抑制宫颈癌细胞的中草药组合物及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制宫颈癌细胞的中草药组合物及制备方法，该中草药组合物由原料有效成分组成，按重量份数计：瓜蒌有效成分1?10份，益母草有效成分1?10份，金银花有效成分1?10份，菊花有效成分1?10份。本发明最大限度的提取了中草药中的有效成分并将其进行科学配伍，所得复方具有体外抑制宫颈癌细胞的作用。
【专利说明】
抑制宫颈癌细胞的中草药组合物及制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中草药复配，具体涉及一种抑制宫颈癌细胞的中草药组合物及制备方 法。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，继乳腺癌后，宫颈癌位居导致女性死亡 肿瘤的第二位。目前治疗肿瘤的主要手段除了手术外，仍然是放疗和化疗。大多情况下，采 用手术、放化疗综合治疗。但是化疗药物在治疗过程中出现的耐药性是治疗中的难题，而中 草药治疗肿瘤有望避免放化疗的毒性及肿瘤细胞产生抗药性等缺点，是因为中草药包含多 种成分，注重配伍提高协同疗效及整体治疗效果。在抑制肿瘤细胞的同时，保护人体的造血 细胞及免疫系统。或者通过激活人体的某些免疫功能，达到自身控制或清除肿瘤细胞的状 态。中药有效成分的提取方法主要有传统提取法、溶剂提取法和超临界萃取法等。
[0003] 传统提取法主要有水煎法、回流法、蒸馏法、渗漉法等，超临界萃取等现代提取和 分离技术由于具有获得提取物的纯度高、操作方法简便、环保节能等优点而优越性日益显 著。但是，由于超临界萃取使用的是新技术新设备，目前局限性也比较大，还难以应用于提 取中药有效成分的工业化大规模生产。溶剂提取法中常用的溶剂亲水性由低到高为石油 醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇，甲醇。经检索发现，乙醇因对有效成分的提取较完 全而更为常用，是效果较佳的溶剂。
[0004]瓜萎是括楼或双边括楼的成熟果实，其化学成分主要有挥发油、留醇、脂肪酸、氨 基酸、蛋白质、色素等。巢志茂等进一步研究瓜萎化学成分，在甲醇渗漉物中分离并鉴定了 棕榈酸、7-豆甾烯-3β-醇、7-豆甾烯醇-3-(H3-D-葡萄糖苷、半乳糖酸γ-内酯和半乳糖。瓜 萎具有降低血清胆固醇、扩张冠脉、抗心肌缺血、改善微循环、抑制血小板聚集、耐缺氧、抗 心律失常等作用，其提取液具有抑制癌细胞作用，能杀死体内腹小癌细胞，对金黄色葡萄球 菌、绿脓杆菌、肺炎双球菌、白色葡萄球菌等均有抑制作用。相关文献报道有"瓜蒌含药血清 及弯齿琵甲对Hela细胞增殖抑制作用的研究"等。
[0005] 据文献中报道，瓜蒌中抑制肿瘤细胞组分有三萜皂苷、蛋白等;益母草中有生物碱 类和黄酮类，金银花中为多糖，菊花中为挥发油类等。然而未见报道将四味药联用来研究其 抑制肿瘤细胞作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于:提供一种抑制宫颈癌细胞的中草药组合物及制备方法，将瓜 萎（Fructu s)、益母草（Herba Leonuri )、金银花（Lonicera japon i ca J (CArjsa/? iA 这些能有效抑制肿瘤细胞的组分提取并结合起来，排除其它不必要 组分干扰的同时，使所得药物疗效确切，用于抑制宫颈癌细胞，工艺简单，操作方便，环境友 好，易于实现工业化生产。
[0007] 本发明的技术解决方案是该中草药组合物由原料有效成分组成，按重量份数计： 瓜蒌有效成分1-10份，益母草有效成分1-10份，金银花有效成分1-10份，菊花有效成分1-10 份。
[0008] 其进一步的优化方案是该中草药组合物由原料有效成分组成，按重量份数计:瓜 蒌有效成分5-10份，益母草有效成分1-10份，金银花有效成分1-10份，菊花有效成分1-10 份。
[0009] 其再进一步的优化方案是该中草药组合物由原料有效成分组成，按重量份数计： 瓜蒌有效成分5-10份，益母草有效成分5-10份，金银花有效成分1-10份，菊花有效成分1-10 份。
[0010] 其更进一步的优化方案是该中草药组合物由原料有效成分组成，按重量份数计： 瓜蒌有效成分5-10份，益母草有效成分5-10份，金银花有效成分5-10份，菊花有效成分1-5 份。
[0011]其最优化方案是该中草药组合物由原料有效成分组成，按重量份数计:瓜蒌有效 成分10份，益母草有效成分10份，金银花有效成分8份，菊花有效成分5份。
[0012]上述中草药组合物的制备方法包括以下步骤： (1) 瓜蒌有效成分制备:瓜蒌，粉碎，过60目筛，加其4倍重量的质量浓度95%乙醇超声 提取3次，每次40 min，抽滤;药渣用其3倍重量质量浓度95%乙醇回流提取3次，每次Ih，将 提取液抽滤;合并两次滤液，40°C旋转蒸发至原体积的1/10，得浓缩液;用浓缩液5倍体积的 去离子水溶解，石油醚等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用甲醇 溶解后，通过硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯=12:1 (v/v)作为洗脱剂进行洗脱，采用 恒定流速2 mL · min-S每20mL收集一次，共收集IOOmL结束;收集40-50min的馏分于50°C旋 转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到白色非晶体性粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的瓜蒌有效成 分； (2) 益母草有效成分制备：益母草，粉碎，过60目筛，加其4倍重量质量浓度95%乙醇回 流提取3次，每次lh，将提取液抽滤，合并，40°C旋转蒸发至原体积的1/10,得浓缩液;浓缩液 用其5倍体积的去离子水溶解，乙酸乙酯等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得 粗品;粗品用甲醇溶解后，通过硅胶柱层析分离，以石油醚:丙酮=5: l(v/v)作为洗脱剂进行 洗脱，采用恒定流速2 mL · min-I每20mL收集一次，共收集IOOmL结束;收集30-40min的馏分 于50°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到了白色针晶粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的益母 草有效成分； (3) 金银花有效成分制备:金银花，粉碎，过60目筛，加其4倍重量水回流提取3次，每次 Ih，将提取液抽滤，合并，70°C旋转蒸发至原体积的1/10，得浓缩液;浓缩液用其5倍体积的 去离子水溶解，用正丁醇等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用质 量浓度20%甲醇溶解后，通过大孔树脂(XAD-16)柱分离，树脂量为25g，用质量浓度80%乙醇 进行洗脱，采用恒定流速2 mL · mirT1，共收集IOOmL，于40°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到 了淡黄色粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的金银花有效成分； (4) 菊花有效成分制备:菊花，粉碎，过60目筛，加其4倍重量水回流提取3次，每次lh，将 提取液抽滤，合并，70°C旋转蒸发至原体积的1/10,得浓缩液;浓缩液用其5倍体积的去离子 水溶解，用正丁醇等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用质量浓度 20%甲醇溶解后，通过大孔树脂(AB-8)柱分离，树脂量为25g，用质量浓度70%乙醇进行洗脱， 采用恒定流速2 mL · mirT1，共收集IOOmU于40°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到了黄色粉 末，即为具有抑制宫颈癌细胞的菊花有效成分； (5)中草药组合物制备:按重量份数计取:瓜蒌有效成分1-10份，益母草有效成分1-10 份，金银花有效成分1-10份，菊花有效成分1-10份;混合，得中草药组合物。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在： (1)本发明操作方法简单，工艺路线短，缩短了生产周期。
[0014] (2)本发明将几味药有效成分复配，改善了某一味药物成分单一，提高了中药对肿 瘤细胞的抑制效果。
[0015] (3)本发明的药物安全可控，便于保管、贮存和运输。
[0016] (4)本发明采取的提取有效成分的方法主要为乙醇和水回流提取法，将中药配伍 的传统理论与现代药学、植物化学结合起来，有效成分配伍，得有效抑制宫颈癌细胞的复方 药物。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的工艺流程简图。
【具体实施方式】
[0018] 以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。 [0019] 本发明的中草药组合物用二甲亚砜(DMSO)溶解使之成为lOOyg/mL浓度，用于细胞 试验，通过使用酶标仪于570nm波长处读取OD值，以此间接反映细胞增殖的情况。
[0020]实施例1:依以下步骤制备中草药组合物 (1) 瓜蒌有效成分制备:瓜蒌，粉碎，过60目筛，加其4倍重量的质量浓度95%乙醇超声 提取3次，每次40 min，抽滤;药渣用其3倍重量质量浓度95%乙醇回流提取3次，每次Ih，将 提取液抽滤;合并两次滤液，40°C旋转蒸发至原体积的1/10，得浓缩液;用浓缩液5倍体积的 去离子水溶解，石油醚等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用甲醇 溶解后，通过硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯=12:1 (v/v)作为洗脱剂进行洗脱，采用 恒定流速2 mL · min-S每20mL收集一次，共收集IOOmL结束;收集40-50min的馏分于50°C旋 转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到白色非晶体性粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的瓜蒌有效成 分； (2) 益母草有效成分制备：益母草，粉碎，过60目筛，加其4倍重量质量浓度95%乙醇回 流提取3次，每次lh，将提取液抽滤，合并，40°C旋转蒸发至原体积的1/10,得浓缩液;浓缩液 用其5倍体积的去离子水溶解，乙酸乙酯等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得 粗品;粗品用甲醇溶解后，通过硅胶柱层析分离，以石油醚:丙酮=5: l(v/v)作为洗脱剂进行 洗脱，采用恒定流速2 mL · min-I每20mL收集一次，共收集IOOmL结束;收集30-40min的馏分 于50°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到了白色针晶粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的益母 草有效成分； (3) 金银花有效成分制备:金银花，粉碎，过60目筛，加其4倍重量水回流提取3次，每次 Ih，将提取液抽滤，合并，70°C旋转蒸发至原体积的1/10，得浓缩液;浓缩液用其5倍体积的 去离子水溶解，用正丁醇等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用质 量浓度20%甲醇溶解后，通过大孔树脂(XAD-16)柱分离，树脂量为25g，用质量浓度80%乙醇 进行洗脱，采用恒定流速2 mL · mirT1，共收集IOOmL，于40°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到 了淡黄色粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的金银花有效成分； (4) 菊花有效成分制备:菊花，粉碎，过60目筛，加其4倍重量水回流提取3次，每次lh，将 提取液抽滤，合并，70°C旋转蒸发至原体积的1/10,得浓缩液;浓缩液用其5倍体积的去离子 水溶解，用正丁醇等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用质量浓度 20%甲醇溶解后，通过大孔树脂(AB-8)柱分离，树脂量为25g，用质量浓度70%乙醇进行洗脱， 采用恒定流速2 mL · mirT1，共收集IOOmU于40°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到了黄色粉 末，即为具有抑制宫颈癌细胞的菊花有效成分； (5) 中草药组合物制备:按重量份数计取:瓜蒌有效成分5mg，益母草有效成分5mg，金 银花有效成分2.5mg，菊花有效成分5mg ;混合，得中草药组合物。
[0021] 实施例1所得的中药组合物用DMSO溶解并稀释至终浓度为100yg/mL，于酶标仪570 nm波长处检测OD值，见表1〇
[0022]实施例2:同实施例1，其中金银花有效成分为5mg。
[0023] 实施例3:同实施例1，其中金银花有效成分为5mg，菊花有效成分为2.5mg。
[0024] 实施例4:同实施例1，其中金银花有效成分为2.5mg，菊花有效成分为2.5mg。
[0025]实施例5:同实施例1，其中金银花有效成分为4mg，菊花有效成分为2.5mg。
[0026] MTT法检测:采用MTT法(全称:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)检 测实施例1-5所得的中药组合物的抑制宫颈癌细胞的效果。
[0027] 处于对数生长期的Hela细胞经0.25%细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬 液，用含10%胎牛血清的RP-MI1640培养液配制成单细胞悬液，以每毫升5 X IO4个细胞接种 于96孔培养板中，每孔体积IOOyL，分别取实施例1，2，3，4，5的中药组合物，DMSO溶解使其最 终浓度为l〇〇yg/mL，于37°C、5% CO2饱和湿度下培养72小时;并设空白对照和溶媒(DMSO)对 照，置于37°C含5% CO2孵箱中培养72 h后，每孔加 MTT(5 mg/mL)20yL，作用4 h后弃上清;各 孔加入150yL DMSO，振荡IOmin，使形成的甲瓒结晶物充分溶解;在酶标仪570nm波长处检 测OD值，记录结果;细胞抑制率(％) =(对照组平均OD值一给药组组平均OD值)/对照组平均OD 值X 100%;由表1可知，相同浓度用MTT法测定中药组合物对宫颈癌细胞增殖影响，比例是1: 1:0.8:0.5为最优选择，此时培养72 h后细胞抑制率达68.9%;由表2可知，选择1:1:0.8:0.5 比例的不同浓度的药物进行MTT法试验，细胞培养72h后，100yg/mL，200yg/mL和300yg/mL药 物组的细胞抑制率分别是68.9%，84.7%，81.8%;在使用200yg/mL药物组浓度时，细胞的抑制 率较lOOyg/mL药物组显著提高，至84.7%，而其后随着浓度的增加，细胞抑制率的上升趋势 又趋于平缓，300yg/mL药物处理组细胞抑制率为81.8%，与200yg/mL处理组无统计学差异， 因此200yg/mL药物处理组是抑制细胞增殖的较佳剂量组；由表1，表2,观察得出200yg/mL药 物组且比例是1:1:0.8:0.5时抑制细胞增殖活性最佳，其细胞抑制率为84.7%;因此200yg/ mL药物且比例是1:1:0.8:0.5是最佳比例有效成分复方药物。
[0028] 表1不同比例复方时MTT法检测Hela宫颈癌细胞抑制率
注：1、2、3、4、5中的比例均为瓜蒌、益母草、金银花、菊花中有效成分的比例。 [0029] 表2相同比例不同浓度复方时MTT法检测Hela宫颈癌细胞抑制率
注：：1、2、3、4、5中的比例均为瓜蒌、益母草、金银花、菊花中有效成分的比例。
【主权项】
1. 抑制宫颈癌细胞的中草药组合物，其特征是:该中草药组合物由原料有效成分组成， 按重量份数计:瓜蒌有效成分1-10份，益母草有效成分1-10份，金银花有效成分1-10份，菊 花有效成分1-10份。2. 如权利要求1所述的抑制宫颈癌细胞的中草药组合物，其特征是:该中草药组合物由 原料有效成分组成，按重量份数计:瓜蒌有效成分5-10份，益母草有效成分1-10份，金银花 有效成分1-10份，菊花有效成分1-10份。3. 如权利要求1所述的抑制宫颈癌细胞的中草药组合物，其特征是:该中草药组合物由 原料有效成分组成，按重量份数计:瓜蒌有效成分5-10份，益母草有效成分5-10份，金银花 有效成分1-10份，菊花有效成分1-10份。4. 如权利要求1所述的抑制宫颈癌细胞的中草药组合物，其特征是:该中草药组合物由 原料有效成分组成，按重量份数计:瓜蒌有效成分5-10份，益母草有效成分5-10份，金银花 有效成分5-10份，菊花有效成分1-5份。5. 如权利要求1所述的抑制宫颈癌细胞的中草药组合物，其特征是:该中草药组合物由 原料有效成分组成，按重量份数计:瓜蒌有效成分10份，益母草有效成分10份，金银花有效 成分8份，菊花有效成分5份。6. 如权利要求1所述的抑制宫颈癌细胞的中草药组合物的制备方法，其特征是该中草 药组合物的制备方法包括以下步骤： (1) 瓜蒌有效成分制备:瓜蒌，粉碎，过60目筛，加其4倍重量的质量浓度95%乙醇超声 提取3次，每次40 min，抽滤;药渣用其3倍重量质量浓度95%乙醇回流提取3次，每次lh，将 提取液抽滤;合并两次滤液，40°C旋转蒸发至原体积的1/10，得浓缩液;用浓缩液5倍体积的 去离子水溶解，石油醚等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用甲醇 溶解后，通过硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯=12:1 (v/v)作为洗脱剂进行洗脱，采用 恒定流速2 mL · min-S每20mL收集一次，共收集100mL结束;收集40-50min的馏分于50°C旋 转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到白色非晶体性粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的瓜蒌有效成 分； (2) 益母草有效成分制备：益母草，粉碎，过60目筛，加其4倍重量质量浓度95%乙醇回 流提取3次，每次lh，将提取液抽滤，合并，40°C旋转蒸发至原体积的1/10,得浓缩液;浓缩液 用其5倍体积的去离子水溶解，乙酸乙酯等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得 粗品;粗品用甲醇溶解后，通过硅胶柱层析分离，以石油醚:丙酮=5: l(v/v)作为洗脱剂进行 洗脱，采用恒定流速2 mL · min-I每20mL收集一次，共收集100mL结束;收集30-40min的馏分 于50°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到白色针晶粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的益母草 有效成分； (3) 金银花有效成分制备：金银花，粉碎，过60目筛，加其4倍重量水回流提取3次，每次 lh，将提取液抽滤，合并，70°C旋转蒸发至原体积的1/10，得浓缩液;浓缩液用其5倍体积的 去离子水溶解，用正丁醇等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用质 量浓度20%甲醇溶解后，通过大孔树脂(XAD-16)柱分离，树脂量为25g，用质量浓度80%乙醇 进行洗脱，采用恒定流速2 mL · mirT1，共收集100mL，于40°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到 了淡黄色粉末，即为具有抑制宫颈癌细胞的金银花有效成分； (4) 菊花有效成分制备:菊花，粉碎，过60目筛，加其4倍重量水回流提取3次，每次lh，将 提取液抽滤，合并，70°C旋转蒸发至原体积的1/10,得浓缩液;浓缩液用其5倍体积的去离子 水溶解，用正丁醇等体积萃取三次，合并，50°C旋转蒸发浓缩至干得粗品；粗品用质量浓度 20%甲醇溶解后，通过大孔树脂(AB-8)柱分离，树脂量为25g，用质量浓度70%乙醇进行洗脱， 采用恒定流速2 mL · mirT1，共收集100mL，于40°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到了黄色粉 末，即为具有抑制宫颈癌细胞的菊花有效成分； (5)中草药组合物制备：按重量份数计取:瓜蒌有效成分1-10份，益母草有效成分1-10 份，金银花有效成分1-10份，菊花有效成分1-10份;混合，得中草药组合物。
【文档编号】A61K36/533GK106074689SQ201610627589
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月3日 公开号201610627589.7, CN 106074689 A, CN 106074689A, CN 201610627589, CN-A-106074689, CN106074689 A, CN106074689A, CN201610627589, CN201610627589.7
【发明人】贾建波, 程倩, 李 东, 朱春, 孙金凤
【申请人】淮阴工学院