专利名称：黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的一种制备方法，属于黄酮类化合物活性改性技术领域。
背景技术：
酶催化反应条件温和，有机溶剂用量少，耗能低，环境污染极小。更重要的是，酶转化反应具有高度的区域和立体选择性，极佳的产率和纯度(尤其是映体过量和ee值)。根据这些优势，在合适的条件下，酶催化技术已经广泛应用于许多食品、饮料和医药材料的エ业生产过程，特别是在药物和手性中间体的制备。但是，酶法转化很少被使用于修饰和优化天然产物的活性。黄酮类化合物广泛存在于蔬菜、水果、牧草和药用植物中，且多以糖苷形式存在，具有明显较低的毒性和抗炎抑菌、抗氧化、抗辐射、降血糖、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。过去，黄酮类化合物的研究主要集中在黄酮氧苷和苷元上，自上世纪90年代以来，由于分析仪器和分析技术快速发展，随着植物黄酮研究和开发的深入，越来越多碳苷黄酮类化合物相继被发现。在所有的碳苷黄酮中，单糖碳苷黄酮以异牡荆苷(isovitexin)(la)、牡荆苷(vitexin) (lb)、异连草苷(isoorientin) (Ic)、连草苷(orientin) (Id)最为常见，它们具有较好的药理活性，且植物来源广泛，如大麦、竹叶、短瓣金莲花、白花败酱草等，尤其是在禾本科植物的竹叶中，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷作为特征组分含量较高。碳苷黄酮拥有強力的抗炎抑菌和抗氧化的特性，有文献报告指出，用羧酸区域选择性酯化黄酮碳苷类6"羟基，会增强其抗菌与抗氧化活性。与此同吋，亦有文献提及，可以从长花铁线莲(Clematis rehderiana)中提取和纯化少量抗氧化功能高的黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物。但是，这些黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物在天然物中存在的例子是非常罕见的，并没有碳苷黄酮那 么普遍。因此，需要对黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物的制备作进ー步的研究。
发明内容
本发明的目的是提供黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的一种制备方法，以及由此制得的黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物的用途。本发明的技术解决方案是黄酮碳苷类6 "羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在干以黄酮碳苷类6"羟基提取物为底物，在微生物脂肪酶及有机溶剂存在的条件下，使其与羧酸进行酯化反应，反应温度为20°C 75°C。进ー步地，上述的黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物的制备方法，反应过程中，以薄层色谱或高效液体色谱的检测方法进行监控，直至所有的起始原料被消耗；酷化反应完成后，脂肪酶被过滤掉，酷化产物用有机溶剂洗涤并纯化。更进一歩地，上述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法中，所述黄酮碳苷类6"羟基提取物为，黄酮碳苷6"羟基异牡荆苷，或黄酮碳苷6"羟基牡荆苷，或黄酮碳苷6"羟基异荭草苷，或黄酮碳苷6"羟基荭草苷；所述羧酸为对香豆酸，或咖啡酸。更进一歩地，上述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法中，所述微生物脂肪酶为，黑曲霉，或南极念珠菌，或皱落念珠菌，或米赫毛霉，或洋葱假单胞菌，或荧光假单胞菌，或delemar根霉；尤其是B型南极念珠菌属脂肪酶，或洋葱假单胞菌的固定形式的脂肪酶。更进一歩地，上述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法中，所述酯化反应过程中的有机溶剂为甲苯、叔丁基甲基醚、こ基醚、THF、MeCN、CH2Cl2、CHCl3、己烷、1，4_ ニ氧杂环己烷、叔戊醇、ニ甲基亚砜，或其混合物，尤其是“叔戊醇/ ニ甲基亚砜”混合溶剤。再进ー步地，前述任意一项制备方法获得的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的用途，其特征在于将制得的黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物与生理相容的载体一起制成制剂组合物，用于生产功能食品、饮料、化妆品或药品。由此，本发明探索出黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的ー种新的制备方法，以来源丰富但活性较弱的黄酮碳苷类6"羟基为底物，通过酶催化反应，从而区位特异合成获得自然界罕见但活性较强的黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物，为黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物在功能食品、饮料、化妆品、医药等诸多领域的应用提供了充足的原料保障。该制备方法底物易得，制备エ艺简便，特异性高，反应条件温和，所得产物易于纯化。
具体实施例方式本发明掲示了黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的一种制备方法，该衍生物自然界罕见稀有，但比碳苷黄酮拥有更佳的抗氧化、抗辐射、抗抑制菌感染等生物活性作用，可作为功能食品、饮料、化妆品和医药中的重要成份。
具体地，本发明以来源丰富但活性较弱的黄酮碳苷类6"羟基提取物为底物，在微生物脂肪酶及有机溶剂存在的条件下，用酶催化反应的方法使其与对香豆酸、咖啡酸等羧酸进行酯化，从而区位特异合成黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物。反应过程如下式所示
: 众:ス旗於
OH O3OH O
1 -- 2
R1 = H, OHR1 = H, OH
R2 = H, OHR2= H1 OH
R3 = H, R5R3 = H, R5, R7
R4 = H1R5JL JLR4 = H1R5, R7
OHR6= ^OH hoAoH,.尸パ
OHorOH or 0H 3" 2" OH3" 2" OH
式中，も,2,3,4,5,6,7取代基已给出了具体的选择范围，对应于各种选择，可以形成一系列具体的制备方法。其中，用于本发明的羧酸(3)，随着取代基R6的不同可以有三种选择，优选对香豆酸和咖啡酸。本发明所用的“微生物脂肪酶”包括催化酶键的水解和形成的酶，是所述酶起始分离自非真核生物源，如黑曲霉，南极念珠菌，皱落念珠菌，米赫毛霉，洋葱假单胞菌，荧光假单胞菌，delemar根霉。但是，选择用于本发明的酶并不局限于从原始源中直接分离和纯化，也可以通过合成或重组的方式，或者通过其它合适的方式而制备。这些酶可以来自ー些商业源，另外，这些酶制剂还可以来自各种供应商，可以具有不同的商品名，它们作为不同微生物源的粗品，通过部分纯化、纯化或固定形式来使用。尤其是，来自B型南极念珠菌属的脂肪酶被发现非常适用于本发明，例如以产物品名NOVO SP435或N0V0ZYM 435得自 Novo Nordisk,或者，以 CHIRAZYME L-2 得自 Roche Molecular Biochemicals andBioCatalytics。此外,洋葱假单胞菌的脂肪酶,尤其其固定形式,脂肪酶PS_C(如,可作为“Amano” II脂肪酶得自Amano)，可在合成角度上像N0V0ZYM435脂肪酶ー样进行反应，尽管反应速率较慢。对于本发明的方法，微生物脂肪酶与合适的溶剂相结合，用于催化黄酮碳苷类6"羟基(I)和羧酸(3)的反应。本领域熟练技术人员容易选择合适的溶剂，如甲苯，叔丁基甲基醚(TBME)，こ基醚，THF，MeCN, CH2Cl2, CHCl3,己烷，1，4_ ニ氧杂环己烷，叔戊醇，ニ甲基亚砜或包括这些溶剂的混合物。在本发明ー个实施方案中，使用“叔戊醇/ ニ甲基亚砜”混合物。根据本发明技术方案，制备时温度控制在20°C 75°C。在一个实施方案中，本发明的酶法反应可在约20°C 约75°C，`或约25°C、27°C、30°C，40°C 约70°C，或约32°C，或约37°C 约65°C下进行；另ー实施方案中，是在约30°C 约55°C，或在室温 约45°C下进行。通常，反应在氮气保护下进行，直至所有的起始原料被消耗。反应进程可以通过各种技术，如薄层色谱(TLC)和高效液体色谱(HPLC)进行监控。当然，本领域熟练技术人员还可以使用其它监控方法。酷化反应完成后，脂肪酶被过滤掉并用合适的溶剂洗涤。洗涤溶剂可以与用于反应的溶剂相同，也可以不同于反应溶剤。如果溶剂不同，可以选用以上定义的溶剂，或者其它常用溶剤，如丙酮、こ酸こ酷、甲醇、こ醇、异丙醇、ニ甲基亚砜以及其它。合并的有机溶剂可随后在合适的条件下(如减压)被蒸发掉，残余物随后通过合适的方法处理，如，通过硅胶柱色谱洗脱，或用合适的溶剂(如己烷-丙酮，己烷-こ酸こ酷，こ基醚)重结晶而纯化。当然，还可以采用本领域熟练技术人员已知的其它方法进行纯化，纯化时也可以采用混合溶剤，混合比例由本领域熟练技术人员确定。制备得到的成品，S卩黄酮碳苷类6"羟基-酷衍生物，可以与生理相容的载体一起制成制剂组合物。该组合物具有抗氧化作用、抑菌作用、抗辐射作用等功效，在功能食品、饮料、化妆品和药品等方面具有广阔应用前景。下面结合具体实例对本发明提供的制备方法作进ー步说明，所举的实施例仅是对本发明作概括性例示，有助于更好地理解本发明，但并不会限制本发明范围。K实施例13如下式所不，将200mg、0. 46mmol的黄酮碳苷6 "轻基异牡荆苷(la), 377. 5mg、2. 38mmol的对香豆酸(3a), 200mg假丝酵母南极州脂肪酶,5ml叔戍醇/ニ甲基亚砜(4 :1,v/v)的混合物在室温下搅拌，直至所有的起始原料被消耗(通过TLC监控)。过滤反应溶液，用50mlこ酸こ酯和50ml水进行洗涤，然后分离，水相用こ酸こ酯(100ml X 2)萃取，合并有机溶剤，用无水硫酸镁干燥，滤掉和减压旋蒸得到粗品，然后以己烷和丙酮为溶剤，经硅胶纯化得到目标产品2a。
权利要求
1.黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于以黄酮碳苷类6"羟基提取物为底物，在微生物脂肪酶及有机溶剂存在的条件下，使其与羧酸进行酯化反应，反应温度为20°C 75°C。
2.根据权利要求1所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于反应过程中，以薄层色谱或高效液体色谱的检测方法进行监控，直至所有的起始原料被消耗； 酯化反应完成后，脂肪酶被过滤掉，酯化产物用有机溶剂洗涤并纯化。
3.根据权利要求1或2所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于所述黄酮碳苷类6"羟基提取物为，黄酮碳苷6"羟基异牡荆苷，或黄酮碳苷6"羟基牡荆苷，或黄酮碳苷6"羟基异荭草苷，或黄酮碳苷6"羟基荭草苷。
4.根据权利要求1或2所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于所述羧酸为对香豆酸，或咖啡酸。
5.根据权利要求1或2所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于所述微生物脂肪酶为，黑曲霉，或南极念珠菌，或皱落念珠菌，或米赫毛霉，或洋葱假单胞菌，或突光假单胞菌，或de Iemar根霉。
6.根据权利要求5所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于所述微生物脂肪酶为B型南极念珠菌属脂肪酶，或洋葱假单胞菌的固定形式的脂肪酶。
7.根据权利要求1或2所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于所述酯化反应过程中的有机溶剂为甲苯、叔丁基甲基醚、乙基醚、THF、MeCN, CH2Cl2, CHCl3、己烷、1，4_ 二氧杂环己烷、叔戊醇、二甲基亚砜，或其混合物。
8.根据权利要求7所述的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的制备方法，其特征在于所述酯化反应过程中的有机溶剂为“叔戊醇/ 二甲基亚砜”混合溶剂。
9.权利要求1-8任意一项制备方法获得的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物的用途，其特征在于将制得的黄酮碳苷类6"羟基-酯衍生物与生理相容的载体一起制成制剂组合物，用于生产功能食品、饮料、化妆品或药品。
全文摘要
本发明提供了黄酮碳苷类6″羟基-酯衍生物的一种制备方法，以来源丰富但活性较弱的黄酮碳苷类6″羟基提取物为底物，在微生物脂肪酶及有机溶剂存在的条件下，使其与羧酸进行酯化反应，从而区位特异合成获得自然界罕见但活性较强的黄酮碳苷类6″羟基-酯衍生物。反应过程中，以薄层色谱或高效液体色谱的检测方法进行监控，直至所有的起始原料被消耗，反应完成后，脂肪酶被过滤掉，酯化产物用有机溶剂洗涤并纯化。该方法底物易得，制备工艺简便，特异性高，反应条件温和，所得产物易于纯化，为黄酮碳苷类6″羟基-酯衍生物在功能食品、饮料、化妆品、医药等诸多领域的应用提供了充足的原料保障。
文档编号A61Q17/04GK103045674SQ20121052367
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者禇慧林 申请人:禇慧林