一种盐酸伊立替康脂质体组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种盐酸伊立替康脂质体组合物，它含有以下重量配比的成分：盐酸伊立替康1份、氢化大豆磷脂2-6份、胆固醇1.0-2.25份、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.04-0.20份。本发明还提供了该脂质体组合物的制备方法。本发明脂质体的成本显著降低，且脂质体稳定性好、杂质少、安全性高，易于工业化大生产。
【专利说明】
一种盐酸伊立替康脂质体组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物制剂领域。更具体地说，本发明涉及一种盐酸伊立替康脂质体组 合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着全球人口老龄化和物质生活水平的提高，大肠癌的患病率及死亡率在我国乃 至世界有逐渐上升的趋势，是常见的十大恶性肿瘤之一。全世界每年大约有一百万新发病 例，同时至少五十万患者死亡。一般来说，经济发达的国家发病率较高。大肠癌在美国、日 本等发达国家的发病率高，是癌症患者的第二大死亡原因。在我国，近年来大肠癌同肺癌一 样有上升趋势，目前占肿瘤发病率的第四位，消化道肿瘤的第二位，而且平均以年4. 2%的 速度递增。大肠癌在不同地区，其发病率有明显区别，以上海、浙江、福建为高发区。
[0003] 盐酸伊立替康是经过化学修饰的天然喜树碱的衍生物，可特异性地与拓扑异构 酶I结合，后者诱导可逆性单链断裂，从而使DNA双链结构解旋；伊立替康及其活性代谢物 SN-38可与拓扑异构酶I-DNA复合物结合，从而阻止断裂单链的再连接。盐酸伊立替康是一 种疗效确切、毒副作用较小的抗癌新药，晚期大肠癌的特效药，对于含5-氟尿嘧啶化疗失 败的患者，本品可作为二线治疗；对小细胞肺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌及卵巢癌亦有疗效。
[0005] 式1盐酸伊立替康结构
[0006] 盐酸伊立替康属喜树碱类抗肿瘤药物，其结构中的α -羟基丙酯环具有pH依赖 性，生理pH值条件下，α-羟基丙酯环水解，半衰期较短，使抗肿瘤活性大大降低。为了在 病理部位和内部达到其治疗浓度，必需使用高剂量的化疗剂，这将导致更加严重的药物毒 副作用。目前盐酸伊立替康市售制剂只有普通注射液制剂和其冻干粉针，给药后产生骨髓 功能抑制、腹泻、中性粒细胞减少、呼吸困难、肌肉收缩等严重的毒副作用。骨髓抑制会使免 疫系统降低，导致原发和继发细菌、真菌感染等更高的发病率；腹泻严重影响患者的生命质 量，当与骨髓抑制并发时，会威胁患者生命。药物毒性成了盐酸伊立替康注射液化疗的主要 限制，需要通过一定的载体，将伊立替康完整的输送到肿瘤部位（弱酸性环境），使伊立替 康以完整活性药物分子或其活性代谢产物SN-38直接作用于肿瘤细胞，提高抗癌活性。
[0007] 脂质体作为药物载体具有安全无毒、生物相容性好的优点，是靶向给药系统的一 种新剂型，一直是药剂学研究的热点之一。脂质体既能保护被包封的药物避免外界因素 (如pH、酶等）的破坏，又可以将药物选择性地输送到肿瘤部位，发挥治疗作用，且不影响 正常细胞、组织或器官的功能，从而达到提高疗效、减少毒副作用的目的。普通脂质体进入 体内后很快被网状内皮系统吞噬，主要靶向在肝、脾、骨髓等网状内皮系统较为丰富的器官 中，对其他部位的靶向性较差，且在体内易受蛋白、酶等的作用而发生渗漏，影响疗效并使 毒性增大。而长循环脂质体则能够有效避免脂质体被巨噬细胞吞噬，使脂质体顺利到达肿 瘤组织。因此，长循环脂质体具有越来越高的实际应用价值。
[0008] CN1980637A专利采用铵和聚阴离子（或取代的铵盐）梯度法将盐酸伊立替康制 备成脂质体，其中所用的聚阴离子需要经过特定的工艺纯化制得，工艺较为繁琐，且成本昂 贵。专利CN102935066A公开了一种伊立替康脂质体的制备方法，其首先采用mPEG-COOH对 伊立替康进行修饰，然后采用离子梯度法将修饰后的伊立替康制备成脂质体制剂。该制备 工艺繁琐，修饰后的盐酸伊立替康产率、杂质都无法控制。CN102271659B专利公布了一种盐 酸伊立替康脂质体，含有伊立替康或盐酸伊立替康、中性磷脂、胆固醇以及二硬脂酰基磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (mPEG2000-DSPE)，胆固醇与中性磷脂的重量比例为1:3-5,盐酸 伊立替康与mPEG2000-DSPE的重量比例为1:0. 34~0. 38,其通过离子梯度法制备得到，由 于mPEG2000-DSPE的使用量大，导致制备脂质体的成本高。
【发明内容】
[0009] 为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种更经济、合理的盐酸伊立替 康脂质体组合物，制备工艺操作简便、易于放大，制备的脂质体稳定性好、杂质少、安全性 高。本发明另一技术方案是提供了该脂质体组合物的制备方法。
[0010] 本发明提供了一种盐酸伊立替康脂质体组合物，所述的组合物含有以下重量配比 的成分：
[0011] 盐酸伊立替康1份、氢化大豆磷脂2-6份、胆固醇1-2. 25份、二硬脂酰基磷脂酰乙 醇胺-聚乙二醇2000 0. 04-0. 20份。
[0012] 进一步优选地，所述的氢化大豆磷脂与胆固醇的重量配比为2~3. 5:1。
[0013] 进一步优选地，所述的盐酸伊立替康、氢化大豆磷脂的重量配比为1:4~5。
[0014] 更进一步优选地，它含有以下重量配比的成分：
[0015] 盐酸伊立替康1份、氢化大豆磷脂4. 5份、胆固醇1. 286份、二硬脂酰基磷脂酰乙 醇胺-聚乙二醇2000 0.08份。
[0016] 其中，所述脂质体平均粒径50~150nm〇
[0017] 本发明还提供了一种制备所述脂质体的方法，包括如下步骤：
[0018] a、空白脂质体初乳：将氢化大豆磷脂、胆固醇溶解于无水乙醇中，得有机相；注入 硫酸铵溶液中，通过挤出将脂质体处理至50~150nm ;
[0019] b、空白脂质体的铵离子梯度构建：配置pH5. 0~7. 0磷酸盐缓冲液作为置换介质， 通过超滤置换脂质体外水相，使脂质体内外水相铵离子形成梯度差；
[0020] c、载药：将盐酸伊立替康与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的混合溶液 加至具有铵离子梯度差的空白脂质体中，孵育5~30min，即得盐酸伊立替康脂质体。
[0021] 其中，步骤a所述的溶解温度为50~70°C ;所述的硫酸铵溶液的温度为50~ 70 0C ；
[0022] 步骤b所述的梯度差大于IO3倍；
[0023] 步骤c所述的孵育温度为55~60°C，孵育时间为：10min。
[0024] 本发明中，所述挤出设备可以采用本领域任何常规的挤出设备进行。优选地，所述 挤出设备采用ATS脂质体挤出系统。
[0025] 本发明中，所述切向流超滤装置采用Pellicon切向流超滤系统。
[0026] 本发明还提供了一种制剂，包括所述盐酸伊立替康脂质体组合物以及药学上可接 受的载体和辅料，优选所述制剂为静脉注射制剂。
[0027] 本发明还提供了一种制剂，包括所述方法制备的盐酸伊立替康组合物以及药学上 可接受的载体和辅料，优选所述制剂为静脉注射制剂。
[0028] 所述盐酸伊立替康脂质体组合物或所述的制剂在制备用于治疗癌症的药物中的 用途，所述癌症选自大肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌和胃癌。
[0029] 本发明采用药物盐酸伊立替康与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000同时 进行载药，通过实验优化合理处方配比，提高盐酸伊立替康脂质体稳定性，不影响脂质体包 封率，也不额外增加脂质体的高温处理时间，同样使脂质体具备长循环作用，有利于得到质 量好的产品，使得产品成本大大降低，利于工业化生产。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0031] (1)本发明中降低功能材料的使用量，尤其是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇2000的用量，提供一种更经济、合理的原辅料配比，所得盐酸伊立替康脂质体包封率高、 稳定性好、成本低。
[0032] (2)制备工艺简单：采用有机溶剂注入法，通过挤出设备进行粒径控制，省去了均 质过程，避免脂质体因高温、长时间受热氧化产生杂质等（如溶血性磷脂酰胆碱），有利于 得到高质量的产品。
[0033] (3)延长药物半衰期、提高治疗指数：经mPEG2000-DSPE修饰的脂质体可避免网状 内皮系统的吞噬而达到肿瘤部位，延长体内滞留时间，维持肿瘤部位一定的血药浓度，提高 治疗指数、降低毒副作用。
【附图说明】
[0034] 图1盐酸伊立替康脂质体粒径分布图（处方3#);
[0035] 图2盐酸伊立替康脂质体粒径分布图（样品C);
[0036] 图3盐酸伊立替康脂质体与盐酸伊立替康普通注射液大鼠体内血药浓度时间曲 线。
【具体实施方式】
[0037] 下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0038] 盐酸伊立替康为连云港杰瑞药业有限公司生产。氢化大豆磷脂为Lipoid公司生 产。胆固醇为日本精华株式会社生产。mPEG2000-DSPE为Lipoid公司生产。
[0039] 实施例1本发明脂质体辅料氢化大豆磷脂（HSPC)、胆固醇重量比对盐酸伊立替 康脂质体的影响
[0040] 表 1 [0041 ]
[0042] 制备工艺：
[0043] 空白脂质体制备：将表1中处方量的氢化大豆磷脂、胆固醇溶解于65°C无水乙醇 中，得有机相，将其注入50-70°C硫酸铵溶液中（有机相与硫酸铵溶液的体积比为1:5)，用 2张 0. 1 μ m挤出膜在挤出器上挤出，使粒径为80~120nm。以pH5. 0-7. 0磷酸盐缓冲液作 为置换介质，采用切向流超滤装置（Pellicon切向流超滤系统）对脂质体进行置换透析，使 脂质体内外水相铵离子梯度差大于1〇 3,得到空白脂质体。
[0044] 载药：将表1中的处方量盐酸伊立替康和mPEG2000-DSPE混合液加至具有铵离子 梯度差的空白脂质体中，55~60°C孵育lOmin，即得盐酸伊立替康脂质体，过0. 2 μ m滤膜除 菌，充氮气灌封，即得盐酸伊立替康脂质体注射液，1-4#的伊立替康脂质体注射液的粒径、 PDI和包封率见表2。
[0045] 【粒径测定】取本品适量，注射液用水稀释后采用马尔文粒径仪（Nano S90)进行粒 径测定。粒径大小以强度径（Intensity)表示。
[0046] 【包封率】取F1D-IODesalting columns预装柱1根，25mL去离子水冲洗平衡。取 样0.1 mL上柱，保持1~2min后，用PBS洗脱，ImL/次收集前6mL置25mL容量瓶中，用溶剂 稀释定容后，取5mL至IOmL容量瓶中，定容，作为包封药物样品，继续洗脱，收集后24mL洗 脱液至25mL容量瓶中，用溶剂定容，作为游离药物样品。另取样品0.1 mL至25mL量瓶中， 溶剂定容，作为未过柱样品。采用紫外-可见分光光度法进行测定，按照下述公式计算包封 率。
[0047] 包封率=W(W+Wf) X 100%
[0048] 其中，W为包封药物量，Wf为游离药物量。
[0049] 表 2
[0050]
[0051] 由结果可知，在一定范围内处方中胆固醇比例增加可提高脂质体包封率，控制 HSPC与胆固醇的重量比在2:1~3. 5:1 (1#、2#、3#)范围内可得到比较高的包封率，且粒径 分布较好（其中处方3#脂质体粒径分布图见图I)，4#处方包封率较低，其中将近9%的药 物处于游离状态。
[0052] 实验例2本发明脂质体药脂比对盐酸伊立替康脂质体的影响
[0053] 将表3的处方按照实施例1相同的制备方法制备盐酸伊立替康脂质体。所制备的 脂质体的各项指标见表4。
[0054] 表 3
[0058] 由上述实验结果可知，药脂比为1:4. 5时，盐酸伊立替康脂质体的包封率达99% 以上，降低处方中磷脂比例，药脂比为1:4时，包封率仅91. 05%。当药脂比为1:6时，虽然 包封率也达到99. 20%，但磷脂使用量大，成本较高。因此优选药脂比为1:4. 5。
[0059] 实施例3本发明制备工艺对盐酸伊立替康脂质体中溶血性磷脂酰胆碱的影响
[0060] 表 5
[0062] 制备
[0063] 样品a :按照表5的处方，制备工艺同实施例1，得到样品a。
[0064] 样品b :空白脂质体制备：将氢化大豆磷脂、胆固醇溶解于无水乙醇中，得有机相， 将其注入上述处方的硫酸铵溶液中，即得空白脂质体初乳，采用高压均质机对初乳进行高 压均质处理，500Bar均质3次，1000 Bar均质均质3次，之后采用2张0. 1 μ m挤出膜在挤出 器上挤出使粒径为80~120nm。以pH5. 0-7. 0磷酸盐缓冲液作为置换介质，采用切向流超 滤装置对脂质体进行置换透析，使脂质体内外水相铵离子梯度差形成大于1〇3,得到空白脂 质体。
[0065] 载药：同实施例1，得到样品b。
[0066] 溶血磷脂测定：
[0067] 照高效液相色谱法（中国药典2000年版二部附录V D)测定。
[0068] 色谱条件与系统适用性试验用氨基丙基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲 醇-0. 008mol/L磷酸铵缓冲液（0. 092 %磷酸水溶液，以氨试液调节pH值至4. 5) (69:26:5) 为流动相；用示差折光检测器；柱温为30°C;溶血卵磷脂的两异构体（LPCl和LPC2)峰之间 的分离度应符合规定。
[0069] 对照品溶液的制备取单肉豆蔻酰卵磷脂对照品约20mg，精密称定，置100mL量瓶 中，加氯仿-甲醇（1:2)溶解并稀释至刻度，摇匀。按下式计算对照品溶液中溶血卵磷脂的 浓度（mg/ml):
[0070] (W*520*1000)/(100*468)
[0071] W为取单肉豆蔻酰卵磷脂对照品取样量（g)
[0072] 520为溶血卵磷脂分子量
[0073] 468为单肉豆蔻酰卵磷脂分子量
[0074] 测定法精密量取本品2ml，置IOml量瓶中，加氯仿-甲醇（1:2)稀释至刻度，摇匀， 作为供试品溶液，量取100 μ 1注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液同法测定。按 外标法以峰面积计算供试品中溶血卵磷脂。
[0075] 样品a与样品b的质量情况如表6 :
[0076] 表 6
[0078] 由上述实验结果可知，未经均质而直接采用挤出工艺所得到的脂质体样品a溶血 性磷脂酰胆碱的含量为0. 20mg/mL，样品b溶血性磷脂酰胆碱含量为0. 58mg/mL，与样品a 相比，样品b的溶血性磷脂酰胆碱偏高（将近样品a的3倍），产品质量存在风险。
[0079] 实施例4本发明脂质体mPEG2000-DSPE处方量对盐酸伊立替康脂质体的影响
[0080] 将表7的处方按照实施例1相同的制备方法制备盐酸伊立替康脂质体。所制备的 脂质体的各项指标见表8。
[0081] 表 7
[0083] 制备方法参考实施例1，所制备的脂质体的各项指标见下表。
[0084] 表 8
[0085]
[0086] 由上述结果可知，mPEG2000-DSPE处方所占比例较小，对盐酸伊立替康脂质体产品 的质量指标无影响，需要体内动物实验验证产品优劣，其中样品C的粒径分布见图2。
[0087] 以下通过药动学试验证明本发明的有益效果。
[0088] 试验例1本发明脂质体中mPEG2000-DSPE处方量对大鼠体内药动学的影响
[0089] 【样品】
[0090] 1.盐酸伊立替康脂质体注射液（实施例4中样品A、样品B、样品C、样品D、样品E 和样品F);
[0091] 2.盐酸伊立替康注射液。
[0092] 【试验方案】
[0093] SD大鼠（四川科伦药物研究院有限公司药理研究部），雄性，体重：（300±50)g。给 药前禁食12h。将21只大鼠随机分为7组，每组3只，分别尾静脉注射6mg/kg的盐酸伊立 替康脂质体样品A、B、C、D、E、F和参比制剂（盐酸伊立替康普通注射液），给药速度为2~ 4ml/min，于给药前及给药后 5min、0. 25h、0. 5h、lh、2h、4h、8h、24h、48h 尾静脉米血 0. 4mL 于 肝素化的离心管中。将血液4000rpm离心10min，分离血浆。血浆保存于-80°C冰箱待测。 建立血浆样品处理方法学和检测方法，LC/MS检测血药浓度，采用Winnonlin软件进行统计 学处理。
[0094] 【试验结果】
[0095] 结果表明盐酸伊立替康脂质体样品A的半衰期为2. 46h，样品B的半衰期为 4. llh，样品C的半衰期为7. 13h (样品C药时曲线见图3)，样品D的半衰期为7. 24h，样品 E的半衰期为7. 36h，样品F的半衰期为7. 41h，而参比制剂普通注射液半衰期为0. 96h，
[0096] 制备成盐酸伊立替康脂质体后，其半衰期较参比制剂有显著提高；采用功能性磷 脂mPEG2000-DSPE修饰脂质体，其半衰期较没有修饰样品A脂质体又有大幅度提升，当盐酸 伊立替康与mPEG2000-DSPE质量比多0. 04时，半衰期基本趋于稳定，增长幅度不大。综上 所述，采用mPEG2000-DSPE修饰的盐酸伊立替康脂质体具有长循环作用。
[0097] 试验例2本发明脂质体与已报道伊立替康脂质体的成本对比分析
[0098] 专利CN102271659B报道伊立替康脂质体处方，其中长循环功能材料 mPEG2000-DSPE处方量是本专利的1. 7~9. 5倍左右【本专利最优选处方的4. 25~4. 75 倍】，该材料为合成磷脂，制备较为困难，价格昂贵，其处方量的增加，会大大增加产品成本。 本研究通过提高氢化大豆磷脂和胆固醇的用量，降低长循环功能材料的用量，在保证较高 的包封率和稳定性的前提下，显著降低了成本。本专利处方与CN102271659B报道伊立替康 脂质体处方成本明细如下：
[0100] 通过上表分析结果可知，本发明脂质体的成本显著降低，且脂质体稳定性好、杂质 少、安全性高，易于工业化大生产。
【主权项】
1. 一种盐酸伊立替康脂质体组合物，其特征在于：所述组合物含有以下重量配比的成 分： 盐酸伊立替康1份、氢化大豆磷脂2-6份、胆固醇1-2. 25份、二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇 20000. 04-0. 20 份。2. 根据权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于：所述的氢化大豆磷脂与胆固醇 的重量配比为2~3. 5:1。3. 根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其特征在于：所述的盐酸伊立替康、氢化 大豆磷脂的重量配比为1:4~5。4. 根据权利要求1或2所述的脂质体组合物，其特征在于：所述组合物含有以下重量 配比的成分： 盐酸伊立替康1份、氢化大豆磷脂4. 5份、胆固醇1. 286份、二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇20000. 08份。5. 根据权利要求1-4任意一项所述的脂质体组合物，其特征在于：所述脂质体平均粒 径 50 ~150nm。6. -种制备权利要求1-4任意一项所述脂质体组合物的方法，其特征在于：包括如下 步骤： a、 空白脂质体初乳：将氢化大豆磷脂、胆固醇溶解于无水乙醇中，得有机相；注入硫酸 铵溶液中，通过挤出将脂质体处理至50~150nm ; b、 空白脂质体的铵离子梯度构建：配置pH5. 0~7. 0磷酸盐缓冲液作为置换介质，通过 超滤置换脂质体外水相，使脂质体内外水相铵离子形成梯度差； c、 载药：将盐酸伊立替康与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的混合溶液加至 具有铵离子梯度差的空白脂质体中，孵育5~30min，即得盐酸伊立替康脂质体。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述的溶解温度为50~70°C; 所述的硫酸铵溶液的温度为50~70°C ;步骤b所述的梯度差大于103倍；步骤c所述的孵 育温度为55~60°C，孵育时间为：10min。8. -种制剂，包括根据权利要求1-5任一项权利要求所述盐酸伊立替康脂质体组合物 以及药学上可接受的载体和/辅料，优选所述制剂为静脉注射制剂。9. 一种制剂，包括根据权利要求6或7任一项所述方法制备的盐酸伊立替康组合物以 及药学上可接受的载体和/辅料，优选所述制剂为静脉注射制剂。10. 权利要求1-5任一项所述的盐酸伊立替康脂质体组合物或权利要求8或9所述的 制剂用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自大肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌和 胃癌。
【文档编号】A61P35/00GK105982857SQ201510068483
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】苏正兴, 赵栋, 张瑞霞, 陈际园, 王利春, 王晶翼
【申请人】四川科伦药物研究院有限公司