放射性碘化氟维司群及其制备方法
【专利摘要】本发明创新性地提出放射性碘化氟维司群及其制备方法，以保证所得碘化氟维司群具有稳定的化学性质，并且保留了原氟维司群与雌激素依赖性乳腺癌细胞结合的能力。该放射性碘化氟维司群由131I标记，标记率为60.56±1.2%。所述放射性碘化氟维司群的制备方法，包括以下步骤：溶液配置、碘化反应、终止碘化反应、分离纯化，得到放射性碘化氟维司群溶液，即得到由131I标记的氟维司群溶液。
【专利说明】
放射性硕化氣维司群及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及放射性舰标记药物，具体设及放射性舰化氣维司群及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 放射性标记化合物是核医学研究的重要手段，其所依赖的放射性核素标记技术是 指将某种放射性核素 W-定的化学形式引入到另一物质的分子之中，使之成为该物质分子 中的重要组成部分的一口技术目前，该技术已广泛应用于医学研究和临床实践当中， 如核素示踪、淋己管显影、肿瘤核素成像、代谢显像、功能显像、药代学研究、受体配体研究、 神经递质研究、肿瘤放射免疫治疗RIT(Radioimmunotherapy RIT)等领域。
[0003] 由于核素种类繁多，在应用放射性标记化合物时，要根据具体的需求选择恰当的 核素。RIT对核素的要求包括:a,易于标记，且标记后对被标记物的理化性质及生物学效能 影响小;b，有恰当的半衰期，W便核素标记物能有足够时间浓聚于病灶内发挥作用;C，衰变 时产生的福射射程短、能量大，W便能有效消灭目的细胞而又保护正常组织。放射性舰有3 种同位素，分别是uil、i25I和1231。其中，uil的半衰期为8.04天，主要释放最大能量为607肪￥ 的0射线;1251的半衰期为60.2天，主要释放35.5KeV的丫射线;1231半衰期为13小时，只产生 能量为159KeV的丫射线。不难看出，uil是当中最适合用于RIT的放射性舰同位素。
[0004] 乳腺癌内分泌治疗始于1896年Beatson用卵巢切除治疗晚期乳腺癌，到上世纪70 年代药物去势出现后，现在运一术式已基本放弃。药物去势主要有两种方式，一为与雌激素 竞争性结合ER，另一为通过干预雌激素的合成直接减少体内雌激素水平。前者的代表性药 物为他莫昔芬，后者的代表性药物为芳香化酶抑制剂，如来曲挫、阿那曲挫
[0005] 氣维司群是2002年首先在美国上市的乳腺癌内分泌治疗药物，具有与雌激素竞争 性结合雌激素受体巧R)的能力。一些研究尚提示氣维司群具有下调雌激素受体蛋白表达的 作用。本品单次肌注后血浆浓度约在7天后达峰值，并维持至少1个月，谷浓度约为峰浓度的 1 /3，半衰期约为40天。一月1次肌注本品250mg，血浆浓度约在3~6次剂量后达稳态，多次剂 量后的AUC是单次剂量的2.5倍，谷浓度与单次剂量的峰浓度相当。而类似的他莫昔芬口服 给药，通常每日2次，每次lOmg，半衰期时目大于7天，α相为7-14小时。
[0006] 正常情况下体内除甲状腺外，均缺乏对uil的特异吸收和结合能力，为此必须将 uil标记到适当的载体上。氯胺T法标记效率高，重复性好，试剂便宜易得，是目前使用最多 的舰标记方法。氯氨-T(Ch--T)是一种溫和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使舰阴离 子氧化成舰分子。运种活性舰可取代肤链上酪氨酸苯环上径基位的一个或两个氨，使之成 为含有放射性舰化酪氨酸的多肤链，但由于氣维司群在水中溶解度差，采用传统的化-T法 (所有物质均在水相中）根本无法进行放射性舰标记，在现有放射性舰标记药物的合成方法 中，没有一种较好的放射性舰化氣维司群的合成方法，W保证所得产品舰化氣维司群具有 稳定的化学性质，并且保留了原氣维司群与雌激素依赖性乳腺癌细胞结合的能力。
【发明内容】
[0007] 本发明创新性地提出放射性舰化氣维司群及其制备方法，W保证所得舰化氣维司 群具有稳定的化学性质，并且保留了原氣维司群与雌激素依赖性乳腺癌细胞结合的能力。
[0008] 本发明放射性舰化氣维司群，其特征在于，所述放射性舰化氣维司群由uil标记。
[0009] 进一步的，所述uil对氣维司群标记率为60.56± 1.2%。
[0010] 本发明还包括放射性舰化氣维司群的制备方法，其特征在于，包括W下步骤：
[00川 S1、溶液配置：
[0012] 氣维司群溶液：精密称取原料药级2mg氣维司群，Wlml无水乙醇溶解，终浓度为 地化；
[0013] 化-T溶液:精密称取分析纯2mg氯胺T溶入乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的混合液1ml， 浓度为2g/L，所述乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的体积比为1:1;
[0014] 偏重亚硫酸钢溶液:精密称取偏重亚硫酸钢2mg溶入乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的混 合液1ml，浓度为2g/L，所述乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的体积比为1:1;
[0015] S2、舰化反应，将20化1氣维司群溶液与Imci化uil充分混合后，再加入新鲜配制 的10化1的化-T溶液，振荡混匀后，室溫下反应5min;
[0016] S3、终止舰化反应，加入20化1偏重亚硫酸钢溶液，终止舰化反应；
[0017] S4、分离纯化，得到放射性舰化氣维司群溶液，即得到由uil标记的氣维司群溶液。 [001引进一步的，步骤51中憐酸盐缓冲液口85的浓度为0.05臟01/1，口巧直为7.5。
[0019]进一步的，步骤S2的舰化反应在PH值为7.5、室溫、反应时间5分钟及总反应体积 500ul的条件下进行。
[0020] 进一步的，步骤S4中分离纯化包括W下步骤：
[0021] S41、葡聚糖凝胶微珠制备：
[0022] a)乙醇浸泡:称取15g型号为Se地adex G15葡聚糖凝胶干粉，在室溫下，将干粉完 全浸泡于50%的乙醇中24小时，并不断揽拌W保证凝胶溶胀，用双蒸水洗去残存的乙醇，滤 干；
[0023] b)双蒸水浸泡：将乙醇浸泡后的凝胶完全浸泡于双蒸水中，在室溫下充分溶胀24 小时，间歇揽拌，W保证凝胶的完全溶胀；
[0024] C)盐酸浸泡:将双蒸水浸泡后的凝胶完全浸泡于0.2N的肥1中，在常溫下浸泡12小 时，间歇揽拌，滤干，蒸馈水洗至中性；
[0025] d)将洗至中性的凝胶真空抽滤，脱气后，将其完全浸泡于浓度为0.05mol/l的憐酸 盐缓冲液PBS中；
[0026] S42、装柱
[0027] 将层析柱洗净惊干并固定，保留约2cm高度的洗脱液，沿内壁将凝胶缓缓注入柱 中，至柱床高度达到20cm;过程中严防气泡产生，最后W2倍柱床体积洗脱液平衡;所述层析 柱规格为内径为10mm，高度为500mm;
[002引S43、加样品
[0029]打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出 口，取步骤S3中的混合液0.5ml，小屯、地加于凝胶表面上，切勿揽动层析柱床表面;打开下端 出口，使样品溶液进入凝胶内，当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口，缓 慢加入无水乙醇60ml，打开下端出口，调整螺旋夹控制流出速度为0.5ml/min，开始W5ml试 管收集流出液，将装有流出液的试管立即上机检测放射活度;并将放射性活度最高的那一 只试管所装流出液视为本发明方法所制备的放射性舰化氣维司群溶液，即由uil标记的氣 维司群溶液。
[0030] 本发明放射性舰化氣维司群及其制备方法的有益技术效果是所得放射性舰化氣 维司群具有稳定的化学性质。保留了原氣维司群与雌激素依赖性乳腺癌细胞结合的能力。
【附图说明】
[0031] 附图1为uil标记纸层析法测定结果(5次)图；
[0032] 附图2为Nai"I对照组纸层析结果图；
[0033] 附图3为分子筛柱层析结果图；
[0034] 附图4为氣维司群标准品检测质谱图；
[0035] 附图5为舰化反应后化合物检测的质谱图；
[0036] 附图6为2地纸层析结果图；
[0037] 附图7为4她纸层析结果图；
[0038] 附图8为7化纸层析结果图；
[0039] 附图9为96h纸层析结果图；
[0040] 附图10为12化纸层析结果图；
[0041 ] 附图11为对照组纸层析结果显示uil-化Ivestrant和舰化钢出现位置图；
[0042] 附图12为uil-fulvestrant与MCF-7细胞结合能力检测结果图；
[0043] 附图13为对照组NaUil与MCF-7细胞结合情况检测结果图。
【具体实施方式】
[0044] 放射性舰化氣维司群的制备方法，包括W下步骤：
[0045] S1、溶液配置：
[0046] 氣维司群溶液:精密称取2mg氣维司群，Wlml无水乙醇溶解，终浓度为2g/L;
[0047] 化-T溶液:精密称取氯胺T 2mg溶入乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的混合液1ml，浓度为 2g/L，其中乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的体积比为1:1，憐酸盐缓冲液PBS的浓度为0.05mmol/ 1，口助7.5;
[0048] 偏重亚硫酸钢溶液:精密称取偏重亚硫酸钢2mg溶入乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的混 合液1ml，浓度为2g/L，其中乙醇与憐酸盐缓冲液PBS的体积比为1:1，憐酸盐缓冲液PBS的浓 度为 0.05mmol/L;
[0049] S2、舰化反应，将20化1氣维司群溶液与Imci化1311充分混合后，再加入新鲜配制 的10化1的化-T溶液，振荡混匀后，室溫下反应5min;
[0050] S3、终止舰化反应，加入20化1偏重亚硫酸钢溶液，终止舰化反应；
[0051 ] S4、分离纯化，得到放射性舰化氣维司群溶液。
[0052] S41、葡聚糖凝胶微珠制备：
[0053] e)乙醇浸泡：称取15gSephadex G15葡聚糖凝胶干粉，在室溫下，将干粉浸泡于 50%乙醇中24小时，并不断揽拌W保证凝胶溶胀，用双蒸水洗去残存的乙醇，滤干；
[0054] f)双蒸水浸泡:将乙醇浸泡后的凝胶置于双蒸水中，在室溫下充分溶胀24小时，间 歇揽拌，w保证凝胶的完全溶胀；
[0055] g)盐酸浸泡:将双蒸水浸泡后的凝胶置于0.2N HC1中，在常溫下浸泡12小时，间歇 揽拌，滤干，蒸馈水洗至中性；
[0056] h)将洗至中性的凝胶真空抽滤，脱气后，保存于0.05m〇Vl憐酸盐缓冲液PBS中；
[0057] S42、装柱
[0058]将层析柱洗净惊干并固定，保留约2cm高度的洗脱液，沿内壁将凝胶缓缓注入柱 中，至柱床高度达到20厘米;过程中严防气泡产生，最后W2倍柱床体积洗脱液平衡;所述层 析柱规格为内径为10mm，高度为500mm;
[0059] S43、加样品
[0060] 打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出 口，取步骤S3中的混合液0.5ml，小屯、地加于凝胶表面上，切勿揽动层析柱床表面;打开下端 出口，使样品溶液进入凝胶内，当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口，缓 慢加入无水乙醇60ml，打开下端出口，调整螺旋夹控制流出速度为0.5ml/min，开始W5ml试 管收集流出液，将装有流出液的试管立即上机检测放射活度;并将放射性活度最高的那一 只试管所装流出液视为本发明方法所制备的放射性舰化氣维司群溶液，即由uil标记的氣 维司群溶液。
[0061] 为保证本发明方法制取的放射性舰化氣维司群溶液能够满足治疗要求，对放射性 舰化氣维司群溶液性能进行各项检测，实验结果如下
[0062] 1、纸层析法对5次uil标记反应及NaUil对照放射活度测定结果如下：
[0063] 5次uil标记反应反应后行纸层析，20个纸条带依次检测放射性计数，结果如表1.1 及图1和图2所示：
[0064] 表1 5次1"1标记反应后纸层析结果(cpm，x±.sd，.n = 5)
[0065] T曰blelp曰per chromatographic consequence 邑roup(5times)
[0066]
[0067] 由上表和附图1、2可知，通过舰化反应生成了另外一种标记了 1叫的物质，经纸层 析检测，标记率达到60.56 ± 1.2 %。
[0068] 2、葡聚糖凝胶分子筛柱层析分离及纯化结果
[0069] 由附图3可知，舰化反应液柱层析洗出液丫计数表现双峰，第一峰与对照组游离舰 峰出现部位一致，证实为游离舰;计算得出标记率为62.34±1.8%，与纸层析结果一致，并 由此获得纯化舰化物。
[0070] 3、液质联用仪质谱分析检测结果
[0071] 由附图4可知：质谱图中有两个主峰，一个出现在605.5处，另一个出现在641.4处， 前者为氣维司群（分子量为606.77)，后者推测为含氯离子的氣维司群（氯离子原子量为 35.5)。
[0072] 舰化反应后，对纯化后的化合物进行检测的质谱图，附图5中可见四个主峰，分别 出现在130.9、605.5、641.4及737.4处，将两幅质谱图进行比较，发现舰化后化合物的质谱 图中在737.4处出现的峰，在附图4中没有，对该峰进行分析，已知氣维司群的分子量为 606.77,图为负离子法检测，因此检测分子量应该加一个H，即737.4-606.77+1 = 131.93， 而uil的分子量为131，从分子量的变化可W推测，舰化反应后，氣维司群分子结合上了舰， 成为"il-fulvestrant。130.9的峰属于1"1，系从i"I-fulvestrant分子上击落的离子。
[0073] 4、i3il-fulvestrant 的稳定性检测
[0074] 由附图6-11可知，在2地、4她、72h 3个时间点对舰化反应产品进行纸层析和放射 强度检测均表现为单峰，9化时有弱第二峰出现，120h时第二峰有所加强。与对照组相比第 二峰出现在层析条带的游离舰范围。表明舰化产物72小时内稳定，9化开始有缓慢分解。另 外，放射活度的逐日下降符合1叫衰变规律。说明在生成后120小时内uil-fulvestrant能保 持稳定化学结构。
[0075] 同时测定的放化纯度见表，120h内的放化纯度虽逐日下降，但无显著统计学差异 (p>0.05)
[0076] 表2为放化纯度测定结果表。
[0077] 表2放化纯度测定结果G + sd,n = 3)
[0078] Tab2radiochemical purity testin邑 result(jc±幼n = 3)
[0079]
[0080] 5、氣维司群与MCF-7细胞结合能力的检测
[0081 ] 6个uil-化Ives化ant剂量组与化uil组分别收集的细胞和培养液检测结果如下 表。可见i"I-化Ives化ant组MCF-7细胞的放射性活度随放射剂量的增加而增加，达到顶峰 时继续增加幅度快速下降，而培养液组反射性活度低剂量组较低，2μα后则快速增加。舰化 钢组细胞放射活度始终处于低水平，而培养液内放射性活度呈线性快速增加。表明MCF-7细 胞对i"I-fulvestrant有吸收能力。
[0082] 表3培养液和细胞丫计数测定结果(cpm，_T±sd，n = 3)
[0083] TabSradioactivity testing result of culture solution and cell(cpm, 乂'+ sd，']n = 3)
[0084]
[0085] *i"I-FVT即舰化氣维司群。
[00化]由附图12、附图13和表3可见，i"I-化Ivestrant组中，uil-fulvestrant能够与乳 腺癌MCF-7细胞结合，但结合能力并不随加入的i"I-化Ivestrant的量的增加而增加，而是 在化Ci剂量时达高峰，表现出饱和性;随着剂量的增加，结合的量略有下降。而对照组则反 映出MCF-7细胞摄取NaUil的能力极弱，培养液内的放射强度与加入的总量呈现良好的正相 关关系。
[0087] 上述实验结果表明通过氯胺-T法对氣维司群进行放射性舰标记，在室溫环境、ph 值7.5、反应体积500ul、控制舰化反应时间为5min的条件下，可对氣维司群进行比较稳定 的uil标记，通过纸层析及分子筛柱层析检测，标记率可达到60%左右，通过分子筛柱层析 和高效液相色谱复检结果基本一致。uil-fulvestrant化学结构稳定，72小时的检测结果表 明标记到氣维司群的舰原子并未脱标，之后方才有游离舰释出。细胞结合试验的结果证 明uil-化Ivestrant仍然具有与雌激素依赖性乳腺癌细胞结合的能力，并显示饱和性，符合 配体受体结合规律。
[0088] 由于舰化反应发生时，uil与普通舰原子并无特异性，因而化uil越新鲜越好，即要 求具有较高的放射性比活度。当然，并不要求每一个被标记物都应当被标记上核素，对于氣 维司群，临床应用时每月肌注250mg，但即便仅仅Img被全部标记上uil，其放射强度将达到 超过了生物承受能力的25000mci，事实上临床应用uil治疗甲状腺癌时所用放射剂量仅为 50到lOOmci，换算一下，只需要4ug氣维司群被舰化即可达到运一放射剂量要求。因而一般 研究中均更加关注舰化率，即舰化产品放射活度与总放射活度的比值。
[0089] 本发明具有如下的有益技术效果：
[0090] 1、创新性提出了放射性舰化氣维司群及其制备方法，为uil应用于乳腺癌的治疗 研究提供了一个可靠的方法和技术保障。
[0091] 2、所得放射性舰化氣维司群具有稳定的化学性质。
[0092] 3、保留了原氣维司群与雌激素依赖性乳腺癌细胞结合的能力。
【主权项】
1. 一种放射性碘化氟维司群，其特征在于，所述放射性碘化氟维司群由1311标记。2. 根据权利要求1所述的放射性碘化氟维司群，其特征在于，所述1311对氟维司群标记 率为 60·56±1·2%。3. -种放射性碘化氟维司群的制备方法，其特征在于，所述放射性碘化氟维司群如权 利要求1或2所述，包括以下步骤： 51、 溶液配置： 氟维司群溶液:精密称取原料药级2mg氟维司群，以lml无水乙醇溶解，终浓度为2g/L; Ch-T溶液:精密称取分析纯2mg氯胺T溶入乙醇与磷酸盐缓冲液PBS的混合液lml，浓度 为2g/L，所述乙醇与磷酸盐缓冲液PBS的体积比为1:1; 偏重亚硫酸钠溶液:精密称取偏重亚硫酸钠2mg溶入乙醇与磷酸盐缓冲液PBS的混合 液lml，浓度为2g/L，所述乙醇与磷酸盐缓冲液PBS的体积比为1:1; 52、 碘化反应，将200μ1氟维司群溶液与lmci NamI充分混合后，再加入新鲜配制的100 μL的Ch-T溶液，振荡混匀后，室温下反应5min; 53、 终止碘化反应，加入200μ1偏重亚硫酸钠溶液，终止碘化反应； 54、 分离纯化，得到放射性碘化氟维司群溶液，即得到由1311标记的氟维司群溶液。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中磷酸盐缓冲液PBS的浓度为 0.05臟〇1/1，卩!1值为7.5。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2的碘化反应在ΡΗ值为7.5、室 温、反应时间5分钟及总反应体积500ul的条件下进行。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中分离纯化包括以下步骤： 541、 葡聚糖凝胶微珠制备： 乙醇浸泡:称取15g型号为Sephadex G15葡聚糖凝胶干粉，在室温下，将干粉完全浸泡 于50%的乙醇中24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用双蒸水洗去残存的乙醇，滤干； 双蒸水浸泡:将乙醇浸泡后的凝胶完全浸泡于双蒸水中，在室温下充分溶胀24小时，间 歇搅拌，以保证凝胶的完全溶胀； 盐酸浸泡:将双蒸水浸泡后的凝胶完全浸泡于0.2N的HC1中，在常温下浸泡12小时，间 歇搅拌，滤干，蒸馏水洗至中性； 将洗至中性的凝胶真空抽滤，脱气后，将其完全浸泡于浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓 冲液PBS中； 542、 装柱 将层析柱洗净晾干并固定，保留约2cm高度的洗脱液，沿内壁将凝胶缓缓注入柱中，至 柱床高度达到20cm;过程中严防气泡产生，最后以2倍柱床体积洗脱液平衡;所述层析柱规 格为内径为1〇臟，高度为500 mm; 543、 加样品 打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口，取 步骤S3中的混合液0.5ml，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面;打开下端出口， 使样品溶液进入凝胶内，当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口，缓慢加入 无水乙醇60ml，打开下端出口，调整螺旋夹控制流出速度为0.5ml /min，开始以5ml试管收 集流出液，将装有流出液的试管立即上机检测放射活度;并将放射性活度最高的那一只试
【文档编号】A61K51/04GK105999315SQ201610570996
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月20日
【发明人】印国兵, 罗婧, 曾斌
【申请人】重庆医科大学附属第二医院