一种本草提取物及其在化妆品中的应用

一种本草提取物及其在化妆品中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种雪茶提取物，该雪茶提取物中包括缩酚酸类化合物，如鳞片衣酸、羊角衣酸、雪茶素、地茶酸中的任意一种或几种。本发明还公开了雪茶提取物的制备方法以及其在化妆品领域的应用。该雪茶提取物采用极性溶剂提取法，提取工艺简单，易于工业化。本发明提供的雪茶提取物，具有优异的抗衰老性能，以及修复受损细胞的能力，此外，还具有优良的保湿性能，可以作为复合型添加剂加入到化妆品中。
【专利说明】
一种本草提取物及其在化妆品中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及一种本草类提取物及其制备方法和包含该提取物 的化妆品，尤其涉及一种雪茶提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。
【背景技术】
[0002] 雪茶(Thamnolia vermicularia)，别名地茶、太白茶、地雪茶，是地衣类地茶科植 物。地衣体枝状，灰白色或白色，高3-7cm，多分叉，常委2-3叉或单支上呈小刺状分叉，长圆 条形或扁条形。
[0003] 雪茶自古以来就是一种名贵中药和保健饮品。《纲目拾遗》中有载："雪茶，出滇南， 色白，久则色微黄，以盈烹渝，清香回胜。土人采得炒焙，以其似茶，色白，故名雪茶。此茶大 能暖胃，若患痨损及失血过多之人，服胃必寒，最忌食茶，惟此茶不忌，烹渝食之，入腹温 暖。"即认为雪茶有清热生津、醒脑安神、降血压和降血脂的功效。
[0004] 雪茶生长在海拔数千米的高山上，分为红雪茶和白雪茶两种。其中，白雪茶含有多 种对人体有益的成分，能降血脂血压、减肥、醒脑润肺、清热解暑、生津止咳、清肝明目、滋阴 润肺等，此外还能清除体内垃圾，排出毒素，因此，白雪茶很早就在饮品、医药等领域得到广 泛应用。申请号为201210190931.1的专利公开了一种复合雪茶及其制备方法，该复合雪茶 具有清热解毒，降高血压、高血脂、高血糖，以及增加冠状动脉和脑血流量的作用。申请号为 201210042650.3的专利公开了一种红雪茶提取物，该提取物以红雪茶干燥粗粉为原料，经 过水提取、醇沉淀、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解、透析和干燥等步骤制成，该提取物可以用 以防治脂肪肝等疾病。但是，目前还未见到雪茶在化妆品方面应用的相关报道。

【发明内容】

[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明以白雪茶为原料，提供一种雪茶提取物，并研究 了该提取物在化妆品领域中的应用。
[0006] 本发明提供的雪茶提取物，所述雪茶提取物包括缩酚酸类化合物。
[0007] 作为本发明的一个优选实施例，所述酚酸类化合物为鳞片衣酸、羊角衣酸、雪茶 素、地茶酸中的任意一种或几种组合。
[0008] 作为本发明的一个优选实施例，所述酚酸类化合物的质量含量为5%_50%，如 8%、45%，优选为 10%-35%，如 15%、30%，更优选为 18%-25%，如20%等。
[0009] 作为本发明的一个优选实施例，所述雪茶提取物还包括α-雪松醇，所述α-雪松醇 的含量为0-5%，如1 %、3%等。
[0010] 作为本发明的一个优选实施例，所述雪茶提取物可以是水提物、醇提物、油提物、 超临界CO2提取物中的任意一种或几种的组合。
[0011] 作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物优选为乙醇提取物。
[0012] 本发明的第二个方面在于提供一种雪茶提取物的制备方法，所述方法包括如下步 骤：
[0013] 步骤1、取粉碎后的雪茶原料，向所述雪茶原料中添加体积为所述雪茶原料10-20 倍的溶媒，在40-80 °C提取多次，合并提取液；
[0014] 步骤2、减压过滤步骤1中合并后的所述提取液，得到过滤液，并减压浓缩所述过滤 液，得到所述雪茶提取物。
[0015] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中的所述溶媒为极性溶媒或非极性溶媒中 的任意一种或几种组合，如甲醇、甲醇水溶液、甲醇、乙醇水溶液、乙醚等，优选为极性溶媒， 如甲醇水溶液、乙醇水溶液。
[0016] 作为本发明的一个优选实施例，所述雪茶提取物为物理粉碎粉末和/或浸膏。
[0017] 作为本发明的一个优选实施例，所述制备方法包括如下步骤：
[0018] 步骤1、取粉碎后的雪茶原料，以雪茶原料:溶媒=Ig: (5-20)mL比例，在50 °C-120 °(：温度下提取至少2次，每次提取0.5-10h，提取结束后混合每次的提取液，得到混合提取 液；
[0019] 步骤2、浓缩所述混合提取液，制备得到所述雪茶提取物。
[0020] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中提取雪茶的溶媒为水、甲醇水溶液、乙醇 水溶液、乙醚等中的任意一种或几种组合。
[0021] 作为本发明的一个优选实施例，所述甲醇水溶液的体积浓度为30%_100%，如 40 %、95 % ;优选为50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中体积浓度为100 %时，所述溶媒即 为无水甲醇。
[0022]作为本发明的一个优选实施例，所述乙醇水溶液的体积浓度为30%_100%，如 40 %、95 % ;优选为50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中体积浓度为100 %时，所述溶媒即 为无水乙醇。
[0023]作为本发明的一个优选实施例，雪茶的提取条件为0.2-0.8MPa，如0.3MPa、 0 · 6MPa，优选为 0 · 4-0 · 5MPa，如0 · 45MPa。
[0024] 作为本发明的一个优选实施例，雪茶的提取条件为1 . 2-1.8MPa，如I . 3MPa、 1 · 6MPa，优选为 1 · 4-1 · 5MPa，如 1 · 45MPa。
[0025] 作为本发明的一个优选实施例，所述制备方法中，步骤2为，将所述混合提取液第 一次浓缩，得到浓缩液一，所述浓缩液一经过层析柱纯化多次，第二次浓缩，得到所述橄榄 叶粉末。
[0026] 作为本发明的一个优选实施例，所述纯化过程为大孔吸附树脂纯化、硅胶柱吸附 纯化中的任意一种或几种组合。
[0027] 作为本发明的一个优选实施例，所述大孔吸附树脂纯化过程的条件为:温度为25 。(:-50 °C，优选为30 °C -40 °C，所述大孔吸附树脂的型号为AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一 种或几种。
[0028] 作为本发明的一个优选实施例，大孔吸附树脂吸附后，使用乙醇和/或水的混合溶 液梯度洗脱，所述混合溶液的体积比为乙醇:水=1: (0-10)，优选为乙醇:水=1: (1-5)。 [0029]作为本发明的一个优选实施例，所述洗脱过程中，所述混合溶液的流速为2-4BV/ 11，洗脱温度为30°050°(：。
[0030]作为本发明的一个优选实施例，所述硅胶柱吸附纯化过程的条件为:25°c-50°c， 三氯甲烷：甲醇:水=(1-3) :(1-5) :(1-2)作为洗脱剂洗脱，所述洗脱剂的流速2-4BV/h，洗 脱温度为30°C-50°C。
[0031 ]作为本发明的一个优选实施例，步骤2中减压浓缩后还可以包括干燥步骤。
[0032]作为本发明的一个优选实施例，所述干燥步骤为喷雾干燥和/或热空气干燥。
[0033]作为本发明的一个优选实施例，所述喷雾干燥过程中，高压栗在80_120MPa压力下 将所述过滤液通过雾化器形成100-200μπι的颗粒，与所述颗粒接触的热空气的温度为60-100°C，接触时间为5-50s。
[0034]本发明的第三个方面在于提供上述任意一种雪茶提取物的应用。
[0035]所述雪茶提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮肤外表 面的制品。
[0036]其中，本发明所述雪茶提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品和/ 或护肤品。
[0037]本发明的第四个方面在于提供一种包含上述任意一种雪茶提取物的日化用品，优 选为包含上述任意一种雪茶提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化妆品和/或护肤 品中，优选为化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养性添加剂。
[0038]作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述雪茶提取物的含 量为0.001%-50%，如0.003%，40%，优选为0.005%-30%，如1%、3%、5%、10%、20%等。
[0039] 本发明提供的雪茶提取物的制备工艺简单，得到的雪茶提取物具有优异的保湿性 能和抗衰老能力，可以作为复合型添加剂加入到化妆品中，是理想的化妆品添加剂。
【附图说明】
[0040] 图1为自然状态下雪茶提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；
[0041] 图2为过氧化氢对细胞存活率的影响；
[0042] 图3为雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；
[0043] 图4为雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-I分泌的影响；
[0044] 图5为雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞丙二醛含量的影响；
[0045] 图6为雪茶提取物对DPPH自由基去除率的影响；
[0046] 图7雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞HAS3含量的影响；
[0047] 图8为雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞HA含量的影响；
[0048] 图9为雪茶提取物对过氧化氢损伤的HaCat细胞LOR含量的影响。
【具体实施方式】
[0049] 雪茶提取物的制备
[0050] 实施例一
[0051]取干燥的IOkg白雪茶作为原料，去离子水清洗2遍，除杂后粉碎，并过80目筛。向白 雪茶原料中加入体积比为14倍量的70 %乙醇溶液，在75 °C水浴中常压提取2h，提取结束后， 再加入原料量10倍量的50%乙醇溶液，75°C水浴中常压提取2h，提取结束后合并2次的提取 液，将得到的提取液在5kPa、微沸状态下浓缩至4L，得到浸膏，将浸膏保持于4°C，该浸膏即 为雪茶提取物。
[0052]使用C18色谱柱的液相色谱-质谱联用仪分析该雪茶提取物(将该雪茶提取物溶解 在无水甲醇中，甲醇用量为雪茶提取物的10倍体积，配制成甲醇溶液），以甲醇:〇.5%甲酸 溶液=75:25作为流动相，250nm波长、柱温25°C。
[0053] 分析可知，该雪茶提取物中，缩酚酸类化合物的质量含量10%，鳞片衣酸的质量含 量为2%、羊角衣酸质量含量2%、雪茶素质量含量5%。
[0054] 实施例二
[0055]取干燥的IOkg白雪茶作为原料，去离子水清洗2遍，除杂后粉碎，并过80目筛。向白 雪茶原料中加入体积比为I 〇倍量的70 %乙醇溶液，在75 °C水浴中常压提取2h，提取结束后， 再加入原料量10倍量的50%乙醇溶液，65°C水浴中常压提取2h，提取结束后，再加入原料量 10倍量的去离子水，80°C水浴中常压提取2h，提取结束后合并3次的提取液，将得到的提取 液在5kPa、微沸状态下浓缩至5L。
[0056] 冷却后，向减压漏斗上放置两层滤纸，减压过滤浓缩液，将滤饼喷雾干燥后得到雪 茶提取物。其中，喷雾干燥器中的条件为：IOOMPa压力下，将浸膏制成150μπι的微粒，将微粒 通过70°C的热空气干燥15s。
[0057] 使用C18色谱柱的液相色谱-质谱联用仪分析该雪茶提取物(将该雪茶提取物溶解 在无水甲醇中，甲醇用量为雪茶提取物的10倍体积，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作为流动相，250nm波长、柱温25°C。
[0058]分析可知，该雪茶提取物中，缩酚酸类化合物的质量含量20%，鳞片衣酸的质量含 量为10%、羊角衣酸质量含量5%、雪茶素质量含量3%。
[0059] 实施例三
[0060] 取干燥的IOkg白雪茶作为原料，去离子水清洗2遍，除杂后粉碎，并过80目筛。向白 雪茶原料中加入体积比为I〇倍量的70 %甲醇溶液和10倍量的70 %乙醇溶液，在70 °C水浴中 常压提取2h，提取结束后，再加入原料量10倍量的50%乙醇溶液，65°C水浴中常压提取2h， 提取结束后，再加入原料量10倍量的去离子水，80°C水浴中常压提取2h，提取结束后合并3 次的提取液，将得到的提取液在5kPa、微沸状态下浓缩至5L。
[0061] 冷却后，向减压漏斗上放置两层滤纸，减压过滤浓缩液，将滤饼喷雾干燥后得到雪 茶提取物。其中，喷雾干燥器中的条件为：120MPa压力下，将浸膏制成100μπι的微粒，将微粒 通过70°C的热空气干燥30s。
[0062] 使用C18色谱柱的液相色谱-质谱联用仪分析该雪茶提取物(将该雪茶提取物溶解 在无水甲醇中，甲醇用量为雪茶提取物的10倍体积，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作为流动相，250nm波长、柱温25°C。
[0063] 分析可知，该雪茶提取物中，缩酚酸类化合物的质量含量40%，鳞片衣酸的质量含 量为25%、羊角衣酸质量含量10%、雪茶素质量含量3%。
[0064] 实施例四
[0065]取干燥的IOkg白雪茶作为原料，去离子水清洗2遍，除杂后粉碎，并过30目筛。向白 雪茶原料中加入体积比为15倍量的70 %甲醇溶液和10倍量的70 %乙醚溶液，在70 °C水浴中 1.2MPa下提取2h，提取结束后，再加入原料量10倍量的50 %乙醇溶液，85°C水浴中1.2MPa提 取2h，提取结束后，再加入原料量10倍量的去离子水，80 °C水浴中0.8MPa提取2h，提取结束 后合并3次的提取液，将得到的提取液在5kPa、微沸状态下浓缩至5L。
[0066] 冷却后，将浓缩液使用200目硅胶柱纯化，以体积比三氯甲烷：甲醇：水= 3:5:2作 为流动相，流动相的流速为3BV/h，在25°C下洗脱，将洗脱液浓缩后，再使用200目硅胶柱二 次纯化，以体积比三氯甲烷：甲醇:水= 4:2:4作为流动相，流动相的流速为2BV/h，在25°C下 洗脱，二次洗脱液在5kPa、30°C下蒸发，去除其中的三氯甲烷和甲醇，静置12h，向减压漏斗 上放置两层滤纸，减压过滤浓缩液，将滤饼喷雾干燥后得到雪茶提取物。其中，喷雾干燥器 中的条件为：120MPa压力下，将浸膏制成100μπι的微粒，将微粒通过70°C的热空气干燥30s。
[0067] 使用C18色谱柱的液相色谱-质谱联用仪分析该雪茶提取物(将该雪茶提取物溶解 在无水甲醇中，甲醇用量为雪茶提取物的10倍体积，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作为流动相，250nm波长、柱温25°C。
[0068] 分析可知，该雪茶提取物中，缩酚酸类化合物的质量含量50%，鳞片衣酸的质量含 量为30%、羊角衣酸质量含量10%、雪茶素质量含量6%。
[0069] 实施例五
[0070] 取干燥的白雪茶原料10kg，去离子水清洗2遍，除杂后粉碎，并过30目筛。向白雪茶 原料中加入体积比为15倍量的乙醚，在60°C水浴、I. IMPa压力下提取2次，每次提取2h。然后 向提取结束的白雪茶中加入20倍量的80 %甲醇溶液，在70°C、I. IMPa压力下提取2次，每次 提取2h，提取结束后合并4次的提取液。
[0071] 向减压漏斗上放置两层滤纸，减压过滤合并后的提取液，得到滤液，将滤液在 5kPa、饱和蒸汽压下浓缩至4L，将浸膏保持于4°C，该浸膏即为雪茶提取物。
[0072] 取干燥的IOkg白雪茶作为原料，去离子水清洗2遍，除杂后粉碎，并过30目筛。向白 雪茶原料中加入体积比为15倍量的50 %乙醇溶液和10倍量的70 %乙醚溶液，在70 °C水浴中 1.2MPa下提取2h，提取结束后，再加入原料量10倍量的60 %甲醇溶液，85°C水浴中1.2MPa提 取2h，提取结束后合并2次的提取液，将得到的提取液在5kPa、微沸状态下浓缩至5L。
[0073] 冷却后，向减压漏斗上放置两层滤纸，减压过滤浓缩液，将滤饼喷雾干燥后得到雪 茶提取物。其中，喷雾干燥器中的条件为：120MPa压力下，将浸膏制成100μπι的微粒，将微粒 通过70°C的热空气干燥30s。
[0074] 使用C18色谱柱的液相色谱-质谱联用仪分析该雪茶提取物(将该雪茶提取物溶解 在无水甲醇中，甲醇用量为雪茶提取物的10倍体积，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作为流动相，250nm波长、柱温25°C。
[0075] 分析可知，该雪茶提取物中，缩酚酸类化合物的质量含量30%，鳞片衣酸的质量含 量为15%、羊角衣酸质量含量10%、雪茶素质量含量5%。
[0076] 对照试验
[0077]称取IOkg雪茶放入200L的萃取池中，置于转盘上。加入二氯甲烷作为萃取溶剂，在 压力10.34MPa和60°C温度下，预热Imin，静态萃取2h，氮气吹扫90s。收集萃取液，向萃取液 中加入1 %体积倍量的无水硫酸钠于〇 tC静置过夜。过夜后的萃取液在0.7MPa、30 °C蒸发浓 缩去除大部分二氯甲烷，浓缩液于40°C经喷雾干燥得到雪茶提取物。
[0078] 使用C18色谱柱的液相色谱-质谱联用仪分析该雪茶提取物(将该雪茶提取物溶解 在无水甲醇中，甲醇用量为雪茶提取物的10倍体积，配制成甲醇溶液），以甲醇:0.5%甲酸 溶液=75:25作为流动相，250nm波长、柱温25°C。
[0079] 分析可知，该雪茶提取物中，缩酚酸类化合物的质量含量30%，鳞片衣酸的质量含 量为22%、羊角衣酸质量含量6%、雪茶素质量含量1 %。
[0080] 雪茶提取物对HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响
[0081] 取对数生长期、浓度为IO5个/mL的人HDF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中， 每孔细胞液l〇〇yL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每孔设3个复孔。
[0082]将96孔板置于37 °C的细胞培养箱中贴壁培养6h。
[0083] 将终浓度为lmg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的雪茶提取物加入到96孔细胞培养板 中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37°C、包含5%C02的细胞培养箱中孵育48h。
[0084] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的细胞培养箱中黑 暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMSO，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波 长，检测吸光度。
[0085]计算细胞存活率，结果如表1所示：
[0086] 表1，雪茶提取物对HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响
[0088]以细胞存活率高于80%为对人HDF细胞和HaCat细胞无毒的标准，由表1可知，本发 明提供的雪茶提取物对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.0 lmg/mL，由表1可知，本发明提供的 雪茶提取物对人HaCat细胞无毒的最高浓度为0.01mg/mL，因此，确定雪茶提取物的浓度 0.0 lmg/mL为后续的试验浓度。
[0089]雪茶提取物的抗衰老性能
[0090]自然状态下雪茶提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响
[0091]为了考察本发明提供的雪茶提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响，本实施例将试验 分为空白组、实验组1、实验组2、实验对照组和标准组。
[0092]取对数生长期、浓度为IO5个/mL细胞，每孔IOOyU于37°C、含有CO2的细胞培养箱中 培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。
[0093] 向标准组中加入50yL标准液，向实验组1中加入IOyL上清液和40yL实施例三提供 的雪茶提取物的稀释液，向实验组2中加入IOyL上清液和40yL实施例四提供的雪茶提取物 的稀释液，向实验对照组中加入IOyL上清液和40yL采用对比实施例所述方法制备的雪茶提 取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次，每孔设3个复孔。
[0094]向五组样品中分别加入生物素标记的抗-IgG抗体50yL，于37°C温育30min，洗涤5 次。
[0095]向五组样品中分别加入50yL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于37 °C温育 30min，洗涤5次。
[0096] 向五组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，轻轻震荡混匀，于37°C避光孵 育30min，向五组样品中加入终止液50yL。
[0097]以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度，结果如表 2和图1所示。
[0098]表2，雪茶提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响
[0100]胶原蛋白主要包括I型胶原和in型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提高 是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了 I型胶原蛋白的表达，两种情况 造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含量减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱 纹的主要原因。由表2可知，向HDF细胞中添加本发明提供的浓度为0.01mg/mL雪茶提取物 后，皮肤中的I型胶原蛋白含量分别为空白组的1.04倍和1.18倍，而采用现有技术制备的雪 茶提取物与空白组中不加入雪茶提取物的I型胶原蛋白含量相差无几，说明本发明提供的 雪茶提取物能够显著的促进I型胶原蛋白的表达，是潜在的抗老化添加剂。
[0101] 过氧化氢对HDF细胞存活率的影响
[0102]选取不同浓度的过氧化氢，如50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用MTT法检测不同浓度的过氧化氢对HDF 细胞存活率的影响。
[0103] 取培养至浓度为IO5个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培养箱中贴壁培养6h，每孔做复孔3个。
[0104]使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h;向每个样品孔中加入浓度为 0.5mg/mL的MTT IOOyU于37°C、含有CO2的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。
[0105] 去除上清液，向样品中加入150yL DMS0,震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照 波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。 Γ"_/? --十每个样翁孔的啜光度V
[0106] 细胞存活率X 1繼瀹
[0107] 测试结果如图2所示，人HDF细胞于浓度为50-800μΜ的过氧化氢共孵育3-9h后，人 HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μΜ时，细胞存活率低于50% dOOyM过氧化 氢作用6h后，细胞存活率降到70 %。
[0108] 雪茶提取物对经过过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响
[0109 ] 本测试分为空白组、阴性对照组、阳性对照组和实验组1、实验组2和对照实验组。 [0110] 取培养至密度为IO5个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔IOOyL。于37°C，含有CO2的 培养箱中贴壁培养6h。
[0111] 向阳性对照组中加入维甲酸，向实验组1中加入本发明实施例三提供的雪茶提取 物，向实验组2中加入本发明实施例四提供的雪茶提取物，向对照实验组中加入对比实施例 提供的雪茶提取物，空白组和阴性对照组不加样品。
[0112] 利用过氧化氢损伤建模，并向每孔加入0.5mg/mL的MTT IOOyL，于37 °C、5 %⑶:^的 黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入DMSO 150yL，震荡检测吸光度，计算细胞存活率，结果 如表3所示。
[0113]表3，雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响
[0115] 由表3可知，经过过氧化氢孵育后，HDF细胞的存活率降低至70 %，如表3中的阴性 对照组所示。向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入本发明实施例三提供的雪茶提取物后， 人HDF细胞的存活率达到80.01 % ;向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入本发明实施例四 提供的雪茶提取物后，人HDF细胞的存活率达到77.19%，均高于对照实验组中的73%，以及 阴性对照组的70%，说明本发明提供的雪茶提取物相对于现有技术，能够更有效修复过氧 化氢对HDF细胞的损伤。
[0116] 雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响
[0117] 本试验分为空白组、实验组1、实验组2、对照试验组、阴性对照组和阳性对照组。
[0118] 取培养至密度为IO5个/mL的HDF细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔ImU每孔设3 个复孔。于37 °C，含有CO2的培养箱中贴壁培养6h。
[0119] 空白组、阴性对照组中不加入样品，实验组1中加入本发明实施例三提供的雪茶提 取物，实验组2中加入本发明实施例四提供的雪茶提取物，对照实验组加入采用对比实施例 制备的雪茶提取物，向阳性对照组中加入维甲酸。
[0120] 实验组1、实验组2、阳性对照组和对照实验组利用过氧化氢损伤建模。
[0121] 向每孔中加入0.5mg/mL的MTT IOOyL，于37 °C、5 % CO2的黑暗条件下孵育4h。去除 上清液，加入DMSO 150yL，震荡检测吸光度，计算胶原蛋白含量，结果如表4和图3所示：
[0122] 表4,雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响
[0124]由表4和图3可知，经过过氧化氢损伤后，HDF细胞I型胶原蛋白分泌量变为未损伤 时的72%，如表4中阴性对照组所示。而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入维甲酸后， HDF细胞中I型胶原蛋白的分泌量提高至94%，如表4中阳性对照组所述。而向经过过氧化氢 损伤的HDF细胞中加入本发明提供的雪茶提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量达到 85%、89%。而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的雪茶提取物后，人HDF 细胞中I型胶原蛋白的含量为78%，明显低于加入本发明提供的雪茶提取物后人HDF细胞中 I型胶原蛋白的含量，即本发明提供的雪茶提取物相对于现有技术制备的雪茶提取物，具有 优良的修复细胞损伤的能力，能够显著修复过氧化氢对HDF细胞造成的损伤，是优良的抗衰 老化妆品添加剂。
[0125] 雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞基质金属蛋白酶(MMP-I)的影响
[0126] 材料与试剂
[0127] 细胞培养液24孔细胞培养板
[0128] 细胞培养箱过氧化氢
[0129] 离心机 ELISA试剂盒 [0130] 测试步骤
[0131 ] 本测试分为标准组、空白组和实验组。
[0132] 取对数生长期的浓度为IO5个/mL的HDF细胞接种于24孔培养板中，每孔lmL，于37 °C，含有CO 2的细胞培养箱中培养6h。
[0133] 向实验组1中加入本发明实施例三提供的雪茶提取物，向实验组2中加入本发明实 施例四提供的雪茶提取物，向标准组加入标准物，空白组中不添加样品。
[0134] 诱导建立过氧化氢损伤模型。小心吸取上清液培养基，离心，按照试剂盒说明书， 取IOyL细胞悬液进行实验。以空白孔调零，在反应终止后15min内，用450nm波长测量各孔的 吸光度。根据标准品对应的MMP-I的浓度及对应的吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方 程，再根据样本的吸光度值，在回归方程上计算出实验组中MMP-I的浓度。
[0135] 表5，雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-I含量的影响
[0137] 由表5和图4可知，人HDF细胞经过过氧化氢刺激后，HDF细胞中的MMP-I水平显著上 升至原来的167%，如表5中阴性对照组所示。加入维甲酸后，MMP-I的值有所降低，如表5中 的阳性对照组所示。而向过氧化氢刺激过的HDF细胞中加入本发明提供的雪茶提取物后， MMP-I的含量均降低至100%左右，甚至100%以下，如加入本发明实施例四提供的雪茶提取 物后，MMP-I的含量为91 %。而向过氧化氢刺激过的HDF细胞中加入采用现有技术制备的雪 茶提取物后，HDF细胞中MMP-I的含量为130 %，说明本发明提供的雪茶提取物相对于现有技 术制备的雪茶提取物具有更明显的抑制MMP-I的能力。即在氧化应激条件下，本发明提供的 雪茶提取物具有优异的抑制MMP-I表达的能力。
[0138] 雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞中丙二醛(MDA)的影响
[0139] MDA在酸性条件下加热时，可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物3，5，5-三 甲基恶唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸(TBA)，故称此法为 TBA 法。
[0140] 取对数生长期、浓度为IO5个/mL的HDF细胞，接种于6孔细胞培养板，每孔2mL，培养 6h.
[0141] 向实验组1加入经新鲜培养基稀释的本发明实施例三制备的雪茶提取物，向实验 组2加入经新鲜培养基稀释的本发明实施例四制备的雪茶提取物，向对照组加入经新鲜培 养基稀释的采用对照实施例制备的雪茶提取物，阳性对照组加入维甲酸，空白组和阴性对 照组不加入样品。
[0142] 诱导建立过氧化氢损伤模型，以1000 rpm离心10min，收集培养基上清液中的细胞 及贴壁细胞，在细胞沉淀中加入500yL PBS，轻轻颠倒混匀，于4°C下，以2000rpm离心10min， 弃除上清液留存底部沉淀。向沉淀中加入500yL roS，超声破碎细胞(400A，5s/次，间隙IOs 反复3~5次），制备细胞匀浆；
[0143] 按照试剂盒说明书进行实验。将试剂混匀，用保鲜膜将试管口扎紧，用针头刺孔透 气，用锅开盖煮沸40min，取出后流水冷却，以4000rpm离心10min，使沉淀完全。取上清液，采 用分光光度法测定532nm波长处的吸光度;利用BCA蛋白检测试剂盒，按照说明书方法将本 发明制备的雪茶提取物稀释适当倍数，测定细胞中的蛋白质含量。
[0144]表6，雪茶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MDA含量的影响
[0146] 由表6和图5可知，不加入雪茶提取物时，HDF细胞中对应的MDA含量记为100,过氧 化氢损伤后，MDA浓度快速上升，6h时MDA含量增加3.5倍至326.34，而加入维甲酸后MDA含量 的增加得到抑制，降低至空白组的2.6倍，向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明实 施例三提供的雪茶提取物后，MDA含量明显降低至200左右，采用实施例四制备的雪茶提取 物以后，MDA含量降低至185,而加入采用现有技术制备的雪茶提取物后，经过氧化氢损伤的 HDF细胞中MDA的含量为262,本发明提供的雪茶提取物与现有技术提供的雪茶提取物相比， 具有更明显的抑制HDF细胞中MDA分泌的能力，即本发明提供的雪茶提取物对人HDF细胞损 伤具有显著的修复作用。
[0147] 雪茶提取物去除自由基的性能
[0148] 1，1_二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性 主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能 发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前广泛 用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处 有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使 其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行 快速的定量分析。
[0149] 材料与试剂
[0150] DPPH 无水乙醇
[0151] dd 水 200yL 吸头
[0152] 96孔板8通道加样枪
[0153] 酶标仪
[0154] 测试步骤
[0155] 用无水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表没食子儿 茶素没食子酸酯(EGCG)溶液，。
[0156] 向实验组1添加20uL浓度为0.01mg/mL本发明实施例三提供的雪茶提取物溶液和 0.2mmoI/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组1中添加180uL无水乙醇与20uL本发 明提供的雪茶提取物溶液，向标准组中添加180uL DPPH溶液与20uL蒸馏水，每孔设置至少3 个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。
[0157] 向实验组2添加20uL浓度为0.01mg/mL本发明实施例四提供的雪茶提取物溶液和 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组2中添加180uL无水乙醇与20uL本发 明提供的雪茶提取物溶液，向标准组中添加180uL DPPH溶液与20uL蒸馏水，每孔设置至少3 个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。
[0158] 向对照试验组添加20uL浓度为0.01mg/mL采用现有技术制备的雪茶提取物溶液和 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组3中添加180uL无水乙醇与20uL采用 现有技术制备的雪茶提取物溶液，每孔设置至少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置 30min，测定各组的吸光度。
[0159] 向阳性对照组中添加20uL浓度为0.0 lmg/mL EGCG溶液和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶 液180uL至96孔板中，向空白组4中添加180uL无水乙醇与20uLEGCG溶液溶液，每孔设置至少 3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。
[0160] DPPH自由基的清除能力按下式表示：
[0161]
[0162] 其中，计算实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度分别为实验组1、实验组2的吸光 度，空白组吸光度分别为空白组1、空白组2的吸光度；
[0163] 计算对照实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为对照实验组的吸光度，空白组 吸光度为空白组3的吸光度；
[0164] 计算阳性对照组的DPPH清除率时，测试样吸光度为阳性对照组的吸光度，空白组 吸光度为空白组4的吸光度；
[0165] 清除率越大表明抗氧化能力越强，结果如图6所示，当溶液中不存在DPPH自由基 时，空白组的DPPH清除率为0，本发明实施例三制备的雪茶提取物对DPPH自由基的去除率为 33.62%，本发明实施例四制备的雪茶提取物对DPPH自由基的去除率为28.12%，而采用现 有技术制备的雪茶提取物对DPPH自由基的去除率不足20%，说明相对于现有技术，本发明 制备的雪茶提取物具有更优异的DPPH清除率。
[0166] 雪茶提取物的保湿性能
[0167] 皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮 下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤 对水的维持作用：
[0168] I)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；
[0169] 皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重 要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的 细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚 韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。
[0170] 2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。
[0171] 雪茶提取物对HDF细胞透明质酸合成酶(HAs3)表达量的影响
[0172] 正常皮肤中，HA主要由HAs合成，HAs主要包括三种，分别为说31、说82、说83，其中 HAs3的催化活性最大，且催化生成小分子量的HA(200-300ku)，而HA是已知的保湿能力最强 的物质，因此，皮肤中HAs3的含量提高能够间接促进皮肤的保湿能力。
[0173] 本测试分为空白组、实验组1、实验组2、对照实验组和标准组。
[0174] 取对数生长期、浓度为IO5个/mL的HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔 细胞液ImU于37°C、含有CO 2的细胞培养箱中培养6h。
[0175] 向实验组1细胞液中加入一定量本发明实施例三提供的雪茶提取物，向实验组2细 胞液中加入一定量本发明实施例四提供的雪茶提取物，向对照实验组中加入对比实施例提 供的雪茶提取物，向标准组中加入标准液，空白组不加样品。
[0176] 置于37 °C、含有5 %⑶:^及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h;弃除上清液，用 预冷I3BS冲洗细胞两次，在培养孔中加入IOOyL裂解液，冰上裂解细胞IOmin，收集细胞裂解 液，以13000rpm离心I Omin，取上清液备用。
[0177] 按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；
[0178]利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组HAs3表达量采用蛋白量矫正，结果 如表7和图7所示。
[0179]表7,雪茶提取物对HAs3表达的影响
[0181]由表7和图7可知，添加本发明提供的雪茶提取物后，人HDF细胞中HAs3含量比不加 入雪茶提取物中的含量提高27%，说明本发明提供的雪茶提取物保湿性比现有技术制备的 雪茶提取物的保湿性好。
[0182] 雪茶提取物对透明质酸分泌的影响
[0183]在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比 例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它对 皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。
[0184] 本测试分为空白组、实验组1、实验组2、对照实验组和标准组。
[0185] 取对数生长期的浓度为IO5个/mL的人HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每 孔细胞液ImU于37°C、含有CO 2的细胞培养箱中培养6h。
[0186] 向实验组1细胞液中加入本发明实施例三提供的雪茶提取物，向实验组2细胞液中 加入本发明实施例四提供的雪茶提取物，向对照实验组细胞液中加入对比实施例提供的雪 茶提取物，置于37°C、含有5%C0 2及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h;
[0187] 小心收集上清培养基，离心后得到上清液，备用。
[0188] 向标准组中加入50yL标准液，向实验组1中加入IOyL上清液和40yL本发明实施例 三提供的雪茶提取物的稀释液，向实验组2中加入IOyL上清液和40yL本发明实施例四提供 的雪茶提取物的稀释液，向对照实验组中加入IOyL上清液和40yL对比实施例提供的雪茶提 取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0189] 向五组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，于37°C避光孵育30min，向五组 样品中加入终止液50yL。
[0190] 以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光光度值，并根 据吸光度值计算细胞液中HA的含量，结果如表8和图8所示。
[0191] 表8，雪茶提取物对HA分泌的影响
[0193] 由表8和图8可知，添加本发明提供的雪茶提取物后，人HDF细胞中HA含量比未加入 雪茶提取物时，HDF细胞中HA含量提高了约13%。而加入现有技术提供的雪茶提取物后，HDF 细胞中HA含量提高了 5%，说明相对于现在技术制备的雪茶提取物，本发明提供的雪茶提取 物能够明显促进HDF细胞分泌HA，有效保持细胞中水分，并进而起到保湿的作用。
[0194] 雪茶提取物对兜甲蛋白（LOR)表达的影响
[0195] 角质层是由角质形成细胞构成的坚韧有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。 角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化学物质内渗和体液外渗的作用，其中含量最高的角 蛋白叫做兜甲蛋白，约占角蛋白的80 %，兜甲蛋白的含量会直接影响皮肤水分的流失状况。
[0196] 本试验通过考察Hacat细胞兜甲蛋白（LOR)的表达来考察本发明提供的雪茶提取 物的保湿性能。本测试分为空白组、实验组1、实验组2、对照试验组和标准组。
[0197] 取对数生长期的浓度为IO5个/mL的Hacat细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每 孔细胞液ImU于37°C、含有CO 2的细胞培养箱中培养6h。
[0198] 向实验组1细胞液中加入本发明实施例三提供的雪茶提取物，向实验组2细胞液中 加入本发明实施例四提供的雪茶提取物，向对照实验组细胞液中加入对比实施例提供的雪 茶提取物，置于37°C、含有5%C0 2及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h;
[0199] 弃除上清液，用预冷I3BS冲洗细胞两次，在培养孔中加入IOOyL裂解液，冰上裂解细 胞IOmin，收集细胞裂解液，以13000rpm离心10min，取上清液备用。
[0200] 按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；
[0201] 利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组LOR表达量采用蛋白量矫正，结果 如表9和图9所示。
[0202]表9,雪茶提取物对LOR表达的影响
[0204] 由表9和图9可知，添加本发实施例四提供的雪茶提取物后，人HaCat细胞中LOR含 量比空白组提高31%，而添加采用现有技术制备的雪茶提取物后，LOR含量仅比空白组提高 12%，这说明本发明提供的雪茶提取物能够显著促进LOR的表达。
[0205] 综上所述，本发明提供的雪茶提取物具有显著的保湿性能和优良的抗衰老抗氧化 能力，能够作为双重作用的添加剂加入化妆品中。
[0206] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述化妆品和/或护肤品包含雪茶提取物，所 述雪茶提取物的含量为0.001 %-50 %。2. 根据权利要求1所述的化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述雪茶提取物的质量含 量为 5 %-50 %。3. -种雪茶提取物，其特征在于，所述雪茶提取物包括缩酚酸类化合物，所述酚酸类化 合物为鳞片衣酸、羊角衣酸、雪茶素、地茶酸中的任意一种或几种组合。4. 根据权利要求3所述的雪茶提取物，其特征在于，所述缩酚酸类化合物的质量含量为 5-50% 〇5. -种根据权利要求3或4所述的雪茶提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括 如下步骤： 步骤1、取粉碎后的雪茶原料，向所述雪茶原料中添加体积为所述雪茶原料10-20倍的 溶媒，在60-150 °C提取多次，合并提取液； 步骤2、减压过滤步骤1中合并后的所述提取液，得到过滤液，并减压浓缩所述过滤液， 得到所述雪茶提取物。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中雪茶的提取条件为1.2- 1.8MPaS〇.2-〇.8MPa。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述溶媒为甲醇和/或其水溶液、乙醇 和/或其水溶液、乙醚中的至少一种。8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中减压浓缩后还包括100-300目 硅胶柱纯化，所述硅胶柱纯化的条件为25 °C_50 °C，三氯甲烷：甲醇:水=(1-3): (1-5): (1-2)作为洗脱剂洗脱，所述洗脱剂的流速2-4BV/h，洗脱温度为30°C-5(TC。9. 一种如权利要求3或4所述雪茶提取物的应用，其特征在于，所述雪茶提取物应用于 制备涂覆于皮肤外表面的制品。10. 根据权利要求9所述的雪茶提取物的应用，其特征在于，所述制品为化妆品和/或护 肤品。
【文档编号】A61Q19/08GK106074263SQ201610520127
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】洪民华, 刘丹, 赵兆, 洪奇, 吕智, 卢艳花, 何浩
【申请人】上海相宜本草化妆品股份有限公司, 华东理工大学