一株紫玉盘内生真菌节菱孢及其用途
【专利摘要】本发明公开了一株紫玉盘内生真菌节菱孢及其用途。该节菱孢(Arthrinium?sp.)A092于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCCNO:?M?2014348。该节菱孢提取物具有明显的清除DPPH自由基的活性，清除能力与维生素C相当，能用于制备DPPH自由基清除剂，因此，节菱孢A092提取物在制备抗氧化药品、保健品及护肤品中具有广阔的应用开发前景。
【专利说明】一株紫玉盘内生真菌节菱孢及其用途
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物和医药【技术领域】，具体涉及一株紫玉盘内生真菌节菱孢 (Arthrinium sp.)A092 及其用途。
【背景技术】：
[0002] 自由基和人类多种疾病有着密切的关系，如果体内自由基过多，则可引起蛋白质、 核酸（DNA)变性，导致细胞和组织器官损伤，诱发各种疾病，加速机体衰老。同时，自由基过 量产生也是导致皮肤自然衰老和光致老化的主要原因，减少自由基的产生和清除老化代谢 产物已成为目前延缓人体和皮肤衰老的有效方法。由于在药品、保健食品和护肤品中使用 的合成抗氧化剂通常具有毒副作用，因此，寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂成为了一种必 然趋势。
[0003] 植物内生真菌（Endophytic fungi)是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活 于健康植物的各种组织和器官内部的真菌。植物内生真菌作为一种新的微生物资源引起了 广泛关注，已从中分离出多种生物活性物质，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然化合物，其中 不少是新物质，具有特殊生物活性，在医药、保健品和护肤品等各个领域都展现出良好的应 用前景，而且植物内生真菌是一类可持续利用的资源，对自然资源破坏极少，能够解决自然 资源不足的问题。
[0004] 在文献 "Bloor S. Arthrinic acid, a novel antifungal polyhydroxyacid from Arthrinium phaeospermum[J]. The Journal of Antibiotics, 2008, 61 (8)，515-517.，'中， 作者报道了节菱孢属真菌能产生结构新颖的抗真菌代谢产物；在"专利CN101294137B" 中，章初龙等从水寥Polygonum hydropiper L.中分离得到的一株节菱孢Arthrinium sp.，并从该菌株的代谢产物中获得的2, 3β-羟基卷线孢菌素对芽孢杆菌（Bacillus sp.)具有抑制作用，最低抑制浓度为50yg/mL;在文献"Jung HJ, Shim JS, Song YM，et al. Terpestacin inhibits tumor angiogenesis by targeting UQCRB of mitochondrial complex III and suppressing hypoxia-induced reactive oxygen species production and cellular oxygen sensing[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(15):11 584-11595. "）中，作者则报道了此属真菌的代谢产物具有细胞毒活性。但到目前为止尚未 有关于节菱孢属（Arthrinium)代谢产物具有抗氧化活性的报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的第一个目的是提供一株节菱孢（Arthrinium sp. )A092,其于2014年7 月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为： CCTCC NO: M2014348。
[0006] 本发明的节菱孢A092是从药用植物紫玉盘叶中分离得到，其分离方法为：取新鲜 健康的紫玉盘叶，用自来水冲洗干净，置于滤纸上自然风干后放入〇. 1 %的升汞溶液中浸泡 5?7min，用无菌水漂洗4次，再放入75%的乙醇中浸泡3?5min，用无菌水漂洗3次。剪 去接触药液边缘，将叶片剪成约0. 5X0. 5cm大小，置于含20 μ g/mL硫酸卡那霉素和20 μ g/ mL氨苄青霉素的PDA培养基中，28°C恒温箱培养3?7d后挑取边缘菌丝转接到新鲜培养 基上，继续纯化获得纯菌株节菱孢A092。所述的PDA培养基是每升通过以下方法获得：用 500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH 2P043g、MgS040. 75g、维 生素 BdOmg，琼脂20g，用水补足至1L，pH自然。
[0007] 本发明的节菱孢A092,其在PDA培养基上的生长温度为28°C，气生菌丝发达，初 为白色，棉絮状；培养3天后，菌落直径为60mm，边缘轮廓清晰，背面中间浅灰褐色；培养7 天后，菌丝长满整个平板，正面灰白色，背面中间灰绿褐色。菌丝有隔，产孢细胞圆柱形或瓶 形，8. 16?23. 33X0. 84?3. 34 μ m ;分生孢子球形、近球形、椭圆形，未成熟的分生孢子无 色，成熟后变为褐色至深褐色，中间有一条淡色条带，4. 83?8. 16 X 2. 23?6. 67 μ m。
[0008] 根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区， 其ITS区的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度 最高的序列（登录号为：AY425967)为节菱孢（Arthrinium sp.)，相似度达99. 1%。根据 ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为（Arthrinium sp··)，命名为节菱孢（Arthrinium sp.) A092。
[0009] 本发明的第二个目的是提供上述节菱孢A092在制备DPPH自由基清除剂中的应 用。
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种具有DPPH自由基清除活性的节菱孢A092提取 物，其是以节菱孢A092为菌株，通过液体发酵培养获得发酵液，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃 取液浓缩后获得节菱孢A092提取物。
[0011] 本发明的第四个目的是提供一种DPPH自由基清除剂，其特征在于，其是以上述节 菱孢A092提取物作为活性成分。
[0012] 本发明的节菱孢A092提取物，通过实验发现，该提取物在500 μ g/mL浓度下对 DPPH自由基的清除率为95. 31 %，同样浓度下，阳性对照药物维生素 C对DPPH自由基的清 除率为99. 12%。由实验结果可以看出：节菱孢A092提取物具有明显的清除DPPH自由基 活性，清除DPPH自由基的能力与维生素 C相当，能用于制备DPPH自由基清除剂，因此，节菱 孢A092提取物在制备抗氧化药品、保健品及护肤品中具有广阔的应用前景。
[0013] 节菱孢（Arthrinium sp. )A092于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保藏 中心（CCTC C)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO: Μ 2014348。
【专利附图】
【附图说明】：
[0014] 图1为本发明的节菱孢Α092菌株在PDA培养基中的菌落特征图，其中A、B、C分别 为培养3天背面图、培养7天背面图、培养7天正面图。
[0015] 图2为本发明的节菱孢A092菌株的产孢细胞和分生孢子图。
【具体实施方式】：
[0016] 以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。
[0017] 实施例1 :节菱孢A092的分离培养：
[0018] 节菱孢A092是从采自广东肇庆市鼎湖山自然保护区的药用植物紫玉盘的叶中 分离得到，其分离方法为：取新鲜健康的紫玉盘叶，用自来水冲洗干净，置于滤纸上自然风 干后放入0. 1 %的升萊溶液中浸泡5?7min,用无菌水漂洗4次,再放入75 %的乙醇中浸 泡3?5min，用无菌水漂洗3次。剪去接触药液边缘后，剪成约0. 5X0. 5cm大小，置于含 20 μ g/mL硫酸卡那霉素和20 μ g/mL氨苄青霉素的PDA培养基中，28 °C恒温箱培养3?7d 后挑取边缘菌丝转接到新鲜培养基上，继续纯化获得纯菌株节菱孢A092。所述的PDA培养 基是每升通过以下方法获得：用500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄 糖20 8、腿2?0438、1%3040.75 8、维生素811011^，琼脂2(^，用水补足至比，？!1自然。
[0019] 本发明的节菱孢A092形态特征如下：
[0020] 如图1和图2所示，该菌株在PDA培养基上的生长温度为28°C，气生菌丝发达，初 为白色，棉絮状；培养3天后，菌落直径为60mm，边缘轮廓清晰，背面中间浅灰褐色；培养7 天后，菌丝长满整个平板，正面灰白色，背面中间灰绿褐色。菌丝有隔，产孢细胞圆柱形或瓶 形，8. 16?23. 33X0. 84?3. 34 μ m ;分生孢子球形、近球形、椭圆形，未成熟的分生孢子无 色，成熟后变为褐色至深褐色，中间有一条淡色条带，4. 83?8. 16 X 2. 23?6. 67 μ m。
[0021] 根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区， 其ITS区的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度 最高的序列（登录号为：AY425967)为节菱孢（Arthrinium sp.)，相似度达99. 1%。根据 ITS序列分析结果，该菌株被鉴定为（Arthrinium sp·)，命名为节菱孢（Arthrinium sp.) A092。
[0022] 该节菱孢（Arthrinium sp. )A092于2014年7月21日保藏于中国典型培养物保 藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO: Μ 2014348。
[0023] 实施例2 :节菱孢Α092提取物的制备
[0024] 将节菱孢Α092在PDA培养基上28 °C活化培养5d后接种到马铃薯液体培养基 (TOB)中，120r/min，28°C培养7d，收集去除菌丝体后的滤液，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃 取液经减压浓缩即为节菱孢A092提取物。所述的PDB培养基是每升通过以下方法获得：用 500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH 2P043g、MgS040. 75g、维 生素 BdOmg，用水补足至lL，pH自然。灭菌备用。
[0025] 实施例3 :节菱孢A092清除DPPH自由基能力的测定
[0026] 将实施例2获得的节菱孢A092提取物和维生素 C用无水乙醇分别配成500 μ g/ mL溶液，DPPH用无水乙醇配成0. 2mm〇L/L溶液。吸取100 μ L节菱孢A092提取物溶液于 96孔板中，加入100 μ L DPPH溶液作为样品组，以无水乙醇作为空白对照组，以无水乙醇代 替DPPH溶液作为样品背景组，以无水乙醇代替节菱孢Α092提取物溶液作为阴性对照组， 以维生素 C代替节菱孢Α092提取物溶液作为阳性对照组，置30°C培养箱中反应30min，用 酶标仪测定每孔517nm处吸光值（A)，按以下公式计算DPPH自由基的清除率％ :
[0027] 清除率％= [1-(A样品-A样品背景）/(A阴性对照-A空白对照）]X 100%
[0028] 实验结果为：在相同浓度条件下，节菱孢A092提取物对DPPH自由基清除率为 95. 31 %，维生素 C对DPPH自由基清除率为99. 12%。从实验结果可以看出，节菱孢A092提 取物具有明显的清除DPPH自由基的能力，其清除能力与维生素 C相当，能用于制备DPPH自 由基清除剂，因此，节菱孢A092提取物在制备抗氧化药品、保健品及护肤品中具有广阔的 应用开发前景。
【权利要求】
1. 节菱孢（Arthrinium sp.)A092,其保藏号为：CCTCC NO:M 2014348。
2. 权利要求1所述的节菱孢A092在制备DPPH自由基清除剂中的应用。
3. -种具有DPPH自由基清除活性的节菱孢A092提取物，其特征在于，其是以权利要求 1所述的节菱孢A092为菌株，通过液体发酵培养获得发酵液，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取 液浓缩后获得节菱孢A092提取物。
4. 一种DPPH自由基清除剂，其特征在于，其是以权利要求3所述的节菱孢A092提取物 作为活性成分。
【文档编号】A61Q19/08GK104195053SQ201410428171
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】李浩华, 章卫民, 陈玉婵, 李赛妮, 谭国慧 申请人:广东省微生物研究所