专利名称::维药没食子的辐射防护作用的制作方法
技术领域:
:本发明涉及维吾尔医习用药材没食子的新用途,具体地说是把没食子药材及其提取物,应用于预防和治疗辐射损伤的药物制剂、保健品中。
背景技术:
:随着辐射技术在生产、科研、医疗、军事等方面的广泛应用,人体受放射线辐射的机会越来越多。恶性肿瘤患者是接触放射线的特殊人群,报道显示,在我国约有70%的恶性肿瘤患者需要接受放射线治疗。而值得重视的是放疗在杀伤肿瘤细胞的同时,对机体的正常组织也会造成不容忽视的损伤,有的患者由于辐射损伤严重而被迫终止有效的治疗。辐射对人体的危害较大,可引起机体从细胞损伤到整个机构功能异常和器质性改变甚至死亡。辐射损伤的原发机制为电离辐射对生物分子的直接和间接作用。辐射可以直接作用于DNA、蛋白质及酶类等,引起电离与化学键断裂,使分子变性和细胞结构破坏,从而造成机体多种组织和器官损伤;也可以作用于机体内水分子,水分子被电离激发,产生大量自由基,自由基再与生物大分子作用,从而间接地使组织细胞变性、坏死。不同组织器官和细胞对辐射表现出不同的敏感性,血液系统、免疫系统对辐射高度敏感,淋巴细胞、性腺细胞和骨髓细胞等是辐射的易感细胞。机体损伤程度与辐射剂量密切相关,长期过量的辐射将导致机体产生一系列损伤,包括氧化应激损伤、造血系统功能异常、免疫功能障碍及细胞DNA链断裂、基因突变、染色体重组、细胞凋亡等;短期小剂量辐射可能未见明显的病理改变,但若引起DNA改变则具有遗传学上的潜在危险性。辐射损伤的发生与发展过程具体见说明书附图1。目前所研究的辐射防护剂的候选对象主要集中于氨巯基化合物、细胞因子、蛋白酶抑制剂、激素类等,研究证实它们具有良好的抗辐射损伤活性,但人们也注意到它们大多具有较大的毒副作用,从而降低了其临床应用价值。由于从化学合成物中筛选发现辐射防护新药的命中率明显降低,且毒副作用较大,人们期望能从天然产物中寻找到理想的辐射防护剂。没食子(Turkishgalls)为壳斗科植物没食子树(QuercusinfectoriaOliv.)幼枝上的干燥虫瘿,由没食子蜂科昆虫没食子蜂(Cynipsgallae-tinctoriaeOliv.)幼虫寄生而形成,是维吾尔族医传统特色药材,维吾尔医称为Mezha,具固涩收敛、益血生精、止血消炎等功效。它主要产于地中海沿岸、印度、巴基斯坦等地,尤以小亚细亚产量最多。没食子在我国具有悠久的药用历史,自唐、宋以来的医学著作《唐本草》、《海药本草》、《开宝本草》等中都有记载,以维吾尔医中应用最为普遍。目前国内外对没食子药材及其提取物的研究报道较少,并且均未涉及其在辐射损伤防护领域的研究报道。现有的研究成果已经证实电离辐射下机体内产生的自由基对DNA、蛋白质和细胞膜等生物大分子的损伤是辐射损伤发生的主要原因之一,因此从抗氧化、清除自由基的角度寻找有效的辐射防护剂的一个重要思路。鉴于没食子富含鞣质、没食子酸,具有较强抗氧化活性,本实验对其辐射防护作用进行了研究,结果显示没食子具有较明显抗辐射损伤功效。
发明内容本发明的目的在于提供没食子及没食子提取物的新用途。内容包括没食子或没食子提取物可通过提高机体造血功能、免疫功能和清除体内自由基等多个环节的综合作用,达到辐射防护的效果。本发明还提供了含有没食子原生药粉或提取物作为活性成分的药物、保健品及其制备方法和用途。本发明提供了维药没食子在预防和治疗辐射损伤的药物或保健品中的用途。所述的维药没食子为壳斗科植物没食子树(QuercusinfectoriaOliv.)幼枝上的干燥虫瘿,该虫瘿由没食子蜂科昆虫没食子蜂(Cynipsgallae-tinctoriaeOliv.)幼虫寄生而形成。所述的没食子为没食子原生药粉或提取物。本发明提供了一种药物或保健品组合物,它是由所述的没食子原生药粉或没食子提取物为活性成分,加上药学或保健品行业领域可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。其中,所述的没食子提取物为水及乙腈、低碳醇、低碳酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂中的一种或任意两种或者多种溶剂以任意比例组成的混合溶剂提取物。提取溶剂的选择和配比取决于提取溶剂的极性,在提取溶剂极性固定的情况下,可选择其它不同配比的不同溶剂。其中,所述的没食子提取物含有没食子鞣质3099%。进一步地,所述的没食子提取物中还含有没食子酸。上述的鞣质、没食子酸可作为控制药物或保健品的指标成分,增强了本发明制剂质量的可控性。所述的制剂是口服制剂或注射剂。本发明还提供了该药物或保健品组合物的制备方法,包括以下步骤步骤1选取干净的没食子并粉碎作为加工原料;上述步骤1所选没食子最好为个大、体重、体重、未穿孔、干燥洁净的虫瘿。步骤2以水、低碳醇或低碳酮等较强极性溶剂中的一种或几种作为溶媒,并以没食子加工原料320倍重量提取溶媒对没食子加工原料进行溶解提取并过滤,收集透过液得滤液;上述步骤2所述的提取为煎煮、回流提取、渗漉提取、浸渍提取或超声提取方法中的一种。上述步骤2最好重复25次,每次按没食子加工原料320倍重量加入溶媒。步骤3滤液在常压或减压条件下浓缩至一定浓度,静置备用,优选减压浓缩;步骤4将步骤3的提取浓缩液以适量水混悬,用乙醚、氯仿、二氯苯等弱极性溶剂中的一种或几种进行萃取,以除去亲脂性杂质及脂溶性色素等;上述步骤4最好重复25次,每次水混悬液与萃取溶剂的比例为11110。步骤5将步骤4所得的水层部位再以乙酸乙酯、正丁醇等中等极性强度的溶剂中的一种或几种进行萃取,以除去多糖、蛋白质及水溶性色素等,有机溶剂萃取液减压浓缩,备用。步骤6将步骤5所得的有机溶剂萃取浓缩液进行葡聚糖凝胶、反相硅胶、大孔吸附树脂柱色谱层析中的一种或几种进行分离,也可以将浓缩液采用超临界流体萃取、液滴逆流色谱等方法进行分离,收集富含鞣质流份,将其浓缩,得浸膏,经真空或冷冻干燥得干粉,再加上药学、保健品或化妆品行业领域可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药学或保健品行业领域中常用的口服制剂或注射剂。本发明还提供了该药物或保健品组合物的在制备抑制皮肤色素沉着和防晒美白作用的药物、保健品或化妆品中的应用。本发明从维药没食子中提取得到的没食子提取物,对辐射损伤机体的造血系统、免疫系统具有较明显的保护作用和抗氧化活性。本发明还提供了以所述的维药没食子及其提取物作为活性成分的药物或保健品制剂,可用于预防和治疗辐射损伤。本发明进一步地,提供一种药物或保健品组合物,其中含有维药没食子或其提取物,或维药没食子及其提取物与其它具有预防和治疗辐射损伤的活性成分配伍组成的复方制剂。按照本发明,可以将上述含有维药没食子或其提取物,或维药没食子及其提取物与其它具有预防和治疗辐射损伤功效的活性成分配伍组成的复方制剂,按照常规制剂技术,制备成口服制剂或注射剂。根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下,还可以作出其它多种形式的修改、替换或变更。下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述。但不以此限制本发明,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施例方式实施例1没食子原生药药品的制备取维药没食子原生药,即壳斗科植物没食子树(QuercusinfectoriaOliv.)幼枝上的干燥虫瘿,净制后,按常规方法粉碎,过筛,制成粒度为6080目的细粉,细粉装入胶囊,灭菌,分装即成。实施例2没食子提取物的制备取没食子原生药,净制,适当粉碎作为加工原料,加入10倍重量的80%丙酮溶液,加热回流提取2小时,过滤,滤渣再加入8倍重量80%丙酮溶液,加热回流提取1.5小时,过滤。合并两次滤液,浓缩至一定浓度,静置备用。用3倍重量的乙醚溶液萃取3次,合并3次水萃取部位,浓缩至一定浓度,再以3倍重量的乙酸乙酯溶液萃取3次,合并3次水萃取部位,浓缩,得浸膏。所得浸膏加水加溶解,上S^hadexLH-20层析色谱柱进行分离,以甲醇-水系统梯度洗脱,收集40%100%甲醇流脱流分,浓缩,得浸膏,真空冷冻干燥得干粉。实施例3;片剂的制备取没食子提取物50g,加入微晶纤维素240g,PVPlOg,混勻,以75%乙醇为粘合剂制颗粒,过22目筛,50°C干燥3小时,22目筛整粒,加入少量硬脂酸镁,混勻,压片,制成1000片,即得。实施例4:口服糖浆剂取没食子提取物50g,另取蔗糖35g,50%乙醇180mL,柠檬酸8050mg,苯甲酸钠500mg,混合加水至10L,混勻后分装成1000支,即得。实施例5注射剂的制备取没食子提取物25g,另取二乙胺四乙酸二钠盐0.125g,注射用水IOOOmL,在无菌条件下,搅拌使完全溶解,分别经玻砂过滤器G3、G6过滤,滤液定量(ImL)灌注于安瓿瓶或西林瓶内,立即转入冷冻干燥机内,冷冻干燥24小时,熔封瓶口或加盖封口,即得1000支注射用冻干粉针剂。临床使用前加入注射用水,摇勻溶解即可用于肌肉注射。实施例6没食子提取物对辐射损伤小鼠的保护作用1实验材料1.1实验动物昆明种小鼠,SPF级,雌雄各半,体重1723g,由新疆医科大学实验动物中心提供,生产许可证号SCXK新(2003)0001。1.2药物、试剂与仪器没食子药材购自新疆维吾尔医医院,经新疆医科大学药学院热娜·卡斯木教授鉴定为壳斗科植物没食子树幼枝上的干燥虫瘿Turkishgalls。贞芪扶正胶囊(甘肃新兰药业有限公司,批号2009060215)。SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20090605),MDA测试盒(南京建成生物工程研究所,批号20090605),其它试剂均为分析纯。UV-2550紫外可见分光光仪(日本Shimadzu公司),BC_2800VE兽用全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞医疗电子股份有限公司),BS110S电子天平(德国Sartorius公司),RE-52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),1001冷冻干燥机(美国EdwardsPirani公司),DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司),80-2B台式低速离心机(江苏金坛市医疗仪器厂)。2实验方法2.1实验药物的制备称取适量没食子药材粉碎,用3倍量体积分数的80%丙酮溶液在室温条件下浸渍提取24h,滤取滤液,残渣重复以上浸提2次,每次24h,合并3次滤液,减压浓缩,冷冻干燥,制成粉末(得率41.11%);粉末加水混悬,经乙醚脱脂,用等体积乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯溶液并减压浓缩,冷冻干燥,制得TgE冻干粉(得率11.5%)。将TgE冻干粉分别制备成浓度为12.0,6.00和3.00mg/ml的双蒸水溶液,每日新配制作为供试药物。2.2实验分组与给药小鼠喂养1周适应环境,随机分成六组正常组、模型组、TgE低、中、高剂量组和阳性对照组,每组10只,雌雄各半,分笼饲养,标准饲料;正常组和模型组每天一次性灌胃生理盐水(20ml/kg);阳性对照组取贞芪扶正胶囊水溶液按125mg/kg剂量灌胃给药;TgE组的给药剂量按mg/kg体重计算(给药体积为0.lml/10g体重),低、中、高给药剂量分别为30、60、120mg/kg。各组小鼠均在照射前IOd及照射后IOd持续灌胃给药,每日1次。2.3照射条件除正常组外,其余各组小鼠均接受6tlCoγ射线4Gy—次性全身均勻照射,照射剂量率为3.89Xl(T2Gy/kg,距离0.80m。2.4胸腺、脾脏指数测定小鼠于照射后第IOd称重处死,立即取出胸腺、脾脏,称重,计算胸腺、脾脏指数[胸腺或脾脏指数(mg/g)=胸腺或脾脏重量/小鼠体重]。2.5血清超氧化物歧化酶(SOD)活力的检测小鼠于照射后第IOd摘除眼球取血于离心管中,3000rpm离心lOmin,收集血清。血清SOD值按SOD试剂盒说明书进行测定,计算SOD活力[SOD活力(U/ml)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度+50%]。2.6血清中丙二醛(MDA)含量的测定小鼠于照射后第IOd摘除眼球取血于离心管内,3000rpm离心lOmin,收集血清。血清MDA值按MDA试剂盒说明书进行测定,计算MDA含量[MDA含量(nmol/ml)=(测定管吸光度_测定空白管吸光度)/(标准管吸光度_标准空白管吸光度)X标准溶液浓度]。2.7骨髓细胞微核分析小鼠于照射后第IOd处死,取胸骨,挤出骨髓液与小牛血清混勻,常规涂片,甲醇固定,Giemsa染液染色,蒸馏水冲洗,晾干。光学显微镜下观察1000个嗜多染红细胞(Polychromaticerythrocytes,PCE),计数微核细胞数,以千分率表示,即微核率(%。)。2.8外周血象分析小鼠于照射后第IOd摘除眼球取血,加入抗凝剂,混勻,于全自动血液细胞分析仪下测定白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)和血红蛋白含量(HGB)。2.9统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料均以i±s表示,组间差异采用t_检验,P<0.01表示有极显著性差异,P<0.05表示有显著性差异。3结果与分析3.1TgE对小鼠胸腺、脾脏指数的影响小鼠受照射后胸腺、脾脏指数均有所下降,与正常组比较具有极显著性差异(P<0.01),说明电离辐射对小鼠胸腺和脾脏有严重损伤。TgE高剂量组与模型组比较胸腺指数具有显著性差异(p<0.05),说明TgE对电离辐射所致的小鼠胸腺指数下降有升高作用;TgE低、中、高剂量组分别与模型组比较脾脏指数均具有显著性差异(P<0.05),说明TgE对电离辐射所致的小鼠脾脏指数下降有明显升高作用;此外,阳性对照药物贞芪扶正胶囊与模型组比较没有显著性差异(P>0.05),说明贞芪扶正胶囊不能提高受照小鼠的胸腺和脾脏指数。实验结果显示TgE对受照小鼠的胸腺和脾脏具有一定保护作用。各组小鼠胸腺、脾脏指数的比较(mg/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与正常组比较ΔΡ<0.01;与模型组比较*Ρ<0.053.2TgE对小鼠血清SOD活力的影响模型组与正常组相比,小鼠血清SOD值明显降低(P<0.01),说明辐射能使血清SOD值下降;阳性对照组和TgE低、中、高剂量组与模型组比较,小鼠血清SOD值明显升高(P<0.05),说明阳性药物、不同剂量的TgE均能显著提高由辐射造成的SOD值的下降,且TgE与阳性药物作用相当(P>0.05),表明TgE和阳性对照药物均有助于提高辐射损伤小鼠清除体内自由基的能力。3.3TgE对小鼠血清MDA的影响模型组与正常组相比,小鼠血清MDA值明显升高(P<0.01),说明辐射能使血清MDA值升高;阳性对照组和TgE低、中、高剂量组与模型组比较,小鼠血清MDA值明显降低(P<0.05),说明阳性药物、不同剂量的TgE均能显著降低由辐射造成的MDA值的升高,且TgE与阳性药物作用相当(P>0.05),表明TgE和阳性对照药物均有助于提高辐射损伤小鼠清除体内自由基的能力。各组小鼠血清SOD活力和MDA含量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与正常组比较ΔP<0.01;与模型组比较*P<0.053.4TgE对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核数的影响模型组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与正常组比较,具有极显著性差异(P<0.01);阳性对照组、TgE低、中和高剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与模型组比较具有显著性差异(P<0.05),表明TgE和阳性药物均有助于抑制因辐射导致的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核数的升高。各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与正常组比较ΔP<0.01;与模型组比较*P<0.053.5TgE对小鼠外周血象的影响与正常组比较,经电离辐射后的小鼠外周血液细胞中的WBC和PLT计数有极显著下降(P<0.01),RBC显著降低(P<0.05),HGB没有明显变化(P>0.05)。阳性药物、TgE中、高剂量组与正常组比较,能显著提高小鼠外周血液中的WBC计数(P<0.05),但对RBC、HGB和PLT计数没有明显改变(P>0.05)。各组小鼠外周血象的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与正常组比较ΔΡ<0.05,ΔΔΡ<0.01;与模型组比较*Ρ<0.054讨论胸腺和脾脏是参与免疫功能调节的重要器官,对辐射高度敏感。机体受辐射后会引起胸腺、脾脏指数下降,细胞凋亡增加,机体的免疫功能降低,本实验中辐照小鼠的胸腺、脾脏指数的急剧下降证实了这一点,而TgE能显著提高小鼠胸腺和脾脏指数,说明TgE有缓解电离辐射对小鼠胸腺和脾脏损伤的作用,即对放射性免疫器官损伤有一定的保护作用。电离辐射作用于机体后可以诱发体内水分子辐射产生自由基,攻击生物膜上的不饱和脂肪酸引起脂质过氧化反应,产生MDA等代谢产物,其含量可以间接反映机体细胞受自由基攻击的程度。同时机体内还存在一系列抑制和清除自由基的抗氧化酶,其中SOD是体内主要的抗氧化酶,它可以催化超氧阴离子歧化成过氧化氢,再经氧化物水解酶的作用成为水分子,从而避免超氧阴离子对身体的损害,可见机体中MDA含量和SOD活力可以反映机体受自由基攻击的损害程度及清除自由基的能力。本实验结果显示,电离辐射可明显降低小鼠血清SOD活性(P<0.01),而TgE能在一定程度拮抗辐射所致SOD活力的下降(P<0.05)。同时,与模型组比较,TgE各剂量组均能明显降低小鼠体内MDA的含量(P<0.05)。说明TgE具有抑制脂质过氧化、增强SOD活性的作用,提示TgE能够明显减轻辐射所致小鼠的氧化应激损伤。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。本实验观察到TgE组微核率明显低于模型组,这可能是由于TgE清除体内自由基而减少了辐射对DNA的损伤,从而减轻了电离辐射对机体遗传物质的损伤。造血系统对辐射高度敏感,而外周血血象可以反映机体造血系统的基本功能状态,因此保护造血系统、改进机体血液细胞计数是衡量药物对辐射损伤保护作用的重要生化指标。本研究表明,辐照小鼠的WBC,RBC,PLT均有所下降(P<0.05),其中以WBC和PLT下降最为明显(P<0.01)。TgE对RBC,HGB和PLT的影响不大(P>0.05),但能显著提高辐照小鼠的WBC(P<0.05),提示TgE对辐射小鼠血象有一定的保护作用。贞芪扶正胶囊具有补气养阴作用,用于久病虚损,气阴不足,配合手术、放射治疗、化学治疗,能促进机体正常功能的恢复。本文研究显示贞芪扶正胶囊能升高辐射小鼠的血清SOD活力,抑制血清MDA含量,降低骨髓嗜多染红细胞微核数,升高WBC计数,说明该药物具有一定的抗辐射作用,因此本文选作阳性对照药物。现有的研究成果已经证实电离辐射下机体内产生的自由基对DNA、蛋白质和细胞膜等生物大分子的损伤是辐射损伤发生的主要原因之一,因此从抗氧化、清除自由基的角度寻找有效的辐射防护剂的一个重要思路。没食子是维吾尔医学中习用的一种传统药材,富含没食子鞣质,具有较强抗氧化活性,但目前对其研究报道较少,其在辐射防护方面的报道还是空白。本文对TgE的辐射防护作用进行了初步探讨,为开发辐射防护新药、拓宽没食子药材的临床应用提供参考依据。权利要求没食子在制备用于辐射防护的药物和保健品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用,其中所述的没食子来自于壳斗科植物没食子树(QuercusinfectoriaOliv.)幼枝上的干燥虫瘿。3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于所述的没食子为没食子原生药粉。4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于所述的没食子为水和/或有机溶剂提取物。5.一种药物或保健品组合物,它是由权利要求3或4所述的没食子原生药粉或没食子的水和/或有机溶剂提取物为活性成分,加上药学或保健品行业领域可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。6.根据权利要求5所述的组合物,其特征在于所述的没食子提取物中含有没食子酸和没食子鞣质,其中没食子酸的重量百分比为0.20%,鞣质重量百分比为3099%。7.根据权利要求5所述的组合物,其特征在于所述的制剂是口服制剂或注射剂。8.一种制备权利要求5所述的组合物的方法,它包括以下步骤(1)选取干净的没食子并粉碎作为加工原料;(2)以水、低碳醇或低碳酮等较强极性溶剂中的一种或几种作为溶媒,并以没食子加工原料320倍重量提取溶媒对没食子加工原料进行溶解提取并过滤,收集透过液得滤液;(3)滤液在常压或减压条件下浓缩至一定浓度,静置备用;(4)将提取浓缩液以适量水混悬,用乙醚、氯仿、二氯苯等弱极性溶剂中的一种或几种进行萃取;(5)将萃取所得的水层部位再以乙酸乙酯、正丁醇等中等极性强度的溶剂中的一种或几种进行萃取,有机溶剂萃取液减压浓缩,备用;(6)将有机溶剂萃取浓缩液进行葡聚糖凝胶、反相硅胶、大孔吸附树脂柱色谱层析中的一种或几种进行分离,也可以将浓缩液采用超临界流体萃取、液滴逆流色谱等方法进行分离,收集富含鞣质流份,将其浓缩,得浸膏,经真空或冷冻干燥得干粉,再加上药学或保健品行业领域可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药学、保健品或化妆品领域中常用的口服制剂或注射剂。全文摘要本发明提供了维吾尔习用药材没食子用于辐射防护的新用途。具体地,是把没食子药材及其提取物,应用于预防和治疗辐射损伤的药物制剂、保健品中。实验表明,没食子能够抑制辐射对生物胸腺和脾脏的损伤,对受照生物的白细胞和红细胞计数也能显著提高,同时还具有增强机体SOD活性、抑制脂质过氧化和加速清除体内自由基的作用。文档编号A61Q19/02GK101810645SQ201010105388公开日2010年8月25日申请日期2010年2月4日优先权日2010年2月4日发明者张国庆,杨建华,热娜·卡斯木,胡君萍申请人:新疆医科大学附属肿瘤医院