专利名称：通过与甘油的酶促反应浓缩脂肪酸烷基酯的制作方法
技术领域：
公开的发明属于用于浓缩脂肪酸烷基酯的酶促方法的领域。
背景技术：
从天然来源获得的甘油三酯由许多不同的脂肪酸组成，该脂肪酸 在碳原子数、取代模式、不饱和程度以及立体化学方面可能不同。例 如在鱼油中，已经发现了超过50种不同的脂肪酸，包括商业上重要的 且具有生物学活性的(o-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)、 二十二碳六 烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA) 。 co _3脂肪酸与对人和动物有益的 健康作用相关，特别是在心血管疾病、炎症及认知功能和发育方面 [1-3]。因此，需要从如鱼油、海藻油和海豹油的来源中纯化co-3脂 肪酸。
在植物油中，也可发现许多不同的脂肪酸，如反-ll油酸(异油酸) 和顺-6，9，12十八碳三烯酸(y-亚麻酸(GLA))。脱水氢化蓖麻油是异 油酸的良好来源，而琉璃苣油和月见草油是GLA的良好来源。GLA是 一种也与积极的健康作用，如免疫系统调节、特应性湿疹、类风湿性 关节炎、糖尿病性神经病和肝硬化的治疗有关的脂肪酸[4]。乳脂代表 生物活性脂肪酸象反-异油酸和共轭脂肪酸的另一来源。
由于若干脂肪酸的强阳性生物学效应，脂肪酸可被用作食品增补 剂、食物/祠料成分以及药物。然而，天然来源中的例如co-3脂肪酸 的浓度较低，因此需要一种可增加所需脂肪酸浓度的方法。先前，已 经使用过短程蒸馏、低温溶剂结晶、溶剂冬化法和尿素配位。
这些方法昂贵且耗时，由此导致浓缩脂肪酸的高加工成本。近来， 酶促反应(水解、酯化等)已经受到关注并探究将其作为以游离脂肪酸、乙酯[6]或己酯[7]形式富集DHA/EPA的方式。此外，该技术已经 用于以游离脂肪酸形式富集GLA[8]和以烷基酯形式富集共轭亚油酸 (CLA)的异构体[9]。那些方法的限制或者是终产品的低产率，或者是 加工步骤的个数，两者均对产品的成本具有直接影响。
因此，需要一种更简单、由更少的加工步骤构成、产生更高产率 更高纯度的产品的方法。较大体积的EPA/DHA以乙酯形式供应给全球 市场。因此，以乙酯形式富集EPA/DHA可节省加工步骤并由此节约时 间和成本。
发明内容
第一方面，本发明提供一种通过使烷基酯在一步法中与甘油反应 而分离脂肪酸烷基酯的方法。该反应由酶催化，在真空室中，在有水 存在的条件下进行，水被允许从第二容器进入。选择反应条件以使底 物与甘油以不同速率反应。在达到平衡前终止反应，以便使脂肪酸烷 基酯部分的组成与最初组成相比发生改变。由于脂肪酸烷基酯与反应 产物(甘油单-、二-和三-酯)之间挥发性的较大差异，可使用短程蒸馏 以高产率获得纯化的烷基酯組合物。用作起始物质的脂肪酸烷基酯可 从海产来源如鱼油和海藻油、从植物来源如蓖麻油、月见草油和琉璃 苣油或从动物来源如海豹油和鲸油制备。根据来源不同，所述方法可 用于制备烷基酯的浓缩物。这类烷基酯的非限制性实例为EPA乙酯、 DHA乙酯、DPA乙酯、GLA乙酯和异油酸乙酯。
本发明的另一方面是由上述方法产生的脂肪酸烷基酯组合物。此 外，是进一步包含由上述方法产生的所述组合物的食物/祠料产品、食 品 增补剂和药物。
本发明的另一个实施方案是一种新的脂质组合物，它包含脂肪酸 烷基酯、甘油酯和游离脂肪酸。所述脂肪酸烷基酯具有高于或大于所 述甘油酯1.1倍的碘值。所述组合物中所述游离脂肪酸的量少于
50% (w/w)。所述组合物可被动物或人安全地食用。
图1是通过脂肪酸烷基酯与甘油(以不同速率)在真空室(B)中的 酶促反应而分离脂肪酸烷基酯的方法的示意图。
定义
此处所用术语"食品"是指适于人食用的任何食物或饭食。"食 物"可以是预制和包装食品(例如，蛋黄酱、色拉调料、面包、干酪产 品)或动物饲料(例如，压榨和颗粒动物饲料或粗混合祠料)。
此处所用术语"动物饲料"是指适于由动物食用的任何饲料。 此处所用术语"婴儿食品"是指为婴儿配制的食品如嬰儿配制食
叩o
此处所用术语"食品增补剂"是指被配制成膳食或营养补充剂， 用作膳食的一部分的食品。
此处所用术语"co-3脂肪酸"是指多不饱和脂肪酸，其在从分子 甲基末端起第三和第四个碳原子之间的烃链中具有最后的双键。co-3 脂肪酸的非限制性实例包括5， 8， 11， 14， 17-二十碳五烯酸(EPA)、 4， 7， 10， 13， 16， 19-二十二碳六烯酸(DHA) 、 7,10， 13， 16， 19-二十二碳 五烯酸(DPA) 、 9， 12， 15-十八碳三烯酸(ALA)和6， 9， 12， 15-十八碳四烯 酸(SDA)。
此处所用术语"co-6脂肪酸"是指多不饱和脂肪酸，其在从分子 甲基末端起第6和第7个碳原子之间的烃链中具有最后的双键。0)-6 脂肪酸的非限制性实例包括顺-6， 9， 12-十八碳三烯酸(GLA)。
此处所用术语"鱼油"是指从海产来源获得的任何油，例如金枪 鱼油、海豹油和海藻油。
此处所用术语"脂酶，，是指能够水解脂肪酸酯的任何酶。 此处所用术语"挥发性反应产物"是指水和具有l-12个碳的醇。 此处所用术语"脂肪酸烷基酯"是指脂肪酸的衍生物。该脂肪酸
具有1-24个碳的链长和0-6个双键。该衍生物可以是具有1-12个碳 的烷基。预期了任何适合的烷基如支链、不饱和及取代的烷基链。
此处所用术语"催化有效量"是指获得催化反应所需的催化剂的 最小量。
发明描述
本发明公开了一种通过脂肪酸烷基酯与甘油(以不同速率)在真空 室(B)中进行酶促反应而分离脂肪酸烷基酯的方法。将减压施加于容器 B并使水蒸汽(水分)通过管子由第二容器(A)进入到反应混合物中(见 图1的实验装置示意图)。本发明不限于从单独的容器中加水。以緩慢 和可控方式增加水蒸汽/湿度的其它方式也落在本发明范围之内。
在达到平衡之前终止反应并使用短程蒸馏从甘油酯中分离出富含 脂肪酸烷基酯的馏分。甘油的用量、酶的用量和类型以及反应时间和 温度需要针对每次应用进行优化。这些参数设定取决于初始组合物的 化学性质、可利用的时间以及试图制备的最终组合物。本发明不限于 使用任何特定的酶。事实上，预期了多种酶的使用，包括，但不限于 r力er迈o;z7/ces Za"〃g// c^ZAy月旨酵、W力i'zo/zwcor迈ieAe/月旨醉、Ca/2(/2 a j/7""〃ca脂酶、荧光假单胞菌脂酶和爪哇毛霉脂酶。根据酶和/或 酶载体极性的不同，将固定化酶(例如TL-IM)分散到非极性反应混合 物中可能较为困难。为了使乳液稳定，加入卵磷脂。
本发明不限于任何特定的脂肪酸烷基酯。预期了使用所公开的方 法，以不同速率与甘油反应的任何脂肪酸垸基酯。这包括，但不限于 癸酸(10:0)、十一酸(11:0)、 10-十一酸(ll: 1)、十二酸(12: 0)、顺 -5-十二酸(12:1)、十三酸(13:0)、十四酸(14:0)、肉豆蔻脑酸(顺-9-十四烯酸，14:1)、十五酸(15:0)、十六酸(16:0)、棕榈烯酸(顺-9-十六烯酸，16:1)、十七酸(17:1)、十八酸(18:0)、反油酸(反-9-十八 烯酸，18:1)、油酸(顺-9-十八烯酸，18:1)、十九酸(19:0)、 二十酸 (20:0)、顺-11-二十碳烯酸(20: 1)、 11, 14-二十碳二烯酸(20: 2) 、 二 十一酸(21:0)、 二十二酸(22:0)、芥酸(顺-13-二十二烯酸，22:1)、
二十三酸(23:0)、 二十四酸(24:0)、 二十四碳烯酸(24: 1) 、 二十五酸 (25:0)、 二十六酸(26:0)、 二十七酸(27:0)、 二十八酸(28:0)、 二十 九酸(29:0)、三十酸(30:0)、异油酸(t-11-十八碳烯酸，18:1)、塔日 酸(十八碳-6-炔酸，18: 1)和蓖麻酸(12-羟基十八碳-顺-9-烯酸，18: 1) 和co3、 co6、和co9脂肪酰基如9， 12， 15-十八碳三烯酸(ot-亚麻 酸)[18:3， co 3]; 6， 9， 12， 15-十八碳四烯酸(十八碳四烯酸)[18: 4， co 3]; 11， 14， 17-二十碳三烯酸(二高-a-亚麻酸)[20: 3, co 3]; 8，11，14，17-二十碳四烯酸[20:4， oo 3〗；5， 8， 11， 14， 17-二十碳五烯 酸[20:5， co 3] ; 7， 10， 13， 16， 19-二十二碳五烯酸[22: 5 ， co 3];
4, 7， 10， 13， 16， 19-二十二碳六烯酸[22: 6， co 3]; 9,12-十八碳二烯酸 (亚油酸)[18:2， co6]; 6， 9， 12-十八碳三烯酸(y-亚麻酸)[18: 3， co 6]; 8，11，14-二十碳三烯酸(二高-y -亚麻酸)[20: 3， co 6];
5, 8， 11， 14-二十碳四烯酸(花生四烯酸)[20: 4， co 6]; 7，10，13，16-二 十二碳四烯酸[22:4， a 6]; 4， 7， 10， 13， 16-二十二碳五烯酸[22: 5, w 6]; 6，9-十八碳二烯酸[18:2， co 9]; 8， 11-二十碳二烯酸[20: 2， w 9]; 5，8,11-二十碳三烯酸蜂蜜酒(Mead)酸)[20:3, co 9]; tl0，cl2十八碳 二烯酸、c10， t12十八碳二烯酸；c9， tll十八碳二烯酸和t9， cll十八 碳二烯酸。此外，酰基残基可以是共轭、羟基化、环氧化或羟基环氧 化酰基残基。
在从由10。/。EPA和50。/J)HA组成的组合物中富集DHA乙酯的情况下， 使用了下列条件反应时间(24小时)，甘油(13°/。) ， ^/zo/z wcorWe力e/ 脂酶(RM-IM) (13%),乙酯(74。/。)，反应温度(40X:)和压力(0. 1-1毫巴)。 在达到平衡前终止反应，然后使用短程蒸馏分离产物，其由脂肪酸烷 基酯(83%)、甘油酯(14%)和游离脂肪酸(3°/。)组成。24小时后，乙酯馏 分中DHA的含量从5(T/。升高至74%。通过降低反应温度至25'C，其 选择性进一步增加，且37小时后，达到了 84%的DHA浓度。41小时 后，co-6脂肪酸花生四烯酸(AA)的水平也从0. 6%降低至0. 27% 。在 一些实施方案中，降低产物中AA的浓度可能是有用的，因为AA是一 种促炎前体。慢性炎症与若干病症如心血管疾病、代谢综合征和2型
糖尿病有关[10-12]。
在一个实施方案中，该方法可用于从包含这种脂肪酸烷基酯如乙 基化鱼油、海藻油和/或海豹油的混合物中富集DHA烷基酯、EPA烷基 酯和/或DPA烷基酯。鱼油的非限制性实例可以是从冷榨金枪鱼、沙丁 鱼获得的油或它可以是鳕鱼鱼肝油。
在另一实施方案中，该方法可用于从富含GLA的来源如乙基化琉 璃苣油或乙基化月见草油中富集GLA烷基酯。本发明公开了通过使乙 基化琉璃苣油与甘油反应而将GLA浓度从20%增加至66. 7% 。
在另 一实施方案中，该方法可用于从脱水氢化蓖麻油乙酯或部分 氢化的共轭亚油酸乙酯的混合物中以及从其它来源中富集异油酸。
在另一实施方案中，CLA乙酯异构体如顺-9、反-ll可从CLA乙酯 异构体如顺-9、顺-ll;顺-9、反-11;反-9、顺-ll;反-9、反-ll; 顺-IO、顺-12;顺-10、反-12;反-IO、顺-12和反10、反-12的混合 物中富集。
本发明不限于任何特定的机理。事实上，机理的理解无需实践本 发明。尽管如此，根据我们的观察和其它报道[5]，烷基酯与甘油之间 的反应较慢。加入少量水可增加反应速度，然而分子水平的机理还不 清楚。由于反应过程中酸值没有增加(酸值从2.8-3，4)这一事实，有 理由相信反应在脂肪酸烷基酯与甘油之间直接进行。预期水可提高酶 的活性且游离脂肪酸不是该方法中的中间体。
本发明与现有技术相比在以下方面提供了改进，即可在不转化成 游离脂肪酸的情况下，直接富集脂肪酸烷基酯。大体积的浓缩的脂肪 酸烷基酯可在世界范围的市场上商购。使用本发明，可节省1-3个方 法步骤，由此可减少富集过程的时间和成本。此外，可以增加产率， 这是因为例如DHA乙酯与甘油酯之间的挥发性大于游离脂肪酸形式的 DHA与甘油酯之间的挥发性。甘油酯是当脂肪酸烷基酯与甘油反应时 形成的反应产物。
具体实施例方式
实施例1
将IOO g乙酯(10°/。 EPA和50% DHA (相对峰面积))、13g甘油和 13g来自于Novozymes (Bagsvaerd, Denmark)的固定化r力/zo廳cor 迈/e力e/脂酶(RM-IM)混合于反应容器中并搅拌。反应在40。C (压力 0.1-1毫巴)下进行，水/蒸汽从第二个单独的容器中进入(见图1的 图解)。8、 16和24小时后从反应混合物中收集样品并通过GC-FID分 析。结果表明乙酯部分中DHA的含量在8、 16和24小时后分别为61%、 70%和74%。 24小时后，乙酯的量降低至约40%且游离脂肪酸的水平 增加至约2%。相对于乙酯的初始量，从第二容器中食用的水量为约 40%。接着，过滤除去酶并使混合物脱气且使用短程蒸馏法蒸馏，以 便从甘油酯中分离出乙酯馏分。GC分析表明最终的蒸馏液含有83%乙 酯、14%甘油单酯和2-3%游离脂肪酸。残余物主要由甘油酯(甘油单-、 二-和三-酯)组成，但还有5%乙酯和0. 5-1%游离脂肪酸。
实施例2
在与实施例l相同的条件下进行实验，区别之处在于使4. 3g甘油、 4. 3g RM-IM和33g乙酯(10% EPA和50。/。 DHA)在的温度下反应。 29小时、37小时和41小时后，乙酯部分分别含有81% DHA、 84% DHA 和80% DHA。 AA的水平从第0小时的0. 7 %降低至41小时后的0. 26 %。反应食用了9g水。酸值在5-8的范围内。
实施例3
在与实施例1相同的条件下进行实验，区别之处在于使100g脂肪 酸乙酯(富含GLA的乙基化琉璃苣油)、13g甘油、0. 34g卵磷脂和13. 7g 来自 Novozymes (Bagsvaerd， Denmark)的固定化 7y er/z70/z77ces Za/7og/;2"Si^ (TL-BVI)在50。C的温度下反应。开始时，GLA乙酯的浓 度为20% ， 18: 1， 18: 2和18: 3峰之间的比值为1: 2: 1。 2小时后，GLA 的浓度增加至34. 8%且18: 1， 18: 2和18: 3的比值变为1: 3: 3。 5小 时后，GLA的浓度增加至42. 4%且18: 1， 18: 2和18: 3的比值为1: 3: 4。
23小时后，GLA的浓度增加至67°/。且18:1， 18:2和18:3的比值为 1:3:11。反应过程中食用的水量为547g。
实施例4
进行与实施例3相同的实验，区别之处在于没有加入卵砩脂。40 小时后终止实验，结果表明反应没有发生。
实施例5
在与实施例1相同的条件下进行实验，区别之处在于使300 g脂 肪酸乙酯(乙基化海豹油)、40g甘油、lg卵磷脂和45g TL-IM在50°C 的温度下反应。海豹油是富含co-3脂肪酸EPA、 DHA和DPA的海产来 源。25小时后，终止实验。DHA浓度从8%增加至11. H, DPA浓度从 3. 2增加至3. 7%且EPA浓度从7. 1增加至8. 2°/。。反应过程中食用了 50g 水。酸值从开始时的0. 5增加至25小时后的7. 9。
从上面可以清楚看出，本发明提供了一种新的富集脂肪酸烷基酯 的方法。上面说明书中提及的所有出版物和专利引入此处作为参考。 在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明所述方法和系统的各 种改进和变化对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。虽然已经 根据具体的优选实施方案描述了本发明，但应理解所要求保护的本发 明不应不适当地限制到这类具体的实施方案。事实上，用于实施本发 明的所述模式的各种改进，其对于药物、生物化学或相关领域的技术 人员而言是显而易见的，意欲落在下列权利要求的范围之内。参考文献 J. A. Nettleton: 0迈ega-3 fatty acids and health. Chapmand and Hall, New York (USA) 1995. Richardson AJ and Montgomery P. _Petftafn'cs 115 (2005)1360. [3] Kremer肌/C/z."胸r 71 (2000) 249. [4] Beganriu S, Farmacia 44 (1996) 3-4. US 6,518,049; Lipase-Catalyzed Esterification of Marine Oil. Halldorsson A， Kristinsson B, Haraldssson GG, Awf. / 丄z》t'cf Sc!'. rec&io厶106 (2004) 79. Ju Y and Chen T， J04GS, 79 (2002) 29. Libby P.血JC7z'w胸r 83 (2006) 456S. Sacks FM and Campos H. /. Awrfoch". Afeto6o/. 91 (2006) 398. [12] Tracy RR C7/"尸ra", 134 (2003) 10-17.
权利要求
1.一种用于分离脂肪酸烷基酯的方法，包括a)形成至少两种脂肪酸烷基酯、甘油和催化有效量的酶的混合物；b)在有水存在的情况下减压处理该混合物，其条件是使得至少两种脂肪酸烷基酯以不同速率酯化。
2. 权利要求1的方法，进一步包括分离至少两种脂肪酸烷基酯，从 而获得富含脂肪酸烷基酯的组合物的步骤。
3. 权利要求l或2的方法，其中水以蒸汽形式由单独的容器或蒸汽 供应装置供应。
4. 权利要求1-3的方法，其中步骤(b)中的条件包括在可有效引起 甘油以不同速率开始酯化脂肪酸烷基酯的温度下搅拌该混合物，同时从 反应混合物中除去挥发性反应产物。
5. 权利要求1-4的方法，进一步包括在所有脂肪酸烷基酯被酯化前 终止酯化反应的步骤。
6. 权利要求2-4的方法，其中该分离包括使产物混合物经历短程蒸 馏步骤，以便获得与最初组合物相比富含脂肪酸烷基酯的脂肪酸烷基酯 馏分。
7. 权利要求1-6的方法，其中脂肪酸烷基酯从甘油三酯如鱼油、海 藻油、海豹油、鲸油、琉璃苣油、月见草油、脱水氢化蓖麻油和部分氢 化的共辄亚油酸制备。
8. 权利要求7的方法，其中所述脂肪酸烷基酯是鱼油乙酯或曱酯。
9. 权利要求2-8的方法，进一步包括使用至少一种其它可食用物质 配制富含脂肪酸烷基酯的组合物的步骤。
10. 权利要求2-9的方法，进一步包括将富含脂肪酸烷基酯的组合 物配制成食品的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述食品选自动物饲料、婴儿配制食 品、 和为人类制备的食品。
12.按照权利要求1-11的方法制备的组合物、食品、婴儿配制食品、 或动物飼料。
13. 按照权利要求1-8的方法制备的组合物，其中所述组合物包含 脂肪酸烷基酯、甘油酯和脂肪酸；所述脂肪酸烷基酯具有高于或大于所 述甘油酯1. 1倍的硪值；所述组合物中所述脂肪酸的量少于50%(w/w); 其中所述组合物可净皮动物安全食用。
14. 一种组合物，包含脂肪酸烷基酯、甘油酯和脂肪酸；所述脂 肪酸烷基酯具有高于或大于所述甘油酯1. 1倍的碘值；所述组合物中所 述脂肪酸的量少于50%(w/w);其中所述组合物可被动物安全食用。
15. —种用于分离脂肪酸烷基酯的方法，包括使脂肪酸烷基酯、甘 油、水和催化有效量的酶的混合物在可有效引起甘油以不同速率开始酯 化脂肪酸烷基酯的温度下反应，同时从反应混合物中除去醇和水。
16. —种用于分离脂肪酸烷基酯的方法，包括使脂肪酸烷基酯、甘 油和催化有效量的酶的混合物酯化，如此甘油以不同速率酯化脂肪酸烷 基酯并在所有脂肪酸烷基酯被酯化前终止该酯化反应。
17. —种酶促脂肪酸分离方法，包括在可有效引起甘油以不同速率 开始酯化脂肪酸烷基酯的温度下搅拌混合物中的脂肪酸，同时除去反应 混合物中的挥发性反应产物的步骤。
18. —种酶促脂肪酸分离方法，包括在所有脂肪酸烷基酯被酯化前 终止酯化反应的步骤。
19. 权利要求1的方法，进一步包括c)加入充足浓度的卵磷脂，以便 提高乳液的稳定性。
全文摘要
公开了一种在没有有机溶剂存在的条件下动力学分离烷基酯的酶促方法。使从例如鱼油获得的烷基酯在有水存在的条件下，以不同速率在真空室中与甘油反应。该反应在达到平衡之前被终止，并通过短程蒸馏从反应混合物中分离出富含烷基酯的部分。
文档编号C11C3/06GK101356258SQ200680024886
公开日2009年1月28日 申请日期2006年5月23日 优先权日2005年5月23日
发明者A·塞伯, D·曼奇内利, I·布鲁海姆, P·C·塞伯 申请人:纳图拉尔股份公司