一种中药制剂及其制备与应用
【专利摘要】本发明公开了一种中药制剂及其制备与应用，所述由如下重量配比的原材料制成：黄芪20?30份、南沙参20?30份、北沙参20?30份、百合10?20份、石斛5?15份、紫菀10?20份、枇杷叶10?20份、苦杏仁10?20份、百部10?20份、当归10?20份。具有清肺止咳平喘、益气养阴活血功效。服用后，通过药物可以直接作用于放射性肺炎的病变部位，抑制肺泡壁毛细血管炎性细胞渗出，肺间质充血、出血、水肿及肺泡结构破坏，降低TLR4信号传导通路信号分子蛋白和局部肺组织相关细胞的细胞因子的表达，从而减轻肺部炎症反应，达到延缓或治疗放射性肺炎的目的。
【专利说明】
一种中药制剂及其制备与应用 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及一种中药制剂，特别涉及一种中药制剂及其制备与在防治放射性肺炎 中的应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 肺癌等胸部恶性肿瘤发病率呈逐年上升趋势，成为危害健康的重要因素之一。放 疗是其重要的治疗手段之一，放射性肺炎是胸部恶性肿瘤经放射治疗后常见的并发症，其 发生率达5%至15%，常引起严重的临床后果。轻者无明显症状，重者可引起肺广泛纤维化， 呼吸功能障碍，甚至呼吸衰竭。
[0003] 目前对放射性肺炎的治疗主要是使用肾上腺皮质激素，激素具有强大的抗炎作 用，但是长期使用激素会导致对其依赖性，并产生较大副作用。中医认为辐射属于中医的 "火热毒邪"，病机为肺热血淤、气阴两伤、肺失宣肃。近些年发现放射性肺炎中医治疗具有 较好的效果，无明显副作用，成本亦低，故从中医方面治疗放射性肺炎具有一定的前景。 (三)
【发明内容】
[0004] 本发明目的是针对目前医疗技术的有限性，提供一种不但能够起到抗放射性肺损 伤作用，而且具有提高免疫力、减少肿瘤复发和转移的有效的、副作用小、低成本的一种防 治放射性肺炎的中药制剂。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种中药制剂，所述中药制剂由如下重量配比的原材料制成:黄芪so-so 份、南沙参 20-30 份、北沙参 20-30 份、百合 10-20 份、石斛 5-15 份、紫菀 10-20 份、枇杷叶 10-30份、苦杏仁10-20份、百部10-20份、当归10-20份。
[0007]进一步，所述中药制剂由如下重量配比的原材料制成：黄芪30份、南沙参25-30 份、北沙参25-30份、百合10-15份、石斛10-15份、紫菀15-20份、枇杷叶15-30份、苦杏仁ΙΟ-? 5份 、百部 10-15份 、当归 15-20份。
[0008] 更进一步，所述中药制剂由如下重量配比的原材料制成：黄芪30份、南沙参30份、 北沙参30份、百合15份、石斛10份、紫菀1 5份、枇杷叶15份、苦杏仁15份、百部15份、当归15 份。
[0009] 更进一步，所述中药制剂由如下重量配比的原材料制成：黄芪30份、南沙参30份、 北沙参30份、百合10份、石斛10份、紫菀15份、枇杷叶20份、苦杏仁12份、百部15份、当归18 份。
[0010] 更进一步，所述中药制剂由如下重量配比的原材料制成：黄芪30份、南沙参25份、 北沙参25份、百合15份、石斛10份、紫菀15份、枇杷叶15份、苦杏仁15份、百部15份、当归15 份。
[0011]本发明还提供一种所述中药制剂的制备方法，所述方法为:按配方量，将各个组分 混合，加入3-4倍重量的水浸泡20min，120 °C煎煮20min，然后调至80 °C煎煮20min，过滤，获 得一次滤液和一次滤饼，将一次重复煎煮一次，过滤，获得二次滤饼和二次滤液，合并一次 滤液和二次滤液并减压浓缩至1.5-2倍体积，获得中药制剂。
[0012] 进一步，所述减压浓缩是在0.097Mpa、50-60 °C条件下进行。
[0013] 此外，本发明还提供一种所述中药制剂在制备防治放射性肺炎药物中的应用。
[0014] 本发明各中药原料的药理作用如下：
[0015] 黄芪具有补肺健脾、补中益气功效。黄芪能促进骨髓造血功能刺激造血升高白细 胞，能不同程度地提升和增强中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬和杀菌功能，也能明显刺激NK 细胞的分裂、增殖，并通过诱导淋巴细胞产生干扰素从而起到抗感染的作用。其含有的主要 成分黄芪多糖能有效加快修复损伤的组织、增强机体免疫调节功能，对放射性辐射起到抵 抗性作用。
[0016] 沙参具有养阴清肺、清胃生津、化痰功效。沙参可调节免疫平衡、增加白细胞数及 T、B细胞值，也可增强巨噬细胞吞噬能力，延长抗体在体内维持的时间，对放化疗后免疫功 能低下的机体治疗起到积极有效的作用。
[0017] 百合具有养阴润肺、清心安神功效，对放化疗所致气阴两虚的患者最为适宜。对放 化疗所致的白细胞减少症有预防作用，其主要成分秋水仙碱可提高癌细胞中cAMP水平，阻 止其有丝分裂，抑制肿瘤细胞增殖。
[0018] 石斛具有益胃生津，滋阴清热功效。主要增强机体免疫功能和诱生多种细胞因子 而增强机体的免疫力从而起到抗肿瘤作用，对由于放化疗及其他原因导致的免疫力低下患 者起到很好的辅助治疗功效。
[0019] 紫菀具有润肺化痰止咳功效。卢艳花等实验研究发现其中的紫菀酮、表木栓醇对 各种原因引起的咳嗽具有显著的抑制作用。
[0020] 枇杷叶，味苦，微寒，归肺、胃经。具有清肺止咳，降逆止呕功效。主要含有黄酮类、 酚类、萜类和苦杏仁苷等成分，具有抗氧化、抗炎止咳、抑菌、抗肿瘤等作用。
[0021] 百部具有润肺止咳功效。现代药理研究显示百部主要有抗氧化活性、镇咳平喘、抗 肿瘤、抗菌等作用。
[0022] 杏仁具有降气化痰，止咳平喘功效。具有抗氧化、防治高血压、抗肿瘤、镇咳、镇痛、 抗凝血、解毒等作用。
[0023] 当归除了具有补血活血功效。当归对多种致炎因子引起的毛细血管通透性增高、 组织水肿及慢性损伤均有明显的抑制作用；当归多糖可通过相关途径激活骨髓中的巨噬细 胞、淋巴细胞等，也具有纠正造血功能以及抗贫血的功能，此外，当归可扩张血管、改善微循 环血流量，也可抑制血小板聚集、抗血栓形成、促进纤维蛋白溶解，起到活血化瘀的作用。
[0024] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:本发明以清肺止咳平喘、益气养阴 活血为原则，各种药物相互形成协同作用。以黄芪、沙参、百合、石斛、紫菀、杏仁、百部、当归 等加减组成，方中黄芪、沙参为君药益气养肺润肺;石斛、杏仁、百合为臣药以清肺热;佐以 紫菀、百部止咳平喘;并辅以当归补血和血、活血化瘀为使者，各药相辅相成。具有清肺止咳 平喘、益气养阴活血功效。服用后，通过药物可以直接作用于放射性肺炎的病变部位，抑制 肺泡壁毛细血管炎性细胞渗出，肺间质充血、出血、水肿及肺泡结构破坏，降低TLR4信号传 导通路信号分子蛋白和局部肺组织相关细胞的细胞因子的表达，从而减轻肺部炎症反应， 达到延缓或治疗放射性肺炎的目的。临床治愈114例(67.86% )，有效41例（24.40% )，无效 13例（7.74%)，总有效率为92.26%。本发明用药疗效显著，无明显副作用，安全性好，成本 低。不仅能改善患者症状，而且提高患者的生活质量、减轻痛苦、延长生存期。 (四）【附图说明】
[0025]图1大鼠肺组织切片HE染色电镜观察(HE*400)，A(照射鼠+中药1) (400X)，B(照射 鼠+中药2) (400X)，C(照射鼠+中药3) (400X)，D (照射鼠+地塞米松）（400X)，E (照射鼠+蒸馏 水）（400X)，F(健康鼠+蒸馏水）（400X)，G (健康鼠+中药2) (400X)。
[0026] 图2为信号分子蛋白Western blot图，ASMyD88Western blot，B为TRAF-6Western blot，C为TRIF Western blot，D为TLR4Western blot。
[0027] 图3为Myd88TRAF-6灰度值，A照射鼠+中药1，B照射鼠+中药2，C照射鼠+中药3，D照 射鼠+地塞米松，E照射鼠+蒸馏水，F健康鼠+蒸馏水，G健康鼠+中药2。
[0028]图4为TRIF TLR4灰度值，A照射鼠+中药1，B照射鼠+中药2，C照射鼠+中药3，D照射 鼠+地塞米松，E照射鼠+蒸馏水，F健康鼠+蒸馏水，G健康鼠+中药2。 (五)【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0030]本发明实施例所用各组分均按照《中国药典2015》进行采集制备。
[0031] 实施例1:
[0032]黄芪30g、南沙参30g、北沙参30g、百合10g、石斛10g、紫菀15g、枇杷叶20g、苦杏仁 12g、百部15g、当归18g。
[0033]制备方法：按配方量，将各个组分混合，加入3倍重量的水浸泡20min，120°C煎煮 20min，然后调至80°C煎煮20min，过滤，滤饼重复一次煎煮一次，过滤，合并滤液并减压浓缩 (0.097Mpa、50-60 °C)至1.5倍体积，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0034] 实施例2:
[0035]黄芪30g、南沙参25g、北沙参25g、百合15g、石斛10g、紫菀15g、枇杷叶15g、苦杏仁 15g、百部15g、当归15g。
[0036]制备方法：按配方量，将各个组分混合，加入4倍重量的水浸泡20min，120°C煎煮 20min，然后调至80°C煎煮20min，过滤，滤饼重复煎煮一次，过滤，合并滤液并减压浓缩 (0.097Mpa、50-60 °C)至2倍体积，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0037] 实施例3:
[0038]黄芪30g、南沙参30g、北沙参30g、百合15g、石斛10g、紫菀15g、枇杷叶15g、苦杏仁 15g、百部15g、当归15g。
[0039] 制备方法:按配方量，将各个组分混合，加入3.5倍重量的水浸泡20min，120 °C煎煮 20min，然后调至80°C煎煮20min，过滤，滤饼重复煎煮一次，过滤，合并滤液并减压浓缩 (0.097Mpa、50-60 °C)至1.8倍体积，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0040] 实施例4
[00411黄芪30g、南沙参20g、北沙参20g、百合15g、石斛15g、紫菀20g、枇杷叶25g、苦杏仁 12g、百部15g、当归18g。
[0042]制备方法同实施例1，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0043] 实施例5
[0044] 黄芪30g、南沙参20g、北沙参20g、百合10g、石斛15g、紫菀20g、枇杷叶30g、苦杏仁 10g、百部15g、当归20g。
[0045] 制备方法同实施例1，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0046] 实施例6
[0047]黄芪30g、南沙参25g、北沙参25g、百合15g、石斛15g、紫菀20g、枇杷叶20g、苦杏仁 12g、百部10g、当归18g。
[0048] 制备方法同实施例1，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0049] 实施例7
[0050] 黄芪30g、南沙参30g、北沙参30g、百合10g、石斛15g、紫菀15g、枇杷叶20g、苦杏仁 12g、百部10g、当归18g。
[0051 ]制备方法同实施例1，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。
[0052] 实施例8
[0053]黄芪30g、南沙参30g、北沙参30g、百合10g、石斛10g、紫菀15g、枇杷叶20g、苦杏仁 15g、百部15g、当归15g。
[0054] 制备方法同实施例1，获得中药生药浓度2g/ml的汤剂。）
[0055] 实施例9临床观察
[0056] (1)临床资料
[0057]本发明人于2009年至今，经患者知情同意下对168例胸部恶性肿瘤患者经放射治 疗形成放射性肺炎后进行临床观察与治疗，年龄20-66岁。
[0058] (2)治疗方法
[0059] 口服实施例3制备的汤剂，一日两次，每次100ml，饭后服用。连续服用15-30天。
[0060] (3)治疗结果
[0061 ] 临床治愈114例（67.86%)，有效41例（24.40%)，无效13例（7.74%)，总有效率为 92.26%〇
[0062]实施例10动物实验过程及结论 [0063] 1、实验动物分组
[0064]健康雄性的SD大鼠，体重（200 ± 20)g，84只，由中科院上海实验动物中心提供，随 机分成:A(照射鼠+中药1)、B(照射鼠+中药2)、C(照射鼠+中药3)、D(照射鼠+地塞米松）、E (照射鼠+蒸馏水）、F(健康鼠+蒸馏水）、G (健康鼠+中药2)共7组，每组12只。
[0065] 2、实验药物制备
[0066]中药2为实施例3制备的生药浓度2g/ml的汤剂，中药1是将中药2浓缩至生药浓度 lg/ml，中药3是将中药2浓缩至生药浓度4g/ml。地塞米松是将地塞米松(众益美松)5mg溶于 蒸馏水2 5m 1中以配制成0.2mg/m 1的水溶液。
[0067] 3、实验动物造模
[0068]照射鼠：按照人与大鼠之间等效剂量换算，10%水合氯醛以0.35ml/100g腹腔内注 射，待大鼠完全麻醉后将其仰卧固定在架子上，再放于照射台上，调整照射野上至大鼠前肢 两腋窝中点连线，下至胸骨剑突水平，使照射区完全覆盖大鼠两肺。用2cm厚铅块屏蔽大鼠 其余部位，行西门子光子直线加速器6MV-X线照射，吸收剂量单次10Gy，吸收剂量率300cGy/ min，源皮距离lm，照射面积4*4cm。隔日重复1次，总剂量20Gy。照射完毕后等待大鼠自然苏 醒，再送回浙江中医药大学实验动物中心继续常规饲养。
[0069] 4、实验动物处理
[0070]各组大鼠适应性喂养7天，禁食、不禁水24h后进入实验。照射完成后次日开始灌服 中药(A、B、C、G)或地塞米松(D)，另两组灌服等量蒸馏水(E、F)。各实验大鼠所需药物量按照 人与大鼠之间等效剂量换算，即以lml/100g喂养大鼠，每日灌药1次，连续喂药14天后处死 大鼠，并在无菌条件下切取出双肺，肉眼观察后将每只大鼠左肺上叶放于包埋盒里置入甲 醛中以用于后续的病理切片染色，剩余肺组织剪碎分别按右肺上叶、中叶、下叶分装于3个 冻存管放于液氮中，再转至-80摄氏度冰箱中保存以用于后续Elisa、Western blot实验。 [0071] 5、观察指标
[0072] (1)大鼠的一般情况
[0073] (2)大鼠体重变化
[0074] (3)肺组织病理改变
[0075] (4)肺病理评分:观察病理切片肺组织损伤程度
[0076] (5)信号传导通路分子蛋白表达:Wes tern blot法测MyD88、TRAF-6、TRIF、TLR4表 达量
[0077] (6)部分细胞因子表达结果:Elisa法检测肺组织匀浆上清液TNF-a、IL-17、TGF_i3 表达量
[0078] 6、HE染色肺组织病理学步骤
[0079] (1)固定
[0080] 10%中性甲醛溶液室温固定24h。标本经流水冲洗30min;
[0081] (2)脱水
[0082] 依次将标本按以下过程进行梯度脱水:75%乙醇（lh)、95%乙醇I(lh)、95%乙醇 11(111)、100%乙醇1(2511^11)、100%乙醇11(2511^11);
[0083] (3)透明
[0084] 二甲苯两次共透明12min;
[0085] (4)浸蜡
[0086] 标本浸润于60度石蜡中三次共2h;
[0087] (5)包埋
[0088] 提前打开包埋机预热，冷冻台预冷，常规方法包埋制成蜡块；
[0089] (6)切片
[0090]标本连续切片，切片厚度为5mm，40摄氏度恒温水浴捞片，65摄氏度烤片3h;
[0091] (7)苏木精-伊红染色(HE染色），步骤如下：
[0092] 1)标本自然风干，4%多聚甲醛浸泡30min;
[0093] 2)蒸馏水洗，pH7 · 2-7 · 4的 PBS 液浸泡5min;
[0094] 3)二甲苯脱脂，10min*2 次；
[0095] 4)无水乙醇，3min*2 次；
[0096] 5)95%、85%、75%酒精下行至蒸馏水，各2min;
[0097] 6)Harris 苏木素 5min;
[0098] 7)10%酸化酒精分化(冰醋酸），5-10sec;
[0099] 8)自来水冲洗，30min;
[0100] 9)蒸馏水冲洗20min;
[0101] 10)75%、85%、95%酒精上行，各2min;
[0102] 11)0.5-1%(95%酒精配制）伊红，5-1〇11^11;
[0103] 12)95% 酒精分色，lmin;
[0104] 13)无水乙醇，3min*2 次；
[0105] 14)二甲苯，10min*2 次；
[0106] 15)树胶封片。
[0107]以上操作由浙江中医药大学实验动物中心实验室工作人员完成。
[0108] (8)病理标本评分
[0109]按以下5项指标进行评分：1)肺间质和肺泡水肿；2)肺泡出血;3)间隙或血管壁中 性粒细胞浸润或聚集;4)透明膜形成;5)肺不张。根据每项指标的轻重程度半定量分析，以 无损伤为〇分，每高倍视野下病变范围占小于25%为1分，占视野25%~50%为2分，50%~ 75%为3分，超过75%为4分。双盲评定，总肺损伤评分为上述各项评分之平均分。
[0110] 7、Western blot检测MyD88表达的实验步骤
[0111] (1)肺组织总蛋白的提取
[0112] 1)从-80摄氏度冰箱中取出每个样品的右肺中叶置于液氮中，称重，每个样品重量 在20mg左右置于1.5mlEP管中；
[0113] 2)向各EP管加入RIPA细胞裂解液及PMSF(裂解液:PMSF体积比=99:1，一般20mg肺 组织加200ul液体），再加入钢珠2粒；
[0114] 3)放于研磨机研磨60sec*2次；
[0115] 4)4摄氏度12000rpm离心10min，收集上清液，保存于-80摄氏度冰箱中。
[0116] (2)BCA法测定肺组织总蛋白浓度
[0117] 1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50 :1)配制适量BCA工作 液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定；
[0118] 2)倍比稀释标准品：取8只150ul的小EP管，编号S1-S8，S1加入100ul lmg/ml蛋白 标准品，其余的均加入50ul纯水。从S1的EP管取50ul液体加入S2的EP管中，吹打混匀，再从 S2管取50ul液体加入S3管，吹打混匀。依次类推至S7。移取S1-S8标准品20ul加至96孔板，两 重复；
[0119] 3)移取20ul样本至96孔板，两重复；
[0120] 4)向各孔分别加入200ulBCA工作液，37°C恒温箱放置30min;
[0121] 5)用酶标仪595nm波长下读取数据。根据标准品的浓度及光密度(0D值)绘出标准 曲线，然后根据曲线计算出样品的蛋白浓度；
[0122] 6)蛋白变性:根据所测蛋白浓度加入相应量的蛋白电泳上样缓冲液和裂解液，使 其终浓度为3ug/ul，震荡混匀，95摄氏度恒温水浴5min使蛋白变性。
[0123] ⑶制胶
[0124] 1)取洁净玻璃板(一厚一薄)2套，用酒精擦拭干净；
[0125] 2)仔细检查玻璃板是否有裂痕，厚板字母向上放置；
[0126] 3)将2套玻璃板分别固定于制胶架上，加入双蒸水验证有无渗漏；
[0127] 4)倾斜制胶架，将水倒出；
[0128] 5)SDS_PAGE 凝胶配制；
[0129] a制备下层胶:将过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20摄氏度保存。根据大 鼠 MyD88分子量(33-35kD)选择10% SDS-PAGE的分离胶（即下层胶），按照表1配制。用移液枪 注入两玻璃板缝隙间（约4.5ml)，注意避免气泡产生，在液面上小心加入蒸馏水进行水封。 静置待胶凝固约30min，出现分层后倒出上层水；
[0130] b制备上层胶：按照表1配制5%SDS-PAGE的浓缩胶（即上层胶），加入玻璃板内，排 去气泡，迅速插入梳子，静置15min。
[0131] 表1 Western blot分离胶和浓缩胶的配置
[0133] ⑷电泳
[0134] 1)将10 X电泳液用蒸馏水稀释10倍配成1 X电泳液；
[0135] 2)从制胶架上取出胶板，两块板凹面朝内侧，固定于电泳槽，将槽放入电泳盒内， 注意电极方向；
[0136] 3)将电泳液加入到电泳槽内，内流与口齐平，外流没过金属丝约lcm;
[0137] 4)上样:双手平衡取出梳子，把Mark和蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内；Mark 加入10ul，蛋白样品加入13ul;
[0138] 5)接好电源，调整电压为100V，时间为90min。电泳至溴酚蓝线到达分离胶底部。
[0139] (5)半干转
[0140] a配置电转液：10 X电转液40ml、甲醇80ml、蒸馏水280ml配置400ml电转液；
[0141] b电泳完毕后，取出胶，置于电转液中，根据分子量剪裁合适大小凝胶、滤纸以及 PVDF膜，PVDF膜置于甲醇中浸泡3min，在电转液中依次放置滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸并赶走 气泡，置于半干转设备中，调整电压为20V半干转40min。
[0142] (6)封闭
[0143] 将10XTBST用蒸馏水稀释10倍配成1XTBST;称取2.5g脱脂奶粉，溶于50mllX TBST中，配置成5%脱脂奶粉封闭液；半干转结束后，立即把PVDF膜放置到预先准备好的 TBST洗涤液中，漂洗lOmin以洗去膜上的转膜液。加入5%脱脂奶粉封闭液，在摇床上缓慢摇 动，室温封闭40min后用TBST洗涤液洗涤10min*3次。
[0144] (7) -抗孵育
[0145] 参考MyD88-抗的说明书，按照合适的比例（1:500)用一抗稀释液进行稀释。4摄氏 度冰箱孵育过夜后加入TBST洗涤液洗涤10min*3次。
[0146] (8)二抗孵育
[0147] 参考二抗的说明书，按照1:5000比例用二抗稀释液稀释，室温摇床孵育1小时后加 入TBST洗涤液洗涤10min*3次。
[0148] (9)曝光及分析
[0149] 加显影剂3_4min显色后，生物发光成像系统采集图像后采用Image J软件处理。以 β-actin的灰度值为1，以所测各样本的灰度值与内参β-actin的灰度值的比值代表定量值 进行分析。
[0150] TRAF-6(58kD)、TRIF(66kD)、TLR4(75-80kD)Western blot的检测步骤与 MyD88Western blot的检测步骤基本相同，按说明书进行。
[0151] 84118&法测1吧_€1含量的实验步骤
[0152] (1)依照说明书介绍准备试剂、标准品稀释液；
[0153] (2)从板架中移走多余的微孔板条，放回箱袋，包括干燥剂，重新封好；
[0154] (3)做好标记，向标记好的各孔加1 OOul标准品、样本(各两重复)于每孔中央，盖上 密封条。室温下孵育2.5h;
[0155] (4)取出板架，弃去各孔液体，在干净吸水纸上将液体拍干，向每孔加300ul lx Wash Buffer静置lmin;弃去各孔液体，并在干净吸水纸上将液体拍干，如此重复4次；
[0156] (5)每孔加入 100ul lx Biotinylated TNF-aDetection Antibody;盖上新密封 条，室温下摇床孵育lh;
[0157] (6)重复(4)过程；
[0158] (7)向每孔加入 100ul lx HRP-Streptavidin Solution，室温下摇床孵育45min;
[0159] (8)重复(4)过程；
[0160] (9)向每孔加入100ul TMB One-Step Substrate Reagent，室温下避光摇床孵育 30min；
[0161] (10)向每孔加入100ul Stop Solution，立即放入酶标仪中测定每孔光密度(0D 值），波长设置为450nm。根据0D值及标准品浓度绘制出标准曲线(y=116.71e3'16()8x，y为标 准品浓度，X为0D值），然后根据曲线计算出样本TNF-α的浓度。
[0162] IL-17、TGF_邱勺Elisa检测步骤基本与TNF-aElisa检测步骤相同，按说明书进行。
[0163] 9、结果
[0164] (1)大鼠的一般情况
[0165] 未经照射的正常组大鼠精神状态极好，活跃，食欲较好，毛色光滑润泽，而各照射 组大鼠于照射后第5天左右开始出现精神萎靡、食欲下降、毛色无光泽、发黄、干枯、竖起甚 至脱毛等症状，发生率90%。灌服中药1和蒸馏水组大鼠随着时间的积累，上述症状越明显； 而灌服中药2、中药3及地塞米松组大鼠自第8天开始精神状态、食欲、毛色等一般状况好转。
[0166] (2)大鼠体重变化
[0167] 大鼠初始体重及2周后体重情况见表2。各组大鼠之间实验前初始体重并无明显差 异(p>〇.05)，进入实验后各组大鼠体重变化差异明显：未受照射两正常组(F和G组)大鼠较 各照射组大鼠体重增长迅速，差异均具有统计学意义(P〈〇.01);但在灌服蒸馏水和中药2组 正常大鼠之间体重增长情况并无明显差异(P>〇.05)。而在各照射组之间，大鼠经中药2、中 药3、地塞米松治疗后体重较灌胃中药1、蒸馏水组大鼠明显增加。A与B相比较p〈0.05，A与C、 D比较p〈0.01;B、C与E相比p〈0.05，D与E相比p〈0.01。但B与C、B与D、C与D组之间大鼠体重增 长差异并无统计学意义（P>〇.05);同样，A与E之间大鼠体重增长情况亦无明显差异（p> 0.05)〇
[0168] 表2大鼠体重(：士s)
[0170] 注:与A组相比较Λ〈0.05，、〈〇. 01;与E组相比较，Λρ〈0.05，^?〈0.01;与F组相比 较，□?〈0 · 05，mp〈0 · 01;与G组相比较，#ρ〈0 ·05，##ρ〈0 · 01
[0171] (3)肺病理改变
[0172] 各照射组大鼠均出现急性炎症表现，病变主要以渗出为主。主要病理表现为:肺间 隔增厚，肺泡壁增宽，肺泡壁毛细血管充血，肺间质充血、水肿，肺泡间隔及部分肺泡腔内见 散在中性粒细胞浸润。F、G两正常组大鼠肺组织切片电镜下可见肺泡结构清晰，无明显炎性 渗出表现;A和E组病理切片光镜下可观察到明显的肺泡壁增厚，肺间质毛细血管充血、水 月中，肺泡结构紊乱甚至有透明膜形成;而B、C、D组大鼠光镜下可观察到少量的肺间质充血水 月中、炎性渗出，但不明显;肺泡结构较清晰、肺泡壁较薄，炎症反应较A、E组轻。见图1。
[0173] (4)肺损伤评分
[0174] F、G两正常未照射组大鼠病理切片可见肺组织炎性渗出面积绝大部分小于25%， 评分0-1分;B、C、D组大鼠肺损伤面积大部分处于25%-50%之间，少数在75%以上，评分主 要在1-3分，且在此三组之间并无差异(p>0.05) ;A、E组可明显观察到存在大面积肺组织受 损，绝大部分损伤面积达50%以上，评分2-4分，且此两组之间并无差异(p>0.05);但B、C、D 与A、E组之间评分具有明显统计学差异，且B、C、D与A比较p〈0.05，B与E相比p〈0.05，C、D与E 比较p〈〇. 01。具体评分见表3。
[0175] 表3肺组织损伤病理评分
[0177] 注:与A组相比较Λ〈〇. 〇5，、〈〇. 〇1;与E组相比较，Λρ〈〇. 05，^?〈0.01;与F组相比 较，□?〈0 · 05，mp〈0 · 01;与G 组相比较，#ρ〈0 · 05，##ρ〈0 · 01
[0178] (5)信号传导通路分子蛋白MyD88、TRAF-6、TRIF、TLR4的变化
[0179] 通过western blot检测分子蛋白并经生物发光成像系统采集图像可知:与两组未 经照射的正常组对比，照射组TLR4信号传导通路分子蛋白MyD88、TRAF-6、TRIF、TLR4表达明 显升高;但是，B、C、D组大鼠 MyD88、TRAF-6、TRIF、TLR4表达情况低于A、E组。见图2。经灰度值 分析后结果显示:F、G两正常组较照射各组大鼠灰度值明显偏低(p〈0.01);在各照射组之 间，B、C、D组各信号分子蛋白较A、E具有差异，且B、C组MyD88灰度值与A组比较?〈0.05,0与八 相比p〈0.01，B组TRAF-6灰度值较A相比p〈0.05，C、D与A相比p〈0.01; B、C、D与E各信号分子蛋 白相比p〈〇. 01。具体见表4、表5、图3、图4。
[0180]表4 MyD88TRAF_6灰度值土 s)
[0182] 注:与A组相比较Λ〈〇.〇5广p〈〇.〇l;与E组相比较，气〈0.05，^?〈0.01;与？组相比 较，□?〈0 · 05，mp〈0 · 01;与G组相比较，#p〈0 ·05，##p〈0 · 01
[0183] 表5 TRIF TLR4灰度值(I ±S)
[0185] 注:与A组相比较，V〇. 〇5，、〈〇. 〇1;与E组相比较，Λρ〈〇. 05，^?〈0.01;与F组相比 较，□?〈0 · 05，mp〈0 · 01;与G组相比较，#p〈0 ·05，##p〈0 · 01
[0186] (6)部分细胞因子检测结果
[0187] 各组的TNF-a、IL-17、TGF_f3的表达量Elisa检测结果如表6JX两正常未照射组大 鼠细胞因子TNF-a、IL-17、TGF-0的表达量明显处于低水平状态；与正常组对比，各照射组 丁册-€[、几-17、了6?-0的表达量显著升高，差异具有统计学意义(？〈0.01) ;且8、(：、0组了册-€[、 IL-17、TGF-β表达情况较A、E组明显减少，具有统计学意义(p〈0.01);但在B、C、D三组之间， A、E两组之间并无差异(p>0.05)。
[0188] 表6 Elisa检测结果:（$ 士
[0190] 注：与A组相比较Λ〈0.05广p〈0.01;与E组相比较，Λρ〈0.05p〈0.01;与F组相 比较，αρ〈〇 · 05，mp〈0 · 01;与G组相比较，#p〈0 ·05，##p〈0 · 01
[0191] 10、结论
[0192] (1)自拟验方（中药2)可以明显改善放射性肺炎大鼠的精神状态、毛色、食欲等一 般情况，以及显著增加大鼠体重、提高生存质量；
[0193] (2)自拟验方（中药2)可明显减轻放射性肺炎大鼠肺局部炎症反应、镜下肺间质充 血、渗出、出血、水肿及肺泡结构破坏，且其抗放射性肺炎疗效与激素相当；
[0194] (3)自拟验方（中药2)可通过抑制TLR4上游信号通路，抑制TLR4下游MyD88依赖性 信号传导途径和下游非MyD88依赖性信号传导途径的传导，从而抑制肺组织相关细胞的细 胞因子的表达，阻止放射性肺炎的发生发展。
【主权项】
1. 一种中药制剂，其特征在于所述中药制剂由如下重量配比的原材料制成:黄苗20-30 份、南沙参20-30份、北沙参20-30份、百合10-20份、石斛5-15份、紫菀10-20份、枇杷叶10-30 份、苦杏仁10-20份、百部10-20份、当归10-20份。2. 如权利要求1所述中药制剂，其特征在于所述中药制剂由如下重量配比的原材料制 成:黄芪30份、南沙参25-30份、北沙参25-30份、百合10-15份、石斛10-15份、紫菀15-20份、 枇杷叶15-30份、苦杏仁10-15份、百部10-15份、当归15-20份。3. 如权利要求1所述中药制剂，其特征在于所述中药制剂由如下重量配比的原材料制 成:黄芪30份、南沙参30份、北沙参30份、百合15份、石斛10份、紫菀15份、枇杷叶15份、苦杏 仁15份、百部15份、当归15份。4. 如权利要求1所述中药制剂，其特征在于所述中药制剂由如下重量配比的原材料制 成:黄芪30份、南沙参30份、北沙参30份、百合10份、石斛10份、紫菀15份、枇杷叶20份、苦杏 仁12份、百部15份、当归18份。5. 如权利要求1所述中药制剂，其特征在于所述中药制剂由如下重量配比的原材料制 成:黄芪30份、南沙参25份、北沙参25份、百合15份、石斛10份、紫菀15份、枇杷叶15份、苦杏 仁15份、百部15份、当归15份。6. -种权利要求1所述中药制剂的制备方法，其特征在于所述方法为：按配方量，将各 个组分混合，加入3~4倍重量的水，120 °C煎煮20min，然后调至80 °C煎煮20min，过滤，获得 一次滤液和一次滤饼，将一次滤饼重复煎煮一次，过滤，获得二次滤饼和二次滤液，合并一 次滤液和二次滤液并减压浓缩至1.5-2倍体积，获得中药制剂。7. 如权利要求6所述中药制剂的制备方法，其特征在于所述减压浓缩是在0.097Mpa、 50-60°C条件下进行。8. -种权利要求1所述中药制剂在制备防治放射性肺炎药物中的应用。
【文档编号】A61K36/904GK106063903SQ201610452687
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年6月21日 公开号201610452687.1, CN 106063903 A, CN 106063903A, CN 201610452687, CN-A-106063903, CN106063903 A, CN106063903A, CN201610452687, CN201610452687.1
【发明人】黄常新, 鲍艳红, 雷艳敏
【申请人】杭州师范大学