一种可用于癌症治疗的益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种益生菌表达的多靶向纳米抗体Nanobody(Nb，或VHH)聚合链接体，由特异性针对靶点HER2、EGFR和VEGF的VHH单体纳米抗体通过多肽链接Linker连接而成，并将所述多靶向纳米抗体聚合链接体的DNA转接负载于口服益生菌内。其口服益生菌菌株可存活于人体肠胃系统一定时间，表达并释放聚合链接的多靶向纳米抗体，以用于治疗胃癌。本发明的纳米抗体聚合链接体发挥了纳米抗体体积小、稳定性高、耐酸碱环境、可穿透人体组织的优点，克服了纳米抗体在人体内半衰期短的缺陷，开创了口服抗体药物治疗胃癌的新方式。本发明的纳米抗体聚合链接体发挥了多靶向抑制癌细胞生长的作用，抗癌作用比简单的单体抗体随机混合增强数十倍乃至上百倍。
【专利说明】
一种可用于癌症治疗的益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体
技术领域
[0001]本发明涉及一种纳米抗体的聚合链接体，利用食品级益生菌通过基因改造表达纳米抗体聚合链接体靶向胃癌肿瘤靶点以治疗胃癌。
【背景技术】
[0002]胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，大多数患者在诊断时已经处于疾病晚期。世界范围内，每年胃癌死亡人数占肿瘤死亡人数的第2位。我国胃癌每10万人口的年死亡率为25.21%，在各种恶性肿瘤中占首位。化疗仍是晚期胃癌的主要治疗方法，但是化疗的疗效难尽如人意，局部复发和远处转移是影响术后5年生存率的主要原因。现有化疗水平已到达一个瓶颈，最佳反应率不足50%，中位总生存期很少超过12个月，想要有所突破，生物治疗成为必要的选择。
[0003]分子靶向治疗是近年来在治疗血液和实体肿瘤中涌现出的新治疗手段。随着对存在于胃癌发生、发展和转移过程中分子生物学机制的研究，也逐步将这种治疗手段应用于胃癌治疗的临床实践。目前这种治疗策略主要包括EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、HER2抑制剂等，多种特异的分子生物靶向治疗手段在胃癌综合治疗中取得了较大进展。
[0004]表皮生长因子受体(EGFR)是一种多功能糖蛋白的跨膜受体，是酪氨酸激酶生长因子受体家族的一个成员，与特异性配体如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a(TGFa)、双向调节蛋白(AR)、β_细胞素(BTC)等结合，通过相应酪氨酸激酶的自身磷酸化作用激活受体，从而激发细胞内的多条信号转导通路如MAPK、PI3K、c-Src等促进肿瘤细胞分裂、迀徙以及促进肿瘤新生血管形成。EGFR在相当一部分肿瘤中都有不同程度的激活表达，如胃癌、结直肠癌、头颈鳞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肾癌和脑胶质母细胞瘤等。因此，选择其特定部位作为靶点，通过干扰EGFR信号传导，来达到抑制肿瘤增殖、浸润和远处转移的目的，为胃癌分子靶向治疗提供了新的思路。
[0005]代表药物为曲妥珠单抗(tra stuzumab，her cep tin)，帕妥珠单抗(pertuzumab，Omni targ) iGFR与同属于erbB家族成员的HER2能形成异二聚体，被HER2激酶激活磷酸化可启动信号转导增强细胞恶性转化和促进肿瘤进展。曲妥珠单抗是1998年美国Π)Α批准上市的第一种重组DNA衍生的人源化mAb，通过与HER2受体特异性结合影响生长信号的传递，它还可以下调血管内皮生长因子和其他血管生长因子活性。2002年进入我国市场，商品名为“赫赛汀”。帕妥珠单抗为第二代重组人源化单克隆抗HER2抗体，与HER2受体胞外Π结合域结合阻止与其他HER2受体之间的二聚化。有学者运用显色原位杂交技术(CISH)检测131例胃癌组织标本和100例贲门癌组织标本，结果16例(12.2%)胃癌标本和24例(24%)贲门癌标本HER2/neu过度表达。曲妥珠单抗治疗可使HER2阳性乳腺癌患者OS延长，但HER2在乳腺癌中的表达率也仅为20?30%，HER2在胃癌中的表达为6?35%，曲妥珠单抗在胃癌中的应用已经在临床上取得可喜成果。
[0006]肿瘤生长具有明确的血管依赖性，肿瘤通过新生血管从宿主获取营养成分，又经过血管向宿主输送肿瘤细胞，增强肿瘤灶的远处转移能力。因此抗血管生成也是胃癌分子靶向治疗的研究热点。这类药物的最大优点之一是不会产生肿瘤耐药，在联合化疗中十分有利。目前有多种血管生成抑制剂正在临床试用。血管内皮生长因子VEGF是目前所知作用最强的促血管内皮生成的细胞因子。多项研究表明，VEGF在进展期胃癌组织中的表达明显增高，与肿瘤的浸润转移及预后密切相关。
[0007]癌症肿瘤往往是通过多种信号通路驱动其生长与扩散，因而，复合靶向治疗将提高治疗效果，降低产生抗药性的可能。
[0008]近年来，分子靶向治疗药物在胃癌的治疗上取得了一些成果，但由于制备相对复杂、价格较贵等原因，应用范围受到了一定的限制。而纳米抗体的出现，带来了常规分子靶向治疗药物所不具有的优势，其分子量小，结构功能性质独特，给胃癌的靶向治疗提供了新的治疗手段和研究思路。
[0009]自然界在骆驼体内存在缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区得到的单域抗体是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量(Mr)仅为15KD，称为纳米抗体，具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达、免疫原性低等特点。这种小型化的基因工程抗体在基础研究、开发新药和疾病的诊断和治疗上具有广阔的应用前景。纳米抗体作为一种小型的基因工程抗体，其特殊的结构使其具有普通抗体所不具备的独特性质:水溶性高、稳定性好、靶向性强、人源化简单和易获得和表达。且纳米抗体独特的三大效应(表面，尺寸和宏观量子隧道效应)，使其在很多方面都明显优于传统抗体。
[0010]人体肠道中存在百万亿细菌，约IKg左右。几乎所有的肠道细菌均可在结肠找到，共同组成肠道菌群。每个细菌是一个单细胞，大约有100多个不同的种类。只有40多种主要细菌组成肠道菌群，大多是益生菌，其余是可导致疾病菌群。益生菌对于保证机体健康至关重要，可以提高机体免疫力，降低血清胆固醇，促进消化系统健康。
[0011 ]益生菌(prob1tics)是定植于人体肠胃系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的对宿主有益的活性有益微生物。对人体有益的细菌或真菌主要有:酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。
[0012]1983年美国Tufts大学两名教授Sherwood Gorbach和Barry Goldin从健康人体中分离出了 LGG(鼠李糖乳杆菌KLGG是人类研究最广泛的益生菌之一，其从属于乳杆菌属，是人体正常菌群之一，能够耐受动物消化道环境，在人和动物肠道内定植长达两周，活性强、肠道黏着率高、定植能力强，能高效降胆固醇，促进细胞分裂，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿及提高机体免疫力等功效。
[0013]益生菌能够与宿主共存，且能产生促进宿主肠道微生态平衡效应的物质，较致病菌和减毒性细菌具有更大的应用优势。消化系是益生菌寄居的主要场所，在益生菌和实体瘤内存在低氧代谢区，故可以利用趋低氧的厌氧菌作为肿瘤基因治疗的载体。厌氧菌作为基因治疗的载体，具有肿瘤靶向性强、安全性高等特点，是一种新型的基因治疗载体。当厌氧菌携带具有治疗作用的目的基因时，可有效抑制实体瘤细胞的生长。
[0014]益生元是可调节益生菌种或活动的物质。一般益生元给益生菌提供“食物”，能够被肠道内有益细菌分解吸收，促进有益细菌生长繁殖。益生元包括低聚果糖、部分蛋白质类物质和蛋白质水解产物、异麦芽低聚糖、天然植物提取物类和多糖类双歧因子等。
[0015]低聚果糖是天然存在的物质，具有良好的促进双歧杆菌增殖活性，能诱导肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌大量繁殖，改善肠道微生物环境，提高人体免疫力，且能结合肠内有毒物质，并促进排出体外，此外，还具有降低血清中胆固醇含量，降低血糖和分解致癌物等功能。研究发现，其不会引发龋齿，同时还作为可溶性膳食纤维来使用，除此之外，它还可以使用在一些需低温加热的食品中。
[0016]根据调查发现，在双歧因子内部有许多蛋白质水解物及部分蛋白质类物质，这些物质有利于促进双歧杆菌的生长，这些蛋白质类物质或蛋白质水解产物的共同成分，那就是含硫的肽，这种糖多肽有利于促进双歧杆菌在肠道中生长，倘若这些含硫的肽的二硫键被还原或者是烷基化，则会令其失去活性，起不到促进双歧杆菌生长的作用，因此，可以得知这些蛋白质类物质及蛋白质水解产物中的二硫键与双歧杆菌健康生长的密切关系。
[0017]异麦芽低聚糖是四糖、五糖，由异麦芽糖结合一分子的葡萄糖而形成，目前市面上应用较多，大多数使用于各类饮料及食品中。其可以取代蔗糖使用，这是因为它甜味甘美，同时又能降低食品甜度来达到益于人体健康的目的，因此将其作为天然添加剂添加到糖尿病患者食品中是比较理想的，并且它不会引起龋齿。根据研究发现，它还具备耐热耐高温性，这种耐热耐高温的性能使其方便于添加在酸性饮料中接受食品高温灭菌的过程。
[0018]研究报告显示，天然植物提取物中存在大量可以促进双歧杆菌生长的物质，比如茶叶中的茶多酚、魔芋水解液、海带、菊芋粉等具备这种功能。双歧因子中存在有多糖类物质，这些物质包含有褐藻硫酸糖、胡萝卜中的含氮多糖、云芝多糖等。
【发明内容】
[0019]本发明的目的是提供一种益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体，以应用于胃癌的靶向治疗。
[°02°]本发明上述发明目的是通过将益生菌菌株作为多革El向纳米抗体Nanobody(Nb，或VHH)聚合链接体药物的输送载体，将多靶向纳米抗体聚合链接体的DNA转接负载于口服益生菌内表达纳米抗体聚合链接体，通过基因改造使益生菌存活于人体肠胃系统一定时间，在益生元的支持调节下，在人体肠胃系统表达和释放纳米抗体聚合链接体生物药靶向胃癌肿瘤的多靶点，抑制肿瘤中EGFR、HER2、VEGF信号通路来实现的。
[0021]具体地，本发明所述益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体是将特异性单体纳米抗体VHH通过多肽链接Linker连接构成纳米抗体聚合连接体，并以口服益生菌菌株作为所述纳米抗体聚合连接体药物的活输送载体，其中，所述的单体纳米抗体V H H是以H E R 2(human epidermal growth factor receptor 2 or HER2/neu)、EGFR(epidermal growthfactor receptor)和/或VEGF(vascular endothelial growth factor)为革巴点的抗体Nb-EGFR、Nb-HER2 和/SNb-VEGF。
[0022]进一步地，所述多革El向纳米抗体聚合链接体中的单体纳米抗体VHH可以完成人源化改造，以降低其免疫源性。
[0023]本发明中，所述多靶向纳米抗体聚合链接体是将单体纳米抗体Nb-HER2、Nb-EGFR和/或Nb-VEGF以任意组合方式通过多肽链接Linker连接起来的偶联体、三聚链接体或四聚链接体。其中包括:Nb-EGFR—多肽链接Linker—Nb-HER2;Nb-EGFR—多肽链接Linker—Nb-VEGF ； Nb-HER2—多肽链接 Linker—Nb-VEGF ； Nb-EGFR—多肽链接 Linker—Nb_HER2—多肽链接 Linker—Nb-VEGF; Nb-VEGF—多肽链接 Linker—Nb-EGFR—多肽链接 Linker—Nb-HER2—多肽链接Linker-Nb-VEGF等，以及其他的包括有三靶点纳米抗体的任何组合的偶联体、三聚链接体或四聚链接体。本发明上述构成的纳米抗体聚合链接体发挥了纳米抗体小体积、高稳定性且耐酸碱、可穿透人体组织、多靶向复合抗癌等优点，克服了特异性靶向纳米抗体在人体内寿命短的缺陷，可以大大地提高胃癌的治疗效果。
[0024]本发明的多革El向纳米抗体聚合链接体中，所述单体纳米抗体通过多肽链接Linker头尾、尾尾或头头连接。其连接方式有多种，图1列出了最可能出现的26种链接方式。
[0025]进一步地，本发明所述的多革El向纳米抗体聚合链接体是由不同的多肽链接Linker连接单体纳米抗体形成的不同的纳米抗体聚合链接体。其中用于连接单体纳米抗体VHH的多肽链接Linker包括短Linker、中Linker或长Linker，具体地，所述短Linker由少于15个氨基酸组成，中Linker由15-25个氨基酸组成，长Linker由26-60个氨基酸组成。下文中列出了一部分多肽链接Linker的序列，但是需要明确的是，本发明的多肽链接Linker的序列包括但不限于所列出的多肽链接Linker序列。
[0026]本发明应用食品级的口服益生菌菌株，包括乳杆菌或双歧杆菌来表达上述复合人源化的纳米抗体群，并将其制成口服制剂，以有利于益生菌人源化纳米抗体的生产和递送。其中，所述的乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus f ermentium)、格氏乳杆菌(LactobaciIIus gasseri )、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，以及乳酸乳球菌1^。1:0(30(^118，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subspecies lactis)等。
[0027]进而，本发明还在所述口服制剂中包括有选择性益生元物质，所述选择性益生元物质包括双歧因子，以助于特定菌株的生长与活性。
[0028]更进一步地，所述选择性益生元物质还包括低聚果糖、蛋白质类物质和蛋白质水解产物、异麦芽低聚糖、天然植物提取物、多糖类双歧因子中的一种或几种。
[0029]优选地，本发明将所述口服制剂制成包括胶囊剂、片剂或口服液制剂等形式的药物剂型。进而，还可以将所述口服制剂制成食品形式服用，例如酸奶、饮料、饼干等等。
[0030]将本发明提供的口服益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体作为抗胃癌药物应用，其益生菌通过基因改造可在人体肠胃系统内存活一定时间，表达并释放多靶向纳米抗体聚合链接体，以作为抗胃癌药多靶向治疗胃癌。
[0031]本发明根据癌症靶点的特性与肿瘤生长的必要条件机理，首创设计出多靶点纳米抗体聚合链接体，它们多位一体(两位一体、三位一体或四位一体)，通过联合各种不同的抗癌机理，同时发挥了多靶向抑制癌细胞生长的作用。多靶向纳米抗体聚合链接体中的一部分纳米抗体(既HER2和EGFR靶点的纳米抗体)可直接作用于癌细胞表面与里面的HER2和EGFR，阻止癌细胞生长信号通路；同时纳米抗体聚合链接体的另一部分(既VEGF靶点的纳米抗体)可在癌细胞周边阻止肿瘤新血管生成的信号通路，并抑制肿瘤生长供养系统形成，造成癌细胞凋亡，如图2所示。多靶向纳米抗体聚合链接体的抗癌作用比简单的单体抗体复合(既多个但非聚合链连接纳米抗体的随机混合)的抗癌作用要增强数十倍乃至上百倍。
[0032]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。
[0033]I)本发明的益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体发挥了纳米抗体体积小、分子量小、结构简单、异源性低、高稳定性且耐酸碱等优点，将单体纳米抗体与寿命较长的分子团链接融合在一起，提高了纳米抗体在血液中的存在时间，克服了特异性靶向纳米抗体在人体内寿命短的缺陷，可连续的穿透人体组织，形成综合机理抑制癌细胞生长，大大提高胃癌的治疗效果。
[0034]2)本发明益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体的生产和使用成本十分低廉。
[0035]3)本发明的益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体具有独特的偶联体与多联体形状，可以提供多靶向多机理多功能的胃癌肿瘤治疗。
[0036]4)本发明首创特殊设计的VHH纳米抗体复合链接体群，可发挥与形成综合多机理消灭与阻碍癌细胞成长作用，既复合纳米抗体群可同时发挥与进行多靶点抑制癌细胞生长以及促使癌细胞凋亡的作用，显著提高纳米抗体胃癌治疗效果。
[0037]5)本发明益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体利用食品级益生菌通过基因改造表达纳米抗体聚合链接体靶向胃癌肿瘤靶点，此口服食品级基因改造益生菌可存活于人体肠胃系统中一定的时间，在益生元的调节辅助之下，在人体肠胃系统表达和释多靶向纳米抗体聚合链接体，以达到治疗胃癌的效果。
【附图说明】
[0038]图1列出了26种多靶向纳米抗体聚合链接体的偶联或多联方式示意图。
[0039]图2给出了两位一体、三位一体或四位一体多种形式的偶联或多联方式的多靶向纳米抗体聚合链接体与癌细胞抗原的相互作用与空间分布示意图。
[0040]复合纳米抗体包括靶向HER2、VEGF、EGFR的纳米抗体偶联体或多联体复合纳米抗，其中连接单体VHH的多肽链接Linker分为短、中、长三类，短Linker由少于15个氨基酸组成，中Linker由15_25个氨基酸组成，长Linker由26-60个氨基酸组成。
[0041]图1中，n’代表人源化单体纳米抗体的头部，c’代表人源化单体纳米抗体的尾部。各个人源化单体纳米抗体通过多肽链接Linker头尾、尾尾或头头连接。
【具体实施方式】
[0042]下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0043]本发明的主要技术环节之一是通过基因改造的益生菌菌株，可在人体肠胃系统表达多革巴向纳米抗体聚合链接体，既革巴向胃癌肿瘤革巴点HER2(human epidermal growthfactor receptor 2，orHER2/neu)、EGFR(epidermal growth factor receptor)和VEGF(vascular endothelial growth factor)，来制备特殊的口服益生菌胃癌药物制剂。
[0044]本发明的主要技术环节之一是通过本发明所述的多靶向纳米抗体聚合链接体提供靶向胃癌肿瘤治疗。这些纳米抗体聚合链接体是纳米抗体VHH的偶联体或多联体。本发明所述的纳米抗体偶联体或多联体包括了分别靶向HER2、VEGF、EGFR的纳米抗体偶联体或多联体。
[0045]其中，本发明所述的纳米抗体VHH序列为:
含有 128个氨基酸的￥冊-0服1?2序列 I: DVQLVESGGG，SVQGAAGGSL，RLSCAASDIT，YSTDCMGffFR，QAPGKEREGV，ATINNGRAIT，YYADSVKGRF，TISQDNAKNT，VYLQMNSLRP，KDTAIYYCAA，RLRAGYCYPA，DYSMDYffGKG，TQVTVSSG。
[0046]含有126个氨基酸的VHH-aHER2序列2: DVQLEESGGG，SVQTGGSLRL，SCAASGYTYS，SACMGffFRQG，PGKEREAVAD,VNTGGRRTYY,AD SVKGRFTI，SQDNTKDMRY，LQMNNLKPED，TATYYCATGP，RRRDYGLGPC，DYNYffGQGTQ，VTVSSG。
[0047]含有132个氨基酸的VHH-aVEGF序列I:MAQVQLQESG，GGSVQDGGSL，RLSCAASGYA，YDTYYMGffFR，QAPGKEREffV，AGITSLVSGV，AYYKYYTDSV，KGRFTIFRDD，DKNTVDLQMN，SLKPEDTAIY，YCAASRSGLR，ARLLRPELYE，YffGQGTQVTV，SS。
[0048]含有129个氨基酸的VHH-aVEGF序列2: MAQVQLQESG，GGSVQAGGSL，RLSCVASGDT，YSSACMGffFR，QAPGKEREGV，ATICTSTSMR，TRYYADAVKA，RFTISQDNAK，NTVYLQMNSL，KPEDIAMYYC，ATGHTVGSSff，RDPGAffRYffG，QGTQVTVSS。
[0049]含有138个氨基酸的VHH-aEGFR序列I: QVQLQESGGG，LVQPGGSLRL，SCAASGRTFS，SYAMGffFRQA，PGKQREFVAA，IRffSGGYTYY，TDSVKGRFTI，SRDNAKTTVY，LQMNSLKPED，TAVYYCAATY，LSSDYSRYAL，PQRPLDYDYff，GQGTQVTVSS，LEHHHHHH。
[0050]以上非人源化的纳米抗体VHH序列，可将其天然存在的VHH序列结构域的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基替换为常规人VH序列结构域相应位置处存在的氨基酸残基。
[0051]本发明所述治疗胃癌的益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体由上述特异性单体纳米抗体VHH通过长短不一的多肽链接Linker连接而成。人源化的纳米抗体革E向胃癌肿瘤的革巴点包括HER2(human epidermal growth factor receptor 2，orHER2/neu)、EGFR(epidermal growth factor receptor)和VEGF(vascular endothelial growth factor)。
[0052]目前应用最广泛的氨基酸链接Linker是四个甘氨酸与一个丝氨酸的组合(GGGGS)，以及将其重复出现3次的组合(GGGGSGGGGSGGGGS)。除此之外，本发明所述的用于链接纳米抗体VHH单体的氨基酸链接Linker还可以包括以下Linker-Seq所示的氨基酸链接，但并不限于此:
Linkerl: GPcPcPc GlySer-poIyPro(Glyc)-poIyPro(Glyc)-poIyPro(Glyc)
Linker2: GPPcP GlySer-polyPro-poIyPro(Glyc)-polyPro
Linker3: GPGcP GlySer-polyPro-GlySer(Glyc)-poIyPro
Linker4: GPPP GlySer-polyPro-polyPro-poIyPro
Linker5:GPbP GlySer-polyPro-b2m-poIyPro
Linker6:GPbG GlySer-polyPro-b2m-GlySer
Linker7:PbGbG polyPro-b2m-GlySer-b2m-GlySer
Linker8: GPbGbP GlySer-polyPro-b2m-GlySer-b2m-poIyPro
Linker9: GPUG GlySer-polyPro-Ub-GlySer
LinkerlO:GPZP GlySer-polyPro-ZAG-poIyPro
Linkerll:GGZGZP GlySer-GlySer-ZAG-GlySer-ZAG-poIyProLinkerl2:GcGcP GlySer(Glyc)-GlySer(Glyc)-poIyProLinkerI3:cTPR3 (G4S)3_cTPR3_(G4S)3Linkerl4:cTPR6 (G4S)3_cTPR6_(G4S)3Linkerl5:cTPR9 (G4S)3_cTPR9_(G4S)3Linkerl6:cTPR12 (G4S)3_cTPR12_(G4S)3Linkerl7:GSn (G4S)n (n=l，2，3，4，-"9)。
[0053]本发明中的益生菌表达的复合人源化纳米抗体聚合链接体或复合人源化纳米抗体群中的各个人源化单体纳米抗体通过氨基酸链连接头尾、尾尾或头头，形成多位一体。其三种不同纳米抗体的头尾、尾尾或头头相连接的方式最可能出现的共有26种之多，如图1描述。复合人源化纳米抗体群由不同的氨基酸链相连接的方式将形成不同的形状，继而产生不同的阻碍癌细胞成长的效果。
[0054]本发明首创特殊设计的VHH人源化纳米抗体复合连接群，既纳米抗体偶联体或多联体复合纳米抗群，包含了人源化HER2纳米抗体，人源化VEGF纳米抗体和人源化EGFR纳米抗体。人源化纳米抗体复合连接群中，人源化HER2纳米抗体和人源化EGFR纳米抗体直接作用在癌细胞上，发挥多靶点抑制癌细胞生长功能。而人源化VEGF纳米抗体将作用在癌细胞和其周边范围，阻止癌细胞周边的血管生形成，产生抗血管生成作用，从而促使癌细胞凋亡。人源化纳米抗体复合连接群或纳米抗体聚合链接体形成多位一体，其抑制癌细胞生长与促使癌细胞凋亡的作用比各个随机分散的人源化纳米抗体的抑制癌细胞生长作用要有效数十倍乃至几百倍以上。
[0055]本发明利用食品级可服用、且可存活于人体肠胃系统的益生菌株，经过基因工程改造生产和释放活性纳米抗体，递送于人体中肠胃环境，进入血液循环，到达肿瘤内部。
[0056]本发明所述的益生菌包括乳杆菌或双歧杆菌。其口服益生菌制剂中还包括选择性益生元物质，包括双歧因子等益生元，以助于特定菌株的生长与活性。
[0057]与益生菌同时口服的益生元还可以包括低聚果糖、部分蛋白质类物质和蛋白质水解产物、异麦芽低聚糖、天然植物提取物类、多糖类双歧因子等等。
[0058]本发明首创特殊设计的多靶点纳米抗体聚合体通过基因工程技术方法和手段转入益生菌表达和释放。目前可用的DNA转入生物益生菌方法有好几种，例如国内专利(公开号CN 103656633A)中所描述的通过Cre/lox位点特异性重组实现的转入方法。为了使外源蛋白质或者多肽能够在乳酸菌顺利和高效表达，需要对其编码基因的核苷酸序列根据乳酸菌对密码子的使用偏好性进行优化，以去除稀有密码子。
[0059]益生菌活载体已经广泛应用于各种免疫开发。欧盟专利“Oralrecombinantlactobacilli vaccines (EP1084709A1)”公布了一种乳酸菌表面展不抗原的方法。做为可以商品化的乳酸菌疫苗，抗原在乳酸菌细胞壁展示只是多个技术环节之一。欧盟专利“Lactobacilli harboring aggregat1n and mucin binding genes asvaccinedelivery vehicles (EP1066375B1)”公布了一种罗伊氏乳杆菌细胞壁表面展示抗原的方法。美国专利“Live bacterial vaccine (US2009/0324638A1)”公布了一种用于乳酸菌分泌或者细胞壁展示蛋白质或者多肽的方法。
[0000]将本发明所述的纳米抗体VHH单体与上述寿命较长的分子链接Linker融合在一起，可以提高纳米抗体VHH在血液中的存在时间，弥补纳米抗体VHH单体半衰期短的缺陷。
【主权项】
1.一种益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体，是将特异性单体纳米抗体VHH通过多肽链接Linker连接构成纳米抗体聚合连接体，并以口服益生菌菌株作为所述纳米抗体聚合链接体药物的活输送载体，其中，所述的单体纳米抗体VHH是以HER2、EGFR和/SVEGFS-点的抗体 Nb-EGFR、Nb-HER2 和/或 Nb-VEGF。2.按照权利要求1所述的多革E向纳米抗体聚合链接体，将所述单体纳米抗体VHH完成人源化改造，以降低其免疫源性。3.按照权利要求1所述的多靶向纳米抗体聚合链接体，其纳米抗体聚合链接体是将单体纳米抗体Nb-HER2、Nb-EGFR和/或Nb-VEGF以任意组合方式通过多肽链接Linker连接起来的偶联体、三聚链接体或四聚链接体。4.按照权利要求3所述的多革E向纳米抗体聚合链接体，所述单体纳米抗体通过多肽链接Linker头尾、尾尾或头头连接。5.按照权利要求1所述的多革E向纳米抗体聚合链接体，所述用于连接单体纳米抗体VHH的多肽链接Linker为短Linker、中Linker或长Linker，其中，所述短Linker由少于15个氨基酸组成，中Linker由15_25个氨基酸组成，长Linker由26-60个氨基酸组成。6.按照权利要求1所述的多靶向纳米抗体聚合链接体，所述口服益生菌菌株包括乳杆菌或双歧杆菌。7.按照权利要求6所述的多靶向纳米抗体聚合链接体，其中所述的乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌，以及乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种。8.—种益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体的口服制剂，含有权利要求1所述益生菌表达的多革El向纳米抗体聚合连接体，在所述口服制剂中还包括选择性益生元物质，所述选择性益生元物质包括助于特定菌株的生长与活性的双歧因子。9.按照权利要求7所述的口服制剂，所述选择性益生元物质还包括低聚果糖、蛋白质类物质和蛋白质水解产物、异麦芽低聚糖、天然植物提取物、多糖类双歧因子中的一种或几种。10.按照权利要求7所述的口服制剂，其特征是将所述口服制剂制成胶囊剂、片剂或口服液制剂。11.按照权利要求7所述的口服制剂，其特征是将所述口服制剂制成酸奶、饮料或饼干。12.权利要求1所述口服益生菌表达的多靶向纳米抗体聚合链接体作为抗胃癌药物的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106075433SQ201610429387
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】渠志灿, 李少平
【申请人】山西纳安生物科技有限公司