab)依照制造商的指示分离。对于具有寡(dT)i2-is引物（Invitrogen)和 Superscript III逆转录酶（Invitrogen)的RNA的逆转录，使用各2yg人以及鼠的样品的RNA。 定量实时PCR采用iCycler iQ? Real-Time PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories)和iQ? Sybr Green Supermix(Bi〇-Rad Laboratories)根据制造商数据进行。使用以下引物(5 3'方向）：
[0068] 人引物:
[0069] TN碱性磷酸酯酶fw:GGGACTGGTACTCAGACAACG(SEQ ID No.l);
[0070] TN碱性磷酸酯酶rev:GTAGGCGATGTCCTTACAGCC(SEQ ID Νο·2);
[0071] RUNX2fw：GGAAGGGCTTGATTGACGTG(SEQ ID No.3)；
[0072] RUNX2rev：CAGAACCAAACATAGCACTGACT(SEQ ID No.4)；
[0073] TGFBlfw：CAATTCCTGGCGATACCTCAG(SEQ ID No.5)；
[0074] TGFBlrev:GCACAACTCCGGTGACATCAA(SEQ ID No.6)〇
[0075] GAPDH fw：GAGTCAACGGATTTGGTCGT(SEQ ID No.7)；
[0076] GAPDH rev：GACAAGCTTCCCGTTCTCAG(SEQ ID No.8)；
[0077] NFA75fw：GGGTCAAACGACGAGATTGTG(SEQ ID No.9)；
[0078] NFAT5rev：GTCCGTGGTAAGCTGAGAAAG(SEQ ID No.10)；
[0079] S0X9fw：AGCGAACGCACATCAAGAC(SEQ ID No.11)；
[0080] S0X9rev:CTGTAGGCGATCTGTTGGGG(SEQ ID No.12)。
[0081] 鼠引物：
[0082] Nfat5fw：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG(SEQ ID No.13)；
[0083] Nfat5rev：CTGGTGCTCATGTTACTGAAGTT(SEQ ID No.14)；
[0084] Gapdh fw：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(SEQ ID No.15)；
[0085] Gapdh rev:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(SEQ ID No.16)〇
[0086] PCR产物的特异性通过熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳检验。所有PCR各进行两次 并且mRNA量的倍数通过方法用GAPDH作为内参照计算。
[0087] 全体动物实验根据德国动物保护法规的规定进行并且得到地方当局的批准。
[0088] 雄性和雌性亚效等位基因 klotho-小鼠（klothohm)与雄性和雌性野生型小鼠 (klotho+A)进行对比。小鼠的来源、培养和基因分型描述于现有技术中；参见Kuro-o等人 (1997),Mutation of the mouse klotho gene leads to a Syndrome resembling ageing，Nature 390:45-51。通过用129/Sv-近亲交配的动物反复回交（>9代）制备klothohm-小鼠的同类品系并用于这些研究中。使所述小鼠获取水或以下的水溶液(NH 4)2S04(0.14M)、 順4(：1(0.281〇、順4勵 3(0.281〇、乙酰唑胺(80011^/1)和氯喹二磷酸盐(0.28811^/1111)并用对照 饲料（Sniff,苏斯特（Soest)，德国）饲喂。用NH4C1(0.28M)或乙酰唑胺（800mg/l)处理以亲 代配对开始并且继续从妊娠直至处死子代。
[0089] 1.2血液化学
[0090] 为了采血，将小鼠用乙醚(Roth，卡尔斯鲁厄，德国）麻醉并通过穿刺眼眶后血管丛 将50至200μ1血液样品提取到包含肝素的毛细管中。血浆中的磷酸盐浓度和钙浓度使用分 光光度法(FUJI roc 3500i，Sysmex，诺德施泰特，德国）测定。血浆中的FGF23-浓度和ΡΤΗ-浓度使用市售 ELISA-试剂盒（FGF23: ImmunDiagnos tics，Bos ton，USA; PTH: Immuno topics， San Clemente，USA,MPG:Cloud-Clone Corporation，休斯顿，USA)测定。血衆中的骨化三醇 [1.25(0H)-维生素 D3]的浓度的测量同样使用市售ELISA-试剂盒（IDS，博尔顿，英国）进行。 氨浓度以酶法借助于谷氨酸脱氢酶采用NADPH作为辅因子测量。计算同样采用分光光度法 (ADVIA 1650分析仪，Siemens，费恩瓦尔德，德国）进行。
[0091] 1.3组织学
[0092]为了研究气管、肺、肾、心脏、胃和血管，提取雄性klotho+A-小鼠（8周龄）和雄性 klothohm-小鼠（八周龄）的相应组织，不用和采用（NH4)2S〇4(0 · 14M)、NH4C1 (0 · 28M)、NH4N〇3 (0.28M)和氯喹（0.288mg/ml)的水溶液处理，或在雌性动物中不用或采用乙酰唑胺处理 (800mg/l于饮用水中）灌封到石錯中，切割成2至3μηι的片并用H&E和范库萨染色（von Kossa);参见Mossbrugger等人，（2007)，Standardized morphological phenotyping of mouse models of human diseases within the German Mouse Clinic, Verh.Dtsch.Ges.Pathol.91:98-103〇
[0093] 1.4统计学
[0094] 数据以中值±SEM给出，其中n为独立实验的数目。使用AN0VA或成对或不成对的 Student t检验研究全部数据的显著性。对于寿命的实验而言，使用SAS Jmp第8.0.1版(SAS Institute Inc.，Cary，NC，美国）。只有p〈0.05的结果被认为是统计学显著的。
[0095] a.结果
[0096] klotho是跨膜蛋白，其与β-葡萄糖醛酸酶相关。在具有慢性肾衰竭的患者中观察 到该蛋白产生的减少，这经常伴随有衰退过程，如动脉硬化、骨质疏松症和皮肤萎缩。该蛋 白中的突变可能与衰老过程相关。
[0097] 在所研究的小鼠模型中，klotho表达由于klotho基因中的缺陷大量减少。将经感 染的小鼠称为亚效等位基因小鼠。缺失klotho导致类似于人衰老的综合征。具体而言，在该 动物中观察到（加速）出现组织钙化和/或脉管钙化、动脉硬化、肺气肿、皮肤萎缩、肌无力、 免疫缺陷、不育、脊柱后凸、CaP0 4-代谢紊乱、骨质疏松症、免疫不全(胸腺退化）、听力丧失 和神经退行性病变。此外，受感染的动物具有明显缩短的预期寿命并且是不育的。
[0098] 图1中显示了 TGFmmRNA在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC =人主动脉平滑肌细胞） 中的表达。将细胞用2πιΜβ-甘油磷酸盐处理，以刺激成骨细胞信号转导。提高的磷酸盐浓度 导致TGFmmRNA表达的显著上升。该上升可以通过添加不同的铵盐(0.5mM)(乳酸铵、柠檬酸 铵、硫酸铵)来减轻或者甚至阻止(氯化铵、硝酸铵）。
[0099] 图2中示出了 Runx2mRNA在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC =人主动脉平滑肌细胞） 中的表达。这也由于添加2πιΜβ-甘油磷酸盐提高磷酸盐浓度而导致转录因子的提高的表达， 所述表达又可以通过添加氯化铵、硝酸铵以及硫酸铵来抑制。
[0100] 此外，研究了碱性磷酸酯酶(ALP)在人主动脉平滑肌细胞(HA〇SMC =人主动脉平滑 肌细胞）中的表达（图3)。添加2πιΜβ-甘油磷酸盐又导致提高的ALP mRNA表达。图3A示出了通 过氯化铵、硝酸铵和硫酸铵抑制表达升高。图3B示出了通过氯喹（100μΜ)抑制ALP mRNA表达 升尚。
[0101] 在图4中示出了，转录因子NFAT5在klothohm-小鼠的主动脉中的表达相对于klotho +/+_小鼠明显提高。用NH4C1 (0.28M)处理导致转录水平的正常化。
[0102] 图5示出了 NFAT5和S0X9在人主动脉平滑肌细胞(HAoSMC =人主动脉平滑肌细胞） 中的转录水平。用2πιΜβ-甘油磷酸盐刺激提高了转录水平，而同时用NH4C1处理又降低了表 达。
[0103] 图6示出了 NFAT5、S0X9、Runx2和ALP在人主动脉平滑肌细胞中在用NFAT5转染之后 的转录水平。将细胞用2πιΜβ-甘油磷酸盐刺激再一次地导致各转录水平的提高。而同时用 NH4C1处理使得用空载体转染的细胞的各基因的表达又降低至正常水平，用NFAT5转染的细 胞中的表达仍然保持得较高。
[0104] 图7示出了 NFAT5在人主动脉平滑肌细胞中用TGF0以及2πιΜβ-甘油磷酸盐处理下的 转录水平的提高。虽然用NH4C1处理细胞可以使通过用2πιΜβ-甘油磷酸盐处理触发的NFAT5 转录的提高逆转，然而同时用TGF0处理时的表达仍然明显提高。
[0105] 在图8中显示了未处理的亚效等位基因 klotho-小鼠（klotho1?)相比于其野生型同 窝仔畜（klotho+A)的明显的生长不良。klothohm-小鼠的生长不良可以通过用NH 4C1处理几 乎完全抵消（klothohm NH4C1)。野生型小鼠显示用NH4C1处理没有生长刺激（kl〇th 〇+A NH4C1)。由图8显而易见的是，未处理的klothohm-小鼠（对照）的体重明显低于未处理的 klotho+A-小鼠的体重。在用NH4C1处理的klothohm-小鼠中，可以几乎完全抵消重量不足
[0106] 如下表中所示，未处理的klothohm-小鼠的血液的pH值明显低于未处理的klotho +/+_小鼠。在kl〇th〇+A-小鼠中，施用NH 4C1倾向导致血液中的pH值下降，然而达不到统计学 显著性。与此相应地，用NH4C1处理klothohm-小鼠也导致酸中毒没有明显加重(表1)。
[0107]
[0108] 表1:野生型小鼠（klotho+/+)和亚效等位基因 klotho-小鼠（klothohm)的血液中的 pH值，对所述小鼠施用水或NH4C1水溶液（15g/l)(算术平均值+SEM，η = 4，*p〈0.05指示与饮 水的kl〇th〇+A-动物的统计学上的显著差异）。
[0109] 用乙酰唑胺处理klotho1?-小鼠同样导致动物重量和尺寸的增加。如由图9A显而易 见的是，生长不良不能通过处理而完全平衡。图9B中显示了体重尽管同样可以通过乙酰唑 胺提高，然而动物仍然明显小于kl 〇th〇+A-小鼠。
[0110] 如在图10A中所显示，在klothohm-小鼠的情况下以及在kl〇th 〇+A-小鼠的情况下用 氯化铵处理小鼠导致氨血浆浓度的明显升高。图10B示出了动物的血浆磷酸盐含量，其在 klothohm-小鼠的情况下明显高于klotho+A-小鼠的情况。用NH4C1处理既没有改变klotho +/+_小鼠的血浆磷酸盐含量，也没有改变klothohm-小鼠的血浆磷酸盐含量。如在图10C中所 示出，未处理的klotho hm-小鼠中的Ca++的血浆浓度明显高于klothohm-小鼠中的Ca ++的血浆 浓度。NH4C1-处理倾向于导致klothohm-小鼠的血浆中的Ca ++-浓度降低，然而这没有达到统 计学显著性。同样在图10中显示了 1.25(0H)2D3(骨化三醇）、FGF23和甲状旁腺素的血浆浓 度。在klotho hm-小鼠中比在klotho+/+-小鼠中丄25(0H)2D3和FGF23的浓度明显更高，甲状 旁腺素的浓度明显更低。用NH 4C1处理klothohm-小鼠导致较不明显的激素浓度的改变（图 10D-F)。与此相应地，骨化三醇或者1.25(0H) 2D3和FGF23的血浆浓度即使在NH4C1-处理之后 在klothohm-小鼠中也仍然明显高于在klotho +A-小鼠中。此外，klothohm-小鼠具有明显更 低的血浆中的基质Gla蛋白（MGP)的浓度，通过用NH4C1处理可以使其正常化（图10G)。
[0111] 在图11中显示了各自采用或没用乙酰唑胺处理的kl〇th〇 +A-小鼠和klotho1?-小鼠 的Ca++、磷酸盐和1.25(0H) 2D3的血浆浓度。在此，1.25(0H)2D3的浓度和磷酸盐的浓度均不受 处理的影响。即使经处理的klotho hm-小鼠的钙含量仍然轻微升高，然而未处理的klothohm-小鼠以及k 1 〇tho+A-小鼠均没有显著差异。动物的血浆中的基质G1 a蛋白（MGP)的浓度也可 以通过用乙酰唑胺处理完全正常化。
[0112] 如在图12-18中所示，在具有8周龄的klotho1?-小鼠中在所有经分析的组织中观察 到强烈的钙化，例如在气管、肺、肾、胃和脉管组织中。klotho hm-小鼠中的钙化可以通过用 (NH4)2S〇4(图 12、13)、NH4N〇3(图 13、14、15)和順4(：1(图16)处理而极大地减少。
[0113] 图17同样示出了 klothohm-小鼠的所选择的器官的组织切片。用乙酰唑胺处理动物 同样导致所分析的组织中钙化的明显减少。
[0114] 图18示出了 klothohm-小鼠和用氯喹二磷酸盐处理的klothohm-小鼠所选择的器官 的组织切片。用氯喹盐处理动物同样导致所分析的组织中钙化的明显减少。
[0115] 如在图19中所显示，用(NH4)2S〇4、NH4Cl、NH4N〇3、乙酰唑胺或氯喹处理klotho hm-小 鼠导致预期寿命的显著延长。与平均在66天龄死亡的未处理的klothohm-小鼠相比，用 (NH4) 2S〇4处理动物可以将平均预期寿命延长至129天，用NH4N03处理延长至平均112天（图 19A)(n = 9-14)。同样在另一试验中用NH4C1处理也可以明显延长动物的寿命。虽然所有 klothohm-小鼠 （n = 16)在110天之后死亡，但是直至该时间点所有用NH4C1处理的小鼠 （n = 14)还是幸存的（图19A)。与此相反，未处理的klotho1?-小鼠 （n = 10)在该实验中具有78天的 平均寿命。同样，乙酰唑胺显示出对动物寿命的强烈影响（图19B)，虽然不如用NH4C1处理那 样明显。用乙酰唑胺处理的动物的平均预期寿命为220天。对照组的动物(n = 10)在此在90 天后死亡。到该时间点，所有用乙酰唑胺处理的动物仍然生存。此外还研究了氯喹对 klothohm-小鼠的寿命的影响。在此，klothohm-小鼠的平均预期寿命为69天，而经氯喹二磷 酸盐处理的klotho 1?-小鼠的平均预期寿命提高至90天（图19D)。
[0116] 3.结论
[0117] 本发明人采用硫酸铵、氯化铵(NH4C1 )、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸铵和乳酸 铵提供了适合于防止组织钙化和组织纤维化和延迟与年龄相关的疾病发病并因此延长生 物的寿命的物质。这一方面通过对细胞培养物中钙化标记物和纤维化标记物的表达的影 响，另一方面通过氯化铵和乙酰唑胺对所建立的动物模型的令人印象深刻的效果得以说 明。相应的经处理的动物显示出比未经处理的动物明显减少的老年综合征(通过组织钙化 和脉管钙化而令人印象深刻地说明），并且存活明显更久。
【主权项】
1. 选自以下的物质用于在生物中减少组织钙化和组织纤维化以及用于延迟与年龄相 关的疾病的发病中的用途:硫酸铵、氯化铵、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸铵和乳酸铵。2. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述与年龄相关的疾病选自：动脉硬化、肺气肿、 皮肤萎缩、肌无力、免疫缺陷、不育、脊柱后凸、CaP0 4-代谢紊乱、骨质疏松症、免疫不全(胸 腺退化）、神经退行性病变。3. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述组织纤维化基于选自以下的疾病：肾功能不 全、肝硬化、克罗恩病、纤维化胰腺炎、肺纤维化、心机能不全、瘢痕形成、腹膜透析时的纤维 化、阿尔茨海默氏病。4. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述物质作为有效成分用于药物组 合物中。5. 根据权利要求4所述的用途，其中，所述药物组合物成型为选自如下的应用：口服、直 肠、肠胃外、腹膜内、局部或透皮。6. 根据权利要求4或5所述的用途，其中，所述药物组合物成型为选自如下的剂型:粉末 剂、片剂、糖衆、滴剂、透析液、胶囊、栓剂、溶液剂、注射液、气溶胶、软膏剂、洗剂、硬膏剂、丸 剂、锭剂、改变释放的剂型。7. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述物质作为添加剂用于食品中。8. 制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于减少组织钙化和组织纤维化、用于延 迟生物的与年龄相关的疾病的出现，所述方法包括以下步骤：1. 提供有效成分，和2. 将有效成分配制到药学上可接受的载体中，以获得药物组合物， 其中，所述有效成分选自：硫酸铵、氯化铵、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸铵和乳酸 铵。9. 制备食品的方法，所述食品用于减少组织钙化和组织纤维化、用于延迟生物的与年 龄相关的疾病的发病，所述方法包括以下步骤：1. 提供添加剂，和2. 将所述添加剂引入食物中，以获得食品， 其中，所述添加剂选自：硫酸铵、氯化铵、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸铵和乳酸铵。10. 用于在生物中减少组织钙化和组织纤维化、延迟多种与年龄相关的疾病的发病的 方法，所述方法包括使用选自如下的物质:硫酸铵、氯化铵、乙酰唑胺、氯喹、硝酸铵、柠檬酸 铵和乳酸铵。
【文档编号】A61K31/4706GK105939711SQ201480064440
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2014年9月24日
【发明人】弗洛里安·兰, 克里斯蒂娜·莱布罗克, 艾奥尔娜·阿莱苏坦
【申请人】费森尤斯卡比德国有限公司