专利名称：一种表皮干细胞活性成分及含有该活性成分的美容制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表皮干细胞活性成分，该表皮干细胞活性成分的获取方法，以及该表皮干细胞活性成分在美容方面的应用。
背景技术：
干细胞(Stem Cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是形成人体各种组织、器官的“祖宗细胞”、“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据分化潜能大小又可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞可以产生和分 泌大量的生物活性因子，这些干细胞生物活性因子可有效调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老细胞。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些细胞因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。皮肤是构成人体器官的最大器官,约占身体体积的16%,面积1.8m2,厚度2 4mm,重量约3kg，由表皮、真皮及皮下脂肪层构成。皮肤与外部环境直接接触，起到使人体免受包括有害微生物在内的多种有害因子和紫外线等外部刺激影响，有重要的保护膜作用，并且是对全身代谢所需的生化功能的维持必不可少的器官。表皮干细胞(Keratinocyte stem cells, KSC)存在于皮肤最外侧的基底层中，表现出再生能力。表皮干细胞持续分裂大体上生成两种细胞，其中之一是进行自我复制而制造的一模一样的干细胞，另一个是过渡放大细胞。过渡放大细胞进一步扩增并进行初期分化而成为角质形成细胞，继续进行分化而被挤到皮肤表面上。在此过程中，角质形成细胞引起分化和角化而形成角质层，并在3 4周后从角质层中脱落。利用干细胞分泌产生的生物活性因子激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种表皮干细胞活性成分，以及该表皮干细胞活性成分的获取方法。提供一种含有该活性成分的美容制剂，是本发明的另一发明目的。一种表皮干细胞活性成分，所述活性成分由表皮干细胞分泌，存在于培养表皮干细胞所产生的上清中，并以β-Γ的形式表达β-ι。上述表皮干细胞活性成分的获取方法是:将表皮组织以PBS清洗，剪成ImmXlmmX Imm大小，按照组织与酶液的体积比为1: 3，加入溶解在含有双抗的DMEM中的浓度2.5mg/ml的dispase II酶液中，将酶液置于4°C冰箱过夜；用200目过滤网过滤细胞，收集滤液，用等量的含10wt%FBS的DMEM中和酶的活性；剩余组织块以0.25wt%胰酶/EDTA在37°C消化，用200目过滤网过滤细胞，收集滤液；合并两次滤液，应用磁珠标记的抗β_1抗体，即⑶29抗体，以磁珠筛选法筛选出β -1+细胞。
用流式细胞仪技术鉴定筛选后β-r表皮干细胞的纯度，结果显示，提取的β-Γ表皮干细胞纯度可以达到99.9%。
本发明同时也提供了上述获得的表皮干细胞活性成分的培养方法，包括: 1)、将分选出的表皮干细胞接种于生长有ΝΙΗ3Τ3细胞的培养瓶上，加入5ml表皮干细胞专用培养基，在湿度彡95%，温度37°C，CO2体积浓度5%环境下培养，隔2天换液； 2)、待细胞80%融合后，先用0.02wt%EDTA去除NIH3T3细胞，再以0.25wt%胰酶和0.02wt%EDTA消化传代，将传代产生的细胞移入新的培养瓶中； 3)、重复以上培养、扩增过程，培养过程中可根据需要调整最佳的细胞数量。
其中，所述的表皮干细胞专用培养基是由DMEM:HAM F_12=3:1的体积比混合，并含有 10wt%FBS 20ng/ml、EGF 5ug/ml、转铁蛋白 1.8X l(T4mol/l、腺嘌呤 1.8X 1(T4 mol/1、胰岛素5ug/ml和氢化可的松0.4ug/ml, pH = 7.0 7.4。
收集上述在培养的表皮干细胞上清，1000r/min离心5min，弃去悬浮细胞，将上清移入50ml离心管中，使用大容量低温高 速机，9000r/min离心15min，弃去50ml离心管中的液体，用Iml PBS液重悬离心管底的沉淀物，即表皮干细胞上清中的表皮干细胞活性成分，将收集到的含有表皮干细胞活性成分的PBS移入1.5ml EP管中，置于_20°C保存。
本发明通过体外培养、扩增，维持表皮干细胞的高增殖能力和稳定性状，并在表皮干细胞拥有高增殖能力和稳定性状的时期里收集表皮干细胞上清，低速离心弃去细胞，通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，获得了高纯度的表皮干细胞活性成分。
本发明获得的表皮干细胞活性成分富含干细胞因子群、多肽、天然免疫蛋白和核酸等，可促进机体干细胞增殖、分化、活化，具有提高机体免疫力和抗衰老作用。
本发明可以利用上述表皮干细胞活性成分进一步制成针剂、涂剂、膏剂、霜剂或粉剂等美容制剂，应用表皮干细胞的活性因子修复人体皮肤损伤，对各种损伤皆有一定的疗效，在医学、保健和美容领域有极佳的应用前景，同时也避免了直接应用干细胞可能导致的致癌问题。
本发明进一步提供了一种应用上述表皮干细胞活性成分制备的霜剂化妆品，所述霜剂化妆品由以下重量份数的组分为原料:羊毛醇3 5、白蜂蜡I 3、鲸蜡5 10、硼砂0.3 0.5、去离子水20 50、表皮干细胞活性成分10 15、DMDM/F12培养基20 55、成纤维细胞生长因子0.02 0.08、表皮细胞生长因子0.05 0.08、S0D3 5，按照霜类化妆品常规生产方法制备得到。
本发明制备得到的霜剂化妆品具有以下积极效果:1、对皮肤细胞有良好的促进作用，可以加快细胞新陈代谢，具有除皱美白祛斑祛疤功效，并能够保持皮肤弹性，恢复皮肤自然活力；2、在祛痘方面产生效果十分迅速，与其他祛痘产品相比优势明显；3、避免了直接使用干细胞可能造成的癌变危险；4、表皮干细胞传代次数较其他干细胞多，在合适的培养基中生长较多，有利于细胞扩增。
图1是本发明中所描述的表皮干细胞使用流式细胞仪鉴定后得到的分析结果图。图2是本发明中所描述的表皮干细胞培养生长状态照片。图3是应用本发明化妆品涂抹软化角质的前后效果对比照片。图4是应用本发明化妆品涂抹修复陈旧性疤痕前后效果对比照片。图5是应用本发明化妆品涂抹祛痘前后效果对比照片。图6是应用本发明化妆品祛老年斑美白前后效果对比照片。图7是应用本发明化妆品祛斑前后效果对比照片。
具体实施方式
·以下通过具体实施例对本发明进行进一步的举例描述，但下述实施例并不构成对本发明的任何限制。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变，都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1:表皮干细胞的分离
1.将表皮组织以PBS清洗干净，放入5ml Ep管中，用眼科剪剪成ImmX ImmX Imm大小，加入3 4ml dispase II酶液中，此酶液中含有2.5mg/ml dispase II并在含有双抗的DMEM中溶解。将上述酶液与细胞的混合液放置于4°C过夜。2.次日，用200目过滤网过滤细胞到圆底聚苯乙烯管内，收集滤液，用等量的含10%FBS的DMEM中和酶的活性。剩余组织块用0.25%胰酶/EDTA 37°C消化lOmin。用200目过滤网过滤细胞到圆底聚苯乙烯管内，合并两次滤液，细胞计数。3.从上述细胞中，应用磁珠标记的抗β-1抗体(⑶29) (SIGMA公司)，以磁珠筛选法筛选出β-r细胞。具体步骤为将收集到的细胞用计数板计数，将细胞数控制在IO7 IO8之间，然后按照分选试剂盒说明书操作。4.用流式细胞仪技术鉴定筛选后β-Γ表皮干细胞的纯度，结果显示，提取的β-Γ表皮干细胞纯度可以达到99.9% (结果见图1)。实施例2:表皮干细胞的培养
1.将分选后的细胞接种于生长有ΝΙΗ3Τ3细胞的25mm培养瓶上，加专用培养基:DMEM:HAM F_12=3:1 混合，另含 10%FBS 20ng/ml、EGF5ug/ml、转铁蛋白 1.8X l(T4mol/l、腺嘌呤、5ug/ml胰岛素和0.4ug/ml氢化可的松,pH = 7.0 7.4。隔2天换液,培养环境保持在湿度彡95%，温度37°C，C02浓度5%。2.待细胞80%融合后可传代，先用0.02%EDTA去除NIH3T3细胞，再用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化传代。3.多次重复此培养、扩增过程可获得大量表皮干细胞(细胞生长状况见图2)。实施例3:表皮干细胞活性物质的获取
1.收集表皮干细胞上清，1000r/min离心5min弃去悬浮细胞。2.将收集到得上清移入50ml离心管中，使用低温高速机控制温度，离心收集表皮干细胞上清中的表皮干细胞活性物质，离心速度9 000 r/min,离心时间15 min。3.弃去离心后50ml离心管中的液体，用ImlPBS液重悬离心管底部的沉淀物，将含有表皮干细胞活性物质的PBS移入1.5mlEP管中并在_20°C保存。
实施例4:霜类化妆品的制备 称取羊毛醇4g，白蜂蜡2g，鲸蜡8.5g，硼砂0.5g，去离子水30ml，表皮干细胞活性物15g，DMDM/F12培养基35g、成纤维细胞生长因子0.08g、表皮细胞生长因子0.08g、S0D5g，按照霜类化妆品的常规生产方法制备成美容制剂。
应用例1:美容制剂的角质软化试验 用实施例3-4制备的美容制剂进行角质软化试验，同时观察其对皮肤的刺激性、过敏性及不良反应。
涂抹本发明制剂时，受试者应先用温水冲洗患部，用擦手纸吸干水分，在温度22± I°C，相对湿度55±5%的恒温恒湿条件下保持患部不与其他部位接触15min。每日早晚各2次，每3日对产品效果进行一次评价，综合评分分为三个等级，分别为效果不明显(0-3分)，效果一般(4-6分)，效果显著(7-10分)。半个月后对总体效果进行分数评价。
使用本发明制剂后效果见图3。从图3可以看出，使用添加表皮干细胞活性物质化妆品前后皮肤变化显著，使用后角质软化十分明显，角质硬化区域明显减少，效果为7分，未发现本制剂对皮肤有刺激性。
应用例2:美容制剂的褪疤试验 用实施例3-4制备的美容制剂进行陈旧疤痕的美白褪疤试验，同时观察其对皮肤的刺激性、过敏性及不良反应。
涂抹本发明制剂时，受试者应先用温水冲洗患部，用擦手纸吸干水分，在温度22± I°C，相对湿度55±5%的恒温恒湿条件下保持患部不与其他部位接触15min。每日早晚各2次，每3日对产品效果进行一次评价，综合评分分为三个等级，分别为效果不明显(0-3分)，效果一般(4-6分)，效果显著(7-10分)。半个月后对总体效果进行分数评价。
使用本发明制剂后效果见图4。从图4可以看出，使用添加表皮干细胞活性物质化妆品前后皮肤变化显著，使用后疤痕颜色变淡，疤痕区域缩小，效果为6分。未发现本制剂对皮肤有刺激性。
应用例3:美容制剂的祛痘试验 用实施例3-4制备的美容制剂进行祛痘试验，同时观察其对皮肤的刺激性、过敏性及不良反应。
涂抹本发明制 剂时，受试者应先用温水冲洗患部，用擦手纸吸干水分，在温度22± I°C，相对湿度55±5%的恒温恒湿条件下保持患部不与其他部位接触15min。每日早晚各2次，每3日对产品效果进行一次评价，综合评分分为三个等级，分别为效果不明显(0-3分)，效果一般(4-6分)，效果显著(7-10分)。半个月后对总体效果进行分数评价。
使用本发明制剂后效果见图5。从图5可以看出，使用添加表皮干细胞活性物质化妆品前后皮肤变化显著，使用后原来的青春痘明显缩小，并最终消失，效果为9分。未发现本制剂对皮肤有刺激性。
应用例4:美容制剂的祛除老年斑试验 用实施例3-4制备的美容制剂进行祛除老年斑试验，同时观察其对皮肤的刺激性、过敏性及不良反应。
涂抹本发明制剂时，受试者应先用温水冲洗患部，用擦手纸吸干水分，在温度22± I°C，相对湿度55±5%的恒温恒湿条件下保持患部不与其他部位接触15min。每日早晚各2次，每3日对产品效果进行一次评价，综合评分分为三个等级，分别为效果不明显(0-3分)，效果一般(4-6分)，效果显著(7-10分)。半个月后对总体效果进行分数评价。使用本发明制剂后效果见图6。从图6可以看出，使用添加表皮干细胞活性物质化妆品前后皮肤变化显著，使用后老年斑明显范围缩小，颜色变淡，效果为9分。未发现本制剂对皮肤有刺激性。应用例5:美容制剂的祛雀斑试验
用实施例3-4制备的美容制剂进行祛雀斑试验，同时观察其对皮肤的刺激性、过敏性及不良反应。涂抹本发明制剂时，受试者应先用温水冲洗患部，用擦手纸吸干水分，在温度22± I°C，相对湿度55±5%的恒温恒湿条件下保持患部不与其他部位接触15min。每日早晚各2次，每3日对产品效果进行一次评价，综合评分分为三个等级，分别为效果不明显(0-3分)，效果一般(4-6分)，效果显著(7-10分)。半个月后对总体效果进行分数评价。
使用本发明制剂后效果见图7。从图7可以看出，使用添加表皮干细胞活性物质化妆品前后皮肤变化显著，使用后原来的雀斑明显缩小，并最终消失，效果为9分。未发现本复合制剂对皮肤有刺激性。
权利要求
1.一种表皮干细胞活性成分，所述活性成分由表皮干细胞分泌，存在于培养表皮干细胞所产生的上清中，并以β-Γ的形式表达β-ι。
2.权利要求1表皮干细胞活性成分的获取方法，是将表皮组织以PBS清洗，剪成ImmXlmmX Imm大小，按照组织与酶液的体积比为1: 3，加入溶解在含有双抗的DMEM中的浓度2.5mg/ml的dispase II酶液中，将酶液置于4°C冰箱过夜；用200目过滤网过滤细胞，收集滤液，用等量的含10wt%FBS的DMEM中和酶的活性；剩余组织块以0.25wt%胰酶/EDTA在37°C消化，用200目过滤网过滤细胞，收集滤液；合并两次滤液，应用磁珠标记的抗β_1抗体，即⑶29抗体，以磁珠筛选法筛选出β -1+细胞。
3.权利要求2获得的表皮干细胞活性成分的培养方法，包括: 1)、将分选出的表皮干细胞接种于生长有ΝΙΗ3Τ3细胞的培养瓶上，加入5ml表皮干细胞专用培养基，在湿度≥95%，温度37°C，CO2体积浓度5%环境下培养，隔2天换液； 2)、待细胞8 0%融合后，先用0.02wt%EDTA去除NIH3T3细胞，再以0.25wt%胰酶和0.02wt%EDTA消化传代，将传代产生的细胞移入新的培养瓶中； 3)、重复以上培养、扩增过程，培养过程中可根据需要调整最佳的细胞数量； 其中，所述的表皮干细胞专用培养基是由DMEM:HAM F_12=3:l的体积比混合，并含有10wt%FBS 20ng/ml、EGF 5ug/ml、转铁蛋白 1.8X l(T4mol/l、腺嘌呤 1.8Χ 1(T4 mol/1、胰岛素5ug/ml 和氢化可的松 0.4ug/ml, pH = 7.0 7.4。
4.一种包含有权利要求1表皮干细胞活性成分的的霜剂化妆品，由以下重量份数的组分为原料制备得到:羊毛醇3 5、白蜂腊I 3、鲸腊5 10、硼砂0.3 0.5、去离子水20 50、表皮干细胞活性成分10 15、DMDM/F12培养基20 55、成纤维细胞生长因子0.02 0.08、表皮细胞生 长因子0.05 0.08、S0D3 5。
全文摘要
本发明公开了一种表皮干细胞活性成分及含有该活性成分的美容制剂，所述活性成分由表皮干细胞分泌，存在于培养表皮干细胞所产生的上清中，并以β-1+的形式表达β-1。利用本发明表皮干细胞活性成分开发成具有细胞生物学活性功能的美容制剂，作用于人体后，可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。
文档编号A61Q19/02GK103142447SQ201310084648
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者解军, 李仁科, 刘志贞, 王登高, 王哲, 刘丹, 郝宇卉, 牛勃, 杨丽红, 刁海鹏 申请人:山西医科大学