用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂的制作方法

用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂。具体地说，本发明涉及属于细胞治疗技术领域，涉及一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，特别是涉及一种包括间充质干细胞特别是GD2表达呈阳性的基质细胞和KDR2表达呈阳性的造血干细胞的治疗剂。进一步的，本发明涉及间充质干细胞特别是GD2表达呈阳性的基质细胞和KDR2表达呈阳性的造血干细胞二者组合在制备用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。本发明治疗剂和治疗方法可以有效地用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退，并有效地应用于早老症和早衰患者。
【专利说明】
用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂
技术领域
[0001]本发明属于细胞治疗技术领域，涉及一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，特别是涉及一种包括GD2+基质细胞和KDR2+造血干细胞的治疗剂。进一步的，本发明涉及GD2+基质细胞和KDR2+造血干细胞二者组合在制备用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。已经发现，本发明治疗剂可以有效地用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。
[0003]MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。
[0004]近期的研究显示，脐带组织和胎盘组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。
[0005]造血干细胞(通常缩写为HSC)，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
[0006]造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病(如急性白血病、慢性粒细胞白血病等)、非恶性难治性血液病(如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等)遗传性疾病(先天性免疫缺陷病、地中海贫血等)和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。
[0007]一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，根据其来源分别称之为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，与上述三种来源的造血干细胞相比，胎盘中所含造血干细胞的数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，且移植后反应较轻且不需要采用药物。此外，作为胎盘造血干细胞来源-胎盘，来源广泛，孕妇生产后往往成为废弃物，其采集不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。诸多优点使胎盘造血干细胞有望取代骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞用于造血干细胞移植中。
[0008]目前在国际血液系统疾病的治疗中主要采取的造血干细胞移植的方法，根据细胞的来源，可分为三类:骨髓造血干细胞移植(BMT)、动员周围血干细胞移植(MPST)和脐带血干细胞移植(UCBT) ο前两者干细胞来源丰富，一般有核细胞数可达5-10 X 108/Kg，⑶34+细胞(一种造血干/祖细胞的表面标记)可达1-5 XlOVKg，可是由于供者和受体之间需HLA严格相符，才能保证移植的成功，否则供者造血干细胞不易在病人体内植活，即使成活也会发生较严重的移植物抗宿主病(GVHD)。在一个家庭的子女中，仅有1/4HLA相符的机率，而在非血缘关系的无关供者中，这种机率只有百分之一，极大的限制了BMT或MPST在临床上的广泛应用。
[0009]近十余年来脐带血造血干细胞移植在临床上成功的应用促进了脐带血造血干细胞研究的发展。脐带血来自于胎盘，通常在妇女分娩后废弃，现在发现脐带血中含丰富的造血干细胞，其⑶34+细胞的浓度和骨髓类似，约占总细胞数的0.1-0.5 %，而更早期的造血干细胞CD34-还较骨髓浓度更高。作为一种造血细胞的来源，现在利用脐带血移植手术正在逐渐增加。与BMT相比，UCBT的优势在于减少了严重的移植物抗宿主反应，有效的扩大了对于那些缺少合适的人类白细胞抗原配型家庭或者无关供体移植的可能性。脐带血移植主要的限制在于脐血中的造血干细胞数量有限，这种限制促使临床中需要使用2倍剂量单位的脐血，移植体重较大的成年受助人;另一种方法是进行体外造血干细胞扩增培养，但体外扩增需要花费时间，费用也高，更重要的是扩增的同时，造血干细胞也发生分化，临床应用的结果表明脐血造血干细胞扩增前后对移植无多大差异。
[0010]人类足月胎盘存在大量的造血干细胞，比脐带血有更多的造血干细胞，而且这些胎盘造血干细胞在冷冻储存前后都可以分离出来。胎盘造血干细胞菌落形成单位(CFU)的活性是确定的，在免疫缺陷鼠中的移植实验已经证明胎盘造血干细胞在移植中的潜力。这些结果有力地表明，人类足月胎盘有可能成为一种新型的用于移植的造血干细胞的来源。胎盘中有大量的造血干细胞，胎盘造血干细胞是较为早期的干细胞，能在体内分化成各种细胞，胎盘血内含有丰富的各种阶段早期造血干细胞，其含量大约是脐带血的十几倍，一个胎盘中的造血干细胞可完全满足于两个成年人的需求，若能和脐带血细胞一起应用于病人，无疑大大增加了造血干细胞的含量，这使造血干细胞可完全应用于所有的适用人群。
[0011]机体机能老化和脏器功能衰退较为特殊且典型的表现为早老症(人们通常亦称为早衰症)。修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退是治疗早老症的必要手段。令人遗憾的是，迄今为止临床上尚无有效的治疗早老症的方法。
[0012]因此，本领域技术人员迫切期待有一种有效的方法来治疗早老症，从而实现修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退的目的。

【发明内容】

[0013]本发明的目的在于提供一种有效的方法来延缓和治疗早老症，从而实现修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退的目的。本发明人出人意料地发现，使用间充质干细胞与造血干细胞可以有效地修复机体机能老化以及延缓脏器功能衰退，从而达到治疗早老症的目的。本发明基于此发现而得以完成。
[0014]为此，本发明一方面提供了间充质干细胞与造血干细胞组合在制备用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。
[0015]根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是GD2+基质细胞。
[0016]根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的间充质干细胞。
[0017]根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的⑶2+基质细胞。
[0018]根据本发明第一方面的用途，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的⑶2+基质细胞，且⑶2阳性表达率大于90%，例如大于95%。
[0019]根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞来源于:脐带血、骨髓、胎盘血、和/或动员外周血。
[0020]根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞。
[0021]根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞，该KDR2阳性表达的造血干细胞中KDR2阳性表达率大于85%，例如大于90%。
[0022]根据本发明第一方面的用途，其中所述造血干细胞中⑶34阳性表达率大于80%，例如大于85%。
[0023]根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞。
[0024]根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂在用于哺乳动物，例如人时所述间充质干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(0.1?10) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.5?5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.75?1.5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为17个基质细胞。
[0025]根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂在用于哺乳动物，例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(I?5) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为3 X 17个单个核细胞。或者，在一个实施方案中，其中所述治疗剂在用于哺乳动物，例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(2?10) X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?5)X 15个单个核细胞，例如每公斤体重用量为(2?4) X 15个单个核细胞。
[0026]根据本发明第一方面的用途，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时，先使用间充质干细胞，在I个月之后使用造血干细胞。
[0027]进一步的，本发明第二方面提供了一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，其呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞。
[0028]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是GD2+基质细胞。
[0029]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的间充质干细胞。
[0030]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的⑶2+基质细胞。
[0031]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的⑶2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于90%，例如大于95%。
[0032]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞来源于:脐带血、骨髓、胎盘血、和/或动员外周血。
[0033 ]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞。
[0034]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞，该KDR2阳性表达的造血干细胞中KDR2阳性表达率大于85%，例如大于90%。
[0035]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述造血干细胞中CD34阳性表达率大于80%，例如大于85 %。
[0036]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述间充质干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(0.1?10) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.5?5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.75?1.5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为17个基质细胞。
[0037]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(I?5) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为3 X 17个单个核细胞。或者，在一个实施方案中，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(2?10) X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?5)X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 15个单个核细胞。
[0038]根据本发明第二方面的治疗剂，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时，先使用间充质干细胞，在I个月之后使用造血干细胞。
[0039]本发明所用的间充质干细胞可以使用本领域已知的方法来制备。
[0040]例如，对于通过胎盘获得的间充质干细胞，可以参照中国专利申请号201210292509.9中的方法获得，例如通过该文献方法获得的GD2阳性表达率不低于90%的GD2+基质细胞。在一个实例中，获得该GD2+基质细胞的方法包括以下步骤:
[0041 ] (I)胎盘组织清洗:胎盘组织是在生物安全柜内进行处理，根据胎盘大小使用适量PBS缓冲液对胎盘组织进行冲洗2-3遍，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；
[0042](2)胎盘组织消化处理:使用手术剪从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，把小叶转移到培养皿上，加入25ml PBS缓冲液并把胎盘小叶尽量剪碎，加入25ml 0.25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS缓冲液体积比例为1:1)并混匀组织，把培养皿放进37°C的恒温摇床里消化20分钟；
[0043](3)胎盘组织过滤处理:往培养皿里加入5ml FBS(Gibco)并混匀以达到终止消化的目的，把消化过后的胎盘组织碎片转移到200目金属过滤器上，对胎盘组织碎片进行研磨并利用另一培养皿收集过滤完的液体，分开两次往金属过滤器加入1ml的PBS缓冲液清洗组织并继续研磨，将收集的滤液转移至50ml离心管，以速度HOOrpm离心10分钟，去除上清液并加入I3BS缓冲液重悬细胞，以速度HOOrpm离心10分钟，去除上清液，加入I3BS缓冲液重悬细胞，抽取小量样本进行细胞计数，以速度1400rpm离心10分钟以达到清洗细胞的效果；
[0044](4)配制胎盘全细胞冻存液:所述胎盘全细胞冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO(二甲基亚砜)和65重量份的DMEM-Fl2，配好的冻存液放在4°C冰箱保存直至使用；
[0045](5)胎盘全细胞冻存:将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在4°C的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后以每一管每毫升4X 17到I X 18的细胞密度加入冻存管里，此过程需在4°C的低温条件下进行，将冻存管放入程序降温盒里，先在4°C的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80°C的温度条件下冷冻I天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用；
[0046]必要时，可以进一步地包括与冻存方法配套使用的复苏方法:
[0047](6)冻存胎盘全细胞复苏:将步骤(4)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15%FBS+1%L_Glutamine+0.05%Gentamicin+84%DMEM-F12)进行点滴法清洗胎盘全细胞，解冻获得的细胞悬液与间充质干细胞培养基的体积比为1:3(lml:3ml)，将混合有间充质干细胞培养基的细胞悬液转移到离心管，以速度HOOrpm离心10分钟清洗DMSO，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，并以I份细胞悬液比2-3份红细胞裂解液的比例加入红细胞裂解液(Roche)，在15-25°C的环境下培养10-15分钟，放进离心机以速度HOOrpm离心10分钟进行离心，离心后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后加入PBS缓冲液重悬细胞并抽取小量样本进行细胞计数，放进离心机以速度1400rpm离心10分钟进行离心以清洗细胞，去除上清液；
[0048]必要时，可以进一步地包括复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法:
[0049](7)细胞培养:向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，转移到T25培养瓶，再将T25培养瓶放进C02浓度为5%的37°C培养箱中进行培养，培养至第6天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第9天时将T25培养瓶从培养箱中取出，进行第二次半换液，在第12天把平皿里面的培养基抽走，加入15ml间充质干细胞培养基继续培养，往后每2天进行一次全换液；
[0050](8)细胞传代:当T25培养瓶里面的贴壁细胞融合率达到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离T25培养瓶底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养;此后每两天换液一次直至融合率达到80 %后，即得，必要时再进行传代。
[0051]必要时，可以进一步地针对以上步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项:细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；
[0052]必要时，可以进一步地将以上步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。
[0053]在上述获得的⑶2阳性表达率不低于90%的⑶2+基质细胞的这种胎盘间充质干细胞过程中，对所获得的细胞进行GD2阳性表达率检测，选取GD2阳性表达率不低于90%例如不低于95%的GD2+基质细胞作为本发明使用的间充质干细胞。
[0054]又例如，对于通过脐带获得的间充质干细胞，可以参照中国专利申请号201210159916.2中的方法获得，例如通过该文献方法获得的GD2阳性表达率不低于90%的GD2+基质细胞。在一个实例中，获得该GD2+基质细胞的方法包括以下步骤:
[0055](I)配制脐带组织冻存液:所述脐带组织冻存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMS0(二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide)，配好的冷存液放在4°C冰箱保存直至使用；
[0056](2)消毒和清洗:在生物安全柜中，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开，平铺在无菌1cm细胞培养平皿上，利用PBS清洗组织，以减小组织上面的红细胞；
[0057](3)脐带组织处理:将步骤(2)得到的脐带组织转移至另一个1cm细胞培养平皿中，将脐带组织剪成大小lcm3的正方形状；
[0058](4)脐带组织冷存:在4°C的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存管中，然后将冻存管放入程序降温盒，先在4°C的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80 V的温度条件下冷冻I天，然后将冻存管于液氮中冷冻，备用；
[0059]必要时，可以进一步地包括与冻存方法配套使用的复苏方法:
[0060](5)冻存脐带组织复苏:将步骤(4)冷冻的脐带组织从液氮中取出，放在恒温水浴里解冻至一半冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基(其例如包含15%FBS+1%L-Glutamine+0.05%Gentamicin+84%DMEM-F12)进行点滴法清洗脐带组织，利用10um过滤器将废液去掉；
[0061]必要时，可以进一步地包括复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法:
[0062](6)脐带组织贴壁处理:将复苏的冻存脐带组织平铺于另一个1cm细胞培养平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在10-15块，使组织块风干10-15分钟直至组织贴在平皿上；
[0063](7)脐带组织培养:沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基(其例如包含15%FBS+1 % L-Glutamine+0.05% Gentami cin+84 % DMEM-F12)至组织淹没即可；将平皿置于 C02浓度为5%的37 °C培养箱进行培养，培养至第五天时将平皿从培养箱取出，补加5ml间充质干细胞培养基;在第十天将平皿内的培养基转移，加入15ml新鲜的间充质干细胞培养基;在第十二天清除所有脐带组织块并继续培养，此后每两天进行一次全换液；
[0064](8)细胞传代:当平皿里面的贴壁细胞融合率达到60%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)将贴壁细胞脱离平皿底部，离心后移除上清液，并加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，接种于T25细胞培养瓶进行传代，并进行扩增培养;此后每两天换液一次直至融合率达到80 %后，即得，必要时再进行传代；
[0065]必要时，可以进一步地针对以上步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项:细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；
[0066]必要时，可以进一步地将以上步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。
[0067]在上述获得的⑶2阳性表达率不低于90%的⑶2+基质细胞的这种脐带间充质干细胞过程中，对所获得的细胞进行GD2阳性表达率检测，选取GD2阳性表达率不低于90%例如不低于95%的GD2+基质细胞作为本发明使用的间充质干细胞。
[0068]本发明所用的造血干细胞可以使用本领域已知的方法来制备。
[0069]例如，对于通过胎盘获得的造血干细胞，可以参照中国专利申请号2014104050724中的方法获得，例如通过该文献方法获得的造血干细胞中CD34阳性表达率大于80%，例如大于85% ;并且，通过该文献方法获得的造血干细胞中KDR2阳性表达率大于85%，例如大于90 % ο在一个实例中，获得该KDR2阳性表达的细胞的方法包括以下步骤:胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化。各步骤具体为:
[0070](I)胎盘的收集:在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10°C，24小时内送达实验室；
[0071](2)胎盘的初检:检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样；
[0072](3)胎盘的预消毒:将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况；
[0073](4)胎盘及母血检测:对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测、造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM);
[0074](5)胎盘造血干细胞的灌洗:将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流栗，灌洗液经胶管、开关、蠕动栗、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；
[0075](6)造血干细胞的浓缩纯化:将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500-2000rpm离心15-20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2: 1-1:2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2: 1-1: 2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200-2500rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2:1 -1:2的比例加生理盐水混匀，1200-1500rpm离心10-15分钟；离心结束后去掉上清液，加入10-20mL生理盐水吹打沉淀，再1200-1500rpm离心10-15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。
[0076]在上述获得的⑶34阳性表达率大于80%例如大于85%，且KDR2阳性表达率大于85 %例如大于90 %的造血干细胞过程中，对所获得的造血干细胞进行⑶34阳性表达率检测和KDR2阳性表达率，选取⑶34阳性表达率大于80 %例如大于85 %且KDR2阳性表达率大于85 %例如大于90 %的造血干细胞过作为本发明使用的造血干细胞。
[0077]或者，在一个实施方案中，本发明所用的造血干细胞可照如下方法获得:取造血干细胞来源组织(包括但不限于脐带血、骨髓、胎盘血、动员外周血)，按8:1?1:8比例加入羟乙基淀粉，混合均匀后，转移到AXP造血干细胞分离系统配套处理耗材内，装入AXP造血干细胞分离系统，放入离心机，以离心率(RCF) 1200?1600离心10?30min，再以RCF50?200离心5?15min后取出，自动分离得到单个核细胞，导出AXP数据得到造血干细胞的分离数量。使用流式细胞仪检测分离的到的细胞的CD34和KDR2含量。然后将分离得到的细胞按8:1?1:8比例加入DMSO，程序降温至-90°C后放入液氮环境下冻存。使用前，放在37度水浴中复苏。使用上述方法获得的⑶34阳性表达率大于80%例如大于85%，且KDR2阳性表达率大于85%例如大于90%的造血干细胞。
[0078]进一步的，在冻存前，可以将本发明所述间充质干细胞即⑶2+基质细胞和KDR2+造血干细胞各自独立地分装于瓶子中，接着将两个瓶子置于本发明所述药盒中，得到本发明用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，接着将该治疗剂在冻存条件下保存。
[0079]根据本发明记载的在动物试验中获得的结果，本发明人尝试将本发明方法用于人特别是具有早老症特征的患者以修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。结果显示，本发明方法不但在动物试验中呈现优良的结果，而且在人体中呈现令人鼓舞结果。
[0080]本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
[0081]本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
【具体实施方式】
[0082]通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
[0083]在本发明的具体实验中，使用到的胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞是参照中国专利申请号201210292509.9之实施例1、6、7的方法获得的，并且⑶2阳性表达率大于95%。
[0084]在本发明的具体实验中，使用到的脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞是参照中国专利申请号201210159916.2之实施例1、6、7的方法获得的，并且⑶2阳性表达率大于95%。
[0085]在本发明的具体实验中，使用到的胎盘造血干细胞是参照中国专利申请号2014104050724之实施例1的方法获得的，并且CD34标志物阳性表达率大于85%、KDR2标志物阳性表达率大于90 %。
[0086]在本发明的具体实验中，使用到的脐带血造血干细胞其⑶34标志物阳性表达率大于85%、KDR/2标志物阳性表达率大于90%，并且是参照如下方法制备的:按8:1?1:8比例加入羟乙基淀粉，混合均匀后，转移到AXP造血干细胞分离系统配套处理耗材内，装入AXP造血干细胞分离系统，放入离心机，以离心率(RCF) 1200?1600离心10?30min，再以RCF50?200离心5?15min后取出，自动分离得到单个核细胞，导出AXP数据得到造血干细胞的分离数量。使用流式细胞仪检测分离的到的细胞的CD34和KDR2含量。然后将分离得到的细胞按8:1?1:8比例加入DMSO，程序降温至-90°C后放入液氮环境下冻存。使用前，放在37度水浴中复苏。
[0087]实施例1:使用胎盘间充质干细胞即⑶2+基质细胞与脐带血KDR2+造血干细胞治疗衰老小鼠
[0088]一、动物的选择和分组
[0089 ] 1、动物的选择:模型小鼠为健康C57BL/6 J小鼠，雌性，8周龄，重18?22g，60只。
[0090]2、动物分组:单纯随机分为对照组、模型组、治疗组三组，每组20只。
[0091]二、建立小鼠衰老模型
[0092]模型组和治疗组每日颈背部皮下注射5%的D-半乳糖，注射量为0.25ml/10g，连续给药8-16周建立衰老动物模型。对照组则给予相同体积的生理盐水。
[0093]三、输注
[0094]衰老模型建成两周之后，治疗组注射⑶2+胎盘MSC和KDR2+脐带血HSC。采用表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记GD2+MSC及脐带血KDR2+HSC，以确定⑶2+MSC及脐带血KDR2+HSC在小鼠各脏器的植入情况。检测治疗前后衰老相关指标:包括小鼠体重、胸腺、脾脏、血清、肝组织、肺脏、脑组织过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。
[0095]治疗组第一个疗程:经小鼠尾静脉输注人源GD2+胎盘MSC单细胞悬液2 X 16/
0.2mL/只，每周给药一次，共给药4次为一个疗程。第二个疗程:第一周经小鼠尾静脉输注人源⑶2+胎盘MSC单细胞悬液2 X 106/0.2mL/只，第二周输注人源KDR2+脐带血HSC单细胞悬液2 X 106/0.2mL/只，以后每疗程均输注GD2+胎盘MSC;对照组和衰老模型组给予同等剂量的细胞培养液。
[0096]四、方法
[0097]1、用尾静脉注射架固定小鼠。
[0098]2、用酒精棉球擦尾巴使血管扩张;注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉。
[0099]3、用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定。握住Iml注射器前面
0.1CM处。右手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处，按此手形进针。
[0100]4、注射:注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位，一般选择距离尾尖1/4或1/3处进针。针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，缓慢推注。
[0101]五、结果:
[0102]1.治疗组在受体小鼠中定植，治疗组小鼠胸腺、脾脏、血清、肝组织、肺脏、脑组织MDA及CAT含量明显低于对照组、SOD活力明显高于对照组并且存在显著性差异(P彡0.05)，与模型组相比，则存在极显著性差异(PS0.01)，有统计学意义。
[0103]2.各组小鼠的组织病理切片显示，模型组小鼠的各脏器结构严重破坏，而细胞治疗组小鼠的各脏器损伤有明显修复。结果可见MSC对衰老小鼠的脏器损伤有修复作用，从而发挥其抗衰老作用。
[0104]六、结论:GD2+MSC与KDR2+HSC联合治疗明显改善D-半乳糖诱导亚急性衰老模型小鼠的衰老相关指标，表明GD2+MSC和KDR2+HSC 二者组合使用具有显著的修复机体机能老化和脏器功能衰退的作用。
[0105]补充试验:参照以上实施例1，但是在治疗时仅使用GD2+MSC以及仅使用KDR2+HSC治疗，却发现均未呈现任何治疗作用。
[0106]实施例2:MSC+HSC治疗衰老小鼠的机制研究
[0107]衰老相关B-半乳糖苷酶(SAKal)活性检测
[0108]1、细胞标本收集分别取对照组和治疗组治疗后1(1、3(1、5(1、7(1、14(1、28(1 MSC，以3%中性甲醛室温固定5min后染色。
[0109]2、SAKa I 染色
[0110]先将X-Gal以20/L的浓度溶入二甲基甲酰胺配成X-Gal储存液，常温储存备用。新鲜染液的配制:lmg/mL X-Gal+40mmol/L柠檬酸缓冲液(PH 6.0)+5mmol/L亚铁氰化钾+5mmol/L铁氛化钾+150mmol/L NaCl+2mmol/L MgCbo
[0111]染色:将标本浸入新鲜染液室温染色12?16h，蒸馏水漂洗，中性红或Giemsa染液复染，光镜下观察。
[0112]3、SAKal显色结果观察
[0113]SA-P-Gal染色阳性细胞比率以显微镜下随机所选5个视野/玻片的阳性染色细胞均数作为每张玻片的阳性率，阳性率以3张玻片的均数±标准差计算。
[0114]4、衰老相关B-半乳糖苷酶(SAKal)活性检测结果
[0115]对照组SA-P-Gal染色阳性率为3.03±0.66 % ;而GD2+MSC和KDR2+HSC治疗后IcU3d、7d、14d、28d后MSC的SA-P-Gal染色阳性率分别为2.92±0.58%，3.17±0.76%，3.13土
0.76%，2.37±0.76%，2.61 ±0.76%;它们分别与对照组比较，均无显著差异(ρ>0.05)。实验组和对照组间无显著差异，说明⑶2+MSC与KDR2+HSC不能引起MSC衰老。
[0116]5.细胞衰老相关基因？161吐4&、？53、？21(^?1/￥&^的相对表达
[0117](I )pl6:GD2+MSC 与 KDR2++HSC 治疗后 ld、3d、7d、14d 的 MSC 的 ρ16 未见明显升高，与对照组间无显著差异(Ρ>0.05)<^2+Μ3(:与KDR2+HSC治疗后28d的ρ16与对照组间的差异有极显著意义(Ρ〈0.001)，明显降低。
[0118](2)ρ21: GD2+MSC与KDR2+HSC治疗后Id、7d、14d、28d的MSC的p21未见明显升高，与对照组间无显著差异(P>0.05)。⑶2+MSC与KDR2+HSC治疗后3d的p21与对照组间的差异有显著意义(p〈0.05)，明显降低。
[0119](3453:602+]\^(:与1(01?2+!^(:治疗后1(1、3(1、7(1、14(1、28(1的]\^(:的？53与对照组相比明显降低，组间差异有显著意义(P〈0.05)。
[0120]以上结果显示⑶2+MSC与KDR2+HSC组合治疗对于衰老小鼠有显著的治疗作用。
[0121]本发明人在充分的生物学试验基础上，使用本发明方法尝试治疗患者早老症的患者，结果显示本发明方法具有对早老症优异的治疗作用，这种治疗作用还体现在其能够修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。
[0122]补充试验:参考实施例1的方法，使用胎盘间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR2+胎盘造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例1呈现基本相同的治疗效果。
[0123]补充试验:参考实施例1的方法，使用脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR2+胎盘造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例1呈现基本相同的治疗效果。
[0124]补充试验:参考实施例1的方法，使用脐带间充质干细胞即GD2+基质细胞与KDR2+脐带血造血干细胞治疗衰老小鼠，结果显示与实施例1呈现基本相同的治疗效果。
[0125]产业实用性
[0126]本发明属于细胞治疗技术领域，涉及一种用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，特别是涉及一种包括GD2+基质细胞和KDR2+造血干细胞的治疗剂。进一步的，本发明涉及GD2+基质细胞和KDR2+造血干细胞二者组合在制备用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。本发明治疗剂可以有效地用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退。
【主权项】
1.间充质干细胞与造血干细胞组合在制备用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂中的用途。2.根据权利要求1的用途，其中所述间充质干细胞是GD2+基质细胞。3.根据权利要求1的用途，其特征在于: 其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的间充质干细胞； 其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞;和/或其中所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于90%，例如大于95%。4.根据权利要求1的用途，其特征在于: 其中所述造血干细胞来源于:脐带血、骨髓、胎盘血、和/或动员外周血； 其中所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞； 其中所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞，该KDR2阳性表达的造血干细胞中KDR2阳性表达率大于85%，例如大于90% ;和/或 其中所述造血干细胞中⑶34阳性表达率大于80%，例如大于85%。5.根据权利要求1的用途，其中所述治疗剂呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞。6.根据权利要求5的用途，其特征在于: 所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述间充质干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(0.1?10) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.5?5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.75?1.5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为17个基质细胞； 所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(I?5) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为3 X 17个单个核细胞;或者，在一个实施方案中，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(2?10) X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?5) X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 15个单个核细胞;和/或 所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时，先使用间充质干细胞，在I个月之后使用造血干细胞。7.用于修复机体机能老化和延缓脏器功能衰退的治疗剂，其呈药盒的形式，该药盒中包括单独密封包装的间充质干细胞和单独密封包装的造血干细胞。8.根据权利要求7的治疗剂，其特征在于: 所述间充质干细胞是GD2+基质细胞； 所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的间充质干细胞； 所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞； 所述间充质干细胞是来源于胎盘和/或脐带的GD2+基质细胞，且GD2阳性表达率大于90%，例如大于95 %。9.根据权利要求7的治疗剂，其特征在于: 所述造血干细胞来源于:脐带血、骨髓、胎盘血、和/或动员外周血； 所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞； 所述造血干细胞是KDR2阳性表达的造血干细胞，该KDR2阳性表达的造血干细胞中KDR2阳性表达率大于85%，例如大于90% ;和/或 所述造血干细胞中⑶34阳性表达率大于80%，例如大于85%。10.根据权利要求7的治疗剂，其特征在于: 所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述间充质干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(0.1?10) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.5?5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为(0.75?1.5) X 17个基质细胞，例如每公斤患者体重用量为17个基质细胞； 所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(I?5) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 17个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为3 X 17个单个核细胞;或者，在一个实施方案中，其中所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时所述造血干细胞的剂量是每公斤患者体重用量为(2?10) X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?5) X 15个单个核细胞，例如每公斤患者体重用量为(2?4) X 15个单个核细胞;和/或 所述治疗剂在用于哺乳动物例如人时，先使用间充质干细胞，在I个月之后使用造血干细胞。
【文档编号】A61P43/00GK106074604SQ201610551770
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】许晓椿, 肖海蓉, 刘冰, 程霞, 周丹
【申请人】博雅干细胞科技有限公司