一种基于光遗传学?电生理技术的动物神经功能检测平台的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于光遗传学?电生理技术的动物神经功能检测平台，包括激光检测调控装置、电生理信号记录系统和中央控制系统，所述激光检测调控装置用于对测试动物的初级运动皮层进行可调参数的激光刺激；所述电生理信号记录系统用于记录受到刺激后的测试动物的靶肌肉的反应信号，并将反应信号反馈给所述中央控制系统；所述中央控制系统根据激光检测调控装置刺激测试动物诱发出的动作及反应信号绘制初级运动皮层代表区图谱。本发明能够快速、精确描绘指定上肢靶肌肉的代表区图谱，有助于揭示一侧半球控制双侧上肢运动的脑重塑规律，为后续积极干预脑重塑提供依据。
【专利说明】
一种基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台
技术领域
[0001]本发明涉及神经科学技术领域，特别是涉及一种基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台。
【背景技术】
[0002]中枢神经系统疾病具有极高的致残率和较高的致死率，是当今世界危害人类生命健康的最主要的疾病之一。我国平均12秒就有一人发病，每21秒就有一人死于中枢神经系统疾病，它严重危害着现代人的健康和生命。大多数患者遗留不同程度的功能障碍，作为中枢神经损伤后较为严重的后遗症之一，部分患者丧失工作和生活能力，严重影响生存质量和生活满意度。目前通过改变周围神经通路增强同侧神经纤维对肢体的支配可以实现偏瘫患者的健存大脑半球同时司管双侧上肢。但具体涉及到的神经通路以及患肢运动功能恢复的动态中枢机制尚不明确。随着近几年光遗传学技术的出现和广泛应用，给我们的研究提供了全新的认识。
[0003]近几年来，神经科学技术的飞速发展使得将无创的光技术应用于兴奋神经元变得可能，光遗传学(Optogenetics)是近年来正在迅速发展的一项整合了光学、软件控制、基因操作技术、电生理等多学科交叉的生物工程技术。其主要原理是首先采用基因操作技术将光感基因转入到神经系统中特定类型的细胞中进行特殊离子通道的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。视紫红质通道_2(ChR2)是一种从绿衣藻分离出来的可被光激活的非选择性阳离子通道，当通过转基因等遗传学技术将该通道蛋白表达于指定神经元时，可将光能量转化成神经元活动，即利用光遗传学方法调控神经元兴奋性。自Nage12003年首次提出光遗传学理念以来，Boyden在Nature，Li [ 5 ]在PNAS等陆续报道了他们利用该技术激活啮齿类动物肢体运动、胡须拨动、感知等活动的尝试。该技术具有细胞类型特异性高、无创、空间分辨率强、定位精准且可反复多次应用的优点，为神经科学提供了新的研究手段，因此2010年被Nature Methods杂志评为年度最新技术成果，近几年来被广泛应用于各相关前沿学科研究中。其中Murphy在Nature首次报道了利用该技术成功绘制表达ChR2转基因小鼠的运动皮层代表区，该技术手段为拟开展的动态研究创造了条件。
[0004]因此，在脑外伤后在经过改变周围神经通路的Thyl-ChR2_YFP转基因小鼠，通过在体光遗传学-电生理技术来动态评估运动功能，研究结果将有助于揭示一侧半球控制双侧上肢运动的脑重塑规律为后续积极干预脑重塑，促进卒中、脑瘫、脑外伤后遗症的上肢运动功能恢复研究提供依据。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，能够快速、精确地描绘指定上肢靶肌肉的代表区图谱，并有助于揭示一侧半球控制双侧上肢运动的脑重塑规律，为后续积极干预脑重塑提供依据。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，包括激光检测调控装置、电生理信号记录系统和中央控制系统，所述激光检测调控装置用于对测试动物的初级运动皮层进行可调位置和参数的激光刺激;所述电生理信号记录系统用于记录受到刺激后的测试动物的靶肌肉的反应信号，并将反应信号反馈给所述中央控制系统;所述中央控制系统根据激光检测调控装置刺激测试动物诱发出的测试动物的动作及反应信号绘制初级运动皮层代表区图谱。
[0007]所述激光检测调控装置包括激光器、光纤和光学组件;所述激光器用于发出不同功率的激光，且产生的激光经过光纤后，再通过光学组件对测试动物的初级运动皮层进行激光光斑刺激;所述光学组件用于调整激光光斑刺激的位置和范围。
[0008]所述激光器产生的激光依次通过遮光器和光衰减器的调节后再进入光纤。
[0009]所述激光器与光学组件的耦合用于产生可变光斑直径以及可变照射时间的激光。
[0010]所述电生理信号记录系统包括电极单元和肌电信号记录单元，所述电极单元用于采集测试动物的靶肌肉反应信号，所述肌电信号记录单元用于记录所述靶肌肉反应信号，并将该信号反馈给所述中央控制系统。
[0011]所述肌电信号记录单元通过信号放大系统与所述中央控制系统相连;所述信号放大系统包括信号放大电路和模数转换电路，所述信号放大电路用于将所述靶肌肉反应信号进行放大，所述模数转换电路用于将放大后的信号转换为数字信号。
[0012]所述电极单元包括三道电极，分别是记录电极、参考电极和接地电极。
[0013]所述中央控制系统根据诱发出的测试动物的不同动作或者反应信号来绘制各肌肉在初级运动皮层区中的代表区。
[0014]所述测试动物固定在运动平台上，所述激光检测调控装置的出射光从测试动物的正上方对测试动物的初级运动皮层进行刺激。
[0015]所述运动平台利用X方向的滚珠丝杠和Y方向的滚珠丝杠实现水平面方向的移动，两个滚珠丝杠通过两个伺服电机分别驱动，所述滚珠丝杠上设有与中央控制系统相连的编码器;所述中央控制系统根据编码器的信息对所述伺服电机进行驱动形成反馈机制。
[0016]有益效果
[0017]由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，具有以下的优点和积极效果:本发明使得刺激光斑精确可调，能够适应多种激发情况;本发明通过中央控制系统可精确绘制连接图谱;本发明采用体视镜可以在Z向上对刺激位置进行控制，使得工作起来效率更尚O
【附图说明】
[0018]图1是本发明的结构示意图；
[0019]图2是体视镜放大倍率变化的激光光斑直径变化图；
[0020]图3是实施例中小鼠大脑刺激点位置示意图；
[0021 ]图4是小鼠初级运动皮层代表区绘图结果图；
[0022]图5是小鼠上肢代表区绘图结果图；
[0023]图6是实施例中运动平台反馈机制实施效果图；
[0024]图7是实施例中运动平台配合小鼠大脑刺激点间距示意图；
[0025]图8是电极记录到的反应电位示意图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0027]本发明的实施方式涉及一种基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，如图1所示，包括激光检测调控装置、电生理信号记录系统2和中央控制系统3，所述激光检测调控装置用于对测试动物的初级运动皮层进行可变位置和参数的激光刺激;所述电生理信号记录系统2用于记录受到刺激后的测试动物的靶肌肉的反应信号，并将反应信号反馈给所述中央控制系统3;所述中央控制系统3根据激光检测调控装置刺激测试动物诱发出的测试动物的动作及反应信号绘制初级运动皮层代表区。
[0028]其中，所述激光检测调控装置包括激光器11、光纤12和光学组件13，本实施方式中光学组件13采用体视镜;所述激光器11产生的激光依次通过遮光器14和光衰减器15的调节后再进入光纤12，经过光纤12的激光再通过体视镜13对测试动物的初级运动皮层进行激光光斑刺激。通过遮光器14和光衰减器15使得激光的功率精确可调，通过体视镜13使得刺激光斑精确可调，从而能够适应多种激发情况。所述测试动物固定在运动平台5上，所述激光检测调控装置的出射光从测试动物的正上方对测试动物的初级运动皮层进行刺激，也就是说，体视镜13固定在测试动物的正上方，如此设置可以在Z向上对刺激位置进行控制，使得工作起来效率更高。
[0029]图2所示的是体视镜放大倍率变化的激光光斑直径变化图，不难发现，结合体视镜的变焦参数调整，该检测平台可以实现随体视镜物镜放大倍率变化而精确改变激光光斑的直径，从而更精确地照射选定的大脑皮层某块特定区域。
[0030]所述电生理信号记录系统2包括电极单元和肌电信号记录单元，所述电极单元用于采集测试动物的靶肌肉反应信号，所述肌电信号记录单元用于记录所述靶肌肉反应信号，并将该信号反馈给所述中央控制系统3。所述肌电信号记录单元还通过信号放大系统4与所述中央控制系统3相连;所述信号放大系统包括信号放大电路和模数转换电路，所述信号放大电路用于将所述靶肌肉反应信号进行放大，所述模数转换电路用于将放大后的信号转换为数字信号。
[0031 ]下面通过一个具体的实施例来进一步说明本发明。
[0032]脑外伤模型:
[0033]对小鼠进行称重，后以0.36ml/100g的剂量腹腔注射10 %水合氯醛，待麻醉满意后，将小鼠头顶皮毛剃净，并将头部三点固定于立体定向仪上，常规消毒。沿中线矢状位切开皮肤约lcm，然后逐层切开皮下筋膜，分离骨膜至颅骨，用记号笔标记左侧初级运动皮层代表区(前囱前2mm后1mm，中线旁开0.5mm-3.5mm)，用烦骨钻钻开烦骨，精细操作避免损伤皮层。采用Kopf皮层撞击损伤机器，设定直径为3mm的撞击头的撞击参数为速度:3.5m/s，持续时间:1.5ms，深度:1mm，撞击后及时利用可吸收性明胶海绵止血，冲洗伤口，缝合头皮。
[0034]改变外周神经通路:
[0035]在脑外伤模型一月后，进行改变外周神经通路手术。双侧臂丛神经根暴露及颈七神经根测量切取:取小鼠仰卧位，固定四肢于动物手术板，保持双上肢肩外展90度、伸肘O度位。放大10倍手术显微镜镜视下于肱骨近端处做一横行切口跨颈前部延长至对侧肱骨近端。显露并向两侧牵开下方的胸大肌，暴露束支部臂丛。逆行向根干部锐性分离，注意结扎跨于神经表面的血管。精细拉钩向椎间孔方向牵拉，充分暴露根干部，注意力度适当避免误伤神经。仔细分辨臂丛C5到Tl神经根，以及干、股、束支部神经。分别标记供区及受区C7神经根，用0.5%利多卡因局部封闭，供区在C7分出前后股远端切断，受区在C7神经根自椎间孔发出处切断，分别测量其长度及直径。疏通颈前通路筋膜组织，量取一侧颈七神经前后股远端至另一侧颈七神经根近端的缺损距离。
[0036]腓肠神经获取及测量:小鼠取俯卧位，固定四肢于动物手术板。常规消毒铺巾，在放大10倍手术显微镜镜视下，取外踝与跟腱中点为起点作切口，并延长至胭窝处，显露腓肠神经及伴行小隐静脉，保护小隐静脉下锐性分离腓肠神经周围的肌肉及筋膜组织，显微镜下将神经游离出，用0.5%利多卡因局部封闭后，将腓肠神经从腓总神经发出处切断，于踝部水平切断远端，获取全长腓肠神经，同法取另一侧全长腓肠神经。切取后的神经量取长度及直径。
[0037]移植修复可行性检测:将2股腓肠神经移至C7神经术区，根据双侧C7缺损距离修剪腓肠神经，比较C7直径与移植神经股数的匹配及以及确保无张力缝合所需的移植长度。
[0038]正常小鼠初级运动皮层代表区绘图:
[0039]通过波长为473nm的蓝色激光，通过耦合了光路的体视镜对转基因小鼠的初级运动皮层Ml给予功率为1.5mW、刺激持续时间为6ms、物镜放大倍率为1.25(对应激光光斑直径为30μπι)的刺激，并通过由此诱发出的小鼠动作来绘制初级运动皮层代表区。其中，对小鼠大脑刺激点的位置如图3所示，图中所示的是中线旁开0.5mm到3.5mm，前囟前2.5mm到前囟后1.4mm的区域内，由图可知，本发明可实现精度达0.3mm间距的小范围精确刺激间隔，从而能够用于精确描绘皮层代表区。
[0040]图4是小鼠初级运动皮层代表区绘图结果，其记录刺激位点共140个，其中前肢位点50 ±6个，后肢26 ±3个，胡须14±2个，躯干10 ± I个，下颂9 ± I个，颈部8 ± I个，无反应位点23±3个，不同区域采用不同颜色进行表示。
[0041 ]正常小鼠上肢代表区绘图:
[0042]通过波长为473nm的蓝色激光，通过耦合了光路的体视镜对转基因小鼠初级运动皮层的上肢代表区给予功率为1.5mW、刺激持续时间为6ms、物镜放大倍率为1.25(对应激光光斑直径为30μπι)的刺激，记录能诱发出上肢动作的区域位点，并进一步依据所诱发出的屈肘、伸肘、屈腕、伸腕、屈指、伸指等动作通过不同颜色来描绘各肌肉在初级运动皮层代表区中的位置。
[0043]图5是小鼠上肢代表区绘图结果图，小鼠的上肢代表区位于中线旁开I至3mm，前囟前2mm至前囟后Imm的区域内，且该上肢代表区又由偏前方较小面积的代表区RFA以及偏后方较大面积的代表区CFA构成。其中RFA由6土 I个刺激位点，主要诱发出腕及趾活动，CFA由44 ± 4个刺激位点构成，主要负责肩肘及部分腕活动。其中诱发出肱三头肌动作的位点有20±2个(蓝色区域)，诱发出肱二头肌动作的位点有12±1个(黄色区域)，诱发出前臂伸腕肌动作的位点有14± I个(红色区域)，诱发出前臂屈腕指肌的位点有2± I个(灰色区域)，诱发出前臂伸指肌动作的位点有2±1个(绿色区域)。
[0044]在进行测试时可将小鼠固定在运动平台5上，所述激光检测调控装置的出射光从测试动物的上方对小鼠的初级运动皮层进行刺激。所述运动平台5利用X方向的滚珠丝杠和Y方向的滚珠丝杠实现水平面方向的移动，两个滚珠丝杠通过两个伺服电机分别驱动，所述滚珠丝杠上设有与中央控制系统相连的编码器;所述中央控制系统根据编码器的信息对所述伺服电机进行驱动形成反馈机制。
[0045]该运动平台可以确保覆盖更大的激光刺激区域，固定在运动平台上的动物头部可以根据需求进行沿X方向或Y方向的任意移动。采用滚珠轴承滑轨来降低滚动摩擦力，同时使其具有更高的承载能力和刚度较高的相容性，从而保证更精确的运动控制。一个非常精细的循环滚珠丝杆的编码器作为反馈机制，是用来将轴向运动转化为线性运动，它具有更高的传输效率，更高的运动速度和更精确的增量运动。滚珠丝杠由两个伺服电机分别驱动，相对于直流步进电机，其运转速度更高。其中，由编码器形成的反馈机制可以精确控制平台的位置和它的可重复性，从而实现了更高的精细运动分辨率。因此，可以确保高精度的运转和高效率的运动速度。
[0046]图6是实施例中运动平台反馈机制实施效果图，其中，(a)是没有启动反馈机制时的实施效果，可见，其噪声信号很大，(b)是启动反馈机制时的实施效果，此时噪声信号得到有效控制，基础噪声可控制在0.05mV，在实施检测时几乎没有妨碍。
[0047]本检测平台能够在更长的时间间隔，更大的二维距离和更准确的定位下保证可以获得可重复性优异的光刺激。本检测平台还可以通过体视镜对光斑对刺激光斑的位置和范围进行调节，使得运动平台在精确移动时而刺激光斑的位置是固定的，这样可以避免光纤和物镜位移导致的光学像差，从而获得更佳的整体效果。通过图7可知，利用体视镜和运动平台相结合后测试计算间距与实测间距基本为I比I的关系，即实测间距与计算间距相同。
[0048]利用光遗传学-电生理平台绘制肢体靶肌肉的运动诱发电位MEP:
[0049]采用AM1800双通道信号放大采集系统在研究的靶肌肉(如肱三头肌、前臂伸肌群、肱二头肌等)对激光诱发的肢体反应信号进行采集放大，并通过AXON DIGIDATA1440A数模转换器进行模拟-数字信号转化，Clampexl0.2软件进行数据记录。
[0050]肌肉运动诱发电位MEP的记录和提取:
[0051]采用了双通道肌电信号采集系统，可同时对双侧肢体或一侧肢体的两块靶肌肉进行信号采集。其中每一通道由三道电极构成，分别是负极(记录电极)、正极(参考电极)以及接地。图8是电极记录到的反应电位示意图，其反应的是激光刺激的同时连接在肢体上的记录电极记录到的反应电位，其中，波峰(上)波谷(下)之间的间距越大，说明该块皮层代表区对激光的反应越强烈。
【主权项】
1.一种基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，包括激光检测调控装置、电生理信号记录系统(2)和中央控制系统(3)，其特征在于，所述激光检测调控装置用于对测试动物的初级运动皮层进行可调位置和参数的激光刺激;所述电生理信号记录系统(2)用于记录受到刺激后的测试动物的靶肌肉的反应信号，并将反应信号反馈给所述中央控制系统(3);所述中央控制系统(3)根据激光检测调控装置刺激测试动物诱发出的测试动物的动作及反应信号绘制初级运动皮层代表区图谱。2.根据权利要求1所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述激光检测调控装置包括激光器(11)、光纤(12)和光学组件(13);所述激光器(11)用于发出不同功率的激光，且产生的激光经过光纤(12)后，再通过光学组件(13)对测试动物的初级运动皮层进行激光光斑刺激;所述光学组件用于调整激光光斑刺激的位置和范围。3.根据权利要求2所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述激光器(11)产生的激光依次通过遮光器(14)和光衰减器(15)的调节后再进入光纤。4.根据权利要求2所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述激光器(11)与光学组件(13)的耦合用于产生可变光斑直径以及可变照射时间的激光。5.根据权利要求1所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述电生理信号记录系统(2)包括电极单元和肌电信号记录单元，所述电极单元用于采集测试动物的靶肌肉反应信号，所述肌电信号记录单元用于记录所述靶肌肉反应信号，并将该信号反馈给所述中央控制系统(3)。6.根据权利要求5所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述肌电信号记录单元通过信号放大系统(4)与所述中央控制系统(3)相连;所述信号放大系统(4)包括信号放大电路和模数转换电路，所述信号放大电路用于将所述靶肌肉反应信号进行放大，所述模数转换电路用于将放大后的信号转换为数字信号。7.根据权利要求5所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述电极单元包括三道电极，分别是记录电极、参考电极和接地电极。8.根据权利要求1所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述中央控制系统(3)根据诱发出的测试动物的不同动作或者反应信号来绘制各肌肉在初级运动皮层区中的代表区。9.根据权利要求1所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述测试动物固定在运动平台(5)上，所述激光检测调控装置的出射光从测试动物的上方对测试动物的初级运动皮层进行刺激。10.根据权利要求9所述的基于光遗传学-电生理技术的动物神经功能检测平台，其特征在于，所述运动平台(5)利用X方向的滚珠丝杠和Y方向的滚珠丝杠实现水平面方向的移动，两个滚珠丝杠通过两个伺服电机分别驱动，所述滚珠丝杠上设有与中央控制系统相连的编码器;所述中央控制系统根据编码器的信息对所述伺服电机进行驱动形成反馈机制。
【文档编号】A61B5/0488GK106073772SQ201610398922
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】蒋苏, 徐文东, 王晓敏, 沈云东, 邱彦群, 郑谋雄, 冯俊涛, 王国宝, 于爱萍, 徐建光, 顾玉东
【申请人】复旦大学附属华山医院