专利名称：胰岛素及胰岛素类似物的基因工程制备新方法
技术领域：
本发明涉及生物工程学领域。更具体地，本发明涉及新的胰岛素及胰岛素类似物的基因工程制备方法。
背景技术：
胰岛素从20世纪20年代用于治疗糖尿病，现在仍是无法替代的糖尿病特效药。现在全球糖尿病患者超过1.2亿，预计到2025年为3亿，其中10％为I型糖尿病。每个I型糖尿病病人每天需用胰岛素1.4-2.1毫克，II型糖尿病患者对胰岛素也有相当大的需求，发达国家每年要消耗胰岛素4600公斤。另外，一些新的给药方法能够提高病人用药的依从性，但是生物利用度低，同注射给药相比，需要更多的胰岛素。故而在预防控制糖尿病的同时，研发低成本大规模制备胰岛素的方法势在必行。
制备胰岛素的难点在于在两条链间形成正确配对的二硫键，胰岛素的A、B链含有折叠的全部信息，C-肽并非是必需的，C-肽的连接使得A、B链的折叠变得容易，作为分子内伴侣，如带负电氨基酸可以防止胰岛素的疏水聚集，也能促进折叠。但C-肽含有的Pro的异构化作用使得折叠速度减慢。[Chen，L.M.，Yang，X.W.and Tang，J.G.(2002).Acidic residues on the N-terminus of proinsulinC-Peptide are important for the folding of insulin precursorJ Biochem(Tokyo)131(6)855-9；Qiao，Z，Feng，Y.(2003)In vitro refolding of humanproinsulinkinetic intermediates，putative disulfide-forming pathway，foldinginitiation site and potential role of C-peptide in folding process.J.Biol.Chem.]。现在临床上所用的人胰岛素主要为大肠杆菌系统和酵母系统所表达。
大肠杆菌表达胰岛素是由Genetech公司和Eli Lilly公司于1982年合作完成。在大肠杆菌的胞内胰岛(原)容易快速降解，现在多用融合蛋白使其形成包涵体，也有人试图用大肠杆菌分泌胰岛素原。
在大肠杆菌中表达胰岛素有两种常用方案第一，分别表达融合蛋白-A链、融合蛋白-B链，包涵体溶解后经溴化氰裂解、磺酸化，磺酸化的A、B链用离子交换或反相柱纯化后折叠成胰岛素。这种方法不需要使用价格较为昂贵的酶如羧肽酶B[Schmidt，M.，Babu，K.R.，Khanna，N.，Marten，S.and Rinas，U.(1999).Temperature-induced production of recombinant human insulin in high-celldensity cultures of recombinant Escherichia coliJ Biotechnol68(1)71-83.]。第二，表达融合蛋白-B链-C肽-A链，包涵体溶解后直接磺酸化后折叠成前胰岛素原，经过亲和纯化后，前胰岛素原中的碱性或双碱性氨基酸位点经胰蛋白酶和羧肽酶B处理后形成胰岛素和C肽。这种方法能够同时得到胰岛素和C肽。[Jonasson，P.，Nilsson，J.，Samuelsson，E.，Moks，T.，Stahl，S.and Uhlen，M.(1996).Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptideEur J Biochem236(2)656-61；Nilsson，J.，Jonasson，P.，Samuelsson，E.，Stahl，S.and Uhlen，M.(1996).Integrated production of human insulin and its C-peptideJBiotechnol48(3)241-50]。
就在Eli Lilly公司致力于生物合成胰岛素的同时，Novo公司用酶促转肽的方法从猪胰岛素生产人胰岛素[Markussen，J.(1987).Human insulin by tryptictranspeptidation of porcine insulin and biosynthetic precursors]。到1986年，胰岛素在酵母中分泌表达成功[Thim，L.，Hansen，M.T.，Norris，K.，Hoegh，I.，Boel，E.，Forstrom，J.，Ammerer，G.and Fiil，N.P.(1986).Secretion and processing of insulinprecursors in yeastProc Natl Acad Sci U S A83(18)6766-70.]，使得二硫键的配对不再是表达胰岛素的难题。在该系统中，胰岛素原以类似于aMF的方式分泌。但至今人们还无法使用酵母表达系统有效地分泌天然的胰岛素原[Kjeldsen，T.(2000).Yeast secretory expression of insulin precursors，Appl Microbiol Biotechnol54(3)277-86]。
现在通常所用的表达策略是表达以下结构的多肽前原肽(PreProPeptide)-desB30B链-miniC肽-A链，其中的前原肽[Kjeldsen，(同上)2000]、miniC肽[Kjeldsen，T.，Ludvigsen，S.，Diers，I.，Balschmidt，P.，Sorensen，A.R.andKaarsholm，N.C.(2002).Engineering-enhanced protein secretory expression inyeast with application to insulin J Biol Chem 277(21)18245-8]的结构对胰岛素的表达量都有影响，摇瓶表达量通常为数毫克/升。此外，虽然酶促转肽后可得到胰岛素，但在工业生产中酶促转肽严重制约产品的得率。
此外，在CN 89108320、89109575.6、90101415.X、90101564.4、92105143.3、92105888.8、92110456.1、93103997.5、93112839、95115064.2、94193852.2、01110268.3、01140047.1、02136107.X等众多专利申请或专利中，公开了大量的胰岛素衍生物或类似物以及相应的制法。然而，这些制法主要分为直接化学合成法和基因重组法。化学合成法成本高，而基因重组法存在着表达量低、二硫键错配、终产物制法复杂等缺点。
因此，本领域迫切需要开发表达量高、制法简便的且适合大规模生产的胰岛素制备方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种表达量高、制法简便的且适合大规模生产的胰岛素制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种胰岛素前体，所述前体从氨基端至羧基端分别含有以下元件(a)具有式(Xaa)mZ所示的间隔肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，m为2-10的正整数，Z为Arg或Lys；(b)胰岛素B链元件；(c)具有式(Xaa)nZ′所示的连接肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，n为2-10的正整数，Z′为Arg或Lys；(d)胰岛素A链元件。
在另一优选例中，所述的胰岛素B链元件具有下式X1V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R X23X24X25X26Y27其中，X1为Phe、Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y27是Lys，或Arg。
在另一优选例中，X23X24X25X26Y27是GFFYK。
在另一优选例中，所述的间隔肽元件的序列为EAEA(Xaa)2-4K，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，且所述的连接肽元件的序列是(Ala)2-5Lys。
在另一优选例中，间隔肽元件的序列为EAEAYVEFK。
在另一优选例中，在间隔肽的上游还具有α-结合因子序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA，它编码本发明上述的胰岛素前体。还提供了含有所述DNA的表达载体，以及含有表达载体或所述DNA的宿主细胞。较佳地，所述的宿主细胞是酵母细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种制备胰岛素的方法，包括步骤(a)用胰蛋白酶酶切本发明所述的胰岛素前体，从而形成胰岛素；(b)分离出胰岛素。
在另一优选例中，步骤(a)的条件是0-37℃，pH4-9，更佳地步骤(a)的条件是5±4mg/ml胰岛素前体，pH7.5±2，胰蛋白酶∶胰岛素前体的重量比为＝1∶200±150，30±10℃。
在另一优选例中，所述的胰岛素前体是重组表达的，更佳地，所述胰岛素前体是用酵母细胞(如毕赤酵母)中表达的。
图1A、1B、1C分别显示了三种化学合成的单体胰岛素前体(MIP)(即B27K-DtrI、B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DTrI)的基因序列及其对应的氨基酸序列图。
图2显示了pPIC9K/MIP质粒示意图。
图3显示了摇床实验初步优化发酵的最佳pH值。
图4显示了细胞生长随发酵变化情况。
图5显示了pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳测定MIP表达量，胶浓度为15％，考马斯亮兰染色。从泳道1-5分别为PIP(2μg)；24，48，72，84小时发酵液，上样体积为20μL。
图6显示了阳离子交换柱SP-fast flow纯化胰岛素类似物前体MIP，起始流动相为50mM NaAc-HCl pH4.0缓冲液，上样后用5Vc起始缓冲液洗去不吸附杂质，在15Vc内流动相中NaCl浓度从0线性增至1mol/L，280nm检测。
图7显示了SP-fast flow离子交换柱纯化胰岛素类似物B27K-DTrI，起始流动相为50mM NaAc-HCl pH4.0缓冲液，上样后用5Vc起始缓冲液洗去不吸附杂质，在20Vc内流动相中NaCl浓度从0线性增至1mol/L，280nm检测。
图8显示了pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳胰岛素类似物纯度，胶浓度为15％，考马斯亮兰染色。泳道1-6分别为标准品(从上到下为PIP、胰岛素、DOI)；XAD-7纯化的MIP；SP-fast flow离子交换柱纯化的MIP；MIP经TPCK胰蛋白酶处理30分钟；MIP经TPCK胰蛋白酶处理60分钟；SP-fast flow离子交换柱纯化的B27K-DTrI。
图9显示了B27K-DTrI HPLC分析，C8柱(Beckman，4.6×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(30-70％B/10-40min)，流速为1ml/min。横坐标为流出时间，纵坐标为A280nm。
图10显示了B27K-DTrI的电喷雾质谱分析(MATLCQ ESI-MS)，电喷电压为4.25KV，毛细管温度为200℃。理论分子量为5508.3，实测分子量为5509.0，误差为0.01％。
图11显示了蛋白质浓度对层析的保留时间(上)和峰形(下)的影响。横坐标为蛋白质浓度，纵坐标中Fs为对称因子，Kav为保留因子。
图12显示了本发明的胰岛素制备方法的示意图，其中箭头表示酶切位点。
图13显示了B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DtrI的蛋白质浓度对层析的保留时间的影响，横坐标为蛋白质浓度，纵坐标中Kay为保留因子。
图14显示了B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DtrI蛋白质浓度对和峰形的影响，横坐标为蛋白质浓度，纵坐标中Fs为对称因子。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现在下式所示的胰岛素前体间隔肽元件-胰岛素B链元件-连接肽元件-胰岛素A链元件不仅可以在酵母系统实现高表达，而且有利于目的产物的纯化，同时该前体还可经一步酶切法就获得胰岛素，制法极为简便，省却了传统工艺中的酶促转肽和复性步骤，从而提高了终产率，特别适合于工业化生产。
如本文所用，术语“B27K-DTrI”指B链27位氨基酸为赖氨酸的B链羧端去三肽胰岛素。
如本文所用，术语“B1A B27K-DtrI”指B链第1位为Ala、且27位氨基酸为赖氨酸的B链羧端去三肽胰岛素。
如本文所用，术语“(Des B1)B27K-DTrI”指B链第1位氨基酸不存在、且27位氨基酸为赖氨酸的B链羧端去三肽胰岛素。
B27K-DtrI、B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DtrI的基本结构如下X1V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R X23X24X25X26Y27(SEQID NO1)其中，X1为Phe、Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y27是Lys，或Arg。研究已表明，胰岛素B链只要具有前25个氨基酸(从第23位起的氨基酸可以任意变化)就可具有一定活性。因此，在本发明中，第23-26位的氨基酸可以是任意氨基酸，较佳地是除了Lys，Arg和Cys之外的任何氨基酸，尤其是L型氨基酸。
如本文所用，“胰岛素B链元件”指天然或变异的胰岛素B链序列。更佳地，所述胰岛素B链元件是C末端氨基酸为碱性氨基酸(如Lys或Arg)的胰岛素B链或胰岛素B链类似物。一种优选的例子是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的元件。
如本文所用，“胰岛素A链元件”指天然或变异的胰岛素A链序列。一种优选的例子是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的元件。
如本文所用，“间隔肽元件”指位于介于引导序列(如α-结合因子引导序列)与胰岛素B链元件之间的、起间隔作用的肽序列。间隔肽的结构是(Xaa)mZ，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，m为2-10的正整数，Z为Arg或Lys。其作用是一方面提供碱性Arg或Lys作为酶切位点，另一方面是提高前体的表达量，其原因可能是在表达时防止宿主细胞内酶对表达前体的酶解，增强对胰岛素前体的保护，从而提高表达并保留的前体数量。优选的间隔肽是至少含2个EA的间隔肽(如EAEA(Xaa)2-4K)，这种富含EA的间隔肽特别有利于胰岛素前体的分泌。一种特别优选的间隔肽例子是EAEAYVEFK(SEQ ID NO9)。[注当将(Xaa)m视为间隔肽时，则胰岛素B链元件是氨基端和羧基端都具有为碱性氨基酸(如Lys或Arg)的胰岛素B链或胰岛素B链类似物。]如本文所用，“连接肽元件”指位于胰岛素B链元件和胰岛素A链元件之间，起连接作用的肽序列。连接肽没有特别限制，只要起连接作用，并且在与A链相连的氨基酸残基为Lys或Arg即可。一类连接肽例子是(Ala)2-5Lys，例如Ala-Ala-Lys。
本发明的多肽可以使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明的胰岛素类似物核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中，胰岛素类似物多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含胰岛素类似物编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞等动物细胞。特别优选的宿主细胞是酵母细胞，尤其是毕赤酵母。
优选的用于酵母系统的表达载体包括(但并不限于)pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZalph，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC3.5K，pPIC9K，和PAO815(都可从Invitrogen公司购得)。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在一优选例中，先以单体胰岛素前体形式表达，然后在经一步酶切处理得到所需的单体胰岛素。从氨基端至羧基端，所述的单体胰岛素前体分别含有间隔肽、胰岛素B链、连接肽和胰岛素A链。
酶切处理可以用任何切割Lys和/或Arg的酶，例如胰蛋白酶。酶切条件可根据选用的酶而变化。一种优选的酶切条件是溶剂0.02-0.05M Tris缓冲液，pH7-8，底物浓度，约5mg/ml，胰蛋白酶用量，约为底物质量1/50，4-25℃，1-6小时。另一种优选的酶切条件是5±4mg/ml胰岛素前体，pH 7.5±2，胰蛋白酶∶胰岛素前体的重量比为＝1∶200±150，30±10℃，1-6小时。
MIP酶切后，用分子筛层析等方法分离酶切产物，即可获得本发明的胰岛素类似物。
本发明提供的胰岛素类似物制备方法不仅可以用于B27K-DTrI的制备，还可以用于其他治疗糖尿病胰岛素类的药物制备。例如，在CN 89108320、89109575.6、90101415.X、90101564.4、92105143.3、92105888.8、92110456.1、93103997.5、93112839、95115064.2、94193852.2、01110268.3、01140047.1等众多专利申请或专利中公开了大量的胰岛素衍生物或类似物。本发明方法可适用于这些胰岛素类似物以及其他具有胰岛素活性的胰岛素衍生物。
本发明的主要优点在于(a)胰岛素前体在酵母系统高表达；(b)胰岛素前体经一步酶切法就获得胰岛素，制法极为简便，从而提高了终产率，特别适合于工业化生产(c)无需酶促转肽或体外复性处理。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1表达载体的构建毕赤酵母(P.pastoris)的密码子用法与酿酒酵母(S.cerevisiae)基本相似，但在个别氨基酸如Glu上有一定差异[Zhao，X.，Huo，K.K.and Li，Y.Y.(2000).Synonymous codon usage in Pichia pastoris Sheng Wu Gong Cheng XueBao16(3)308-11.]。依照P.pastoris的密码子偏好性，化学合成单体胰岛素B27K-DTrI前体基因片段(图1A)。
用相同方法化学合成编码B1A B27K-DTrI(图1B)和(DesB1)B27K-DTrI的DNA(图1C)。与S.cerevisiae相似，合适的prepro-leader有助于胰岛素前体在P.pastoris中的分泌表达，将化学合成的DNA片段克隆到pPIC9K质粒(Invitrogen公司)的EcoRI、NotI位点，形成α-Mating factor leader-EAEAYVEFK-MIP表达框架。其中富含EA的间隔肽(例如EAEAYVEFK，SEQ ID NO9)有利于胰岛素前体的分泌，MIP为B27K-DTrI前体、B1A B27K-DtrI前体或(Des B1)B27K-DTrI前体，它们的结构都是胰岛素B链1-26K27AAKA链1-21。
结果获得分别含有三种MIP片段的pPIC9K质粒(即pPIC9K/B27K-DtrI、pPIC9K/B1A B27K-DtrI或pPIC9K/(Des B1)B27K-DTrI)。为了描述方便起见，这三种质粒通称为pPIC9K/MIP(图2)。
实施例2质粒转化和MIP表达菌株的筛选3ug经Bgl II线性化的pPIC9K/B27K-DtrI质粒电转化毕赤酵母GS115(his4)(购自NRRL，保藏号NRRL Y-15851，US6,730,499)，0.4cm电击杯，2.4KV，5.3ms，连续电击两次，转化的酵母细胞涂MD板。质粒pPIC9K/B27K-DtrI经过Bgl II线性化处理后，进入酵母细胞后部分会重新环化通过单点插入整合到染色体中，得到Mut+表型转化子，另外一部分线性质粒通过取代整合到染色体中，得到Muts表型转化子，在此过程中会自发形成多拷贝插入整合。从MD板上挑取1500个单克隆，2ml YPD培养基30℃培养24小时，分别取2μL点到含G418为0.5、1、2、4mg/ml的YPD板，三块板上都长出菌落的克隆进入表型鉴定实验。用甲醇酵母表达胰岛素前体时，胰岛素前体的表达量随整合进酵母染色体的基因拷贝数的增加而增加。用G418筛选来挑取基因拷贝数较高的转化子，抗G418浓度为0.5mg/ml和4mg/ml的菌株在2ml YPM发酵，MIP的表达量分别为0.5mg/L和2.5mg/L，这说明G418抗性试验确实是一种很有效的初步筛选高表达菌株的方法。
从1500个转化子中选择得到80个抗G4184mg/ml的克隆。将抗G4184mg/ml的克隆同时接种到MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)板和MM板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)上，在MM板上生长速度与MD板上无显著差异的克隆为Mut+表型，而在MM板上生长缓慢的克隆为Muts表型。通过MD板和MM板比照实验，80个抗G418 4mg/ml的克隆中，Mut+表型占50％。因为Mut+菌株的发酵周期较短，选择Mut+菌株进行小规模发酵，选取MIP的分泌量较高的菌株。40个Mut+表型克隆分别接种到2ml YPD培养基中，30℃培养48小时，转换成含3％甲醇的YPM培养基，再培养72小时，上清用含0.5％BSA的PBS稀释400倍后用放射免疫法测定MIP的相对含量。各菌株的表达量平均为4mg/L，最高表达量为4.8mg/L，都可用于2L规模发酵。
实施例32L规模发酵高密度发酵是从甲醇酵母中得到大量异源蛋白的有效手段，甲醇酵母在简单无机盐培养基中就可以生长，发酵过程中极少产生酒精和乙酸等有害产物，故适合大规模高密度发酵。发酵液pH值对细胞的生长状态、分泌蛋白的稳定性等都有显著影响，用摇床实验初步优化了发酵的pH范围为4.5-6.5，最佳pH值为5(图3)。
每升基础无机盐培养基(basal salt medium，BSM)含有50ml甘油，26.7mlH3PO4，0.93g CaSO4·2H2O，18.2g K2SO4，14.9g MgSO4·7H2O)，和4.13g KOH，高压灭菌后用NH4OH调pH值。
微量元素溶液(PTM1)配方为1L含有6g CuSO4·5H2O，0.08g KI，3.0gMnSO4·H2O，0.2g(NH4)Mo7O24·4H2O，0.02g H3BO3，0.5g CaSO4·2H2O，20gZnSO4，5ml H2SO4，65g FeSO4·7H2O，0.5g CoCl2·6H2O和0.2g Biotin，过滤灭菌。
将保存菌种接种到20ml YPG培养基，30℃培养24小时作为一级种子；20ml一级种子接种到200ml YPG培养基，30℃培养10小时，OD600nm约为4，作为二级种子。采用补料分批培养(fed-batch culture，FBC)分为三个时期生长期；过渡期；诱导期。在3.7升发酵罐中，2L BSM中加入8ml PTM1，用NH4OH调pH值为5，温度为29℃，并在发酵过程中保持pH 5.0、温度29℃，200ml二级种子接种后维持溶氧为30-35％，开始发酵。约20小时后生长期结束，甘油耗尽，溶氧突然上升，进入过渡期(Glycerol fed-batch phase)，过渡期以限制生长的速率(growth-limiting rate)补加甘油，补料50％(W/V)甘油(含0.25％PTM1)，补料速度从13ml/L·h缓慢升到21ml/L·h，每一小时测定DO峰形(spike)保证发酵液中没有甘油积累，溶氧维持在30-35％。4小时后，改为补甲醇(含0.2％PTM1)，进入诱导期。开始时补料速度为3ml/L.h，维持溶氧在20-30％，约8小时内补料速度增加到12ml/L.h，此后溶氧维持在20-25％，整个诱导期每一小时测定DO峰形，发酵84小时细胞湿重达到400mg/ml(图4)。胰岛素前体的表达量平均为150-250mg/L，最高表达量为400mg/L。
实施例4表达产物的分析与纯化发酵液离心后取上清20μL，按照Gabriel方法[Gabriel O.Analytical disc gelelectrophoresis.Mehtods in Enzymology，1971，22656，Jakoby WB.ed，AcademicPress.New York]，在pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳分析MIP的含量。MIP的表达量约为200mg/L，表达产物在pH8.3电泳上为两条带(图5)，为间隔肽在胞内未被完全酶解所致。然而，这对后续纯化没有影响，因为多余的间隔肽会在体外加工中被胰蛋白酶切除。
疏水吸附柱XAD-7(购自Sigma公司)对MIP有很好的吸附能力，能够除去发酵液中的无机盐、大部分的多糖和色素以及杂蛋白。XAD-7柱经5Vc(即5倍总的柱床体积，以下同)甲醇洗涤、10Vc水平衡后，10Vc离心去细胞发酵液上柱，10Vc水、2Vcl 5％乙醇含5％醋酸依次洗涤，60％乙醇含5％醋酸洗脱，280nm检测。洗脱液旋转蒸发除去乙醇和醋酸后用Sephadex G25除去色素和部分多糖，流动相为1mol/L醋酸，280nm检测。收集蛋白峰用阳离子交换柱SP-fast flow((Amersham Biosciences公司)除去多脂类等杂质(起始流动相为50mMNaAc-HCl pH4.0缓冲液，上样后用5Vc起始缓冲液洗去不吸附杂质，在15Vc内流动相中NaCl浓度从0线性增至1mol/L)，280nm检测，表明得到的MIP蛋白纯度可达90％以上，(图6)。
MIP分子存在4个碱性氨基酸位点，由于在一定的溶液环境中，各个位点所处分子构象不同，胰蛋白酶对其作用的动力学不一样。在非最适条件10mg/ml MIP，溶于100mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH6.0，TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)-胰蛋白酶(W)∶MIP(W)＝1∶200，30℃水浴，观察到连接肽Ala-Ala-Lys*、间隔肽Lys*、B链27位Lys*均比B链22位Arg*更易于酶切。为了避免链22位Arg*处酶切形成DOI，而最有效地切除间隔肽和连接肽，对反应温度、反应时间、pH值、酶与底物比例四个因素进行了正交试验，得到最优化条件为5±4mg/ml MIP，溶于100±50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液，pH7.5±2，TPCK-胰蛋白酶(W)∶MIP＝1∶200±150，30±10℃反应60±30分钟，酶切产率可达95％以上。
酶切反应液用HAc调pH4.0终止反应后过SP-fast flow离子交换柱除去杂蛋白(起始流动相为50mM NaAc-HCl pH4.0缓冲液，上样后用5Vc起始缓冲液洗去不吸附杂质，在20Vc内流动相中NaCl浓度从0线性增至1mol/L)。280nm检测表明，得到B27K-DTrI纯品(图7)。
最终产率是84％。
实施例5表达产物的鉴定与活性分析纯化得到的B27K-DTrI在pH8.3电泳上为单一条带(图8)，C8 HPLC分析为单峰(图9)C8反相柱(4.6×250mm)，流动相A为0.1％TFA，流动相B为含0.1％TFA的70％乙腈，梯度(30-70％B/10-40min)，流速为1ml/min。
经电喷雾质谱测定分子量为5509，与理论分子量相符(图10)。
氨基酸组成测定结果用单字母表示氨基酸，括号里为测定值；R1(1.07)，K1(0.9)，H2(2.16)，F3(3.09)，Y4(4.0)，L6(5.6)，I2(1.72)，V4(3.75)，A1(1)，G4(3.7)，E和Q7(7.6)，S3(2.1)，T1(0.82)，D和N3(2.92)，C6(未测试)。用自外吸收法测定蛋白质浓度280nm波长，光程1cm，1mg/ml胰岛素DPI[B28Lys，B29Pro]-胰岛素光吸收值为分别为1.01、0.88、1.01和1.07。
小鼠惊厥法测定B27K-DTrI的体内生物活性的方法采用中国药典，1985年，附录100页中所述的方法。方法如下雄性昆明小鼠，体重为27-30g，按体重随机分四组，每组24只，实验前禁食2小时。样品用盐酸调至pH值为5的生理盐水溶解，1OD280nm＝1mg/L。估计样品效价为标准品的80％，高剂量为0.09U/ml，低剂量为0.045U/ml，溶剂为盐酸调节pH为2.5的生理盐水。25℃，15分钟内每只小鼠皮下注射0.3ml，置于37℃观察90分钟，惊厥的、死亡的、使其仰卧后3秒内不能自行翻身者均认为是阳性反应。数据按质反应测定法计算。结果表明，B27K-DtrI的体内生物活性为胰岛素的80％(小鼠惊厥法测得B27K-DtrI的活性为21U/mg，而胰岛素标准品27U/mg)。
B27K-DTrI的单体性质测定，在中性溶液中较高浓度胰岛素聚合后形成单体、二体、六体的混合物，使用FPLC凝胶过滤法测定脱锌胰岛素的聚集性质，Superdex 75(HR 10/30)柱，流动相为PBS(phosphate-buffered saline，pH7.4)，流速为0.4ml/min，上样量为0.1ml，室温，280nm检测。随着脱锌胰岛素浓度的上升，其在Superdex 75(HR 10/30)柱上的保留时间缩短、峰的不对称性增强，我们分别用Kav和Fs来描述这种变化，用对称因子Fs描述混合物均一度，用分配系数Kav描述混合物的平均分子量。Fs＝W0.05h/2A，其中W0.05h为在0.05峰高处的峰宽，A为0.05峰高处的前半峰宽；Kav＝(Vr-Vo)/(Vc-Vo)，其中Vr为流出体积，Vo为外水体积，Vc为总的柱床体积。在相同的条件下，比较了脱锌胰岛素、DPI、[B28Lys，B29Pro]-胰岛素和B27K-DTrI的Kav、Fs随蛋白浓度而变化的情况(图11A和B)。DPI，[B28Lys，B29Pro]-胰岛素和B27K-DtrI都是本领域已知的单体胰岛素，它们的单体性质有明显的差别，其中DPI最强，B27K-DTrI略强于[B28Lys，B29Pro]-胰岛素。
同样的技术路线也可用于表达制备其它的胰岛素类似物其它的酵母表达系统或分泌型大肠杆菌表达系统来表达B27K-DTrI。该技术路线与中国专利申请98110912.8中所公开DTI的制备方法相比，不仅可以避免化学合成小肽GFFY(But)Obut，酶促转肽，HPLC分离等烦琐的工艺，而且可以进一步大幅提高前体的表达量，从而提高产率，更适合于工业生产。本发明酶切工艺示意图见图12。
实施例6B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DtrI的制备用实施例2-4相同的方法制备B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DtrI，不同点仅在于用实施例1中制备的pPIC9K/B1A B27K-DtrI或pPIC9K/(Des B1)B27K-DtrI替换pPIC9K/B27K-DtrI。结果同样获得了B1A B27K-DtrI和(Des B1)B27K-DtrI。
B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DtrI的体内生物活性均为胰岛素的80％(小鼠惊厥法测得两种单体的活性均为22U/mg，而胰岛素标准品27U/mg)。
同时，在上述相同的条件下，比较了脱锌胰岛素、B1A B27K-DTrI和(DesB1)B27K-DTrI的Kav、Fs随蛋白浓度而变化的情况。结果如图13和图14所示，表明B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI有显著的单体性质。
此外，免疫原性测定还表明B1A B27K-DTrI和(Des B1)B27K-DTrI的免疫原性有明显下降。
实施例7间隔肽效果比较用实施例2-4相同的方法制备无间隔肽的B27K-DtrI前体的编码序列以及间隔肽为YVEFK的B27K-DtrI前体前体编码序列，然后同样转入毕赤酵母，表达胰岛素前体，再用胰蛋白酶酶切前体，然后分离纯化获得B27K-DtrI。三种B27K-DtrI前体的情况比较见下表。
上述结果表明，引入间隔肽不仅有利于胰岛素前体的分泌，而且因为间隔肽的存在，可以防止胰岛素B链元件的N端被部分切除(如切除2个或更多个氨基酸)，从而避免了形成与所需产物性质很接近的、难以去除的杂质，因此酶切后的分离纯化效果极佳。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海生物泰生命科学研究公司<120>胰岛素及胰岛素类似物的基因工程制备新方法<130>043293<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(26)<223>Xaa＝Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Lys，Arg，Phe，Tyr，Trp，Pro，Cys，Met，His，或Val<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Phe、Ala或无<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>Xaa＝Lys或Arg<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(27)<223>胰岛素B链<400>1Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(21)<223>胰岛素A链<400>2Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20<210>3<211>173<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(173)<223>单体胰岛素B27K-DTrI前体编码序列<400>3gaattcaagt tcgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg 60gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag gctgctaagg gtatcgtcga acaatgttgt 120acctccatct gctccttgta ccaattggag aactactgta actaggcggc cgc173<210>4<211>51<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(51)<223>单体胰岛素B27K-DTrI前体<400>4Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Glu Val Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile20 25 30Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn35 40 45Tyr Cys Asn50<210>5
<211>173<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(173)<223>单体胰岛素B1A B27K-DTrI前体编码序列<400>5gaattcaagg ctgtcaacca acacttgtgt ggttcccact tggtcgaggc tttgtacttg 60gtctgtggtg aaagaggttt cttctacaag gctgctaagg gtatcgtcga acaatgttgt 120acctccatct gctccttgta ccaattggag aactactgta actaggcggc cgc173<210>6<211>51<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(51)<223>单体胰岛素B1A B27K-DTrI前体<400>6Ala Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Glu Val Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile20 25 30Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn35 40 45Tyr Cys Asn50<210>7<211>170<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(170)<223>单体胰岛素(Des B1)B27K-DTrI前体编码序列<400>7gaattcaagg tcaaccaaca cttgtgtggt tcccacttgg tcgaggcttt gtacttggtc 60
tgtggtgaaa gaggtttctt ctacaaggct gctaagggta tcgtcgaaca atgttgtacc 120tccatctgct ccttgtacca attggagaac tactgtaact aggcggccgc170<210>8<211>50<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(50)<223>单体胰岛素(Des B1)B27K-DTrI前体<400>8Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Glu Val Leu Tyr Leu1 5 10 15Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val20 25 30Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr35 40 45Cys Asn50<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>间隔肽<400>9Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Lys1 权利要求
1.一种胰岛素前体，其特征在于，所述前体从氨基端至羧基端分别含有以下元件(a)具有式(Xaa)mZ所示的间隔肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，m为2-10的正整数，Z为Arg或Lys；(b)胰岛素B链元件；(c)具有式(Xaa)nZ′所示的连接肽元件，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，n为2-10的正整数，Z′为Arg或Lys；(d)胰岛素A链元件。
2.如权利要求1所述前体，其特征在于，所述的胰岛素B链元件具有下式X1VNQHLCGSH LVEAL YLVCG ERX23X24X25X26Y27其中，X1为Phe、Ala或不存在，X23、X24、X25和X26各自独立，分别是Gly，Ala，Asp，Glu，Asn，Gln，Ser，Thr，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Met，His，Val或不存在，且X23、X24、X25和X26中至多有一个不存在；Y27是Lys，或Arg。
3.如权利要求2所述的前体，其特征在于，X23X24X25X26Y27是GFFYK。
4.如权利要求1所述前体，其特征在于，所述的间隔肽元件的序列为EAEA(Xaa)2-4K，式中Xaa为20种天然氨基酸中任一种，且所述的连接肽元件的序列是(Ala)2-5Lys。
5.如权利要求1所述的前体，其特征在于，间隔肽元件的序列为EAEAYVEFK，且在间隔肽的上游还具有α-结合因子序列。
6.一种分离的DNA，其特征在于，它编码权利要求1所述的胰岛素前体。
7.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的DNA。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的表达载体或含有权利要求6所述的DNA。
9.一种制备胰岛素的方法，其特征在于，包括步骤(a)用胰蛋白酶酶切权利要求1所述的胰岛素前体，从而形成胰岛素；(b)分离出胰岛素。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(a)的条件是5±4mg/ml胰岛素前体，pH7.5±2，胰蛋白酶∶胰岛素前体的重量比为＝1∶200±150，30±10℃。
全文摘要
本发明提供了胰岛素及胰岛素类似物的基因工程制备方法，所述方法包括用胰蛋白酶酶切胰岛素前体，然后分离出胰岛素，其中所述的胰岛素前体从氨基端至羧基端分别含有以下元件(a)具有式(Xaa)
文档编号C07K14/435GK1699412SQ20041001849
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月20日 优先权日2004年5月20日
发明者张友尚, 费俭, 丁金国, 崔大敷, 蔡国强, 石嘉豪 申请人:上海生物泰生命科学研究有限公司