专利名称：：基于酪氨酸激酶受体(包括igf-ir)的工程化蛋白质的靶向治疗剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及结合胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)的新蛋白质，以及其它重要蛋白质。本发明还涉及药物制剂中的新蛋白质和此类蛋白质的衍生物，及其在诊断、研究和治疗应用中的用途。本发明进一步涉及包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、和包含编码该新蛋白质的多核苦酸的载体。
背景技术：
：胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)是一种跨膜异四聚体蛋白质，其具有两条胞外a链和两条跨膜P链，采取二硫键相连接的p-a-a-P的构造。配体(诸如胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和胰岛素样生长因子-II(IGF-II))通过IGF-IR受体胞外域的结合活化它和(许多情况中的)它的胞内酪氨酸激酶域，导致受体自磷酸化和底物磷酸化。IGF-IR与胰岛素受体同源，在(3链酪氨酸激酶域中具有84。/。的高序列相似性，而在a链胞外富含半胱氨酸域中具有48。/。的低序列相似性(Ulrich,A.等，1986，EMBO，5，2503-2512;Fujita隱Yamaguchi,Y.等,1986,J.Biol.Chem.,261,16727-16731;LeRoith,D.等，1995,EndocrineReviews,16，143-163)。IGF-IR和配体(IGF-I和IGF-II)在许多生理过程中发挥重要作用，包括胚胎发生过程中的生长和发育、代谢、成体中的细胞增殖和细胞分化(LeRoith，D.,2000，Endocrinology,141,1287-1288;LeRoith,D.，1997,NewEnglandJ.Med.，336，633-640)。IGF-I和IGF-II配体都作为内分泌激素在血液中发挥功能，在那里它们主要存在于与IGF结合蛋白的复合物中，且作为局部生成的旁分泌和自分泌生长因子发挥功能(Humbel,R.E.，19卯，Eur.J.Biochem.,190，445-462;Cohick，W.S.和Clemmons,D.R,,1993，Annu.Rev.Physiol.55，131-153)。在体内，IGF-I的血清水平依赖于垂体生长激素(GH)的存在。虽然肝是GH依赖性IGF-I合成的主要部位，但是许多肝外组织也生成IGF-I(Daughaday和Rotwein,EndocrineRev.10:68-91(1989))。多种新生物组织也可生成IGF-I(Wemer和LeRoith,Adv.CancerRes.68:183-223(1996))。如此，IGF-I可以经自分泌或旁分泌以及内分泌机制发挥正常和异常细胞增殖的调节物的作用。IGF-I和IGF-II在体内结合IGF结合蛋白(IGFBP)。在结合至IGF后，IGFBP或是通过循环转运IGF，或是保护IGF免于蛋白水解切割和灭活。游离IGF对于与IGF-IR的相互作用的可用度受IGFBP调控。关于IGFBP和IGF-I的综述参见Grimberg等，J.Cell.Physiol.183:1-9,2000。在分子水平，已经将IGF-IR与促进肿瘤细胞的生长、转化和存活联系起来(Baserga，R.等，1997,Biochem.Biophys.Acta,1332,F105-F126;Blakesley,V.A.等,1997,JournalofEndocrinology,152,339-344;Kaleko，M.,Rutter，W,J"和Miller,A.D.1990,Mol.Cell.Biol.,10，464-473)。已知数种类型的肿瘤表达比正常水平高的IGF-IR，包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、滑膜肉瘤和胰腺癌。参见Khandwala,H.M.等，2000,EndocrineReviews,21,215-244;Werner,H.和LeRo他,D.,1996,Adv.CancerRes"68,183-223;Happerfield,L.C,等，1997，J.Pathol"183,412-417;Frier,S.等，1999,Gut，44，704-708;vanDam,P.A.等,1994，J.Clin.Pathol"47,914-919;Xie，Y.等,1999，CancerRes"59,3588-3591;Bergmann,U.等，1995,CancerRes"55,2007-2011。在体外，IGF-I和IGF-II已经显示为数种人肿瘤细胞系(诸如肺癌、乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤和宫颈癌)的有力促分裂原(Ankrapp,D.P.和Bevan,D.R.，1993,CancerRes.,53,3399-M04;Gullen，K.J.,1990,CancerRes"50,48-53;Hermanto,U.等，2000,CellGrowth&Differentiation,11,655-664;Guo,Y.S.等，1995，J.Am.Coll.Surg"181，145-154;Kappel，C.C.等,1994，CancerRes"54,2803-2807;Steller,M.A.等，1996,CancerRes.，56，1761-1765)。数种这些肺瘤和肿瘤细胞系!还表达高水平的IGF-I或IGF-II,其可以以自分泌或旁分泌方式刺激它们的生长(Quinn，K.A.等，1996，J.Biol.Chem.,271，11477-11483)。流行病学研究已经显示了IGF-I血浆水平升高(和IGF结合蛋白-3水平降低)与前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌风险升高的相关性(Chan,J.M.等，1998,Science,279，563-566;Wolk,A.等,1998,J,Natl.CancerInst"90，911-915;Ma，J.等，1999，J.Natl.CancerInst"91,620-625;Yu，H.等,1999，J.Natl.CancerInst"91,151-156;Hankinson，S.E.等，1998,Lancet,351,1393-1396)。已经提出将降低血浆中IGF-I水平或抑制IGF-IR功能的策略用于癌症预防(Wu,Y.等，2002,CancerRes.,62,1030-1035;Grimberg,A.和CohenR,2000,J.Cell.Physiol.,183,1-9)。IGF-IR能保护胂瘤细胞免于由生长因子剥夺(growthfactordeprivation)、锚着非依赖性(anchorageindependence)或细胞毒性药物处理引起的凋亡(Navarro,M.和Baserga,R,,2001,Endocrinology,142,1073-1081;Baserga,R.等,1997,Biochem.Biophys.Acta,1332,F105-F126)。已经通过突变研究鉴定了IGF-IR中对于其促有丝分裂、转化和抗凋亡活性至关重要的域。例如，已经鉴定了IGF-IR的酪氨酸1251残基对于抗凋亡和转化活性是至关重要的，但是对于其促有丝分裂活性则不然(O'Connor,R.等，1997,Mol.Cell.Biol.,17，427-435;Miura，M.等，1995,J.Biol,Chem.，270，22639-22644)。创建基于IGF-IR拮抗或抑制的治疗剂的困难虽然IGF-IR作为治疗靶物具有诱人的生物学，但是创建拮抗剂或其它类型抑制剂的尝试是緩慢的，主要由于一项或多项依赖于治疗范例(therapeuticpamdigm)的以下因素难以或不能拮抗靶物但又不产生激动作用；由于不想要的与其它酪氨酸激酶靶物或受体(诸如胰岛素受体)的交叉反应性，难以或不能创建选择性拮抗剂或抑制剂；由于潜在治疗剂的半衰期短，难以有效施用；由于潜在治疗剂的溶解度低，难以有效施用；及由于潜在治疗剂的聚集，难以有效施用。本发明的治疗剂克服了一项或多项这些困难。在生物扩散盒(chambers)中注射入动物中后，表达IGF-IRmRNA之反义的肿瘤细胞发生大量凋亡。基于肿瘤细胞比正常细胞对IGF-IR抑制引起的凋亡更加易感的假说，此观察结果使得IGF-IR成为诱人治疗靶物(Resnicoff，M.等，1995，CancerRes"55,2463-2469;Baserga，R.，1995,CancerRes"55,249-252)。然而，反义和siRNA这两种治疗策略都受到施用挑战(administrationchallenge)禾口货物障石f^昝在成本(potentialcostofgoodsobstacles)的困才尤。抑制肺瘤细胞中的IGF-IR功能的另一种策略是使用结合IGF-IR的胞外6域且可抑制活化的抗IGF-IR抗体。已经报告了数项尝试是开发针对IGF-IR的小鼠单克隆抗体(可获得两种抑制性抗体，即IR3和1H7),而且已经在数项IGF-IR研究中报告了它们的使用。IR3抗体是如下开发的，使用部分纯化的胰岛素受体胎盘制备物免疫小鼠，其产生一种选择性结合胰岛素受体的抗体(即IR1)和两种显示出IGF-IR(生长调节素-C受体)的优先免疫沉淀但也有胰岛素受体的弱免疫沉淀的抗体(即IR2和IR3)(Kull,F.C,等,1983，J,Biol.Chem.,258，6561-6566)。辦^^的我体^/^在有些情况中，抗体活化IGF-IR。这在文献中显示了多次。另外，显示出"抑制，，的抗体可能尚未仔细表征且可能实际上在某些条件下(诸如较低的抗体浓度)活化IGF-IR。在可能存在抗体的扩散梯度的肿瘤中，IGF-IR的活化可随肺瘤中较低抗体浓度的抗体而发生。1H7抗体是如下开发的，用纯化的IGF-IR胎盘制备物免疫小鼠，其产生一种抑制性抗体lH7和三种刺激性抗体(Li,S,L.等，1993,Biochem.Biophys,Res.Commun,，196,92-98;Xiong,L.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,5356-5360)。在另一份报告中，通过用表达高水平IGF-IR的转染3T3细胞免疫小鼠，获得了一组对人IGF-IR特异性的小鼠单克隆抗体，通过结合竟争研究和通过它们对IGF-I结合转染3T3细胞的抑制和刺激将它们分入七个组(Soos,M.A.等，1992,J.Biol.Chem.,267，12955-12963)。虽然IR3抗体是IGF-IR体外研究最常使用的抑制性抗体，但是它受到它在表达人IGF-IR的转染3T3细胞和CHO细胞中展现出激动活性的缺点的困扰(Kato,H.等，1993,J.Biol.Chem.，268,2655-2661;Steele-Perkins,G.和Roth，R.A.，1990,Biochem.Biophys.Res.Commun"171,1244-1251)。类似的，在由Soos等开发的那组抗体中，最抑制性的抗体24-57和24-60在转染3T3细胞中也显示出激动活性(Soos,M.A.等，1992,J.Biol.Chem.，267,12955-12963)。虽然已经报告了IR3抗体在完整细胞中和在增溶后抑制IGF-I(但是IGF-II则不然)结合所表达受体，但是它显示出在体外在细胞中抑制IGF-I和IGF-II二者刺激DNA合成的能力(Steele-Perkins,G.和Roth,R.A.,19卯，Biochem.Biophys.Res.Commun.,171，1244-1251)。自嵌合胰岛素-IGF-IR构建物推断出IR3抗体的结合表位是IGF-IR的223-274区域(Gustafson，T.A.和Rutter,W.J.，1990,J.Biol.Chem.，265,18663-18667;Soos,M.A,等，1992,J.Biol.Chem.，267，12955-12963)。通常使用MCF-7人乳腺癌细胞系作为模式细胞系来证明IGF-I和IGF-II的体外生长应答(Dufourny，B.等，1997，J.Biol.Chem.,272,31163-31171)。在MCF-7细胞中，IR3抗体将无血清条件中外源添加的IGF-I和IGF-II的刺激效应不完全地阻断大约80%。还有，IR3抗体不显著抑制(少于25%)10%血清中MCF-7细胞的生长(Cullen,K.J.等，1990，CancerRes.,50,48-53)。IR3抗体在体外对血清刺激的MCF-7细胞生长的此弱抑制可能与一项其中IR3抗体处理没有显著抑制棵鼠中MCF-7异种移植物生长的体内研究有关(Arteaga,C.L.等，1989，J.Clin.Invest"84，1418-1423)。因为IR3和其它所报告的抗体的激动活性弱，而且它们在血清刺激(而不是无血清条件中外源添加的IGF-I或IGF-II的刺激作用)的更加生理性的条件中不能显著抑制肿瘤细胞(诸如MCF-7细胞)的生长，需要能抑制血清刺激的肿瘤细胞生长但它们自身没有显著激动活性的新的抗IGF-IR调控物。虽然，在有些情况中，会想要激动活性(通常用于肿瘤学或失控的或不想要的组织扩增、增殖、或生长以外的应用)。虽然已经报告了抗IGF-IR抗体存在于某些没有自身免疫病的患者中，但是这些抗体无一已经纯化且无一已经显示出对于抑制IGF-I活性适用于诊断或临床规程。参见例如Thompson等，PediatRes.32:455459,1988;Tappy等，Diabetes37:1708-1714，1988;Weightman等，Autoimmunity16:251-257,1993;Drexhage等，Nether.J.ofMed.45:285-293,1994。另外，已经报告了针对IGF-lR的单克隆抗体能刺激细胞增殖(Xiong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5356-5360，1992)。另外，由于特异性、激动作用、聚集作用和溶解性，理论上难以创建抗体和其它治疗剂，以及包括IGF-IR作为靶物的双重特异性治疗剂，特别是在使用抗体时。辦^/i的V、为、子,劍,i/凝潜小分子化学程序在创建针对IGF-IR的治疗剂方面大多是不成功的。出于许多原因，包括为IGF-IR获得选择性化学同时不抑制或结合相关酪氨酸激酶8或受体(诸如胰岛素受体)的能力，难以通过蛋白质或小分子创建此靶物的药物。另外，小分子常常是低溶解度的，使得生物利用度、施用或配制富有挑战性。本发明的许多方面之一是在期望组织(诸如肿瘤)的细胞中选择性结合IGF-IR生物学以触发凋亡的本发明多肽。IGF-IR生物学(包括活化)有助于凋亡调节。它能减緩或阻止凋亡。多种遗传损伤对凋亡程序的遏制可能有助于恶性肿瘤的形成和进展。虽然当前的潜在治疗策略能够在体外诱导凋亡或抑制与IGF-I升高、IGF-II、和/或IGF-IR受体水平升高有关的体外细胞增殖，包括遏制IGF-I水平或IGF-II水平或阻止IGF-I结合IGF-IR，但是它们仍然不适于更好的治疗剂。和/或分泌。已经使用可溶性IGF-IR在体内在肿瘤细胞中诱导凋亡和在实验动物系统中抑制肿瘤发生(D'Ambrosio等，CancerRes.56:4013-20,1996)。另外，已经使用IGF-IR反义寡核苷酸、IGF-I的肽类似物、和针对IGF-IR的抗体来降低IGF-I或IGF-IR表达(见上文)。然而，这些药剂无一适合于长期施用给人类患者。另外，虽然已经给患者施用IGF-I来治疗身材矮小症、骨质疏松症、肌肉质减少、神经病或糖尿病，IGF-I对IGFBP的结合常常使得使用IGF-I的治疗困难或无效。鉴于IGF-I、IGF-II和IGF-IR在病症(包括癌症和增殖性病症，诸如当IGF-I或IGF-II和/或IGF-IR过表达时)中的作用和其它治疗办法(例如小分子、siRNA、反义和抗体)的缺陷，会希望生成能选择性调控、抑制或阻断IGF-IR的针对IGF-IR途经(或者受体或其配体的各种同等型(isoform)或突变体)的治疗剂，诸如本发明多肽。另外，在对IGF-IR或其它靶物的结合特异性之外，会希望这样的多肽以成本高效方式表达，拥有期望的生物物理特性(例如Tm、基本上是单体、或正确折叠)、小尺寸以穿透组织和适当的血液半衰期或体内暴露时间。发明概述本发明的一个方面涉及以高亲和力结合IGF-IR的新多肽。在有些实施方案中，该多肽以约lpM或更少、约10nM或更少、或约lnM或更少的的解离9常数结合IGF-IR。在有些实施方案中，该多肽以约l(iM或更多的解离常数结合胰岛素受体。在有些实施方案中，本发明的多肽抑制IGF-I或IGF-II结合IGF-IR且在基于细胞的测定法中在亚IC50浓度不活化人IGF-IR，其中IC50为少于约lnM或约100pM。在有些实施方案中，本发明的多肽在基于细胞的测定法中在依赖于IGF-IR活化的细胞系中诱导凋亡。在有些实施方案中，IGF-IR结合物阻断IGF-IR活性，诸如对凋亡、磷酸化或二聚化的控制。常常希望(特别是在体内应用中)本发明的靶向IGF-IR的蛋白质(或是作为单特异性治疗剂或是作为多特异性(包括双特异性或三特异性)治疗剂)对于IGF-IR与胰岛素受体相比是选择性的。此类选择性优选为至少约IOO倍、至少约1000倍、至少约10,000倍和至少约100,000倍。另外，可能希望(特别是对于具有对IGF-IR的高亲和力以致在治疗剂或蛋白质的限定浓度或更低浓度检测不到对胰岛素受体的结合的蛋白质)此类浓度为约100nM、约luM、或约1OuM。结合IGF-IR胜过胰岛素受体的蛋白质的选择性相关性也可通过比较Kd、IC50、和Ki(或是测量得到的或是计算得到的，这取决于测定法)或者作为同一生物化学或生物学参数(例如Kd、IC50、和Ki)的比率来表述。此类比率优选包括胰岛素受体结合或其它测量对IGF-IR结合或其它测量的比率，其为约IOO、约l,OOO、约10，000或约100,000。本发明的结合其它耙物(特别是酪氨酸激酶受体)的其它蛋白质优选使用本文中所提供的选择性指导是对期望靶物(例如EGFR或Her2)与胰岛素受体相比是选择性的。在有些实施方案中，该多肽包含基于纤连蛋白的支架(scaffold)蛋白。在有些实施方案中，该多肽包含第十纤连蛋白III型("Fn3)域，其中所述、n3域(i)包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG;(ii)至少一个选自环BC、DE、和FG的环具有相对于人"Fn3域的相应环的序列改变的氨基酸序列；且(iii)以约l^M或更少的解离常数结合人IGF-IR。在有些实施方案中，至少一个选自环BC、DE、和FG的环中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或1O个氨基酸是用不同于野生型序列的氨基酸替代的。在有些实施方案中，对至少一个选自环BC、DE、和FG的环删除或添加了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸。在有些实施方案中，环BC和环FG具有相对于人^Fn3域的相应环的序列改变的氨基酸序列。在有些实施方案中，该多肽包含SEQIDNO:2-125、184-203、或226之任一的氨基酸序列。基本上单价地经基于纤连蛋白地支架结合IGF-IR在本发明的这个和其它实施方案中在降低IGF-IR活化方面是有帮助的。在有些实施方案中，本发明的多肽进一步包含一个或多个药动学(PK)模块(moieties)。PK模块改善多肽的一项或多项药动学特性，例如生物利用度、血清半衰期、体内稳定性、和药物分布。在有些实施方案中，PK模块选自聚氧化烯模块、人血清清蛋白结合蛋白、唾液酸、人血清清蛋白、运铁蛋白、和Fc或Fc片段。在有些实施方案中，PK模块是聚乙二醇(PEG)。在有些实施方案中，PEG模块经Cys或Lys氨基酸与本发明多肽共价相连接。在有些实施方案中，本发明的多肽通过至少一个肽键与以约300nM或更少的结合亲和力结合人血清清蛋白(HAS)的第二蛋白相连接。在有些实施方案中，本发明的多肽进一步包含结合人蛋白质的第二域(domain)。在有些实施方案中，人蛋白质选自EGFR、叶酸受体、Her2、Her3、c-kit、c画Met、FGFRI、FGFR2、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGF3、Tie2、Angl、Ang2、FGF(成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、VEGF-A(血管内皮生长因子-A)、VEGF-C、和VEGF-D。在有些实施方案中，人蛋白质是IGF-IR。在有些实施方案中，人蛋白质是酪氨酸受体。在有些实施方案中，第二域以约lpM或更少、约10nM或更少、或约lnM或更少的解离常数结合人蛋白质。在有些实施方案中，第二域以约lliM或更少、约10nM或更少、或约lnM或更少的解离常数结合VEGFR2且以约lliM、lOpM、或10)iM、或更多的解离常数结合VEGFR1。在有些实施方案中，该多肽包含第一和第二蛋白，其中两者任一或均为单链抗体且所述第一和第二蛋白经PEG模块相连接。在有些实施方案中，第一蛋白结合IGF-IR。在有些实施方案中，第二蛋白选自小于约50kD的抗体模块、脂笼蛋白的衍生物、四连蛋白的衍生物、avimer、锚蛋白的衍生物、和第二个第十纤连蛋白型III('GFn3)域，其中所述第二^Fn3域包含环AB、环BC、环CD、环DE、和环FG;且至少一个选自环BC、DE、和FG的环具有相对于人"Fn3域的相应环的序列随机化的氨基酸序列，且以约IOnM或更少的解离常数结合人，n3域不结合的人蛋白质。在有些实施方案中，第二域是"Fn3域且包含SEQIDNO:2-203或226之任一的氨基酸序列。在有些实施方案中，本发明的多肽和第二域经至少一个二硫4泉、肽键、多肽、聚合糖、或聚乙二醇(PEG)模块可操作相连接。在有些实施方案中，PEG介于约0.5kDa和约100kDa之间。在本发明的有些实施方案中，本发明的多肽包含经多肽相连接的第一和第二蛋白，其中所述第一或第二蛋白或多肽接头具有血液或靶组织中的蛋白酶可切割的蛋白酶位点。此类实施方案可用于释放两种或更多治疗性蛋白质，以实现更好的投递或治疗特性或与分开生成此类蛋白质相比更有效的生成。在有些实施方案中，第一和第二蛋白使用生物相容性聚合物(诸如聚合糖)相连接。此类聚合糖可包括血液或靶组织中的酶可切割的酶促切割位点。此类实施方案可用于释放两种或更多治疗性蛋白质，以实现更好的投递或治疗特性或与分开生成此类蛋白质相比更有效的生成。本发明的另一个方面是本发明的一种或多种蛋白质或本文中所描述的其它蛋白质经聚合物的可操作连接以创建多功能蛋白质，以创建本发明的蛋白质治疗剂。例如，聚合物可以是多肽、聚合糖、基于碳的聚合物(例如脂肪族链)或PEG。本发明的另一个方面包括以PEG连接本文中所描述的本发明的结合IGF-IR的蛋白质与另一种蛋白质，诸如Fab、单链Ab、域抗体、骆驼抗体及其衍生物(特别是小于约50kDa的实体)、抗体模块(例如小于约50kDa)、Adtein(例如以其它特异性结合靶物同时具有一项或多项本文中所描述的药学或生物化学特性(特别是那些涉及酪氨酸激酶受体的)的介于5和40kDa之间的蛋白质)、基于纤连蛋白的支架蛋白(例如AdnectinTM)、或抗体替代物(诸如Avimers、微体、Trans-bodiesTM、AffibodiesTM、Affilins、或三连蛋白(trinectin)(例如四连蛋白(tetranectins))和其它蛋白质(像脂笼蛋白或锚蛋白(DARPin))衍生物。在有些实施方案中，第一和第二相连接的蛋白质总共具有1或0个二硫键。为了改善基于细胞的系统中的蛋白质生成可能希望这样。优选的是，所述第一蛋白基本上是具有基本上单价的对IGF-IR的结合的单一域。为了改善基于细胞的系统中的蛋白质生成可能希望这样。优选的是，所述第一蛋白以约100pm或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且具有至少两个参与所述第一蛋白结合人IGF-IR的结构环。优选的是，所述第二蛋白是通过至少一个肽键与所述第一蛋白相连接的基于纤连蛋白的支架蛋白。在有些实施方案中，所述第一蛋白和第二蛋白通过至少一个二辟d建相连接。虽然这可以在细胞中实现，但是可能希望在体外在没有细胞的情况中实施。本发明的多肽可包括以约300pM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且具有至少两个参与所述第一蛋白结合人IGF-IR的结构环的第一蛋白。优选的是，所述第一蛋白以约1nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体。优选的是，本发明的多肽进一步包含与所述第一蛋白或所述第二蛋白可操作相连接的PEG模块。优选的是，所述第二蛋白结合人癌症中上调的人酪氨酸激酶受体，其中所述第二蛋白以约10nM或更少的结合亲和力结合人酪氨酸激酶受体且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体。在有些实施方案中，本发明的多肽可包含总共具有至少6个二^5充键，或者在另一个方面，总共具有至少8个二硫键的第一蛋白和第二蛋白。优选的是，所述第一蛋白和所述第二蛋白是自微生物表达的单一多肽。优选的是，所述第一蛋白以约100pM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且具有至少两个参与所述第一蛋白结合人IGF-IR的结构环。在有些实施方案中，所述第一蛋白和所述第二蛋白中至少一个是抗体模块。优选的是，此类抗体模块小于约50kDa，或者在另一个方面中，小于约40kDa。在有些实施方案中，抗体模块是单链抗体模块。蛋白质治疗剂包括其中所述第二蛋白结合以下人蛋白质和配体之一的实施方案，蛋白质EGFR、叶酸受体、Her2、Her3、c-kit、c-Met、FGFRI、FGFR2、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGF3、和Tie2;配体Angl、Ang2、FGF、EGF、HGF、干细胞因子(SCF)、VEGF-A、VEGF-C、和VEGF-D。在有些实施方案中，第一蛋白和/或第二蛋白是脂笼蛋白的衍生物。在有些实施方案中，所述第一蛋白和所述第二蛋白中至少一个是四连蛋白的衍生物。在有些实施方案中，所述第一蛋白模块和所述第二蛋白模块中至少一个是avimer的书亍生物。PEG可用在本发明的许多方面中，而且可以爿使用不同大小，如本文中所描述的，用于实现期望的治疗效果或其它体内效果，诸如成像。为了延迟在身体、血液、非血液胞外流体和组织中的半衰期优选较大的PEG。对于体内细胞活性，优选约10-60kDa范围的PEG，以及小于约IOOkDa、更优选小于约60kDa的PEG，虽然也可使用大约约100kDa的大小。对于体内成像应用，可使用较小的PEG，一般小于约20kDa，它们不像较大PEG那样多地延长半衰期，从而容许更快地分布和更短的半衰期。在有些实施方案中，本发明的多肽包含经单一Cys或Lys与PEG可操作相连接的第一蛋白和第二蛋白。在有些实施方案中，至少第一或第二蛋白具有不超过一个Cys或Lys。在有些实施方案中，该单一Cys或Lys位于所述第一或第二蛋白中，位于氨基酸序列中的野生型位置。在有些实施方案中，本发明的多肽包含第一和第二蛋白，其中所述第一蛋白抑制细胞增殖，具有至少55。C的Tm，且在其氨基酸序列中基本上不干扰对人IGF-IR的结合的区域中具有非野生型Cys或Lys。在有些实施方案中，第一蛋白和第二蛋白是自微生物表达的单一多肽。在有些实施方案中，第一蛋白以约50pM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且具有至少两个参与所述第一蛋白结合人IGF-IR的结构环。在有些实施方案中，本发明的多肽具有IV施用的情况中至少l天的体内半衰期。在有些实施方案中，本发明的多肽具有施用后在啮齿类动物中持续超过24小时浓度为所述第一蛋白对人IGF-IR的结合亲和力的至少约10倍的暴露水平。在有些实施方案中，本发明的多肽具有皮下施用后在啮齿类动物中持续超过24小时浓度为所述第一蛋白对人IGF-IR的结合亲和力的至少约100倍的暴露水平。在有些实施方案中，第一或第二蛋白是基于纤连蛋白的支架蛋白。取决于诊断、治疗、体外或体内应用，可使用本发明多肽对IGF-IR、其它人蛋白质、或PK模块的多种亲和力。例如，解离常数类似于或小于约luM、约100nM、约10nM、约lnM、约100pM、约10pM、约lpM或约100fM的亲和力是优选的，特别是对于IGF-IR。对期望靶物具有不同亲和力的本发明蛋白质的体内测试有助于选择用于体内应用的期望亲和力。依赖于其它蛋白质的存在和IGF-IR的量的体外测试一般可使用与体内应用相比具有不同亲和力的本发明蛋白质。通常，在体外可使用较低的亲和力或较弱的结合。在有些实施方案中，该多肽是通过包括以下步骤的方法选择的"Fn3域a)生成一群候选RNA分子，每种包含与人^Fn3域编码序列不同的候选第十纤连蛋白III型(，n3)域序列，所述RNA分子每种都包含与所述候选"Fn3域编码序列可操作相连接的翻译起始序列和起始密码子且每种都在3'端与核酸-。票呤霉素接头可操作相连接；b)在体外翻译所述候选"Fn3域编码序列以生成一群候选RNA，Fn3融合物；c)使所述候选RNA-Fn3融合物群与IGF-IR接触；并d)选择如下RNA-，n3融合物，其蛋白质部分具有相对于所述人^Fn3对IGF-IR的结合亲和力或特异性改变的对IGF-IR的结合亲和力或特异性。本发明的一个方面涉及包含结合人靶物的基于纤连蛋白的支架蛋白的多肽。在有些实施方案中，该多肽进一步包含本文中所描述的PK模块。PK模块可以通过合适的接头(诸如本文中所描述的那些)与基于纤连蛋白的支架蛋白相连接。本发明的一个方面提供了能够在存在生长刺激物(诸如例如血清、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II)时抑制癌细胞生长超过约80%的本发明多肽。本发明的又一个方面提供了包含本发明多肽的药学可接受组合物，其中该组合物基本上不含内毒素。优选的是，该组合物基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。该组合物可以配制用于例如IV、IP或皮下施用。本发明的又一个方面提供了包含编码一种或多种本发明多肽的多核苷酸的细胞。也包括包含此类蛋白质的多核苷酸的载体。序列优选是经过优化的，以使在所使用的细胞类型中的表达最大化。优选的是，表达是在大肠杆菌中。本发明的蛋白质也可以在例如真核微生物中表达，包括酵母(例如毕赤氏酵母(pichia)或酿酒酵母(cervaisea))或蓝绿藻。可以改造酵母细胞以在本文中所描述的任何蛋白质上产生期望的糖基化。一方面，可以改造哺乳动物细胞以在本文中所描述的任何蛋白质上产生期望的糖基化。一方面，细胞表达基于纤连蛋白的支架蛋白。一方面，编码基于纤连蛋白的支架蛋白的多核普酸是为了在所选择的细胞类型中的表达经过密码子优化的。本发明的一个方面提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，其单独地或与其它细胞毒剂或治疗剂联合地通过施用本发明的新多肽。癌症可以是例如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、或其中与非致瘤细胞相比在生理学上IGF-IR水平升高、上调、突变或改变的其它待确定癌症中的一种或多种。本发明的另一个方面提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，其通过单独地或与其它细胞毒剂或治疗剂联合地施用本发明的多肽。具体而言，优选的细胞毒剂和治疗剂包括多西他塞(docetaxel)、帕利他塞(paclitaxel)、多柔t匕星(doxorubicin)、表柔t匕星(epirubicin)、主不石粦醜胺(cyclophosphamide)、曲妥单抗(trastuzumab)、卡培他滨(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氟维司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞片木(goserelin)、奥沙利铀(oxaliplatin)、卡確白(carboplatin)、J侦4白(cisplatin)、i也塞米^^(dexamethasone)、安肽(antide)、贝伐单抗(bevacizumab)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)、亚叶酸15(leucovorin)、左口米p坐(levamisole)、4尹立替康(irinotecan)、依4乇泊芬(etoposide)、托泊替康(topotecan)、吉西他滨(gemdtabine)、长春瑞滨(vinorelbine)、处,莫司汀(estramustine)、米4毛蒽醌(mitoxantrone)、阿巴瑞克(abarelix)、唑来膦酸盐(zoledronate)、链佐星(streptozocin)、利妥昔单抗(rituximab)、伊达比星(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氟达拉滨(fludarabine)、伊马替尼(imatinib)、阿糖胞芬(cytarabine)、替叶尹莫单抗(ibritumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、千4尤素a-2b(interferonalpha-2b)、美法仑(melphalam)、bortezomib、六曱蜜胺(altretamine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、gefitinib、erlonitib、抗EGF受体抗体(例^口西妥昔单净元(cetuximab)或panitumumab)、ixabepilone、和epothilone或其衍生物。更优选的是，治疗剂是铂剂(诸如卡铂、奥沙利铂、顺铀)、紫杉烷(taxane)(诸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他滨、或喜树碱(camptothecin)。另外，可能优选联合本发明的多肽与第二治疗性蛋白质成为单一分子，或者可能成为单一分子再联合第三治疗性蛋白质。这样的治疗性实体包括通过PEG或其它聚合物(例如Cys-Cys二硫化物或多肽)相连接的本发明蛋白质与一种或多种治疗性蛋白质。此类治疗性蛋白质包括抗体衍生物(例如Fab、骆驼抗体及其衍生物、域抗体(例如大小小于约50kDa)和单链(优选大小小于约50kDa))、AdnectinsTM和优选在约5-约40kDa范围内的蛋白质。本发明蛋白质的靶物包括(特别是人型式的，尽管在有些情况中是模式物种型式的，诸如小鼠、大鼠、猴、和犬)IGF-IR、.FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、人pl85受体样酪氨酸激酶(HER2或Her2)、Her3、c-Met、叶酸受体、PDGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、人血管内皮生长因子(VEGF)A、VEGFC、VEGFD、人CD20、人CD18、人CDlla、人凋亡受体-2(Apo-2)、人a4(37整联蛋白、人GPIIb-IIIa整联蛋白、干细胞因子(SCF)、人表皮生长因子受体(EGFR)、和人CD3。另外，本发明的各方面包括结合第一靶物和至少一种其它靶物的多功能蛋白质。优选的是，此类蛋白质通过本文中所描述的PEG相关发明相连接，尽管在许多实施方案中，此类蛋白质可通过多肽或其它聚合物接头或非聚合物接头相连接。稳定连接的本发明蛋白质可用于癌症的治疗性处理。在针对2、3、4或更多种治疗性靶物或表位时，本发明的多特异性蛋白质具有调控、阻断或抑16制超过一种治疗耙物的优点。可以用治疗剂的相应生物学靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。癌症可以是例如乳腺癌(breastcancer)、结肠癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、和横紋肌肉瘤、或其中与非致瘤细胞相比在生理学上IGF-IR水平升高、上调、突变或改变的其它待确定癌症中的一种或多种。可以靶向的其它例示类型的肿瘤包括急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、胆癌(biliarycancer)、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、肺癌、髓性曱状腺癌(medullarythyroidcancer)、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌、和膀胱癌。另外，可以通过本发明的多肽靶向肿瘤相关靶物。在有些实施方案中，抗原靶向会有助于在组织分布方面定位治疗剂或者提高在组织或期望细胞类型中实现的局部浓度。或者，可以与本文中所描述的耙物之一(针对它创建了治疗剂)一起提供别的作用机制来抗击癌症。此类抗原或耙物包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、对于A33抗体特异性的抗原、BrE3抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亚基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP画1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧可诱导因子(HIF)、KC4抗原、KS-1抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4抗原、PSA、PSMA、RS5、S亂TAG画72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-I(IGF-I)、胰岛素生长因子-II(IGF-II)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、胎盘生长因子(P1GF)、17-1A抗原、血管发生标志物(例如ED-B纤连蛋白)、癌基因标志物、癌基因产物、和其它肿瘤相关抗原。最近关于肿瘤相关抗原的报告包括Mizukami等，(2005,NatureMed.11:992-97);Hatfield等，(2005，Curr.CancerDrugTargets5:229-48);Vallbohmer等(2005,J.Clin.Oncol.23:3536-44);及Ren等(2005，Ann.Surg.242:55-63)，通过述及将每一篇收入本文。在其它实施方案中，抗血管发生剂可形成治疗剂的一部分且可与本发明的蛋白质可操作相连接。例示性的可使用的抗血管发生剂包括血管他丁(angiostatin)、baculostatin、canstatin、maspin、净元VEGF才元体或肽、4元月台盘生长因子抗体或肽、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-IO、Gro-卩、血小板反应蛋白(thrombospondin)、2-曱氧基雌二醇、多育曲菌素相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马里马司他(Marimastat)、多石克酸戊聚糖(pentosanpolysulphate)、血管生成素(angiopoietin2)、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、利诺胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可碱(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP-470、内皮他丁(endostatin)、巾白利他塞、accutin、血管他丁(angiostatin)、西多福韦(cidofovir)、长春新石威(vincristine)、博来霉素(bleomycin)、AGM画1470、血小板因子4或米诺环素。本发明的另一个方面提供了包含一种或多种本文中所描述的要素及关于使用那些要素的说明书的试剂盒。在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包括单独的或与第二治疗剂一起的本发明蛋白质。此优选实施方案的说明书包括关于使用单独的或与第二治疗剂一起的本发明蛋白质抑制癌细胞生长的说明书，和/或关于使用单独的或与第二治疗剂一起的本发明蛋白质治疗患有癌症的患者的方法的说明书。本发明的另一个方面提供了基于蛋白质的组合物，其包含特异性结合人IGF-IR的第一蛋白；其中所述第一蛋白的MW介于约4kD和约40kD之间，与人IGFI或IGF1I具有小于约30。/。的氨基酸同一性，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。在有些实施方案中，该组合物进一步包含PK模块，诸如PEG或结合人血清清蛋白的蛋白质。在有些实施方案中，第一蛋白具有约lnM或更少的对IGF-IR的解离常数。在有些实施方案中，该组合物阻断IGF-I或IGF-II结合IGF-IR。本发明的另一个方面提供了基于蛋白质的组合物，其包含以约10nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体的第一蛋白；其中所述第一蛋白基本上是对于人IGF-IR具有基本上单价的结合的单一域，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。在有些实施方案中，该组合物进一步包含通过肽一睫与所述第一蛋白相连接的第二蛋白，其中所述第二蛋白以约1OnM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且18以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体。在有些实施方案中，该组合物进一步包含通过至少一个肽键与所述第一蛋白相连接的第二蛋白，其中所述第二蛋白以约300nM或更少的结合亲和力结合人血清清蛋白。在有些实施方案中，该组合物进一步包含通过PEG与所述第一蛋白相连接的第二蛋白，其中所述第二蛋白以约1OnM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体。在有些实施方案中，第一或第二蛋白包含基于纤连蛋白的支架蛋白。本发明的另一个方面提供了基于PEG的组合物，其包含与以约100nM的结合亲和力结合人IGF-IR的第一蛋白和结合人蛋白质的第二蛋白相连接的第一PEG;其中所述PEG介于约.5kD和约I00kD之间，且所述组合物基本上不含游离PEG且基本上不含微生物污染，使之适用于体内施用。在有些实施方案中，第二蛋白以约lnM或更少的结合亲和力结合至少一种人酪氨酸受体或至少一种人酪氨酸受体配体且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体。在有些实施方案中，这两种蛋白质之一或均为基于纤连蛋白的支架蛋白。本发明的另一个方面提供了基于蛋白质的组合物，其包含可^t喿作相连4妻的结合人IGF-IR的第一蛋白和结合人蛋白质的第二蛋白；其中所述第一蛋白以约1OnM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约1uM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。在有些实施方案中，该基于蛋白质的组合物进一步包含与所述第一蛋白或所述第二蛋白之任一可操作相连接的PEG模块。在有些实施方案中，第二蛋白结合在人癌症中上调的人酪氨酸激酶受体，其中所述第二蛋白以约10nM或更少的结合亲和力结合人酪氨酸激酶受体且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体。本发明的另一个方面提供了蛋白质治疗剂，其包含可操作相连接的结合人IGF-IR的第一蛋白模块和结合人治疗性靶物的第二蛋白模块；其中所述第一蛋白以约10nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，其基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用；且进一步的，其中所述第二蛋白以约10nM或更少的结合亲和力结合人治疗性耙物且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。在有些实施方案中，第一蛋白和第二19蛋白是自微生物表达的单一多肽。本发明的另一个方面提供了蛋白质治疗剂，其包含与PEG可操作相连接的结合人IGF-IR的第一蛋白模块，该PEG与结合人治疗性靶物的第二蛋白才莫块可操作相连接；其中所述第一蛋白模块以约10nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用；且进一步的，所述第二蛋白模块以约力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。在有些实施方案中，第一蛋白模块和第二蛋白模块总共具有至少6个二硫键。本发明的另一个方面提供了蛋白质治疗剂，其包含与PEG可操作相连接的结合人IGF-IR的第一蛋白模块，该PEG与结合人治疗性靶物的第二蛋白模块可操作相连接；其中所述第一蛋白模块以约10nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体且对于人IGF-IR的结合基本上是单价的，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用；且进一步的，其中所述第二蛋白模块以约10nM或更少的结合亲和力结合人治疗性靶物且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体且对于人IGF-IR的结合，且基本上不含孩i生物污染，使之适合于体内施用。本发明的另一个方面提供了蛋白质治疗剂，其包含与生物相容性聚合物可操作相连接的结合人IGF-IR的第一蛋白模块，该生物相容性聚合物与结合人治疗性靶物的第二蛋白模块可操作相连接；其中所述第一蛋白模块以约10nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约1uM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，4吏之适合于体内施用；进一步的，其中所述第二蛋白模块以约10nM或更少的结合亲和力结合人治疗性靶物且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用；且进一步的，其中所述第一蛋白模块和第二蛋合超过一种治疗性靶物的治疗收益最大化。在有些实施方案中，该多肽具有血液或靶组织中的蛋白酶可切割的蛋白酶位点。本发明的另一个方面提供了蛋白质治疗剂，其包含与PEG可操作相连接的结合人IGF-IR的第一蛋白，该PEG与结合人蛋白质的第二蛋白可操作相连接；其中所述第一蛋白以约10nM或更少的结合亲和力结合人IGF-IR且以约luM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体且是人IGF-IR的拮抗剂，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用；且进一步的，其中所述第二蛋白以约10nM或更少的结合亲和力结合人治疗性靶物且以约1uM或更大的结合亲和力结合人胰岛素受体，且基本上不含微生物污染，使之适合于体内施用。在有些实施方案中，第一蛋白抑制细胞增殖，具有至少55。C的Tm,且在其lys。在有些实施方案中，蛋白质治疗剂具有IV施用的情况中至少1天的体内半衰期。在有些实施方案中，蛋白质治疗剂具有施用后在啮齿类动物中持续超过24小时浓度为所述第一蛋白对人IGF-IR的结合亲和力的至少约10倍的暴露水平。在有些实施方案中，第一和/或第二蛋白是基于纤连蛋白的支架。本发明的另一个方面提供了细胞，其包含编码一种或多种本文中所描述的蛋白质的多核苷酸。在有些实施方案中，该细胞是经过改造以在本文中所描述的任何蛋白质上产生期望的糖基化的酵母。在有些实施方案中，该细胞是蓝绿藻。在有些实施方案中，该细胞是经过改造以在本文中所描述的任何蛋白质上产生期望的糖基化的哺乳动物细胞。在有些实施方案中，该蛋白质是基于纤连蛋白的支架且任选具有为了在细胞中的表达经过密码子优化的多核苦酸。附图简述图l。关于结合人IGF-IR的克隆的分离的选择概况。显示的是图示使用随机纤连蛋白支架域蛋白文库进行的PROrusion实验过程中百分比IGF-IR结合增加的图。将一万亿个mRNA/cDNA-蛋白质融合物的文库结合至溶液中的100nM生物素化IGF-IR,并捕捉至链霉亲合素包被的磁珠上。将cDNA洗脱，通过PCR扩增，并用于生成mRNA/cDNA-蛋白质融合物的新文库。以这种方式实施5轮PROfusion,并通过定量PCR监测文库中结合IGF-IR的百分比。图2。人IGF-IR竟争性克隆的SDSPAGE。显示的是显示通过HTPP纯化的人IGF-IR竟争性Adnectins的SDSPAGE凝胶，如实施例35中所述。将样品加载到10%NuPAGE微型胶上并使用Sypro橙染色。图3。人IGF-IR竟争性克隆218C04的纯化步骤的SDSPAGE。SDSPAGE凝胶图示了人IGF-IR竟争性纤连蛋白支架域蛋白质的最终产物(即此例中的领先(lead)克隆218C04)的质量和典型的中等规^莫纯化，如实施例35中所述。图5。人IGF-IR竟争性克隆218C04的优化。该示意示了人IGF-IR纤连蛋白支架域蛋白领先者(在此例中是克隆218C04)的典型优化步骤。图5a显示了通过分别随机化克隆218C04的一个环得到的3个文库的结果。将一万亿个mRNA/cDNA-蛋白质融合物的文库结合至溶液中的lOOnM生物素化IGF-IR，并捕捉至链霉亲合素包被的磁珠上。将cDNA洗脱，通过PCR扩增，并用于生成mRNA/cDNA-蛋白质融合物的新文库。重复文库构建和亲和选择过程，直至结合至IGF-IR的百分比超过1。/。，正如通过定量PCR所测量的。此时，扩增经过优化的环并重组以生成包含所有三个优化环的单一文库(图5b)。将来自此文库的mRNA/cDNA-蛋白质融合物捕捉到IGF-IR包被的珠上，接着是3轮用lnM生物素化IGF-IR进行的PROfiision。在每种情况中，结合百分比是通过定量PCR测量的(图5c)。图6。克隆218C04优化克隆的IGF-I/IGF-IR竟争性测定法。该图显示了具有改善的在实施例35所述竟争性ELISA中抑制IGF-I和IGF-IR间相互作用的能力的经过优化的纤连蛋白支架域蛋白的例子。图7。所选择的克隆218C04优化的、纯化的IGF-IR克隆的SDSPAGE。显示的是SDSPAGE,其显示了如实施例35中所述自领先者(leads)的优化衍生的并通过纯化的改善的人IGF-IR竟争性Adnectins。将样品加载到10%NuPAGE微型胶上并使用Sypro橙染色。图8。经过优化的竟争性IGF-IR克隆338A06的差示扫描量热法。代表性IGF-IR优化克隆(在这种情况中是克隆338A06)的差示扫描量热法(DSC)。黑色迹线是原始数据，红色迹线是拟合。如实施例35中所述实施DSC。图9。经过优化的IGF-IR竟争性克隆338A06的SEC。自优化过程衍生的代表性人IGF-IR竟争性纤连蛋白支架域蛋白(具体是克隆338A06)的大小排阻层析图。层析详情如实施例35中所述。采用荧光检测。图IO。经过优化的IGF-IR竟争性克隆338A06的SECMALLS。纤连蛋白支架域蛋白克隆338A06的SEC-MALLS分析。洗脱峰的洗脱时间对摩尔质量的图。Rayleigh比指所散射的光超过单独的溶剂所散射的光的过量(只显示图ll。IGF-IR竟争性克隆338A06的质语。人IGF-IR竟争性克隆338A06的MALDIMS。样品制备和实验条件如实施例35中所述。图12。克隆338A06的IGF-I增殖测定法。该图呈现了所选择的人竟争性IGF-IR结合克隆(在这种情况中是338A06)对IGF-I介导的有丝分裂的抑制。包括了与商品化中和性抗IGF-IR单抗(MAB391)的比较。如实施例35所示1吏用人胰腺腺癌细胞系BxPC-3图13。IGF-IR竟争性克隆338A06的IGF-IR抑制测定法。该图呈现了所选择的人竟争性IGF-IR结合克隆(在这种情况中是克隆338A06)对IGF-I和IGF-IR间相互作用的破坏。包括了与IGF-I和商品化中和性抗IGF-IR单抗(MAB391)的比较。如实施例35所述使用人乳腺腺癌MCF-7。图14。克隆338A06FG环优化的克隆的IGF-IR结合测定法。该图显示了克隆338A06FG环优化的克隆在实施例35所述直接结合ELISA中的活性。图15。FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的SEC。18种所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的大小排阻层析图。层析条件如实施例29中所述。采用荧光检测。图16。IGF-IRFG环优化的克隆387B01的SEC。中等规模水平纯化的代表性人FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆(具体是克隆387B01)的大小排阻层析图。层析详情如实施例35中所述。釆用荧光检测。图17。IGF-IRFG环优化的克隆387B01的RP-HPLC。代表性人FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆(具体是克隆387B01)的RP-HPLC层析图。层析详情如实施例35中所述。采用A280nm检测。图18。IGF-IRFG环优化的克隆387B01的MALDITOF质谱。中等规模水平纯化的代表性人FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆(具体是克隆387B01)的MALDIMS。样品制备和实验条件如实施例35中所述。图19。PEG化蛋白质的SDSPAGE。显示的是SDSPAGE凝胶，其显示了385A08的PEG化型式。PEG化条件如实施例35中所述。将样品加载到10%NuPAGE微型胶上并使用Sypro橙染色。图20。PEG化人IGF-IR变体的基于细胞的测定法。该图呈现了所选择的IGF-IR克隆385A08的PEG化型式对血清介导的增殖的抑制。如实施例35中所述使用人浆细胞瘤细胞系NCI-H929。图21。IGF-IR多聚体的基于细胞的测定法。该图呈现了所选择的IGF-IR结合性纤连蛋白支架克隆对IGF介导的增殖的抑制。在存在100ng/mLIGF和不同浓度的每种IGF-IR拮抗剂时将工程化淋巴细胞细胞系32D:IGF-IR在含100/c)胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以10000个细胞每孔的浓度分配入96孔板(*IGF-IR单克隆抗体MAB391;■IGF-IR结合克隆385A08(SEQIDNO:226);〇通过PEG相连接的两个IGF-IR结合克隆(SEQIDNO:203):385A08-PEG20-385A08;▲通过二硫键相连接的两个IGF-IR结合克隆(SEQIDNO:203):385A08-SS-385A08)。图22。IGF-IR/VEGFR2多聚体的基于细胞的IGF-IR测定法。该图呈现了所选择的IGF-IR结合性纤连蛋白支架克隆对血清介导的增殖的抑制。在存在不同浓度的每种IGF-IR拮抗剂时将人浆细胞瘤细胞系NCI-H929(ATCC,Manassas,VA)在含10。/o胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以25000个细胞每孔的浓度分配入96孔板(抗IGF-IR单克隆抗体MAB391,R&DSystems,Minneapolis,画；〇IGF-IR结合克隆385A08(SEQIDNO:203);▲通过PEG相连接的VEGFR2/IGF-IR结合克隆(SEQIDNO:203):385A08-PEG20-SEQIDNO:128;■VEGFR2结合克隆(SEQIDNO:128))。图23。IGF-IR/VEGFR2多聚体的基于细胞的VEGFR2测定法。该图呈现了所选择的IGF-IR结合性纤连蛋白支架克隆对VEGF介导的增殖的抑制。在存在5ng/mLVEGF和不同浓度的每种VEGFR2拮抗剂时将工程化原B细胞系hKE8-3(Ba/F3:VEGFR2)在含10。/。胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以25000个细胞每孔的浓度分配入96孔板(VEGFR2结合克隆SEQIDNO:128;〇对照SEQIDNO:227;▲通过PEG相连接的VEGFR2/IGF-IR结合克隆(SEQIDNO:203):385A08-PEG20-SEQIDNO:128)。图24。VH和"Fn3域结构。为具有免疫球蛋白折叠(免疫球蛋白Vh域，左边)的单域多肽和具有免疫球蛋白样折叠(^Fn3域，右边)的单域多肽描绘了结果组织。图25。连接至HAS的纤连蛋白支架IGF-IR结合物的评估。该图呈现了所选择的IGF-IR结合性纤连蛋白支架克隆对血清介导的增殖的抑制。在存在不同浓度的每种IGF-IR拮抗剂时将人浆细胞瘤细胞系NCI-H929(ATCC,Manassas,VA)在含10。/。胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad,CA)中以25000个细胞每孔的浓度分配入96孔板(抗IGF-IR单克隆抗体MAB391,R&DSystems,Minneapolis,MN;〇IGF-IR结合克隆385A08(SEQIDNO:203);▲HSA-385A08(SEQIDNO:203);■人血清清蛋白，HSA，Invitrogen,Carlsbad,CA)。让细胞于37。C，5%C02增殖72小时。增殖期后，使细胞暴露于细胞滴定96水性增殖试剂(Promega,Madison,WI)并再温育4小时。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上测量490nm吸光度，并4吏用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得数据。图26。IGF-IR构建物的体内胂瘤抑制。将中值肿瘤体积(mg)(y轴)对肿瘤植入后天数(x轴)绘图。x轴底部的三角形指示施药。IGFIR化合物(一种IGF-IR拮抗剂)、385A08(SEQIDNO:226)、385A08-PEG20-385A08(SEQIDNO:203画PEG20-SEQIDNO:203)、385A08-PEG40(SEQIDNO:203)、和385A08-HSA(SEQIDNO:203)在Rh41异种移植物模型中展现出不同程度的肿瘤抑制。图27。IGF-IR构建物的体内肿瘤生长抑制。将达到中值组肿瘤大小500mg的天数(y轴)对图26所示不同处理组(x轴)绘图。达到目标大小的组中值时间以水平线标示。对于相对于对照达到500mg的时间，*p^0.05或"氺p^0扁5。图28。IGF-IR-Fc融合构建物的表征。上图显示了SDSPAGE凝胶，最左边的一栏是分子量标志物，接着是未还原的IGF-IR-Ig(泳道l)、endo-H处理的IGF-IR-Ig(泳道2)、和EndoH(泳道3)。endoH处理后向更小质量的小位移指示了IGF-IR-Ig蛋白具有少量的糖基化。下图显示了存在还原剂时的SDSPAGE凝胶，最左边的一栏是分子量标志物，接着是未处理的IGF-IR-Ig(泳道l)、endo-H处理的IGF-IR-Ig(泳道2)、endo-H和SDS处理的IGF-IR-Ig(泳道3)和EndoH(泳道4)。正如能看到的，观察到的质量是未还原样品的大小的大约一半，正如对二硫化物相连接的完整IGF-IR-Ig所预期的。图29描绘了用于评估385A08-Fc抑制Rh41人横紋肌肉瘤细胞中IGF-lRAKT和MAPK磷酸化的能力的Western印迹。将细胞用IGF-I、IGF-II、胰岛素配体(50ng/ml)刺激或不刺激(NS)，然后用各种浓度的385A08-Fc(SEQIDNO:226)处理。用所示抗体以及磷酸特异性抗体探查膜。25图30描绘了人纤维蛋白III型域的野生型第十模块(SEQIDNO:1)、实施例2中所鉴定的IGF-IR竟争性克隆(SEQIDNO:2-109)、来自实施例8的经过优化的218C04克隆(SEQIDNO:110-125)、例示性的VEGFR-2结合"Fn3多肽(SEQIDNO:126-183)、来自实施例18的经过优化的338A06克隆(SEQIDNO:184-202)、来自图21的IGF-IR结合克隆385A08对照(SEQIDNO:226)、来自图23的纤连蛋白支架蛋白对照(SEQIDNO:227)、例示性的HSA-IGF-IR融合蛋白(SEQIDNO:228-235)、和例示性的运铁蛋白-IGF-IR融合蛋白(SEQIDNO:236-243)的氨基酸序列。BC、DE、和FG环在SEQIDNO:l-125中以阴影标示。发明详述定义本文中所描述的方法学已经成功地用于开发本发明的蛋白质，其包括但不限于自至少两组相关蛋白质结构(那些具有免疫球蛋白折叠的蛋白质和那些具有免疫球蛋白样折叠的蛋白质)衍生的单域IGF-IR结合多肽。"多肽"指两个或更多个氨基酸的任何序列，无论长度、翻译后修饰、或功能。"多肽"、"肽"、和"蛋白质"在本文中可互换使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，诸如美国专利No.6,559,126(通过述及收入本文)中披露的那些。还可以以多种标准化学方式之任一修饰多肽(例如可以用保护基团修饰氨基酸；可以将羧基末端氨基酸变成末端酰胺基团；可以用基团修饰氨基末端残基以例如增强亲脂性；或者，可以化学糖基化或以其它方式修饰多肽以提高稳定性或延长半衰期)。多肽修饰可包括另一结构(诸如环状化合物或其它分子)对多肽的附着，而且还可包括包含一个或多个处于改变的构型(例如R或S;或者L或D)的氨基酸的多肽。术语"单域多肽"(singledomainpolypeptide)用于指示受试多肽的耙物结合活性(例如IGF-IR结合活性)位于单一结构域内，不同于例如抗体和单链抗体(其一般由重链可变域和轻链可变域二者贡献出抗原结合活性)。可以连接本文中所公开的种类的多种单域多肽以创建亲合力提高的复合分子。类似的，可以将单域多肽附着(例如作为融合蛋白)至任何数目的其它多肽(诸如焚光多肽、耙向多肽和具有独特治疗效果的多肽)。术语"PK"与"药动学"同义且涵盖化合物的特性，包括例如受试者对26它的吸收、分布、代谢、和消除。"PK调控蛋白"或"PK模块"指在与生物学活性分子融合或一起施用时影响生物学活性分子的药动学特性的任何蛋白质、肽、或模块。PK调控蛋白或PK模块的例子包括PEG、人血清清蛋白(HSA)结合物(如美国公开文本No.20050287153和20070003549中所公开的)、人血清清蛋白、Fc或Fc片段、和糖(例如唾液酸)。免疫球蛋白或免疫球蛋白样支架的单域多肽会趋于共享某些结构特征。例如，该多肽可包含约80个-约150个氨基酸，这些氨基酸在结构上组织成一组P或(3样链，形成I3片层，其中P或P样链通过居间环部分相连接。重链可变域和^Fn3域的结构组织的例子显示于图24。P片层形成单域多肽的稳定核心，同时创建两个由连接(3或P样链的环构成的"面"("face")。如本文中所描述的，这些环可以变化以创建定制的配体结合位点，而且在正确控制下，可以在不破坏蛋白质整体稳定性的情况下产生此类变异。在抗体中，三个这样的环是众所周知的互补决定区(或"CDR")。用于形成单域多肽的支架应当在生理学条件中高度可溶和稳定。免疫球蛋白支架的例子是单域VH或VL支架，以及单域camelidVHH结构域(在camelids中找到的一种重链可变域形式)或在自然界中找到的或在实验室中改造的其它免疫球蛋白可变域。在本文中所公开的单域格式中，免疫球蛋白多肽不需要与第二多肽形成二聚体来实现结合活性。因而，可以改变天然包含介导与第二蛋白的二硫化物交联的半胱氨酸的任何此类多肽以消除该半胱氨酸。或者，可以保留该半胱氨酸用于将别的模块(诸如PEG)缀合至单域多肽。其它支架可以是非抗体支架蛋白。"非抗体支架蛋白或域"指具有免疫球蛋白样折叠的非抗体多肽。"免疫球蛋白样折叠"指包含两层反向平行的(3片层且这两个(3片层的平坦、疏水性面彼此面对面包装的约80-150个氨基酸残基的蛋白质域。这样的支架的例子是"基于纤连蛋白的支架蛋白"，其指基于纤连蛋白III型域(Fn3)的多肽。基于纤连蛋白的支架蛋白的一个例子是AdnectinsTM(AdnexusTherapeutics,Inc.)。纤连蛋白是在胞外基质形成和细胞-细胞相互作用中发挥至关重要作用的大型蛋白质；它由三种类型(I型、II型、和III型)小型结构域的许多重复组成(Baron等，1991)。Fn3自身是一个大型亚家族的范例，该亚家族包括细胞粘附分子、细胞表面激素和细胞因子受体、伴侣、和碳水化合物结合域的一部分。综述参见Bork和Doolittle,ProcNatlAcadSciUSA.1992Octl;89(19):8990-4;Bork等，JMolBiol.1994Sep30;242(4):309画20;Campbell和Spitzfaden,Structure.1994May15;2(5):333-7;Harpez和Chothia,JMolBiol,1994May13;238(4):528-39。优选的是，基于纤连蛋白的支架蛋白是"1QFn3"支架，其指基于人纤连蛋白III型蛋白质的第一模块的多肽变体，其中一个或多个溶剂可及环被随机化或突变，特别是鉴定为BC环(氨基酸23-30)、DE环(氨基酸52-56)和FG环(氨基酸77-87)(编号方式基于人纤连蛋白III型结构域的野生型第十模块的序列)的三个环中的一个或多个VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPV卿TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQIDNO:l)。优选的是，基于纤连蛋白的支架蛋白基于SEQIDNO:l。已经报告了多种突变型"Fn3支架。一方面，Asp7、Glu9、和Asp23中的一个或多个被另一种氨基酸(诸如例如不带负电荷的氨基酸残基，例如Asn、Lys、等)替换。已经报告了这些突变具有与野生型相比促进突变型1QFn3在中性pH处的更大稳定性的效果(参见例如PCT公开文本No.WO02/04523)。已经公开了1QFn3支架中或是有益的或是中性的多种别的改变。参见例如Batori等，ProteinEng.2002Dec;15(12):1015-20;Koide等，Biochemistry2001Aug28;40(34):10326-33。变型和野生型"Fn3蛋白都特征在于相同的结构，即称作A-G的七个P链域序列和连接前述七个P链域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和FG环)。位置与N-和C-末端最接近的P链在溶液中可采取P样构象。在SEQIDNO:l中，AB环对应于残基15-16,BC环对应于残基22-30,CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-55，EF环对应于残基60-66,而FG环对应于残基76-87。如图24中所示，BC环、DE环、和FG环都位于多肽的同一端。类似的，免疫球蛋白支架趋于具有至少七个I3或P样链，而且常常是九个P或P样链。基于纤连蛋白的支架蛋白可包含其它Fn3型纤连蛋白域，只要它们展现出有用的活性和与^Fn3型域相似的特性。本文中所公开的单域多肽可具有分布在至少两个(3片层间的至少五至七条(3或(3样链，和至少一个连接两个P或(3样链的环部分，该环部分参与对IGF-IR的结合，该结合的特征在于小于lxl(^M和优选小于lxlO-SM的解离常数。如本文中所描述的，体内治疗用途特别想要具有小于5xl0一M的解离常数的多肽来抑制配体信号传导。回体(exvivo)或体内检测或标记IGF-IR蛋白的用途可能想要具有介于lxl(^M和5xl0"M之间的解离常数的多肽。任选的是，"IGF-IR结合蛋白"会相对于来自同一物种的其它相关蛋白质特异性结合IGF-IR。"特异性结合"指多肽识别靶物蛋白(例如IGF-IR)并与其相互作用但基本上不识别样品(例如生物学样品)中的其它分子且与其相互作用。在优选的实施方案中，本发明的多肽会以至少像500nM—样紧密的KD特异性结合IGF-IR。优选的是多肽会以lpM-500nM、更优选lpM-100nM、更优选lpM-10nM、和最优选lpM-1nM或更低的KD特异性结合IGF-IR。"功能性Fc区"拥有天然序列Fc区的至少一项"效应器功能"。例示性的"效应器功能"包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬、细胞表面受体(例如B细胞受体(BCR))下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合，而且可以使用本领域已知的用于评估此类抗体效应器功能的各种测定法来评估。"天然序列Fc区"包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列同样的氨基酸序列。图3提供了天然序列人和鼠IgGFc区的氨基酸序列。"变异Fc区"包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如天然序列Fc区或区别多肽的Fc区中约1处至约10处氨基酸替代和优选约1处至约5处氨基酸替代。本文中的变异Fc区会优选与天然序列Fc区和/或区别多肽的Fc区具有至少约80%序列同一性和最优选至少约90°/。序列同一性、更优选至少约95°/。序列同一性。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC"指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞、和巨噬细胞)识别靶细胞上所结合的抗体并随后引起靶细胞的溶解。介导ADCC的主要细胞(NK细胞)只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRn和FcyRin。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。"百分比(。/。)氨基酸序列同一性，，在本文中定义为比对序列并在必要时引入缺口已实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与所选择序列中的氨基酸残基同样的氨基酸的百分比。出于测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech公司创作的，已经与用户文档一起提交给美国版权局(U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559),登记为美国版权注册号TXU510087,而且公众可通过Genentech公司(SouthSanFrancisco,Calif.)获得。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统、优选数字UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不再变化。就本文而言，给定氨基酸序列A对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的。/。氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一。/。氨基酸序列同一性)如下计算100乘分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A对B的。/。氨基酸序列同一性会不等于B对A的。/。氨基酸序列同一性。"多肽链"指如下的多肽，其中它的每个域通过肽键与其它域相连接，与非共价相互作用或二碌J定不同。"分离的"多肽指已经鉴定且与/自其天然环境的成分分开和/或回收。其天然环境的污染物成分指会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，而且可以包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，多肽会被纯化(1)至超过95%(以多肽的重量计，如通过Lowry法所测定的)和最优选超过99%(以重量计)；(2)至足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)至均质，通过还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE,使用Coomassie蓝或优选的银染色。既然多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内原位的多肽。然而，通常会通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。輩巴物还可以是所述耙物的片段。如此，靶物还是所述靶物的、能够引发免疫应答的片段。靶物还是所述靶物的、能够结合针对全长靶物生成的单域抗体的片段。片段在用于本文时指小于该序列的100%(例如99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%等)，但是包含5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸。片段的长度足以以1x10"M或更好的亲和力维持感兴趣的相互作用。片段在用于本文时还指任选的，基本上不改变靶物结合针对全长靶物生成的单域抗体的能力的、一个或多个氨基酸的插入、删除和替代。氨基酸插入、删除或替代的数目优选多至l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。"诱导细胞死亡"的本发明蛋白质指引起可存活细胞变得不能存活的本发明蛋白质。所述细胞一般指表达所述蛋白质所结合的抗原的细胞，尤其是过表达所述抗原的细胞。优选的是，所述细胞是癌细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、曱状腺、胰或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是例如SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB453、MDA-MB-361或SK0V3。体外细胞死亡可在不存在补体和免疫效应细胞时测定，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如此，用于细胞死亡的测定法可使用热灭活血清(即不存在补体)和在不存在免疫效应细胞时实施。为了确定本发明的蛋白质是否能够诱导细胞死亡，可相对于未处理细胞评估膜完整性的丧失，它是通过硤化丙啶(PI)、台盼蓝(trypanblue)(Moore等Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD的摄取来评估的。"诱导凋亡"的本发明蛋白质指根据凋亡相关分子或事件(诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜嚢(称作凋亡小体)形成)的测定，诱导程序性细胞死亡的本发明蛋白质。所述细胞指表达所述蛋白质所结合的抗原的细胞，尤其是过表达所述抗原的细胞。所述细胞可以是肿瘤细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、曱状腺、胰或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SKBR3、BT474、Calu3细胞、MDA-MB453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂，如本文中实施例中所公开的；及可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的蛋白质是在使用表达本发明蛋白质所结合的抗原的细胞的膜联蛋白结合测定法中导致对膜联蛋白的结合相对于未处理细胞诱导约2至50倍、优选约5至50倍、和最优选约10至50倍的蛋白质。术语"治疗有效量"指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减緩和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减緩和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。就药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，可通过例如评估疾病进展前时间(timetodiseaseprogression,TTP)和/或测定响应率(responserate,RR)来测量体内功效。综述本发明人发明了以有利特性结合IGF-IR的本发明的新蛋白质，所述有利特性包括但不限于单价或多价结合模式(例如一个或超过一个结合特定靶物(包括IGF-IR和其它酪氨酸激酶受体)的域)；对期望靶物胜过其它受体的高选择性，特别是就选择性结合IGF-IR胜过胰岛素受体的蛋白质而言；可调的亲和力，包括约100nM至小于约10pM的范围(包括fM(femtomolar)亲和力)；特异性拮抗剂活性，同时具有最小限度的或检测不到的激动剂活性；阻断IGF-I或IGF-II结合或活化；对期望靶物的单特异性或多特异性结合；单表位或多表位结合；在大鼠中延长的半衰期；皮下(SC)或静脉内(IV)剂量给药；尺寸小(例如约5kDa至约40kDa);Tm超过约55。C或超过约60。C;和基本上单体性质(例如在大小排阻层析(SEC)上的单峰，诸如约90%的面积、32约95%的面积或约98%的面积)。以万亿计地产生和测试新蛋白质作为本发明的一个方面，产生了估计l-5万亿不同蛋白质变体，以及与此类蛋白质对应的和编码此类蛋白质的1-5万亿RNA和DNA变体。对所产生的蛋白质测试对人IGF-IR的结合，而且在有些情况中进一步表达和纯化并进行多种生物学、生物化学和生物物理学测定法和测量法以帮助鉴定合适的、有用的蛋白质，特别是治疗剂。另外，使用本发明载体和多核苷酸的实例，在大肠杆菌中表达了超过5000种蛋白质变体，并测试表达水平和多种生物学、生物化学和生物物理学测定法。根据这些测量的结果，不同的、选定的蛋白质进入创建具有本文中所描述的特征的优化的变异。还对许多此类蛋白质测试关于胰岛素受体的选择性。发明人第一个应用结合IGF-IR的蛋白质和域的这种类型的广泛评估。快速产生并测试用于这种类型的评估的本发明蛋白质的一种方式是AdnexusTherapeutics公司核酸-蛋白质融合物技术。此公开内容描述了此类体外表达和标记技术的使用，该技术称作PROftisionTM,利用核酸-蛋白质融合物(RNA-蛋白质融合物和DNA-蛋白质融合物)来鉴定对于结合IGF-IR和其它蛋白质(包括酪氨酸激酶受体)重要的新的单域和多域多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白质融合物技术是一种共价偶联蛋白质与其编码遗传信息的技术。使用PROfusionTM技术来筛选编码单域多肽的核酸集合，所述单域多肽是使用基于人纤连蛋白III型域("Fn3)构建的或自抗体轻链的可变域构建的。对所表达的多肽(称作支架蛋白"文库")筛选能以高亲和力结合靶物的多肽。我们自此支架蛋白文库分离到结合IGF-IR和抑制IGF-IR生物学活性的新的单域多肽。另外，发现许多独立随机化的、位于免疫球蛋白或免疫球蛋白样支架中的环趋于会聚至一套相关的、参与IGF-IR结合的共有序列。因此，预期具有这些共有序列的多肽作为IGF-IR结合剂会是有用的，即使在与鉴定它们的蛋白质环境分开时。参见例如本文中的实施例和表格。此类多肽可以作为独立的小肽IGF-IR结合剂来使用，或者可以位于其它蛋白质中，特别是共享免疫球蛋白或免疫球蛋白样折叠的蛋白质。(关于RNA-蛋白质融合物技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述参见Szostak等，美国专利No.6,258,558;6,261,804;6,214,553;6,281,344;6,207,446;6,518,018;PCT公开文本No.WO00/34784;WO01/64942;WO02/032925;及Roberts和Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.94:12297-12302,1997，通过述及收入本文。)如上文所讨论的，本公开内容证明了具有某些期望特性(诸如高亲和力结合IGF-IR、关于此类受体的一种或多种配体的拮抗剂效应、和改善的药动学)的单域多肽可用作有效的抗癌剂。虽然预期此类多肽作为抗癌剂的效力与IGF配体和受体在癌症中的作用有关，但是我们不希望局限于任何特定机制。IGF-IR设计的基于Fn3的多肽的首次成功努力。在实现体内效力中做出的许多改善和发现可广泛应用于针对这种和其它靶物的其它基于Fn3的多肽和其它蛋白质模块和域，一般是小于约50kDa或约40kDa的蛋白质。换言之，虽然基于Fn3的多肽的配体结合特性一般会由相对少数的、位于溶剂可及(accessible)环区中的氨基酸来决定，但是基于Fn3的多肽的其它特征(诸如药动学特征)会趋于由蛋白质的不直接参与配体结合且在蛋白质间保守的(无论靶物蛋白质)大多数氨基酸来决定。抗体就是这种情况，其中少数环(称作CDR区)介导抗原结合，而体内抗体行为的其它特征主要由保守的框架区和恒定域来规定。别的蛋白质实施方案本发明的蛋白质包括本文中所描述的单域多肽，其一般是结合靶物(诸如IGF-IR)的多肽，其中靶物结合活性位于单结构域内，与例如抗体和单链抗体不同(其一般由重链可变域和轻链可变域二者贡献出抗原结合活性)。本公开内容还提供了可包含结合靶物的单域多肽的较大蛋白质。例如，可以连接多个单域多肽以创建具有升高的亲合力和多价性的复合分子。类似的，可以将单域多肽附着(例如作为融合蛋白)至任何数目的其它多肽。在某些链，如免疫球蛋白和免疫球蛋白样域所例示的。P样链指参与单域多肽的稳定化但是并非必须采取P链构象的一串氨基酸。P样链是否参与蛋白质的稳定化可通过删除该串或改变该串的序列并分析蛋白质稳定性是否被削弱来评估。可以通过例如热变性和复性研究来评估稳定性。优选的是，单域多肽34会包含不超过两条P样链。P样链通常不会采取a螺旋构象，但是可以采取无轨巻曲结构。在免疫球蛋白域或免疫球蛋白样域的背景中，p样链最常见的会存在于结构中否则会被最N端P链或最C端P链占据的位置。若位于蛋白质序列的内部则通常会形成(3链的氨基酸串在位于N-或C-末端附近的位置时可采取并非清晰P链且在本文中称作13样链的构象。在某些实施方案中，本公开内容提供了结合IGF-IR的单域多肽。优选的是，单域多肽结合人IGF-IR和一种模式物种IGF-IR。单域多肽可包含约80个至约150个氨基酸，其具有包含以下各项的结构组织分布在至少两个P片层间的至少七个(3链或(3样链，和连接两个P链或P样链的至少一个环部分，该环部分参与对IGF-IR的结合。换言之，环部分可连接两个(3链、两个P样链、或一个(3链和一个P样链。通常，一个或多个环部分会参与IGF-IR结合，尽管有可能一个或多个(3或P样链部分也会参与IGF-IR结合，特别是那些最接近环部分的P或P样链。单域多肽可包含结构单元，其是免疫球蛋白域或免疫球蛋白样域。单域多肽可结合IGF-IR的任何部分，尽管优选结合IGF-IRi包外域的多肽。可以依照平衡常数(例如解离，Ko)和依照动力学常数(例如结合速率常数kon和解离速率常数k。ff)来评估结合。通常会选择以小于约10^m、或小于约10-7m、约5xlO—sm、约10-sm或小于约10一m的KD结合IGF-IR的单域多肽。结合IGF-IR的多肽可以与IGF家族的一个、或两个或更多个成员(特别是IGF-I和IGF-II)竟争结合，而且可抑制IGF-IR介导的一种或多种生物学事件，诸如癌细胞的增殖和癌症转移。结合IGF-IR的多肽可用于治疗目的以及任何牵涉IGF-IR^r测或结合的目的。用于治疗目的的多肽一般会具有小于5xlO-sm、小于10-Sm或小于10力M的Kd,尽管在k^足够低或k。n足够高的情况中可以承受较高的Ko。在某些实施方案中，结合IGF-IR的单域多肽会包含共有序列或选自本文中所描述的IGF-IR结合克隆的IGF-IR结合序列的一种或多种序列。优选的是，此类序列会位于环中，特别是BC、DE、和FG环，如Chen等的PCT公开文本No.WO2005/056764A2中所记载的。在某些实施方案中，单域多肽包含免疫球蛋白(Ig)可变域。Ig可变域可以例如选自下组人Vl域、人VH域和camelidVhh域。Ig可变域的一个、两个、三个或更多个环可参与对IGF-IR的结合，而且通常称作CDR1、CDR2或CDR3的环中任一个会参与IGF-IR结合。在某些实施方案中，单域多肽包含免疫球蛋白样域。免疫球蛋白样域的一个、两个、三个或更多个环可参与对IGF-IR的结合。一种优选的免疫球蛋白样域是纤连蛋白III型(Fn3)域。此类域可包含(自N端至C端)P或P样链A、环AB、卩或(3样链B、环BC、卩或P样链C、环CD、(3或卩样链D、环DE、卩或卩样链E、环EF、(3或p样链F、环FG、和p或(3样链G。结构组织的一个例子参见图24。任选的是，任何或所有环AB、BC、CD、DE、EF和FG可参与IGF-IR结合，尽管优选的环是BC、DE和FG，特别是环BC和FG。一种优选的Fn3域是衍生自人纤连蛋白的Fn3域，特别是称作"Fn3的纤连蛋白的第十Fn3域。应当注意，本文中所公开的IGF-IR结合多肽无一具有与天然1GFn3同样的氨基酸序列；序列经过修饰以获得IGF-IR结合蛋白，但是具有'GFn3基本结构特征的蛋白质(特别是那些保留与"Fn3的可识别序列同源性的)在本文中仍然称作"'GFn3多肽"。此命名法与在抗体领域中发现的类似，例如，针对特定草巴物蛋白质生成的重组抗体VL域可以与任何天然存在VL域不同^f旦该蛋白质仍然可被识别为VL蛋白。^Fn3多肽可以与SEQIDNO:l中所示人^Fn3域至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%相同。大部分变异性一般会存在于一个或多个环中。"Fn3多肽的每个卩或(3样链可以基本上由与SEQIDNO:1的对应P或卩样链的序列至少80。/。、85%、卯％、95%或100%相同的氨基酸序列组成，只要此类变异不破坏多肽在生理学条件中的稳定性。^Fn3多肽可以在每个环AB、CD、和EF中具有基本上由与SEQIDNO:l的对应环的序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列组成的序列。在许多情况中，任何或所有环BC、DE、和FG会是相对于SEQIDNO:l不太保守的。例如，所有环BC、DE、和FG可以与SEQIDNO:l的对应环小于20。/。、10%、或0。/。相同。在有些实施方案中，只有BC和FG环会相对于SEQIDNO:l不太保守。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含第十纤连蛋白III型("Fn3)域的多肽，其中所述"Fn3域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，且至少一个选自环BC、DE、和FG的环具有相对于人，n3域的对于环的序列改变的氨基酸序列。'T，指一处或多处相对于模板序列(对应的人纤连蛋白域)的氨基酸序列改变，而且包括氨基酸添加、删除、和替代。改变氨基酸序列可通过故意的、盲目的、或自发的序列变异来实现，一般是核酸编码序列，而且可通过任何技术来发生，例如PCR、易错PCR、或化学DNA合成。在有些实施方案中，一个或多个选自BC、DE、和FG的环在长度方面可以相对于对应的人纤连蛋白环延长或缩短。在有些实施方案中，环的长度可以延长2-25个氨基酸。在有些实施方案中，环的长度可以缩短l-ll个氨基酸。具体而言，'GFn3的fg环长12个残基，而抗体重链中的对应环范围为4-28个残基。因此，为了优化抗原结合，"Fn3的fg环的长度优选在长度以及序列方面随机化以覆盖4-28个残基的CDR3范围以获得在抗原结合方面最大的可能灵活性和亲和力。在有些实施方案中，可以将整联蛋白结合基序用极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸(N端至C端方向)的氨基酸序列替换。在有些实施方案中，包含"Fn3域的多肽包含SEQIDNO:2-125或184-202之任一的氨基酸序列。可以在N端或C端添加别的序列。例如，可以在N端方文置额外的MG序列。M通常会被切掉，在N端剩下GVS...序列。在有些实施方案中，可以在"Fn3域的C端放置接头序列，例如SEQIDNO:203和226。在某些实施方案中，本公开内容提供了非抗体多肽，其包含具有结合IGF-IR的免疫球蛋白样折叠的域。非抗体多肽可具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，而且一般会衍生(例如通过氨基酸序列的改变)自参比蛋白或"支架"蛋白(诸如Fn3支架)。非抗体多肽可以以小于1(^M、或小于10々M、小于5x10—Sm、小于10-SM或小于10一M的kd结合igf-ir。未改变的参比蛋白或是基本上不结合IGF-IR或是以大于1(T6M的KD结合。非抗体多肽可抑制IGF-IR信号传导，特别是在非抗体多肽具有小于5xlO-SM、小于10-SM或小于10力M的KD时，尽管在k。ff足够低(例如小于5xlO-、")时可承受更高的KD值。免疫球蛋白样折叠可以是，n3多肽。在某些实施方案在中，本公开内容提供了包含单域的多肽，所述单域具有结合IGF-IR的免疫球蛋白折叠。多肽可具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，而且一般会衍生(例如通过氨基酸序列的改变)自免疫球蛋白的可变域。多肽可以以小于10^M、或小于10々M、小于5xlO-8M、小于l(ySM或小于10力M的Kd結合IGF-IR。多肽可抑制IGF-IR信号传导，特别是在多肽具有小于5xlO-SM、小于10-8M或小于10力M的KD时，尽管在koff足够低或k^足够高时可承受更高的KD值。在某些优选的实施方案中，具有衍生自免疫球蛋白轻链可变域的免疫球蛋白折叠且能够结合IGF-IR的单域多肽可包含选自本文中所描述的IGF-IR结合克隆的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，本公开内容提供了包含本文中所描述的具有最期望的生物化学特征的任何IGF-IR结合克隆的氨基酸序列的IGF-IR结合多肽。在包含此类氨基酸序列的多肽的情况中，可以将PEG模块或其它感兴趣模块共价结合至位于约第85-100位(取决于蛋白质)的半胱氨酸。还可以将PEG模块共价结合至多肽中的胺模块。胺模块可以是例如在多肽N端找到的伯胺或在氨基酸(诸如赖氨酸或精氨酸)中存在的氨基。在某些实施方案中，PEG^f莫块附着于多肽上选自下组的位置a)N末端；b)N末端和最N端的(3链或(3样链之间；c)位于靶物结合位点对面的多肽面上的环；d)C末端和最C端的P链或P样链之间；和e)C末端。在某些方面，本公开内容提供了介导IGF-IR结合的短肽序列。此类序列可以以分离的形式或在插入特定蛋白质结构(诸如免疫球蛋白或免疫球蛋白样域)中时介导IGF-IR结合。此类序列的例子包括表格中所公开的序列和与SEQIDNO:l或本文中所列举的任何其它序列至少85。/c)、90%、或95%相同且保留IGF-IR结合活性的其它序列。因而，本公开内容提供了基本上纯的或分离的多肽，其包含与任何此类序列至少85%相同的氨基酸序列，其中所述多肽结合IGF-IR并与IGF种类竟争对IGF-IR的结合。此类多肽的例子包括包含与同表格中的任何序列至少85%相同的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的氨基酸序列的多肽。优选的是，此类多肽会抑制IGF的生物学活性且可以以小于10"m、或小于10'7m、小于5x1(T8m、小于1(^m或小于10—sm的Kd結合IGF-IR。在某些实施方案中，本文中所描述的任何IGF-IR结合多肽可结合一种或多种额外电话者别的模块，包括例如也结合IGF-IR的模块(例如第二个相同的或不同的IGF-IR结合多肽)、结合不同靶物的模块(例如用以创建双重特异性结合剂)、标记模块、便亍蛋白质纯化的模块或提供改善的药动学的模块。改善的药动学可依照所感受到的治疗需要来评估。通常希望提高生物利用度和/或延长服药间的时间，可能是通过延长服药后蛋白质在血清中保持可获得的时间。在有些情况中希望改善蛋白质的血清浓度随时间的连贯性(例如缩小施药后不久和下次施药前不久蛋白质血清浓度的差异)。在本文中称作"PK模块"的趋于减緩蛋白质自血液清除的模块包括聚氧化烯模块(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)、和耐受良好的蛋白质模块(例如Fc、Fc片段或血清清蛋白)。本发明的多肽可以与清蛋白或清蛋白的片段(部分)或变体融合，如美国公开文本No.20070048282中所记载的。单域多肽可附着至将多肽在哺乳动物(例如小鼠、大鼠、或人)中的清除速率相对于未修饰多肽降低超过3倍的模块。改善的药动学的其它测量可包括血清半衰期，其常常分成OC阶段和P阶段。可通过添加适宜的模块来显著改善两个阶段之一或二者。若采用聚乙二醇，则可以将一个或多个PEG分子附着于蛋白质中的不同位置，而且此类附着可通过与胺、硫醇或其它合适反应性基团的反应来实现。PEG化可通过定点PEG化来实现，其中将合适的反应性基团引入蛋白质中以创建PEG化优先发生的位点。在一个优选的实施方案中，修饰蛋白质，使其在期望的位置具有半胱氨酸残基，容许半胱氨酸上的定点PEG化。PEG在分子量方面可以广泛变化，而且可以是分支的或线性的。注意，本公开内容确立了PEG化与^Fn3多肽的靶物结合活性相容，而且进一步的，PEG化改善此类多肽的药动学。因而，在一个实施方案中，本公开内容提供了PEG化形式的"Fn3多肽，不管此类多肽能结合的靶物。在有些实施方案中，本发明的多肽包含基于纤连蛋白的支架蛋白和PK模块的缀合物。基于纤连蛋白的支架蛋白可结合任何人蛋白质，而且优选衍生自^Fn3域。PK模块可以是任何改善基于纤连蛋白的支架蛋白的药动学的模块。在有些实施方案中，PK模块至少将支架蛋白的血清半衰期加倍。在有些实施方案中，PK模块经多肽接头与支架蛋白相连接。例示性的多肽接头包括PSTSTST(SEQIDNO:244)、EIDKPSQ(SEQIDNO:245)、和GS接头诸如GSGSGSGSGS(SEQIDNO:246)，及其多聚体。在有些实施方案中，PK模块是人血清清蛋白。在有些实施方案中，PK模块是运铁蛋白。在某些方面，本公开内容提供了使用IGF-IR结合蛋白来抑制细胞中的于体内或回体，而且可以是例如活生物体的细胞、培养的细胞或组织样品中接触，接触的量和时间足以抑制此类生物学活性。在某些方面，本公开内容提供了用于治疗患有对抑制IGF或IGF-IR有响应的疾患的受试者的方法。这样的方法可包括对所述受试者施用有效量的本文中所描述的任何抑制IGF-IR的多肽。所述疾患可以是以不当IGF-IR生物学为特征的疾患。本文中所描述的任何抑制IGF-IR的多肽可用于制备药物，该药物用于治疗病症，特别是选自下组的病症自身免疫性病症、再狭窄、和癌症。在某些方面，本公开内容提供了用于检测样品中的IGF-IR的方法。该方39法可包括使样品接触本文中所描述的结合IGF-IR的多肽，其中所述接触是在容许多肽-IGF-IR复合物形成的条件下进行的，并检测所述复合物，由此检测所述样品中的所述IGF-IR。检测可使用本领域已知的任何技术来进行，诸如例如放射线照相术、免疫学测定法、荧光检测、质谦、或表面等离振子共4展。样品常常会是生物学样品，诸如活检，特别是疑似肺瘤、肿瘤的活检。样品可以来自人或其它哺乳类动物。结合IGF-IR的多肽可以用标记模块标记，诸如放射性模块、荧光模块、显色模块、化学发光模块、或半抗原模块。结合IGF-IR的多肽可以在固体支持物上固定化。本公开内容的另一个方面涉及包含编码本文中所公开的多肽的核酸序列的核酸。在某些实施方案中，核酸可包含编码选自下组的多肽的核酸序列的核酸本文中所公开的表格中的任何蛋白质序列。本公开内容的又一个方面涉及包含与启动子可操作相连接的核酸的表达载体，其中所述核酸编码本文中所公开的多肽。本^^开内容的另一个方面涉及包含本文中所公开的核酸的细胞。还提供了生产结合IGF-IR的多肽的方法，其包括表达编码本公开内容的多肽的核酸。在某些实施方案中，核酸可包含编码选自下组的多肽的序列本文中所公开的表格中的任何序列及其对应的蛋白质。在某些实施方案中，核酸在细胞中表达。或者，核酸在无细胞系统中表达。在某些方面，本公开内容提供了可能适用于任何"Fn3多肽的发现，无论多肽改造成结合什么靶物。如上文所记录的，本公开内容证明了可以用PEG成功地改善^Fn3多肽的药动学，同时基本上不干扰靶物结合。因而，本公开内容提供了结合靶物且具有相对于非PEG化多肽改善的药动学的PEG化"Fn3多肽。在又一个实施方案中，本公开内容证明了删除"Fn3多肽的头八个氨基酸能提高靶物结合亲和力。因而，本公开内容提供了缺乏最初八个氨基酸的'Vn3多肽(氨基酸参照SEQIDNO:l的序列来编号)。应当理解，可以将一个或两个氨基酸添加回删除形式的多肽以便于翻译和正确加工。本7>开内容证明了皮下施用"Fn3多肽导致延迟的多肽进入血流的释放和降低的，n3多肽的最大血清浓度。因而，本公开内容提供了通过皮下施用给患者施用IQFn3多肽的方法。此施用路径对于实现相对于静脉内施用延迟的释放和/或将1GFn3多肽的最大血清浓度相对于静脉内施用相等剂量所实现的最大血清浓度降低至少25%或至少50%可能是有用的。所施用的"Fn3多肽可附着至延长，n3的血清半衰期(或降低清除速率、或类似地影响另一种药动学参数)的模块，诸如聚乙二醇模块。优选的是，所施用的"Fn3多肽包含与SEQIDNO:l至少600/。、65%、70%、75%、80%、85%、90%相同的氨基,列。在某些方面，本公开内容提供了结合预先选定的来自第一哺乳动物的靶物蛋白质和来自第二哺乳动物的类似物的单域多肽。此类单域多肽在第一哺乳动物是人而第二哺乳动物是实施临床前测试的期望哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、豚鼠、犬、或非人灵长类动物)的情况中是特别有用的。本公开内容证明了单一多肽能改造成具有此类双重特异性，且所述双重特异性通过容许在人细胞、人受试者和动物模型中测试同一多肽而简化了药物开发。优选的是，预先选定的来自第一哺乳动物的靶物蛋白质和来.自第二哺乳动物的类似物在氨基酸序列方面足够相似以容许生成双重特异性多肽。例如，预先选定的靶物蛋白质和来自第二哺乳动物的类似物可以在至少50个氨基酸的区域上共享至少80%、90%、或95%同一性，且任选可以在整个蛋白质序列上或在胞外域的序列上(在膜蛋白的情况中)共享至少80%、卯％、或95%同一性。具有这种类型的双重特异性结合特征的单域多肽可包含免疫球蛋白或免疫球蛋白样域，而且会优选以小于lxlO^M、lxlO々M、5xl(T8M、lxl(^M或1x10—QM的解离常数结合预先选定的人靶物蛋白质及其类似物。别的测定法力,^f叙敏^:长的,尸劍在又一个实施方案中，本发明的蛋白质提供了在体内抑制IGF-IR酪氨酸磷酸化或受体水平或二者的IGF-IR结合物。在一个实施方案中，对动物施用IGF-IR结合物可1起表达IGF-IR的肿瘤中IGF-IR磷酸化信号的降低。在一个优选的实施方案中，IGF-IR结合物引起磷酸化信号降低至少20。/c)。在一个更优选的实施方案中，IGF-IR结合物引起磷酸化信号降低至少50。/。、更优选60%。在一个甚至更优选的实施方案中，结合物引起磷酸化水平降低至少70%、更优选80%、甚至更优选90%。在另一个实施方案中，给动物施用IGF-IR结合物引起表达IGF-IR的肿瘤中IGF-IR水平的降低。在一个优选的实施方案中，IGF-IR结合物引起受体水平与未处理动物相比降低至少20%。在一个更优选的实施方案中，IGF-IR结41合物引起受体水平降低未处理动物中受体水平的至少50%、更优选60%。在一个甚至更优选的实施方案中，结合物引起受体水平降低至少70%、更优选80%。#力微在本发明蛋白质的另一个实施方案中，IGF-IR结合物在体内抑制肿瘤细胞生长。肿瘤细胞可衍生自任何细胞类型，包括但不限于表皮、上皮、内皮、白血病、肉瘤、多发性骨髓瘤、或中胚层细胞。异种移植物肿瘤研究中使用的常用肿瘤细胞系的例子包括A549(非小细胞肺癌)细胞、DU-145(前列腺)细胞、MCF-7(乳房)细胞、Colo205(结肠)细胞、3T3/]GF國IR(小鼠成纤维细胞)细胞、NCIH441细胞、HEPG2(肝瘤)细胞、MDAMB231(乳房)细胞、HT-29(结肠)纟田月包、MDA-MB-435s(乳房)细胞、U266细胞、SH-SY5Y细胞、Sk-Mel-2细胞、NCI-H929、RPM18226、和A431细胞。在一个优选的实施方案中，与未处理动物中的肺瘤的生长相比，结合物抑制肿瘤细胞生长。在一个更优选的实施方案中，结合物将肿瘤细胞生长抑制50%。在一个甚至更优选的实施方案中，结合物将胂瘤细胞生长抑制60%、65%、70%、或75%。在一个实施方案中，对肿瘤细胞生长的抑制是在动物开始结合物处理后至少7天测量的。在一个更优选的实施方案中，对肿瘤细胞生长的抑制是在动物开始结合物处理后至少14天测量的。在另一个优选的实施方案中，与IGF-IR结合物一起给动物施用另一种抗肿瘤剂。在一个优选的实施方案中，抗肿瘤剂能够进一步抑制肿瘤细胞生长。在一个甚至更优选的实施方案中，抗肿瘤剂是阿霉素(adriamycin)、泰素(taxol)、他莫昔芬(tamoxifen),5-氟脱氧尿苦(5隱fluorodeoxyuridine，5隱FU)或CP-358，774。别的双特异性和多特异性实施方案在许多实施方案中，会希望生成多特异性组合物，例如结合超过一种靶物或其它感兴趣蛋白质的组合物。在一个方面，本发明的蛋白质包含相连才妄的或附着的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以约10nM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第一期望靶物(例如IGF-IR)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的，相关靶物(例如人胰岛素受体)，且优选是单域或基本上单价的，所述第二蛋白以约10nM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第二期望靶物(例如EGFR、c-Met、c-kit、Her2、FGFR1、VEGFR2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、叶酸受体)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如人胰岛素受体)，且优选是单域或基本上单价的。具有双特异性亲和力的此类分子可进一步附着至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白质。在一个方面，本发明的蛋白质包含结合IGF-IR的第一1QFn3域和结合VEGFR2的第二1QFn3域。VEGFR-2结合多肽是如PCT公开文本No.WO2005/056764所述生成的，以此通过述及并入作为参考。对于本发明有用的优选的VEGFR-2结合，n3多肽的序列显示于图30SEQIDNO:126-183。本发明的蛋白质包括删除了头8个氨基酸的所公开氨基酸序列，而且可以在N或C末端包括别的氨基酸。例如，可以在N末端放置额外的MG序列。M通常会被切掉，在N末端剩下GEV...序列。在N末端重新添加正常的8个氨基酸也产生具有期望特性的VEGFR2结合蛋白。在有些实施方案中，N末端曱硫氨酸被切掉。为了体内使用，可生成适合PEG化的形式。在一个实施方案中，可添加包含半胱氨酸的C末端尾(例如在C末端添加EIDKPCQ(SEQIDNO:225))。在一个方面，本发明的蛋白质包含相连接的或附着的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第一期望靶物(例如EGFR)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(undesiredrelatedtarget)(例如人胰岛素受体.)，且优选是单域或基本上单价的，所述第二蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第二期望靶物(例如Her2、叶酸受体)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如人胰岛素受体)，且优选是单域或基本上单价的。具有双特异性亲和力的此类分子可进一步附着至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白质。在一个方面，本发明的蛋白质包含相连接的或附着的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第一期望靶物(例如EGFR)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如人胰岛素受体)，且优选是单域或基本上单价的，所述第二蛋白以约10nM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第二期望靶物(例如VEGFR2)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如VEGFR1)，且优选是单域或基本上单价的。具有双特异性亲和力的此类分子可进一步附着至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白质。在一个方面，本发明的蛋白质包含相连接的或附着的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第一期望靶物(例如Her2)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如Her4)，且优选是单域或基本上单价的，所述第二蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第二期望靶物(例如VEGFR2)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如VEGFR1)，且优选是单域或基本上单价的。具有双特异性亲和力的此类分子可进一步附着至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白质。在一个方面，本发明的蛋白质包含相连接的或附着的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第一期望靶物(例如FGFR1、c-Met、c-kit)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如人胰岛素受体)，且优选是单域或基本上单价的，所述第二蛋白以约10nM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第二期望靶物(例如VEGFR2)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如VEGFR1，且优选是单域或基本上单价的。具有双特异性亲和力的此类分子可进一步附着至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白质。在一个方面，本发明的蛋白质包含相连接的或附着的第一蛋白和第二蛋白，所述第一蛋白以约IOnM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第一期望靶物(例如Her2)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如人胰岛素受体，且优选是单域或基本上单价的，所述第二蛋白以约IOnM(或本44文中所描述的其它适宜亲和力)或更低的结合亲和力结合第二期望靶物(例如Her3)且以约luM(或本文中所描述的其它适宜亲和力)或更高的结合亲和力结合不想要的相关靶物(例如Her4),且优选是单域或基本上单价的。具有双特异性亲和力的此类分子可进一步附着至其它分子，包括本文中所描述的其它蛋白质。别的PEG实施方案就我们所知，这是第一次能使用PEG(或在功能方面类似的分子)来连接两种蛋白质，所述蛋白质是结合单一靶物的非抗体模块，特别是其中每种结合蛋白由单域或多域构成的蛋白质，通常其中每个域是约50个或约60个或约75个氨基酸或更多(与5-20个氨基酸的小肽不同)。优选的是，可以在此类实施方案中有利地使用纤连蛋白支架蛋白，而且更优选适当改造Cys或Lys氨基酸。'就我们所知，这是第一次能使用PEG(或在功能方面类似的分子)来连接两种蛋白质，所述蛋白质是结合两种或更多种不同靶物或感兴趣蛋白质(例如PK调控蛋白)的非抗体模块，特别是其中每种结合蛋白由单域或多域构成的蛋白质，通常其中每个域是约50个或约60个或约75个氨基酸或更多(与5-20个氨基酸的小肽不同)。优选的是，可以在此类实施方案中有利地使用纤连蛋白支架蛋白，而且更优选适当改造Cys或Lys氨基酸。另外，本发明的非PEG和PEG方面包括抗体模块(例如骆驼抗体及其衍生物，以及单链抗体和单域抗体；特别是那些自微生物表达的)和抗体样模块(例如脂笼蛋白、锚蛋白、多Cys-Cys域、和四连蛋白的衍生物；特别是那些自微生物表达的)，特别是那些通过PEG相连接的、小于约40kDa的，更特别的是那些具有有限数目Cys氨基酸的。本发明的PEG相连接的蛋白质有许多先前为认识或发现的特性和优点。当在微生物中表达此类蛋白质时，可能优选分离域，然后经PEG或其它聚合物接头将它们相连接。可以使用PEG或功能可操作聚合物接头来最佳地改变每个蛋白质模块之间的距离以创建具有一项或多项以下特征的蛋白质1)在结合至感兴趣蛋白质(例如靶物)后对结合一种或多种蛋白质域的空间位阻降低或升高；2)将结合不同靶物的两种或更多种域相连接；3)在没有为了提高稳定性或溶解度而搜索别的氨基酸替代的情况下提高蛋白质稳定性或溶解度(例如溶解度至少约20mg/ml或至少约50mg/ml);4)在没有为了降低蛋白质稳定性而搜索别的氨基酸替代的情况下降低蛋白质聚集(例如通过SEC测量)；4)通过添加别的结合域而提高蛋白质对感兴趣蛋白质的整体亲合力或亲和力。PEG相连接的蛋白质的别的优点包括快速生成，单特异性、多价结合模式、以及多特异性、单价或多价结合模式(这取决于PEG相连接的蛋白质中所包括的蛋白质靶向模块的数目)。本发明的'^Fn3多肽可以被PEG化并保留配体结合活性。在一个优选的实施方案中，PEG化的"Fn3多肽是通过定点PEG化生成的，特别是通过将PEG缀合至N或C末端处的半胱氨酸模块。因而，本公开内容提供了具有改善的药动学特性的把物结合性'。Fn3多肽;该多肽包含具有约80个至约150个氨基酸的，n3域，其中所述^Fn3域的至少一个环参与靶物结合；和共价结合的PEG模块，其中所述"Fn3多肽以小于100nM的KD结合靶物且在哺乳动物中具有小于30mL/hr/kg的清除速率。PEG模块可通过定点PEG化附着至"Fn3多肽，诸如通过附着至Cys残基，其中Cys残基可以位于'GFn3多肽的N末端或位于N末端和最N端的p或(3样链之间或位于^Fn3多肽的C末端或位于C末端和最C端的卩或卩样链之间。Cys残基也可以位于其它位置，特别是不参与靶物结合的任何环。PEG模块也可以通过其它化学来附着，包括通过缀合至胺。另外，本发明包括这种类型对抗体模块(例如骆驼抗体及其衍生物，以及单链抗体和单域抗体；特别是那些自微生物表达的)和抗体样模块(例如脂笼蛋白、锚蛋白、多Cys-Cys域、和四连蛋白的衍生物；特别是那些自微生物表达的)的N或C末端PEG缀合，特别是那些通过PEG相连接的、小于40kDa的，更特别的是那些具有有限数目Cys氨基酸的。在本发明的一个具体实施方案中，改良形式的受试可溶性多肽包括连接受试可溶性多肽与非蛋白质性质的结合物。在一个具体的实施方案中，聚合物是聚乙二醇("PEG")、聚丙二醇、或聚氧化烯，其方式如美国专利No.4,640,835;4，496，689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中所列举的。本发明的改良多肽的例子包括本文中进一步描述的PEG化蛋白质。PEG是众所周知的水溶性聚合物，其可通过商业途经获得或者可依照本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,巻3,页138-161)。术语"PEG"广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子，无论大小或PEG末端的修饰，而且可以由下式来<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>表示X-0(CH2CH20)^CH2CH20H(1),其中n是20-2300且X是H或末端修饰，例如CM链烃基。在一个实施方案中，本发明的PEG以氢或曱氧基终止一端，即X是H或CH3("曱氧基PEG")。PEG可包含进一步的、结合反应所必需的化学基团；其源自分子的化学合成；或者其是为获得分子各部分最佳距离的间隔物。另外，这样的PEG可以由一个或多个连接到一起的PEG侧链组成。具有超过一条PEG链的PEG称作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通过例如添加聚环氧乙烷至各种多元醇(包括甘油、季戊四醇、和山梨醇)来制备。例如，可以自季戊四醇和环氧乙烷制备四臂分支PEG。分支PEG记载于例如欧洲已公开申请No.473084A和美国专利No.5,932,462。一种形式的PEG包括两条经赖氨酸的伯氨基相连接的PEG侧链(PEG2)(Monfardini,C.等，BioconjugateChem.6(1995)62-69)。虽然PEG是众所周知的，但是就我们所知，这是第一次证明两个分开的'GFn3多肽可以被PEG化并保留配体结合活性。在一个优选的实施方案中，PEG化的，n3多肽是通过定点PEG化生成的，特别是通过将PEG缀合至N或C末端处的半胱氨酸模块。因而，本公开内容提供了具有改善的药动学特性的輩巴物结合性，n3多肽，该多肽包含具有约80个至约150个氨基酸的^Fn3域，其中所述^Fn3域的至少一个环参与靶物结合；和共价结合的PEG模块，其中所述^Fn3多肽以小于100nM的KD结合靶物且在哺乳动物中具有小于30mL/hr/kg的清除速率。PEG模块可通过定点PEG化附着至'GFn3多肽，诸如通过附着至Cys残基，其中Cys残基可以位于"Fn3多肽的N末端或位于N末端和最N端的卩或卩样链之间或位于^Fn3多肽的C末端或位于C末端和最C端的卩或(3样链之间。Cys残基也可以位于其它位置，特别是不参与靶物结合的任何环。PEG模块也可以通过其它化学来附着，包括通过缀合至胺。PEG对肽或蛋白质的缀合一^:牵涉活化PEG和将活化后的PEG中间体直接偶联至目标蛋白质/肽或接头，该接头随后被活化并偶联至目标蛋白质/肽(参见Abuchowski,A.等,J.Biol.Chem.,252,3571(1977)和J.Biol,Chem"252，3582(1977)，Zalipsky等,和Harris等，于Poly(ethyleneglycol)Chemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications;(J.M.Harris纟扁)PlenumPress:NewYork,1992;章21和22)。注意，包含PEG分子的结合多肽也称作缀合后的蛋白质，而没有附着PEG分子的蛋白质可称作未缀合的。47为了缀合至本发明的结合多肽，可以选择多种分子量形式的PEG,例如约l,OOO道尔顿(Da)至lOO，OOODa(n为20-2300)。PEG中重复单元的数目"n，，是根据以道尔顿描述的分子量而估算的。优选的是，活化后的接头上的PEG的组合分子量适合于药学用途。如此，在一个实施方案中，PEG分子的分子量不超过100,000Da。例如，如果三个PEG分子附着至接头，其中每个PEG分子具有12，000Da的分子量(每个的n为约270),那么接头上的PEG的总分子量为约36，000Da(总n为约820)。附着至接头的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接头上的三个分子中，两个PEG分子可以是每个5，000Da(每个n为约110)另一个PEG分子可以是12,000Da(n为约270)。在本发明的一个具体实施方案中，IGF-IR或其它受体结合多肽与下式的一个聚乙二醇基团共价相连接-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR，其中聚乙二醇基团的-CO(即羰基)与结合多肽的一个氨基形成酰胺键；R是低级链烃基；x是2或3;m是约450至约950;而n和m选择成缀合物减去结合多肽的分子量为约10-40kDa。在一个实施方案中，结合多肽的赖氨酸s-氨基是可利用的(游离的)氨基。上文缀合物可以更具体地以式(II)来表示P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(11)，其中P是本文中所描述的结合多肽的一个基团(即没有与式(n)所示羰基形成酰胺连接的氨基)；且其中R是低级链烃基；x是2或3;m是约450至约950且选择成缀合物减去结合多肽的分子量为约10至约40kDa。在用于本文时，"m"的给定范围具有定向意义。"m"的范围在任何情况中都是确定的，而且完全是由PEG基团的分子量决定的。本领域技术人员能为PEG选择合适的分子量，例如根据PEG化的结合多肽会如何用于治疗、期望的剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考虑。关于PEG及其用于增强蛋白质特性的用途的讨论参见N.V.Katre,AdvancedDrugDeliveryReviews10:91-114(1993)。在本发明的一个实施方案中，PEG分子可以;波活化以与结合多肽上的氨基(诸如与赖氨酸)起反应(BenchamC.O.等，Anal.Biochem.，131，25(1983);Veronese,F.M.等，Appl。Biochem.,11，141(1985);Zalipsky，S.等，PolymericDrugsandDrugDeliverySystems,adrs9-110ACSSymposiumSeries469(1999);Zalipsky,S.等,Europ.Polym.J"19,1177-1183(1983);Delgado，C.等,BiotechnologyandAppliedBiochemistry,12,119-128(1990))。在一个具体的实施方案中，使用PEG的碳酸酯来形成PEG-结合多肽缀合物。可以在与PEG的反应中使用N，N，-二琥珀酰亚氨基碳酸酯(DSC)来形成有活性的混合PEG-琥珀酰亚氨基碳酸酯，其随后可以与接头的亲核基团或结合多肽的氨基起反应(参见美国专利No.5,281,698和美国专利No.5,932,462)。在一种类似类型的的反应中，可以使l，l，-(二苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡。定基)碳酸酯与PEG起反应以分别形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美国专利No.5,382,657)。"Fn3多肽的PEG化可依照本领域已知方法来实施，例如通过结合多肽与亲电子活性PEG的反应(供应商ShearwaterCorp,，USA,www.shearwatercorp.com)。本发明的优选PEG试剂是例如N-羟基琥珀酰亚氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯或分支的N-羟基琥珀酰亚胺诸如mPEG2-NHS(Monfardini,C.，等，BioconjugateChem.6(1995)62-69)。此类方法可用于结合多肽赖氨酸s-氨基或结合多肽N末端氨基处的PEG化。在另一个实施方案中，PEG分子可以被偶联至结合多肽上的硫氬基(sulfhydryl)(Sartore,L.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.,27,45(1991);Morpurgo等,Biocon.Chem,,7，363-368(1996);Goodson等，Bio/Technology(1990)8,343;美国专利No.5,766,897)。美国专利No,6,610,281和5,766,897记载了例示性的可偶联至硫氢基的反应性PEG种类。在有些实施方案中，在PEG分子被缀合至结合多肽上半胱氨酸残基的情况中，半胱氨酸残基对于结合多肽是天然的，而在其它实施方案中，将一个或多个半胱氨酸残基改造入结合多肽中。可以将突变引入结合多肽编码序列中以产生半胱氨酸残基。这可以通过例如将一个或多个氨基酸残基突变成半胱氨酸来实现。用于突变成半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水性残基。优选的是，待突变成半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。根据一级序列或蛋白质预测残基的表面可及性的算法是本领域众所周知。或者，若已经解析出作为设计和发展结合多肽的基础的框架的晶体结构且由此已经筌定出表面暴露的残基，则可以通过比较结合多肽的氨基酸序列来预测表面残基(参见Himanen等，Nature.(2001)20-27;414(6866):933-8)。在一个实施方案中，在N和/或C末端处或附近或者在环区内将半胱氨酸残基引入结合多肽中。在有些实施方案中，PEG化的结合多肽包含共价附着至N末端氨基酸的a氨基的PEG分子。位点特异性N末端还原性氨化记载于Pepinsky等，(2001)JPET,297,1059和美国专利No.5,824,784。利用其它可获得的亲核氨基将PEG-醛用于蛋白质的还原性氨化的用途记载于美国专利No.4,002,531;Wieder等，(1979)J.Biol.Chem.254,12579;和Chamow等，(1994)BioconjugateChem.5,133。在另一个实施方案中，PEG化的结合多肽包含一个或多个共价附着至接头的PEG分子，该接头继而附着至结合多肽N末端处氨基酸残基的a氨基。这样的方法披露于美国公开文本No.2002/0044921和PCT公开文本No.WO94/0145L在一个实施方案中，结合多肽在C末端处^LPEG化。在一个具体的实施方案中，通过引入C末端叠氮-曱硫氨酸，随后经Staudinger反应缀合曱基-PEG-三芳基膦，将蛋白质在C末端处PEG化。这种C末端缀合方法记载于Cazalis等,C-TerminalSite-SpecificPEGylationofaTruncatedThrombomodulinMutantwithRetentionofFullBioactivity，BioconjugChem.2004;15(5):1005-1009。结合多肽的PEG化也可以依照PCT公开文本No.WO94/01451中记载的一般方法来产生。W094/01451记载了用于制备具有经修饰末端氨基酸oc-碳反应性基团的重组多肽的方法。该方法的步骤牵涉形成重组多肽并用一个或多个在N末端cc-胺和C末端a-羧基处以生物学方法添加的保护基团保护它。然后使肽与化学保护剂起反应以选择性保护反应性侧链基团并由此防止侧链基团被修饰。然后用对生物学保护基团特异性的切割剂切割多肽以形成不受保护的末端氨基酸a-碳反应性基团。用化学修饰剂修饰不受保护的末端氨基酸a-碳反应性基团。然后在侧链基团处使侧链受保护的末端修饰的单拷贝多肽去保护以形成末端经修饰的重组单拷贝多肽。该方法中步骤的数目和顺序可以变化以实现多肽N末端和/或C末端氨基酸处的选择性修饰。1:30、或约1:5至1:15。在本发明中可以使用各种水性緩沖液来催化PEG对结合多肽的共价添加。在一个实施方案中，所使用的緩冲液的pH为约7.0至9.0。在另一个实施方案中，pH为弱石威性范围，例如约7.5至8.5。可以使用pKa接近中性pH范围的緩沖液，例如磷酸盐緩冲液。在制备多特异性PEG连接的蛋白质时会使用其它比例，诸如约1:4至1:8或约1:3至1:5。可以使用本领域已知的常规分离和纯化技术来纯化PEG化结合多肽，诸如大小排阻(例如凝胶过滤)和离子交换层析。也可以使用SDS-PAGE将产物分开。可以分开的产物包括单PEG化、二PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的结合多肽，以及游离PEG。可以通过合并洗脱峰周围的更宽级分以提高组合物中单PEG的百分比来控制单PEG缀合物的百分比。约90%的单PEG缀合物代表了产量和活性的优良平衡。可能希望其中例如至少92%或至少96。/。的缀合物是单PEG种类的组合物。在本发明的一个实施方案中，单PEG缀合物的百分比为约90%至96%。在一个实施方案中，本发明的PEG化结合多肽包含一个、两个或更多个PEG模块。在一个实施方案中，PEG模块结合至蛋白质表面上的和/或远离与耙物配体接触的表面的氨基酸残基。在一个实施方案中，PEG-结合多肽中PEG的组合分子量或总分子量为约3,000Da至60,000Da，任选为约10,000Da至36，000Da。在一个实施方案中，PEG化结合多肽中的PEG是基本上线性的、直链PEG。在本发明的一个实施方案中，PEG化结合多肽中的PEG在羟胺测定法(例如450mM羟胺pH6.5，室温，8-16小时)中不会自PEG化氨基酸残基水解，如此是稳定的。在一个实施方案中，超过80%、更优选至少90%、和最优选至少95。/。的组合物是稳定的单PEG-结合多肽。在另一个实施方案中，本发明的PEG化结合多肽会优选保留与未修饰蛋白质有关的至少约250/。、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%的生物学活性。在一个实施方案中，生物学活性指其结合VEGFR-2或IGF-IR的能力，通过K。、k。n或k。ff来评估。在一个具体的实施方案中，PEG化结合多肽蛋白质显示出相对于未PEG化结合多肽升高的对VEGFR或IGF-IR的结合。PEG修饰多肽的血清清除速率可以相对于未修饰结合多肽的清除速率降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70°/。、80%、或甚至90%。PEG修饰多肽可以具有相对于未修饰蛋白质的半衰期延长的半衰期(t1/2)。PEG-结合多肽的半衰期可以相对于未修饰结合多肽的半衰期延长至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400°/。或500%、或甚至1000%。在有些实施方案中，蛋白质半衰期是在体外测定的，诸如在緩沖盐水溶液中或在血清中。在其它实施方案中，蛋白质半衰期是体内半衰期，诸如蛋白质在动物的血清或其它体液中的半衰期。别的载体和多核苷酸实施方案编码本文中所公开的各种蛋白质或多肽之任一的核酸可以化学合成。可以选择密码子使用率以改善在细胞中的表达。此类密码子使用率会取决于所选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用率。参见例如Mayfield等，ProcNatlAcadSciUSA.2003Jan21;100(2):438-42;Sinclair等,ProteinExprPurif.2002Oct;26(l):96-105;ConnellND.，CurrOpinBiotechnol.2001Oct;12(5):446-9;Makrides等,MicrobiolRev.1996Sep;60(3):512-38;及Sharp等，Yeast.1991Oct;7(7):657-78。通用核酸操作技术记载于例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,巻1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1989，或F.Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenPublishingandWiley-Interscience:NewYork,1987)和定期更新，通过述及收入本文。编码多肽的DNA与自哺乳动物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调节元件可操作相连接。此类调节元件包括转录启动子、任选的操纵基因序列(用以控制转录)、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。还掺入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)和选择基因(用以便于转化子的识别)。本发明的蛋白质可以重组生产，不仅是直接的，还有作为与异源多肽的融合蛋白，所述异源多肽优选是信号序列或其它位于成熟蛋白或多肽的N末端、具有特异性切割位点的多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的异源信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导的原核信号序列替换信号序列。对于酵母分泌，可以用例如酵母转化酶前导、oc因子前导(包括糖酵母(Saccharomyces)属和克鲁维酵母(Kluyveromyces)属a-因子前导)、或酸性磷酸酶前导、假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导、或PCTV厶开文本No.WO90/13646中记载的信号替换天然信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导(例如单纯疱渗gD信号)。可以将此类前体区的DNA与编码蛋白质的DNA以符合读码框的方式相连接。表达和克隆载体都包含使载体能够在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是使能够载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2p质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适于哺乳动物或真核细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取多价抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(优选的是灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶例如，首先通过将所有转化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竟争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂(诸如氨基糖普抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的生长来选择经编码多价抗体、野生型DHFR蛋白质和另一种选择标志(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。53适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的^/基因(Stinchcomb等，A^w^282:39(1979))。^/基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如ATCCNo.44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones,Ge"W"85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在巧。7损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带丄ei/2基因的已知质粒补足ZeW缺陷型酵母菌抹(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6pm环状质粒pKDl的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。VandenBerg,所o/rec/z"o/ogv8:135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌抹分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer等，历o/Tec/"o/ogv9:968-975(1991)。表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码本发明蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架蛋白)的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括p/70^(启动子、(3-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子(诸如tac启动子)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码本发明蛋白质的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基西的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加polyA尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP专利公开文本No.73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。可通过例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和更优选的猿猴病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、及热休克启动子获得的启动子来控制哺乳动物宿主细胞中自载体的转录，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,4.19,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4，601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱瘆病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人(3-干扰素cDNA还可参见Reyes等，Atowre297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明蛋白质的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，典型的是，使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一側的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，WafM297:17-18(1982)。可以将增强子剪接入载体，位于多价抗体编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。用于真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码多价抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中披露的表达载体。重组DNA还可包含任何类型的可能对蛋白质纯化有用的蛋白质标签序列。蛋白质标签的例子包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、或GST标签。与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适宜的克隆和表达载体可见于CloningVectors:ALaboratoryManual,(Elsevier,NewYork,1985)，以此通过述及收入其相关公开内容。使用对本领域技术人员显而易见的、对宿主细胞适宜的方法将表达构建物导入宿主细胞中。本领域已知多种用于将核酸导入宿主细胞中的方法，包括但不限于电穿孔；采用氯化钩、氯化铷、磷酸4丐、DEAE-右旋糖酐、或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；和感染(其中载体是传染剂)。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(￡.co/0或芽孢杆菌属(Ba"7/";^)。酵母(优选来自糖酵母属物种，诸如啤酒糖酵母或酿酒酵母(S.cewv/w'ae))也可用于多肽生产。也可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。关于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统的综述见Luckow和Summers,Bio/Technology,6:47，1988。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。为了制备纯化的多肽，培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白。对于许多应用，本文中所公开的许多多肽的小尺寸会使得大肠杆菌表达成为优选的表达方法。然后自培养液或细胞提取物纯化蛋白质。别的表达和细胞实施方案生产和细胞实施方案所优选的蛋白质是基因纤连蛋白的支架和相关蛋白质。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Esc/zen'c/2/a)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(Eco/z')、肠杆菌属(五"^ra6a"e。、欧文氏菌属(￡rvW"/a)、克雷伯氏菌属(尺/eZwW/a)、变形菌属(尸ra/ew)、沙门氏菌属(5"a/mowe〃a)例i口鼠伤寒沙门氏菌(《S"/mo"e〃a/^//z/wwn-Mm)、沙雷氏菌属(Serraria)例i口粘质沙雷氏菌(5"erra"'awarcescara)、志贺氏菌属(57n.ge〃a)、以及芽孢杆菌属(Sa"7//)诸如枯草芽孢杆菌(及MMfc)和地衣芽孢杆菌(及//c/zem/wTmS)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属OP化Mfifomo"os)诸如铜绿假单胞菌(户aerag/"cwa)、和链霉菌属(&re;tomF^)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31，446),尽管其它菌抹诸如大肠杆菌B、大肠杆菌Xn:76(ATCC31，53"和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码蛋白质的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母OSacc/zaram;;c&scerev^ae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主《效生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌4朱且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Sc/2izcwacc/wram;;cMpomZ7e);克鲁维酵母属(K/wj;veram^ce力宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(《./acto)、脆壁克鲁维酵母(&Aagz7/"(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(尺.^/gan'cw)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(尺.w/cferaw")(ATCC24,178)、《wa/"/(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.dmyo//w7an^m)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(/CAe，oto/erara)和马克思克鲁维酵母(^:mwx/a"^);亚罗酵母属(7^roW")(EP专利公开文本No.402,226);巴斯德毕赤酵母CP/c/2/"poton》(EP专利公开文本No.183,070);假丝酵母属(Ow^fo);瑞氏木霉(7Hc/zoa^wa(EP专利7^开文本No.244,234);粗糙脉孢菌(A^Mmsporacrowa);i午旺酵母属(5"c/2wa""z'ow^cas),诸^口5"cMva"w'omyc&yoccz'fife"to/^;和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(A^Mmspora)、青霉属(尸ew'"Www)、弯颈霉属(7b/;^oc/a^Mm)、和曲霉属(y^;ergz7/w)宿主i者i口构巢曲霉(j.m^w/ara)禾口黑适于表达糖基化本发明蛋白质的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊推动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾0S;7Ofltoptera/ra^peWa)(毛虫)、埃及4尹虫丈"ecfesaegyp")(虫丈子)、白纟丈4尹蚊"ed&sa/6op/c^s)(虫丈子)、黑、月复果虫是(ZVoso//n7ame/a"ogasfer)(果虫乾)禾口家蚕(5om6少;cmon')等宿主。公众可获得多种病毒4朱用于转染，例如苜蓿尺虫i^Mtograp/2aca/z/orm'caNPV的L-l变体和家蚕BowZ^xNPV的Bm-5片朱，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。在有些情况中会希望在脊推动物细胞生产蛋白质，诸如糖基化，而且培养(组织培养)中脊推动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，/Wra/.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细57胞/-DHFR(CHO,Urlaub等，尸rac.Ato/.L^477:4216(1980));小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather,所o/.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1，ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等，JmM&MKA^dSc7..383:44-68(1982);MRC5细胞；FS4细胞；人肝瘤系(HepG2);和骨髓瘤或淋巴瘤细胞(例如Y0、J558L、P3和NS0细胞)(参见美国专利No.5,807,715)。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。用本文所述用于生产蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。可以在多种培养基中培养用于生产本发明蛋白质的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham等，Me仇58:44(1979);Barnes等，^"a/.5z.oc/zem.102:255(1980);美国专利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利No.Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、4丐、镁和磷酸盐)、緩冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。本文中所公开的蛋白质也可以使用无细胞翻译系统来生产。为了此类目的，必须修饰编码多肽的核酸以容许体外转录以mRNA和容许mRNA在所利用的特定无细胞系统(真核的，诸如哺乳动物或酵母无细胞翻:^奪系统；或原核的，诸如细菌无细胞翻译系统)中的无细胞翻i奪。本发明的蛋白质也可以通过化学合成来生产(例如通过SolidPhasePeptideSynthesis,第2版，1984,ThePierceChemicalCo"Rockford,IL中记载的方法)。对蛋白质的修饰也可以通过化学合成来产生。本发明的蛋白质可以通过蛋白质化学领域普遍知道的蛋白质分离/纯化方法来纯化。非限制性的例子包括抽提、再结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、反流分布或这些的任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的多种技术将多肽更换到不同的緩冲液中和/或浓缩，包括但不限于过滤和透析。纯化后的多肽优选是至少85%纯的、更优选至少95°/。纯的、和最优选至少98%纯的。不管纯度的精确数值，多肽对于用作药品是足够纯的。别的糖基化实施方案在有些实施方案中，将本发明的蛋白质糖基化可能是优选的。优选的是，此类蛋白质是基于纤连蛋白的支架。基于纤连蛋白的支架通常不包含糖基化位点，然而，可以将此类糖基化位点改造入蛋白质中。蛋白质的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。可以将这些改造入本发明的蛋白质中，特别是基于纤连蛋白的支架蛋白及其对应的多核苷酸。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向本发明的蛋白质中添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成的(用于N-连接的糖基化位点)。或者，也可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。编码本发明蛋白质的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸59序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架蛋白)进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。可能希望在效应器功能方面修饰本发明的蛋白质，例如增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过引入Fc区的活性部分以及在蛋白质(例如基于纤连蛋白的支架蛋白)的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰由此产生变异的Fc区来实现。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。在一个实施方案中，变异的Fc区可以比天然序列Fc区更有效地在存在人效应细胞时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，或以更好的亲和力结合Fc伽马受体(FcyR)。此类Fc区变体可以在Fc区的第256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430位中的一个或多个处包含氨基酸修饰,其中Fc区中残基的编号方式是如Kabat中的EU索引的。别的基于抗体的蛋白质，包括模块和衍生物本发明的的别的实施方案包括单域抗体，即其互补决定区作为单域多肽一部分的抗体。优选的是，针对IGF-IR,以及包括在本发明的PEG连接的蛋白质中。例子包括但不限于重链抗体、天然不含轻链的抗体、自常规4链抗体衍生的单域抗体、工程化抗体和与那些衍生自抗体的不同的单域支架。单域抗体可以是任何现有的或任何未来的单域抗体。单域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼(llama)、山羊、家兔、牛。依照本发明的一个方面，单域抗体在用于本文时是天然存在的单域抗体，即不含轻链的重链抗体。此类单域抗体4皮露于例如WO94/04678。为了使其更清楚，这种自天然不含轻链的重链抗体衍生的可变域在本文中称作VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这样的VHH分子可以衍生自在骆驼科(Camelidae)物种中生成的抗体，例如骆驼、单峰驼、美洲驼、小羊驼(vicuna)、羊驼(alpaca)和大羊駝(guanaco)。骆駝科以外的其它物种也可生成天然不含轻链的重链抗体，此类VHH在本发明的范围内。依照本发明及如本领域技术人员所知，VHH是自天然不含轻链的免疫球蛋白衍生的重链可变域，诸如那些自駱驼科衍生的，如WO94/04678所述(以下称作VHH域或纳米抗体)。VHH分子比IgG分子小约10倍。它们是单一多肽且非常稳定，对极端pH和温度条件有抗性。此外，它们对蛋白酶的作用有抗性，常规抗体则不然另外，VHH的体外表达产生高产量的、正确折叠的功能性VHH。另外，在骆驼(Camelids)中产生的抗体会识别与经由使用抗体文库或免疫骆驼以外的哺乳动物生成的抗体所识别的表位不同的表位(WO9749805)。因此，抗EGFRVHH可以比常规抗体更有效地与EGFR相互作用，由此更有效地阻断EGFR与EGFR配体的相互作用。由于已知VHH结合"非常，，表位，诸如腔(cavities)或沟(grooves)(W097/49805),因此此类VHH的亲和力可能更适合于治疗性处理。本发明的另一个实施方案是抗表皮生长因子受体，其由与针对EGFR或密切相关家族成员的骆驼科VHH的序列对应的序列组成。本发明还涉及所述多肽的同源序列、功能部分或同源序列的功能性部分。本发明还涉及能够编码所述多肽的核酸。本发明的单域抗体可以针对EGFR或密切相关的家族成员。依照本发明及如本文中所讨论的，多肽构建物可进一步不含针对其它靶物(诸如例如血清清蛋白)的单域抗体。针对靶物的单域抗体指能够以好于1(^M的亲和力结合所述靶物的单域抗体。本发明进一步涉及单域抗体，其是属于具有人样序列的一类VHH。这样一类的特征在于VHH携带选自下组的氨基酸第45位处的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、曱疏氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、或谷氨酰胺(诸如例如L45)和第103位处的色氨酸，依照Kabat编号方式。因此，术语这类的多肽显示出与人VH框架的高度氨基酸序列同源性，而且所述多肽可以直接施用于人，预期不会由此产生不想要的免疫应答，且没有进一步人源化的负担。另一种人样类别的骆驼科单域抗体已经记载于PCT公开文本No.的疏水性FR2残基，但是通过第103位带电荷精氨酸残基替代来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基补偿了此亲水性损失。因此，属于这两类的肽显示出与人VH框架区的高度氨基酸序列同源性，而且所述肽可以直接施用于人，预期不会由此产生不想要的免疫应答，且没有进一步人源化的负担。本发明还涉及能够编码此类多肽的核酸。抗体可包括全长骆-呢科抗体，即Fc和VHH域。抗清蛋白VHH可以以更有效的方式与称作载体蛋白的血清清蛋白相互作用。作为载体多肽，血清清蛋白的有些表位可能是所结合的蛋白质、肽和小型化学化合物不可及的。由于已知VHH结合"非常"或非常规表位，诸如腔(W097/49805),因此此类VHH对循环中的清蛋白的亲和力可能更适合于治疗性处理。血清清蛋白可以是在受试者的血清中找到的任何合适蛋白质或其片段。在本发明的一个方面，血清蛋白质是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、曱状腺素结合蛋白、运铁蛋白、或纤连蛋白。根据预定用途，诸如有效治疗所要求的半衰期和/或靶抗原的隔室化，VHH-配偶(partner)可针对上述血清蛋白质之一。"抗体片段"只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward等，Atoi^341:544-546(1989)),其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键相连的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv;scFv)(Bird等,&/ewce242:423-426(1988)和Huston等，/WASYtZ&4」85:5879-5883(1988》；(x)"双抗体，，，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(参见例如EP专利公开文本No.404,097;WO93/11161;和Hollinger等，iVoc,胸/.加d腦90:6444-6448(1993));(xi)"线性抗体"，其包含一对串联的Fd区段(VH-CHl-VH-CHl),与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，8(10):1057-1062(l"5)和美国专利5，641，870)。已经为抗体片段的生产开发了多种技术，它们可用于制备本发明中所使用的抗体片段。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化来衍生(参见例如Morimoto等,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);及Brennan等，Science,229:81(1985))。然而现在可以由重组宿主细胞直接生成这些片段。例如，可以自上文所讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以自大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可以自重组宿主细胞培养物直接分离F(ab')2片段。用于抗体片段生产的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185;美国专利No.5,571,894;及美国专利No.5,587,458。抗体片段也可以是"线性抗体"，例如如例如美国专利No.5,641，870所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。备选的靶向蛋白质治疗剂在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可以包含一种或多种avimer序列。avimer是一类对各种靶分子(包括本文中所描述的那些)具有亲和力和特异性的结合蛋白。这些蛋白质可以包括在本发明的PEG连接的实施方案中。它们可以通过体外外显子改组和噬菌体展示自人胞外受体域开发(Silverman等，2005，NatBiotechnol.23:1493-94;Silverman等，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多域蛋白可包含多个独立的结合域，其可展现出与单表位结合蛋白相比改善的亲和力(在有些情况中是亚纳摩尔的)和特异性。在各种实施方案中，avimer可附着至例如PEG或多肽接头。关于avimer的构建和使用方法的别的细节披露于例如美国专利公开文本No.20040175756,20050048512，20050053973,20050089932和20050221384,通过述及将每一篇的实施例部分以及整个文件收入本文。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含一种或多种脂笼蛋白相关序列，例如抗anticalins或脂笼蛋白衍生物。anticalins或脂笼蛋白衍生物是一类对各种靶分子(包括本文中所描述的那些)具有亲和力和特异性的结合蛋白。此类蛋白质记载于美国专利公开文本No.20060058510(Anticalins)、美国专利公开文本No.20060088908(Muteinsofhumanneutrophilgelatinase-associatedlipocalinandrelatedproteins)、美国专利公开文本No.20050106660(Muteinsofapolipoproteind)和PCT公开文本No.W02006/056464。这些蛋白质可包括在本发明的PEG连接的实施方案中。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含一种或多种四连蛋白C型凝集素相关序列或三连蛋白例如四连蛋白C型凝集素或四连蛋白C型凝集素衍生物。四连蛋白C型凝集素或四连蛋白C型凝集素衍生物是一类对各种靶分子(包括本文中所描述的那些)具有亲和力和特异性的结合蛋白。不同的四连蛋白C型凝集素和相关蛋白记载于PCT公开文本No.W02006/053568,WO2005/080418,WO2004/094478,WO2004/039841,WO2004/005335,WO2002/048189,WO98/056906,和美国专利公开文本No.20050202043。这些蛋白质可包括在本发明的PEG连接的实施方案中。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含一种或多种天然锚蛋白重复蛋白，例如DARPins(MolecularPartners)。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含一种或多种AffibodiesTM。AffibodiesTM衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合域。可通过改变位于蛋白A域结合表面附近的残基来获得新的结合特性。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含一种或多种基于半胱氨酸结的蛋白质支架，即微体(Selecore/NascaCe11)。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含一种或多种Trans-bodies。Trans-bodiesTM基于运4失蛋白支架(BioResis/Pfizer)。在某些实施方案中，本文所述发明的蛋白质可包含基于伽马晶体蛋白或遍在蛋白质的结合蛋白。这些所谓的AffilinTM(ScilProteins)分子特征在于蛋白质(3片层结构中结合区的从头设计。AffilinTM分子已经记载于美国公开文本No.20070248536。连接至本发明蛋白质的毒素和其它分子本文所公开发明的蛋白质可连接至细胞毒剂。此类实施方案可通过适宜的体外或体内方法来制备。体外方法包括本领域众所周知的缀合方法，包括与蛋白质相容的化学，诸如对特定氨基酸(诸如Cys和Lys)的化学。为了将细胞毒剂连接至本发明的蛋白质，使用连接接头或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团是二辟b化物基团和碌o醚基团。例如，可以使用二碌"匕物交换反应或通过在抗体和细胞毒剂之间形成硫醚键来构建缀合物。优选的细胞毒剂是美登木素生物碱、紫杉烷和CC-1065类似物。体内方法包括将毒素、标签或标记蛋白质连接至本发明蛋白质，成为融合蛋白。使用编码期望多肽的多核苷酸生成单一多肽。可以通过在对毒素有制毒性蛋白质。尽管不是限制性的，在各种实施方案中，可以将本发明的蛋白质连接至蛋白质，诸如细菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、蛋白酶、葡萄球菌肠毒素-A、商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、Ranpimase(Rap)、Rap(N69Q)、酶、或荧光蛋白。美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物是优选的细胞毒剂之一。合适的美登木素生物碱的例子包括美登醇和美登醇类似物。合适的美登木素生物碱披露于美国专利No.4,424，219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;6,333,410;5,475,092;5,585,499;和5,846,545。紫杉烷也是优选的细胞毒剂。适合用于本发明的紫杉烷^坡露于美国专利No.6,372,738和6，340,701。CC-1065及其类似物也是用于本发明的优选细胞毒剂。CC-1065及其类似物披露于美国专利No.6,372，738;6,340,701;5,846,545和5,585,499。用于制备此类细胞毒性缀合物的一种诱人候选物是CC-1065，其是一种自泽耳链霉菌(5^eptom;/casze/e"w力培养液分离得到的有力的抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外比常用的抗癌药(诸如多柔比星、曱氨蝶呤和长春新碱)更有力约IOOO倍(B.K.Bhuyan等，CancerRes.,42，3532-3537(1982))。细胞毒性药物(诸如曱氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、和加利车霉素)也适合于制备本发明的缀合物，而且也可以通过居间载体分子(诸如血清清蛋白)将药物分子连接至抗体分子。为了诊断应用，通常会用可检测模块标记本发明的抗体。可检测模块可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何模块。例如，可检测模块可以是放射性同位素，诸如H3、C14或13、P32、S35,或I131;荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明、或萤光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、(3-半乳糖香酶或辣根过氧化物酶。缀合可以采用本领域已知的用于将蛋白质缀合至可检测模块的任何方法，包括Hunter等，Nature144:945(1962);David等，Biochemistry13:1014(1974);Pain等，J.Immunol.Meth.40:219(1981);及Nygren，J.Histochem.andCytochem.30:407(1982)所记载的方法。体外方法包括本领域众所周知的缀合化学，包括与蛋白质相容的化学，诸如对特定氨基酸(诸如Cys和Lys)的化学。为了将模块(诸如PEG)连接至本发明的蛋白质，使用连接基团或反应性基团。合适的连接基团是本领域众所周知的，而且包括二疏化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。根据应用，优选的连接基团是二硫化物基团和硫醚基团。对于基于纤连蛋白的支架或其它不含Cys半胱氨酸的蛋白质，可以在某个位置改造Cys容许蛋白质存在活性同时创建缀合位置。成像和其它应用本发明的蛋白质对于体内成像也是有用的，其中给受试者施用(优选键入血流)经可检测模块(诸如不透射线的药剂或放射性同位素)标记的蛋白质并测定经标记蛋白质在宿主中的存在和位置。这种成像技术在恶性肿瘤的分期和治疗中是有用的。可以用在宿主中可检测(通过核7磁共振、放射学、或本领域已知的其它检测手段)的任何模块标记蛋白质。本发明的蛋白质作为亲和纯化剂也是有用的。在这种方法中，使用本领域众所周知的方法将抗体固定化在合适的支持物上，诸如Sephadex树脂或滤纸。基于其对IGF-IR在细胞中的功能的抑制，本发明的蛋白质作为生物学研究中的试剂也是有用的。本发明的蛋白质可用于任何已知的测定法，诸如竟争性结合测定法、直接和间接三明治测定法、和免疫沉淀测定法(Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,页147-158(CRCPress,Inc.,1987))。可以以本发明的适宜实施方案一起^f吏用的别的药剂在其它治疗性处理或组合物中，将本发明的蛋白质与一种或多种别的治疗剂共施用或序贯施用。合适的治疗剂包括但不限于靶向治疗剂、其它发现生物制品、和细胞毒性或细胞抑制性药剂。在有些情况中会优选在同一个或66分开的、装有液体配制剂的治疗可接受管形瓶、注射器或其它施用装置中施用药剂。癌症治疗剂指那些试图杀死癌细胞或限制癌细胞生长同时对患者具有最低限度影响的药剂。如此，此类药剂可利用与健康宿主细胞相比癌细胞特性(例如代谢、血管化或表面抗原呈递)的任何差异。肿瘤形态学差异是干预的潜在位点例如，第二治疗剂可以是在迟滞实体瘤内部血管化方面有用，由此减緩其生长速率的抗体，诸如抗VEGF抗体。其它治疗剂包括但不限于辅助剂诸如盐酸格拉司琼(granisetronHCl)、；维激素抑制剂诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、抗生素诸如多柔比星、抗雌激素诸如他莫昔芬、抗代谢物诸如干扰素a-2a、细胞毒剂诸如紫杉醇、酶抑制剂诸如ras法尼基转移酶抑制剂、免疫调控剂诸如阿地白介素(aldesleukin)、和氮芥衍生物诸如盐酸美法仑、诸如此类。可以为了改善的抗癌效果而与本发明的蛋白质组合的治疗剂包括肿瘤学实践中所使用的多种药剂(参考文献Cancer,Principles&PracticeofOncology,DeVita,V.T"Hellman，S.，Rosenberg,S.A.，第6版，Lippincott-Raven,Philadelphia,2001),诸如多西他塞、帕利他塞、多柔比星、表柔比星、环磷酰胺、曲妥单抗、卡培他滨、他莫昔芬、托瑞米芬、来曲唑、阿那曲唑、氟维司群、依西美坦、戈舍瑞林、奥沙利铂、卡铂、顺铂、地塞米松、安肽、贝伐单抗、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、左旋咪唑、伊立替康、依托泊苷、托泊替康、吉西他滨、长春瑞滨、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑来膦酸盐、链佐星、利妥昔单抗、伊达比星、白消安、苯丁酸氮芥、氟达拉滨、伊马替尼、阿糖胞苷、ibritumomab、托西莫单抗、干扰素a-2b、美法仑、bortezomib、六曱蜜胺、天冬酰胺酶、gefitinib、erlonitib、抗EGF受体抗体(例3口西妥昔单4元或panitumab)、ixabepilone、epothilones或其书f生4勿、和细胞毒性药物与针对细胞表面受体的抗体的缀合物。优选的治疗剂是铂剂(诸如卡铂、奥沙利铂、顺铀)、紫杉烷(诸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他滨、和喜树碱。可以在本发明的抗体、抗体片段或缀合物之前、同时、或之后施用一种或多种别的治疗剂。熟练技术人员会理解，对于每种治疗剂，特定施用次序可能是有利的。类似的，熟练技术人员会理解，对于每种治疗剂，施用药剂与本发明的抗体、抗体片段或缀合物之间的时间长度会变化。配制和施用本发明的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的所述蛋白质与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.编(1980))混合，以水溶液、冻干或其它干燥配制剂的形式制备。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括緩冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二曱基千基铵(octadecyidimethylbenzylammoniumchloride);氯化己烷双胺(hexamethoniumchloride);苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、苯索氯铵(benzethoniumchloride);酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkylparabens),诸如对羟基苯曱酸甲酯或丙酯；邻苯二酚(catechol);间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子(salt-formingcounter-ions),诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。本文中提供了活性化合物组合的例子。此类分子以对预定目的有效的量合适的组合存在。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱S旨)微胶嚢)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.编(1980)。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明蛋白质的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶嚢。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶嚢化抗体或免疫偶联物在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37。C的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。虽然熟练技术人员会理解每种治疗剂的剂量会取决于药剂的身份，但是优选的剂量范围可以是约IOmg/平米至约2000mg/平米、更优选约50mg/平米至约1000mg/平米。对于优选的药剂，诸如铂剂(卡铂、奥沙利铂、顺铂)，优选的剂量是约10mg/平米至约400mg/平米，对于紫杉烷(帕利他塞、多西他塞)，优选的剂量是约20mg/平米至约150mg/平米，对于吉西他滨，优选的剂量是约100mg/平米至约2000mg/平米，而对于喜树4成，优选的剂量是约50mg/平米至约350mg/平米。这种和其它治疗剂的剂量可取决于本发明的抗体、抗体片段或缀合物是否与治疗剂同时或序贯施用。为了治疗性应用，以药学可接受剂量形式将本发明的蛋白质或缀合物施用于受试者。它们可以静脉内(作为推注或持续一段时间的连续输注)、肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径施用。蛋白质也可以通过肺瘤内、肿瘤周围、病变内、或病变周围^各径施用，以发挥足部以及系统治疗效果。合适的药学可接受载体、稀释剂、和赋形剂是众所周知的，而且可以由本领域技术人员4艮据临床形势许可来决定。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括(l)Dulbecco氏磷酸盐緩冲衍生，pH约7.4，含有约lmg/ml至25mg/ml人血清清蛋白；(2)0.9%盐水(0.9%w/vNaCl);和(3)5。/。(w/v)右旋糖。本发明的方法可以在体外、在体内、或回体实施。本发明的蛋白质和一种或多种别的治疗剂的施用(无论是共施用或者是序贯施用)可以如上所述为治疗应用而发生。根据共施用的具体治疗剂的身6份，熟练技术人员会了解适合于共施用的药学可接受载体、稀释剂、和赋形剂。在以水性剂型而非冻干剂型存在时，蛋白质通常会配制成约O.lmg/ml至100mg/ml的浓度，尽管这些范围以外的广泛变异也是容许的。为了疾病的治疗，抗体或缀合物的适宜剂量会取决于如上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防目的还是治疗目的、先前疗法的过程、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。一次性地或通过一系列处理地合适地施用蛋白质。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量优选是约1mg/平米至约2000mg/平米蛋白质、更优选约IOmg/平米至约1000mg/平米抗体，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或者是通过连续输注。对于持续数天或更长时间的重复施用，根据状况，重复治疗直至期望的对疾病症状的遏制发生。然而，其它剂量摄生法可能是有用的，不被排除在外。本发明还包括试剂盒，其包括一种或多种本文中所描述的成分和关于那些成分的使用说明书。在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包括本发明的抗体、抗体片段或缀合物，及治疗剂。关于此优选实施方案的说明书包括使用本发明的蛋白质及治疗剂抑制癌细胞生长的说明书，和/或施用本发明的抗体、抗体片段或缀合物及治疗剂治疗患有癌症的患者的方法的说明书。优选的是，试剂盒中所使用的治疗剂选自下组多西他塞、帕利他塞、多柔比星、表柔比星、环磷酰胺、曲妥单抗、卡培他滨、他莫昔芬、托瑞米芬、来曲唑、阿那曲峻、氟维司群、依西美坦、戈舍瑞林、奥沙利铂、卡铂、顺鉑、地塞米松、安肽、贝伐单抗、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、左旋咪唑、依托泊苷、拓朴替康、吉西他滨、长春瑞滨、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑来膦酸盐、链佐星、利妥昔单抗、伊达比星、白消安、苯丁酸氮芥、氟达拉滨、伊马替尼、阿糖胞苷、ibritumomab、托西莫单抗、干扰素a-2b、美法仑、bortezomib、六曱蜜胺、天冬酰胺酶、gefitinib、erlonitib、抗EGF受体抗体(侈'J3口西妥昔单4元或panitumumab)、ixabepilone、禾口epothilone或其书亍生4勿。更优选的是，治疗剂是铂剂(诸如卡铂、奥沙利铂、顺賴)、紫杉烷(诸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他滨、或喜树^4。本发明试剂盒的成分出于适合于试剂盒的形式，诸如溶液或冻干粉。熟练技术人员会了解，试剂盒的成分的浓度或量因试剂盒的每种成分的身份和试剂盒的说明书中提到的癌症及其细胞包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、滑膜癌、胰腺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、和横紋肌肉瘤。别的专利参考文献以下别的专利申请和专利中所记载的方法和组合物也包括在本公开内容中美国专利公开文本No.20050186203;20050084906;20050008642;20040202655;20040132028;20030211078;20060083683;20060099205;20060228355;20040081648;20040081647;20050074865;20040259155;20050038229;20050255548;20060246059;和美国专利No.5,707，632;6,818,418;和7,115,396;及PCT公开文本No.WO2005/085430;WO2004/019878;WO2004/029224;WO2005/056764;WO2001/064942;和WO2002/032925。本申请要求2006年11月22日和2007年1月9日分别提交的美国临时申请No.60/860,605和60/879，666的优先权，通过述及完整收入其内容。通过述及的收录本文中所记载的所有文件和参考文献(包括专利文件和网站)通过述及个别地收入本文件，就像完整地或部分地在本文件中书写的程度。实施例现在通过述及以下实施例来描述本发明，实施例只是例示性的，并非意图限制本发明。虽然已经详细地、述及具体实施方案地描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，可以进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。实施例l:IEG-结合分子的初始鉴定以人纤连蛋白第十3型域的支架为基础构建了在第23-29、52-55和77-86位处具有三个随机化区的大约10。个RNA-蛋白质融合物变体的文库(氨基酸编号参照SEQIDNO:l)(三环文库;Xu等,Chemistry&Biology9:933-942，2002)。转变成mRNA/cDNA异双链体后，将一万亿个mRNA/cDNA-蛋白质融合物的文库结合至溶液中的100nM生物素化IGF-IR，并捕捉至链霉亲合素包被的磁珠上。将cDNA洗脱，通过PCR扩增，并用于生成mRNA/cDNA-蛋白质融合物的新文库。以这种方式实施5轮选择，并在每轮后通过定量PCR监测文库中结合IGF-IR的百分比以鉴定靶物结合富集(图l)。实施例2:竟争性IGF-IR克隆的鉴定使用竟争性结合测定法在存在IGF-IR的情况中对由独立克隆编码的蛋白质分析对靶物结合的抑制。超过一百个克隆被鉴定为抑制IGF-I结合IGF-IR，提示这些克隆在天然配体(IGF-I)结合位点处或附近结合IGF-IR。这一百个克隆的SEQIDNO(见图30)及其在竟争性结合测定法中的百分比抑制呈现于表l。表l:IGF-IR竟争性克隆的SEQIDNO和。/。抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>实施例3:IGF-IR竟争性克隆的电泳特性的检验通过SDS-PAGE检验了所选择克隆的纯度和电泳特性(图2)。考虑到它们的单柱纯化，发现这些克隆是适度纯的，而且它们具有与理论质量一致的表观分子量(考虑了与C末端标签有关的额外质量)。实施例4:结合IGF-IR的序列家族的鉴定对能够与IGF-I竟争的克隆测序并使用VectorNTI(Invitrogen)比对。大多数克隆落入三个不同的家族。一个家族以保守BC环第6位的缬氨酸和含有保守精氨酸和酪氨酸的长度可变FG环来识别(克隆218C04、215D09、2MC(H、214F03、214C03、214E01、和218F09)。第二个家族以DG环中的保守酪氨酸和脯氨酸来识别，而且常常与恰好10个氨基酸的FG环有关(克隆225D03、215E09、215B07、215D11、218E09、309B01、310A01、和310A03)。第三个克隆家族具有含保守疏水性氨基酸的14个氨基酸的FG环(克隆Clones223B01、223B02、和218F08)。剩余克隆没有显示出与其它家族的相似性，不能分入不同的家族，而且未显示。实施例5:适合于优化的候选克隆的鉴定源自上述选择过程的克隆有可能未达到生物治疗剂的严格亲和力、特异性、和生物物理学要求，并因此需要进一步诱变，其中细调或"优化，，结合环。为了鉴定最大限度遵循此轨迹的克隆，选择一些候选物进行深入表征。在此实施例中，描述了一个IGF-IR竟争性克隆(即218C04)的表征。制备一升大肠杆菌培养液，并如SDS-PAGE所示纯化克隆218C04(图3)。在生物物理学特性的检验中，SEC反映了218C04事实上都是单体的(图4),提示此克隆不具有在较高蛋白质浓度生成稳定聚集体的倾向。纯化产物的表面等离振子共振(BIAcore)分析揭示了以溶液相注入的克隆以1.8nM的Ko结合固定化IGF-IR。总之，这些特性指示了此克隆适合于优化。实施例6:IGF-IR特异性克隆的优化在以下实施例中，描述了一个IGF-IR特异性克隆(即218C04)的优化。显示了克隆218C04的序列，其中BC、DE、和FG环分别以下划线标示SSARTATISGLKPGVDYTITVYAVTPSNIIGRHYGPIS雨RT(SEQIDNO:17)构建了三个文库，其中每次用随机序列替换一个环。如下所述在DNA水平构建文库，只是三个环中两个的随机序列用与克隆218C04对应的固定序列替换。对这三个文库实施扩增、mRNA-蛋白质融合物的合成、和亲和选择。每轮监测结合百分比(图5a)，并继续PROftision直至每个文库显示出超过l。/c)的结合。在此点，自每个文库扩增随机环并重新组装以制备其中所有3个环都进行了优化的主文库(masterlibrary)(图5b)。对包含所有3个经过优化的环的主文库进行多轮扩增、mRNA-蛋白质融合物合成、和亲和选择。使用递减浓度的IGF-IR以选择最高亲和力的结合物(图5c)。实施例7:用于评估经过优化的衍生物克隆的竟争性IGF-IR测定法在此实施例中对于所选择的经过优化的基于纤连蛋白的支架蛋白与优化前的克隆(即克隆218C04)在竟争性测定法中比较它们抑制IGF-I和IGF-IR之间相互作用的能力。在HTPP和量化后，许多克隆展现出比起始克隆卓越的抑制，IC50在低nM范围中(图6)。具体而言，一个克隆(即338A06)表现出在此测定法中具有lnM或低于lnM的IC50(图6)。实施例8:经过优化的IGF-IR竟争性克隆的序列在优化所选择的克隆并在竟争性测定法中对衍生物评估对IGF-IGF-IR相互作用的抑制后，对克隆测序。参见图30和表2中的SEQIDNO:110-125。75与此实施例中的亲本克隆218C04相似，所有抑制性衍生物克隆在BC环中包含保守缬氨酸残基。另外，在BC环中的保守位置处频繁观察到保守的疏水性残基(通常是亮氨酸)。经过优化的克隆的FG环也与亲本克隆218C04在特定位置共享保守残基，尽管环的长度有变化。对于这个特定克隆家族，精氨酸-X-酪氨酸基序表现出是功能性所要求的重要基序。这见于除一个以外的所有书f生物克隆，而在此克隆(354C10,精氨酸-X-缬氨酸)表现出是耐受的、保守替代。因此，对于218C04克隆家族，表现出有四个优势(dominant)位置，两个在BC环中，两个在FG环中，它们表现出在限定IGF-IR结合和抑制活性方面发挥最大作用。表2克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:338A05110354A09115354D10120338A06111354A10116354E02121339A01112354B10117354F11122353F10113354C05118354F06123353H09114354C10119354G02124354G09125实施例9:经过优化的IGF-IR竟争性克隆的电泳特性的检验制备了所选择的经过优化的克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。SDS-PAGE(图7)揭示了优良的纯度(尽管是单柱纯化)和与它们的理论分子量(虑及(allowfor)标签)一致的表观分子量。实施例10:经过优化的IGF-IR竟争性克隆的热稳定性的检验制备了所选择的IGF-IR优化克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。实施了差示扫描量热法(DSC)来表征各个克隆的解折叠能量学或熔解温度Tm。克隆338A06展现出解折叠温度为62。C(图8),指示了高度稳定的结构。别的优化克隆的熔解温度见表3。实施例ll:经过优化的IGF-IG竟争性克隆的溶液特性的检验表3:通过差示扫描量热法测定的IGF-IR克隆的熔化温度克隆(Tm,0C)338A0568353F1059353H0955354A1046368G0556375G1059制备了所选择的优化克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。大小排阻层析(SEC)揭示了单体行为(在此实施例中是克隆338A06)(图9)，指示了在较高蛋白质浓度，经过优化的克隆不具有聚集的趋向。使用与多角度激光散射(MALLS)联合的SEC证实了单体性。"经典"光散射(也称作"静态"或"Rayldgh，，散射或MALLS)提供了分子量的直接测量。因此，它对于确定蛋白质的天然状态是单体还是高级寡聚物，及对于测量聚集体或其它非天然种类的质量是非常有用的。在此实施例中，呈现了对克隆338A06的分析。如图10所示，SECMALLS测定出克隆338A06的质量为12,190Da,完全在带His标签的单体的预测质量ll,740的实-睑误差内。这提供了这些克隆在溶液中是表现优良的单体的额外证据。实施例12:经过优化的IGF-IR竟争性克隆的结合亲和力和动力学的测定制备了所选择的优化克隆的一升大肠杆菌培养液并純化蛋白质。使用重组的、固定化的IGF-IR和溶液相克隆实施表面等离振子共振(BIAcore)分析以测定结合动力学和结合亲和力。如表4所示，此实施例所示克隆的结合亲和力的范围为两位数pM至一位数(singledigit)nMKD。解离速率在1(T4(1/s)范围中，而结合速率非常快，通常是约1()6(1/M.s)。表4:ka、kd和Kd的BIAcore测定克隆ka(1/M*s)x10+5ko(1/s)x10懇4KD(nM)353F103.72.10.056353H093.82.20.057338A062.24.30細354A101.11.80.158338A051.33.30.261375G101.37.00.538339A011.26.70.565368G050.00369.82.740实施例13:经过优化的IGF-IR竟争性克隆对胰岛素受体的结合的测定制备了所选择的优化克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。人IGF-IR对人胰岛素受体的同源性为大约56%。为了确保IGF-IR竟争性克隆确实是对IGF-IR特异性的，使用BIAcore方法学在高浓度针对人胰岛素受体进行评估。将人胰岛素受体固定化到BIAcore芯片上，正如作为非特异性结合对照的无关蛋白质。使克隆以1(VM流过芯片，该浓度比大多数克隆的IGF-IR結合Kd高10,000倍以上。记录相似浓度时胰岛素结合信号百分比并呈现于表5。大多数克隆在此高浓度不展现出或刚刚展现出可检测的对胰岛素受体的结合，说明了它们确实是对IGF-IR特异性的。展现出一些程度的对胰岛素受体结合的克隆表现出是选择性结合物。表5:IGF-IR克隆的胰岛素受体(IR)结合克隆10nM处的。/。IR结合338A062354A101353F101353H090375G100368G0521338A0545339A01>訓78胰岛素1100_实施例14:IGF-IR克隆338A06的MALDITOF质镨对纯化后的、经过优化的IGF-IR克隆实施质镨以确保身份。在此实施例中，检验了克隆338A06。克隆338A06的预测质量为11741原子量单位(amu)。用标准品校准后，克隆338A06的MALDITOF质谱揭示了质量为11741m/z(图ll)。观察到更高m/z处别的次要种类，然而这些与基质加合物一致(图11)。因此，338A06和事实上所有检验的IGF-IR克隆给出与它们的预测质量一致的质量。实施例15:IGF-IR竟争性克隆338A06在基于细胞的测定法中的活性在基于细胞的测定法中评估纯化后的、经过优化的IGF-IR克隆以验证活性。在一个例子中展示了所选择的克隆338A06对IGF-I介导的有丝分裂的抑制，如图12所示。用连续稀释的克隆338A06或常用的抗IGF-IR单克隆抗体(MAB391)处理无IGF-I培养基中的人胰腺癌细胞系BxPC-3。刺激性暴露于IGF-I24小时后，用311-胸苷处理细胞以测量细胞增殖。如图12所示，克隆338A06与单克隆抗体对照相当地抑制IGF-I依赖性增殖，IC50为大约10-20nM。在第二个基于细胞的测定法中展示了克隆338A06对同位素标记的IGF-I结合表达IGF-IR的癌细胞系的抑制。将人乳腺癌MCF-7细胞与克隆338A06、单克隆抗体MAB391、或未标记的IGF-1预温育30分钟。温育期后，添加方文射性标记的IGF-I。随后裂解细胞并量化放射性。如图13所示，克隆338A06和冷的IGF-I具有基本上相当的IC50，大约为l-2nM,而单克隆抗体表现出效力较低，IC50为大约5nM。实施例16:克隆338A06的优化贮存期间对蛋白质看到的常见降解过程之一是曱疏氨酸残基的氧化，这可导致化学和物理学稳定性及生物学活性的潜在损失。虽然基于纤连蛋白的支架蛋白克隆在它们的骨架中不含曱硫氨酸残基，所选择的一些IGF-IR竟争性克隆在它们的环中包含甲硫氨酸。为了选择保留起始克隆的生物学活性的期望特性和生物物理学特性但替代了环中不想要的曱硫氨酸残基的克隆而实施了优化。在此实施例中，显示了在FG环中包含曱硫氨酸残基的克隆338A06的优化。使用在FG环中具有6个随机氨基酸的单一文库优化了克隆338A06。使用适宜的寡核苷酸将338A06的序列(SEQIDNO:lll)掺入新文库的BC和DE环中。如下所述构建了文库并将双链DNA转变成mRNA-蛋白质融合物以给出约1000个拷贝的每种FG环序列。实施扩增、mRNA-蛋白质融合物形成和亲和选择的PROfusion循环。在第一轮中，生物素化IGF-IR浓度为100nM，但是这在后续轮中降低以富集最高亲和力结合物。实施例17:338A06的优化衍生物的直接结合测定法使用直接结合测定法对克隆338A06的优化衍生物筛选增强的对IGF-IR的结合。使用克隆浓度梯度进一步分析在单点测定法中显示出结合的克隆。如图14所示，许多衍生物克隆以与亲本克隆338A06相当的亲和力结合IGF-IR。在大约lnM的浓度看到半最大结合(图14)。实施例18:经过优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的序列优化338A06克隆的FG环并在直接结合测定法中对衍生物评估对IGF-IR的结合后，对克隆测序。参见图30和表6的SEQIDNO:184-202。在此实施例中所呈现的克隆中，只有一个克隆在FG环中包含曱硫氨酸(克隆387A09),而且这位于与亲本338A06克隆不同的位置。因此，338A06克隆的FG环中的曱硫氨酸表现出对功能性不重要。本发明提供了改造除掉此失稳性残基的方法。与这些克隆的218C04衍生化一致，精氨酸-X-酪氨酸基序被保留在338A06FG环优化努力的所有产物中。这提供了此区域中这两个残基在用于此特定家族的基于纤连蛋白的支架蛋白折叠的背景中在IGF-IR结合和抑制中表现为优势决定因素的额外证据。__表6克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:克隆SEQIDNO:385A08184385F08190386F10196385A09185385H06191386F11197<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>实施例19:FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的溶液特性的检验FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的HTPP物质的大小排阻层析(SEC)揭示了单体行为，指示了在较高蛋白质浓度，经过优化的克隆不具有聚集趋向。在此实施例中呈现了9个自优化和HTPP衍生的克隆(图15)。实施例20:FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的结合亲和力和动力学的测定制备了所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。使用重组的、固定化的IGF-IR和溶液相克隆实施了BIAcore分析以测定结合动力学和结合亲和力。如表7所示，对于此实施例中所显示的克隆，结合亲和力的范围为两位数至三位数pM。解离速率在10"(l/s)范围中，而结合速率非常快，通常为约10"1/M.s)。_表7:ka、kd和Ko的BIAcore测定<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>实施例21:FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆对胰岛素受体的结合的测定制备了所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。人IGF-IR对人胰岛素受体的同源性为大约56。/。。为了确保IGF-IR竟争性克隆确实是对IGF-IR特异性的，使用BIAcore方法学在高浓度针对人胰岛素受体进行评估。将人胰岛素受体固定化到BIAcore芯片上，正如作为非特异性结合对照的无关蛋白质。使克隆以10pM流过芯片，该浓度比大多数克隆的IGF-IR结合Kd高10,OOO倍以上。记录相似浓度时胰岛素结合信号百分比并呈现于表8。大多数克隆在此高浓度不展现出可检测的对胰岛素受体的结合，说明这些克隆确实是对IGF-IR特异性的。表8:338A06FG环优化的IGF-IR克隆的胰岛素受体结合<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>实施例22:FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的热稳定性的检验制备了所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。实施了差示扫描量热法(DSC)来表征各个克隆的解折叠能量学或熔解温度Tm。所测试的克隆展现出解折叠温度为58-63。C,指示了高度稳定的结构。经过优化的克隆的熔解温度见表9。表9:通过差示扫描量热法测定的IGF-IR克隆的熔化温度<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>实施例23:FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆在纯化后的熔化特性的检验制备了所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的HTPP物质的大小排阻层析(SEC)揭示了单体行为，指示了在较高蛋白质浓度，经过优化的克隆不具有聚集的趋向。在此实施例中，呈现了一个代表性克隆387B01的SECi普(图16)。实施例24:FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆在纯化后的纯度和同质性的RP-HPLC检验制备了所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。实施了反相高效液像层析(RP-HPLC)以表征克隆的纯度以及确立克隆同质性。所有克隆在利用改造入其C末端的C末端标签的单柱纯化后展现出卓越的纯度和同质性，如图17所示代表性层析图所例示的。实施例25:FG环优化的338A06克隆在纯化后的MALDITOF质谱制备了所选择的FG环优化的338A06IGF-IR竟争性克隆的一升大肠杆菌培养液并纯化蛋白质。对纯化后的、经过优化的IGF-IR克隆实施了质谱以确保身份。在此实施例中，检验了克隆387B01。克隆38B01的预测质量为11554原子量单位(amu)。在用标准品校准后，克隆387B01的MALDITOF质谱揭示了大约11553m/z的质量，完全在仪器的实验误差内(图18)。观察到更高m/z处别的次要种类(图18)。不确定这是基质加合物还是次要翻译后修饰种类。因此，387B01和事实上所有检验的IGF-IR克隆给出与它们的预测质量一致的质量。实施例26:基于纤连蛋白的支架蛋白的PEG化为了实施体内研究，实施了基于纤连蛋白的支架蛋白的PEG化。在此实施例中，在大肠杆菌表达系统中生成克隆385A08，其具有C末端延伸以产生如下蛋白质序列(C末端延伸以斜体、粗体标示，Cys97以下划线标示)(SEQIDNO:203)使用标准马来酰亚胺化学利用第97位半胱氨酸残基的单一硫氢基来偶83联PEG变体以产生两种不同PEG化形式的385A08。将线性20kDa双功能PEG和单功能性分支40kDaPEG(NOFCorporation)都与克隆385A08缀合以分别产生385A08-PEG20-385A08和385A08-PEG40。通过阴离子交换层析和大小排阻层析将PEG化蛋白质形式与未反应的蛋白质和PEG纯化分开。通过SDS-PAGE(图ll)和质谱证实了385A08的这两种PEG性质的共价连接。实施例27:PEG化基于纤连蛋白的支架克隆变体的结合亲和力和动力学的测定使用重组的、固定化的IGF-IR和液相分析物实施了表面等离振子共振(BIAcore)分析以测定385A08-PEG20-385A08和385A08-PEG40变体的结合动力学和结合亲和力。虽然发现385A08-PEG40形式具有相对于未修饰的385A08慢大约10倍的结合速率(ka)，但是385A08-PEG20-385A08形式具有快大约2倍的结合速率(表10)。变体的解离速率(kd，表10)相对于未修饰385A08略有升高(385A08-PEG40形式)或略有降低(385A08-PEG20-385A08变体)(表IO)。表10:ka、kd和Ko的BIAcore测定克隆ka(l/M*s)xlO+6kd(1/s)xl0-4KD(pM)385A086.91.623385A08-PEG20-385A08150.96385A08-PEG400.62.1355实施例28:IGF-IR增殖测定法中对PEG化基于纤连蛋白的支架克隆的评估使用人浆细胞瘤细胞系NCI-H929对PEG化基于纤连蛋白的支架变体评估对血清介导的增殖的抑制。在此细胞系中，抗IGF-IRMAB391和未修饰的385A08展现出程度相当的对细胞生长的抑制，表观IC50为大约100pM。385A08-PEG40变体的抑制作用略低，IC50接近lnM。另一方面，PEG20-385A08-PEG20变体极度有力，在所测试的所有浓度基本上100%抑制。因此，IC50低于100fM。实施例29:IGF-IR增殖测定法中对纤连蛋白支架IGF-IR结合物多聚体的评估使用表达人IGF-IR的鼠淋巴细胞细胞系32D来评估IGF-IR拮抗剂的效果。包含两个纤连蛋白支架IGF-IR结合域的拮抗剂展现出抑制效果比单个纤连蛋白支架域或抗IGF-IR抗体显著升高。实施例30:IGF-IR增殖测定法中对双特异性纤连蛋白支架多聚体的评估使用人浆细胞瘤细胞系NCI-H929对纤连蛋白支架蛋白评估对血清介导的增殖的抑制。在此细胞系中，IGF-IR纤连蛋白支架和IGF-IR/VEGFR2双特异性纤连蛋白支架多聚体展现出程度相当的对细胞生长的抑制。实施例31:VEGFR2增殖测定法中对双特异性纤连蛋白支架多聚体的评估对纤连蛋白支架蛋白评估对VEGF依赖性细胞系的抑制。在此细胞系中，VEGFR2纤连蛋白支架和IGF-IR/VEGFR2双特异性纤连蛋白支架多聚体展现出程度相当的对细胞生长的抑制。实施例32:对纤连蛋白支架IGF-IR结合物HAS缀合物的评估使用人浆细胞瘤细胞系NCI-H929对纤连蛋白支架蛋白评估对血清介导的增殖的抑制。IGF-IR和IGF-IR/HAS蛋白质展现出程度相当的对细胞生长的抑制(见图25)。在RH41肉瘤异种移植物中对多种IGF-IR拮抗剂测试了它们的体内抗肿瘤活性(见图26和27)。表ll总结了该研究的结果。表ll:RH41肉瘤研究中的体内抗肿瘤活性<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>*肿瘤生长抑制和概率值是在第39天计算的。a媒介为80。/。PEG400,20%dH20。b媒介为PBS。c每个组的平均体重变化为处理开始时(第20天)和处理结束时(第42天)体重之间的均值差异。TVDT是为500mg的大小计算的。所使用的缩写如下po，口服路径；ip，腹膜内路径；LCK，总体对数细胞杀伤，以LCK-T-C/(3.32xTVDT)来计算，其中T-C为受处理肿瘤(T)达到预定大小(肿瘤目标大小)的时间(以天计)相对于媒介对照组(C)的差异除以乘上3.32的肿瘤体积倍增时间(TVDT)。TVDT为对照肿瘤达到目标大小的时间(以天计)中值(median卜对照肿瘤达到目标大'J、一半的时间(以天计)中值；结果，若某种处理摄生法产生统计学显著的LCK>1.0，则认为它是有效的；％TGI，相对％肿瘤生长抑制，以。/。TG》[(Q-Tt)/(CrQ))]xIOO计算，其中C产肿瘤植入后时间t(以天计)时对照小鼠的肿瘤重量中值，T尸时间t时受处理小鼠的肿瘤重量中值，Qr时间O时对照小鼠的肿瘤重量中值。在多个时间点计算。/。TGI值，在1.5倍肿瘤体积倍增时间后开始并持续3倍肿瘤体积倍增时间的一段时期(如果可能的话)。〉50。/。的。/。TGI值视为有效的，q2dx5(作为进度表的一个例子)，隔天施用5剂化合物。还生成了多肽融合蛋白HSA-IGF-IR。下文列举了对IGF-IR克隆385A08的多种N-和C-末端HAS融合物。C-末端构建物中省略了HAS前导和前肽序列。Fn接头l衍生自连接第一和第二纤连蛋白m型域的氨基酸序列。Fn接头2衍生自连接第十和第十一纤连蛋白m型域的氨基酸序列(见图30)。人血清清蛋白(未加工的)^11接头1-385八08;SEQIDNO:2283SSA0S-Fn接头l-人血清清蛋白(经加工的)；人血清清蛋白(未加工的)〗11接头2-385八08;人血清清蛋白(未加工的)-(08)5接头-385八08;人血清清蛋白(未加工的)-卿0接头-385八08;385A08-Fn接头2-人血清清蛋白(经加工的)；385A08-(GS)5接头-人血清清蛋白(经加工的);385A08-(GS)10接头-人血清清蛋白(经加工的)；SEQIDNO:229SEQIDNO:230SEQIDNO:231SEQIDNO:232SEQIDNO:233SEQIDNO:234SEQIDNO:235实施例33:对连接至运铁蛋白的纤连蛋白支架IGF-IR结合物的评估使用人浆细胞瘤细胞系NCI-H929对融合至运铁蛋白的纤连蛋白支架蛋白评估对血清介导的增殖的抑制。生成了多肽融合蛋白运铁蛋白-IGF-IR。下文列举了对IGF-IR克隆385A08的多种N-和C-末端运铁蛋白融合物。C-末端构建物中省略了HAS前导序列(图30)。人运铁蛋白(未加工的)^11接头1-385八08;385A08-Fn接头l-人运铁蛋白(经加工的)；人运铁蛋白(未加工的)-Fn接头2-385A08;人运铁蛋白(未加工的)-(GS)5接头-385A08;人运铁蛋白(未加工的)-(08)10接头-385八08;385A08-Fn接头2-人运铁蛋白(经加工的)；385A08-(GS)5接头-人运铁蛋白(经加工的)；385A08-(GS)10接头-人运铁蛋白(经加工的)；SEQIDNO:236SEQIDNO:237SEQIDNO:238SEQIDNO:239SEQIDNO:240SEQIDNO:241SEQIDNO:242SEQIDNO:243实施例34:IGF-IR-Fc融合蛋白对融合至Fc的基于纤连蛋白的支架蛋白评估它们抑制多种细胞系的能力。在Rh41细胞(4.5nM)、DU4475细胞(〉50nM)、H929细胞(0.15nM)、BXPC-3(>500nM)、和HT-29细胞(〉1000nM)中测定了385A08-Fc(SEQIDNO:247的氨基酸90-423)的IC50值。IGF-IR-Fc融合物在RH41细胞系中展现出91%的最大抑制。在RH41人横紋肌肉瘤细胞中对融合至Fc的基于纤连蛋白的支架蛋白评估了它们抑制IGF-1R、AKT和MAPK磷酸化的能力(图29)。87在Rh41和H929细胞系中对融合至Fc的基于纤连蛋白的支架蛋白评估了它们抑制增殖的能力(表12)。如所记录的，用nM浓度的385A08-Fc处理细胞。IC50值如下Rh41试验l(48.65nM);Rh41试验2(39.43nM);Rhl试验平均值(44nM);和H929试验(0.15nM)。表12:385A08-Fc在Rh41和H929细胞系中对细胞增殖的效果Rh41试验lRh41试验2H929测定法nM[3司摻入标准偏差[3H]掺入标准偏差卩H]掺入标准偏差5054.92.6752.13.2720.21.5210.061.91.5659.31.1418.40.892.077.92.8678.61.920.60.620.497.12.2694.61.0832.01.970.08102.91.1498.40.5257.13.870.016101.21.26102.50.9580.13.09实施例35:本文中所使用的方法的例子以下材料和方法被用于前述实施例中所描述的实验。重组蛋白重组人IGF-I、IGF-IR、胰岛素受体(IR)、抗IGF-IRMAB391、和重组人VEGF-R2-Fc得自R&DSystems(Minneapolis,MN)。IGF-IR的生物素化在存在EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-生物素(Pierce,IL)时在lxPBS中于4。C进行2小时。通过针对lxPBS透析除去过量的EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-生物素。通过质谱测定生物素化水平，和使用CoomassieProteinPlus测定法(Pierce，IL)测定蛋白质浓度。引物通过化学合成制备以下寡核苷酸，最终用于文库构建和选定克隆的诱变T7TMV:5'-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATG-3，(SEQIDNO:204)GCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGG-3，(SEQIDNO:205)FnBC:5'-AGCCTGCTGATCAGCTGGNNS丽SNNSNNSNNS丽SNNSCGATATTACCGCATCACT-3，(SEQIDNO:206)FnCD:5，-AGGCACAGTGAACTCCTGGACAGGGCTATTGCCTCCTGTTTCGCCGTAAGTGATGCGGTAATATCG-3，(SEQIDNO:207)FnDE:5，-CAGGAGTTCACTGTGCCT丽SNNS丽S丽SACAGCTACCATCAGCGGC画3，(SEQIDNO:208)TTTAAGGCCGCTGATGGTAGCTGT-3，(SEQIDNO:209)FnFG6:5，-ACTGTGTATGCTGTCACTNNSNNS丽S丽SNNS丽SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:210)以产生具有6个随机氨基酸的FG环FnFG8:5，-ACTGTGTATGCTGTCACTNNSNNSNNS丽SNNSNNS丽S丽SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:211)以产生具有8个随机氨基酸的FG环FnFG10:5'-ACTGTGTATGCTGTCACT丽S丽S丽SNNS丽S丽S丽S丽S丽S丽SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:212)以产生具有10个随机氨基酸的FG环FnFG12:5，-ACTGTGTATGCTGTCACT丽S丽S丽S丽S丽S丽SNNS丽SNNS丽SNNSNNSCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:213)以产生具有12个随机氨基酸的FG环FnFG14:5，画ACTGTGTATGCTGTCACTNNS丽S丽S丽S丽S丽S.NNSNNS丽S丽S丽S丽S丽S丽SCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:214)以产生具有14个随机氨基酸的FG环FnG:5，-TTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGTGCGGTAATTAATGGAAATTGG-3，(SEQIDNO:215)GTCGTCGTCCTTGTA-3，(SEQIDNO:216)218C04BC:5,-AGCCTGCTGATCAGCTGGTCCCCGTACCTGCGCGTCGCCCGATATTACCGCATCACT-3'(SEQIDNO:217)218C04DE:5，-CAGGAGTTCACTGTGCCTTCCTCCGCCCGCACAGCTACCATCAGCGGC-3，(SEQIDNO:218)89218C04FG:5，-ACTGTGTATGCTGTCACTCCGTCCAACATCATCGGCCGTCACTATGGCCCAATTTCCATTAATTAC-3，(SEQIDNO:219)FnB:5，-AGCCTGCTGATCAGCTGG-3，(SEQIDNO:220)FnD:5，-CAGGAGTTCACTGTGCCT-3，(SEQIDNO:221)FnF:5，-ACTGTGTATGCTGTCACT-3，(SEQIDNO:222)338A06BC:AGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGCGCGTCTGAAAGTTGCGCGATATTACCGCATCACT(SEQIDNO:223)338A06DE:CAGGAGTTCACTGTGCCTAAAAACGTTTACACAGCTACCATCAGCGGC(SEQIDNO:224)一级文库构建使用KOD聚合酶(EMDBiosciences,SanDiego,CA),通过上文所列交叠的合成寡核普酸的延伸来构建多样性文库。在这些寡核苷酸表述中，"N"代表A、C、G和T的混合物；而"S，，代表C和G的混合物。环的定义与先前所述的那些相同(Xu等，2002)。通过50pmo1FnBC与lOOpmolFnCD在补充有lMBine和3。/。DMSO的10(^1KOD反应中的延伸来构建BC环。该反应进行10个温度循环30s94°C，30s52。C和lmin68°C，以确保片段的完全延伸。使用200pmolFnDE与lOOpmolFnEF(用于DE环)或者100pmo1FnFG10与200pmo1FnG(用于FG环)，以相似的方式构建DE和FG环。在这三个环的延伸后，将DE和FG环组合，并一起再延伸10个温度循环30s94°C，30s52。C和lmin68。C。以相同的方式用1OOpmolFnAB延伸BC环。将DE/FG混合物和BC环均用新鲜的KOD试剂稀释10倍并分别用FLAG和T7TMV延伸10个温度循环30s94。C,30s52。C和lmin68。C。最后，将各片段组合并一起延伸10个温度循环30s94。C,30s52。C和lmin68。C。这产生了具有BC环中的7个随机氨基酸、DE环中的4个随机氨基酸、和FG环中的10个随机氨基酸的文库。通过使用寡核苷酸FnFG6、FnFG8、FnFG12或FnFG14代替FnFG10构建了具有不同FG环长度的别的文库。将包含长度介于6个和14个氨基酸之间的FG环的文库组合以产生长度可变的FG文库。自克隆218C04构建单环随机化文库构建了三个文库，其中用随机序列替换单环。这些文库是如上所述用KOD聚合酶通过交叠延伸在DNA水平构建的，只是三个环中两个的随机序列用与克隆218C04对应的固定序列替换。BC环中的固定序列由寡核苷酸90218C04BC提供，DE环中的固定序列由寡核香酸218C04DE提供，而FG环中的固定序列由寡核苷酸218C04FG提供。在文库构建过程中用这些寡核苷酸替换对应的随4几寡核苷酸FnBC、FnDE、或FnFGlO。其中来自218C04的BC环用随机氨基酸替换的文库是通过装配如上所述寡核苷酸T7TMV+FnAB+FnBC+FnCD+218C04DE+FnEF+218C04FG+FnG+FLAG构建的。其中来自克隆218C04的DE环用随机氨基酸替换的文库是通过装配寡核香酸T7TMV+FnAB+218C04BC+FnCD+FnDE+FnEF+218C04FG+FnG+FLAG构建的。其中来自克隆218C04的FG环用随机氨基酸替换的文库是通过装配寡核苦酸T7TMV+FnAB+218C04BC+FnCD+218C04DE+FnEF+FnFGlO+FnG+FLAG构建的。自克隆218C04构建三环随机化文库如上所述将自克隆218C04衍生的三个单环文库进行PROfbsion选择。每个文库中幸存克隆包含2个来自亲本克隆的环和1个来自随机序列(其与每种基于纤连蛋白的支架蛋白的结合相容)的环。-使用结合周围支架区的寡核苷酸引物扩增这三个随机环(每个文库一个)。使用寡核苷酸引物FnB和FnCD自包含可变BC环的文库扩增BC环。使用寡核苷酸引物FnD和FnEF自包含可变DE环的文库扩增DE环。使用寡核苷酸引物FnF和FnG自包含可变FG环的文库扩增FG环。通过琼脂糖凝胶电泳纯化这三个切出的环，以等比例混合，并先用引物FnAB和FnG后用T7TMV和FLAG通过KOD聚合酶扩增。自克隆338A06构建单环随机FG文库构建了其中克隆338A06的FG环用6个随机氨基酸替换的文库。使用KOD聚合酶来交叠延伸如上所述寡核苷酸T7TMV+FnAB+338A06BC+FnCD+338A06DE+FnEF+FnFG6+FnG+FLAG。通过寡核苷酸338A06BC和338A06DE引入与克隆338A06对应的环序列，并通过寡核苷酸FnFG6引入随机6氨基酸FG环。RNA-蛋白质融合物生成基本上如Xu等，2002，Kurz等，Nuc.AcidRes.28:83,2000所述将双链DNA文库转变成RNA-蛋白质融合物(PROflision)。简言之，使用体外转录试剂盒(MEGAscriptTM,Ambion,Austin,Tex)转录DNA文库，并通过NAP-5柱(GEHealthcare)上的大小排阻层析将所得RNA脱盐。通过在200pl含150mMNaCl,10mMTris-HCl(pH8)和1.5倍过量的含嘌呤霉素接头(5，-PsouagcggaugcXXXXXXCCPu-3，(Pu=嘌呤霉素，Pso=C6-补骨脂素，u,a，g,c=2'-OMe-RNA,X二9-原子PEG间隔物))的溶液中以314nM辐射20分钟来交联2nmo1認A。然后使mRNA-噤呤霉素分子在3ml家兔网织红细胞溶胞物(Ambion,Austin,Tex)中在存在35S标记的曱硫氨酸时翻译。使用寡聚dT纤维素(GEHealthcare)纯化所得mRNA-蛋白质融合物，并使用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)和2nmol引物FLAG依照制造商的说明书逆转录。通过M2Flag琼脂糖(Sigma,StLouis,MO)纯化cDNA/mRNA-蛋白质融合物并通过测量所掺入的35S曱硫氨酸来量化。这给出了纯化后的大约1012个全长基于纤连蛋白的支架蛋白的文库，使用引物T7TMV和FLAG通过PCR扩增，供后续PROfUsion实验用。对IGF-IR的结合的亲和选择将如上所述制备的mRNA-蛋白质融合物文库与链霉亲合素包被的磁珠(M280Streptavidin，Invitrogen)—起温育以除去结合链霉亲合素的基于纤连蛋白的支架蛋白。在磁体上分离珠，收集未结合的级分并添加至含0.05%Tween20和lmg/mlBSA(Ambion)的PBS中的100nM生物素化IGF-IR。30分钟后，在链霉亲合素包被的磁珠上捕捉所结合的基于纤连蛋白的支架蛋白，并使用Kingfisher磁性粒子处理仪(ThermoElectron,Waltham，MA)清洗6次。将cDNA在100mMKOH中洗脱，用100mMTris-HCl中和，并通过PCR扩增以生成结合IGF-IR的分子得到富集的第二代文库。将扩增、mRNA-蛋白质融合物的合成、和亲和选择这一连续过程实施总共5次，并通过定量PCR监测所结合的分子的数目。扩增第4轮和第5轮后得到的基于纤连蛋白的支架蛋白群，并通过重组(InFusionTM,Clontech,MountainView,CA)连接入包含T7RNA聚合物和框内HiS6标签的大肠杆菌表达载体中。将连接混合物转化入大肠杆菌菌抹BL21(DE3)pLysS(Invitrogen),该菌抹在用IPTG诱导后表达T7RNA聚合酶，由此给出诱导型蛋白质表达。含3个随机环的克隆218C04的优化如上所述将三环随机化218C04文库进行多轮扩增、mRNA-蛋白质融合物的合成、和亲和选4奪。对于第l轮，将IGF-IR固定化在环氧活化的珠上以避免选择结合链霉亲合素的肽。此后使用递减浓度的生物素化IGF-IR以选择最高亲和力结合物。自第2轮起，还包括浓度为lpM的非生物素化胰岛素受体(IR)，起IR结合的负选择的作用。四轮后，将所得基于纤连蛋白的支架蛋白群克隆入大肠杆菌，供如上所述分析用。含6氨基酸随机FG环的克隆338A06的优化如上所述将DNA文库转变成mRNA-蛋白质融合物以给出约1OOO个拷贝的每种FG环序列。如上所述实施扩增、mRNA-蛋白质融合物形成和亲和选择的PROfiision循环。第l轮中生物素化IGF-IR的浓度为100nM,但是这在第2轮中降至0,8nM,在第3轮中降至0.4nM。所选择的目标浓度使得结合至IGF-IR的mRNA-蛋白质融合物的百分比在每种情况中小于0.1。/。，如定量PCR所测量的。通过这种方法，具有改善的亲和力的基于纤连蛋白的支架蛋白与作为整体的群体相比会具有优势。针对IGF-IR的竟争性ELISA:将MaxiSorpTM板(NuncInternational,Rochester,NY)用PBS中的30nMIGF-IR于4。C包被过夜，接着在OptEIA緩冲液(BDbiosciences,SanDiego,CA)中于室温封闭3小时。使纯化后的基于纤连蛋白的支架蛋白在OptEIA緩冲液中以范围为50pM-1pM的浓度于室温结合每个孔l小时。在PBST中清洗以除去未结合的基于纤连蛋白的支架蛋白后，添加10nM生物素化IGF-I(Upstate,Temecula，CA)于室温1小时以结合至未被占据的IGF-IR。通过用PBST清洗除去过量的配体，并用链霉亲合素-HRP(Pierce,Rockford，IL)使用TMB检测试剂(BDbiosciences)依照制造商的说明书检测所结合的配体。针对IGF-IR的直接结合ELISA:将MaxiSorpTM板(NuncInternational,Rochester,NY)用PBS中的10nMIGF-IR于4。C包被过夜，接着在PBS-酪蛋白緩冲液(Pierce)中于室温封闭3小时。使纯化后的基于纤连蛋白的支架蛋白在酪蛋白緩冲液中以5nM的浓度于室温结合每个孔l小时。用PBST清洗板，并向每个孔添加100)ilHis-HRP探针(Pierce)的l:4000稀释液，于室温温育15分钟。将孔用PBST清洗5次，并用TMB检测试剂(BDbiosciences)依照制造商的说明书检测所结合的HRP。进一步使用范围为30pmo1-330nM的基于纤连蛋白的支架蛋白浓度梯度分析在此单点测定法中显示出结合的克隆。高通量蛋白质生成(HTPP):将所选择的结合物克隆入pDEST-14载体中并转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中，以24孔格式接种5ml含50jag/mL羧千青霉素和3493Mg/mLchloromphenicol的LB培养基并于37。C培养过夜。制备新鲜的5mlLB培养基(50昭/mL羧千青霉素和34吗/mLchloromphenicol)培养物供诱导型表达用，即自过夜培养物吸出200pl并分配入适宜的孔。将培养物于37。C培养直至A6。00.6-1.0。与lmM异丙基-P-硫代半乳糖苷(IPTG)—起温育后，将培养物于30。C再培养4小时，并通过于4。C以3220g离心30分钟来收获。将细胞沉淀物冷冻于-80。C。通过重悬于450pl裂解緩冲液(50mMNaH2P04，0.5MNaCl，lxCompleteTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒-不含EDTA(Roche),lmMPMSF，10mMCHAPS，40mM咪唑，lmg/ml溶菌酶，30ug/mlDNA酶，2ug/mlaprotonin,pH8.0)并于室温摇动l小时来裂解细胞沉淀物(以24孔格式)。将溶胞物澄清并再次设置成96孔格式，即转移入配有96孔650pl捕捉板的96孔WhatmanGF/DUnifilter并以200g离心5分钟。将澄清后的溶胞物转移至经平tf緩冲液(50mMNaH2P04,0.5MNaCl,10mMCHAPS,40mM咪唑，pH8.0)平衡的96孔Ni螯合板并温育5分钟。通过真空除去未结合的物质。将树脂用清洗緩冲液l(50mMNaH2P04，0.5MNaCl，5mMCHAPS,40mM咪唑，pH8.0)清洗2x0.3ml/孔，通过真空除去每次清洗。接着，将树脂用PBS清洗3x0.3ml/孔，通过真空除去每次清洗步骤。在洗脱前，将每个孔用50|11洗脱緩沖液(？88+20mMEDTA)清洗，温育5分钟，并通过真空弃去此清洗。通过将另外的100ul洗脱緩冲液应用于每个孔来洗脱蛋白质。于室温溫育30分钟后，将板以200g离心5分钟，并在有5(al0.5MMgCl2附着至Ni板底部的96孔捕捉板中收集所洗脱的蛋白质。使用Bradford测定法量化所洗脱的蛋白质，以BSA作为蛋白质才示准品0可溶性基于纤连蛋白的支架蛋白结合物的中等规模表达和纯化为了表达，将所选择的克隆(后面有His6标签)克隆入pDEST-14载体并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中表达。用20ml接种物培养物(自单个涂布菌落产生的)接种1升含50pg/mL羧苄青霉素和34吗/mLchloramphenicol的LB培养基。将培养物于37。cf培养直至A6。。0.6-1.0。用lmM异丙基-卩-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，将培养物于30。C再培养4小时并通过于4。C以>10,000g离心30分钟来收获。将细胞沉淀物冷冻于-80。C。使用Ultra-turrax匀浆仪(IKAworks)在冰上将细胞沉淀物重悬于25mL裂解緩冲液(20mMNaH2P04,0.5MNaCl,lxCompleteTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒-不含EDTA(Roche),lmMPMSF,pH7.4)。使用M-110S型微流化仪(Microfluidics)通过高压(>18,000psi)匀浆来实现细胞裂解。通过于4。C以23，300g离心30分钟来分离可溶性级分。经0.45pm滤器使上清液澄清。将澄清后的溶胞物(lysate)加载到用20mMNaH2P04,0.5MNaCl,pH7.4预平衡的HisTrap柱(GE)上。然后用25个柱体积的20mMNaH2P04，0.5MNaCl,pH7.4,接着用20个柱体积的20mMNaH2P04，0.5MNaCl,25mM咪唑pH7.4,再接着用35个柱体积的20mMNaH2P04,0.5MNaCl,40mM咪唑pH7.4洗柱。用15个柱体积的20mMNaH2P04,0.5MNaCl,500mM咪唑pH7.4洗脱蛋白质，根据A280吸光度合并级分，并针对lxPBS或50mMNaOAc;150mMNaCl;pH4.5透析。通过0.22pm过滤除去任何沉淀物。抗IGF1R纤连蛋白支架的PEG化经马来酰亚胺化学用对C型纤连蛋白支架2倍过量的PEG-40-kDa(NOFCorporation)来制备纤连蛋白支架-PEG40分子。让反应于室温进行2.5小时。通过阳离子交换层析(SP-H汀rap;GE)将游离PEG-40与纤连蛋白支架-PEG-40分开。将反应混合物用20mMNaH2PO4,pH6.71:10稀释，并应用于用平衡緩冲液(20mMNaH2P04,10mMNaCl,pH6.7)预平衡的SP-H汀rap柱，用平衡緩冲液清洗，并用20mMNaH2PO4,0.5MNaCl,pH6.7洗脱。根据SDS-PAGE分析合并所洗脱的级分。经G25层析(GE)将SP合并洗脱液交换緩沖液入PBS。经马来酰亚胺化学用对PEG-20-kDa(NOFCorporation)2倍过量的纯化的纤连蛋白支架-C来制备PEG20-纤连蛋白支架-PEG20分子。让反应于室温进行1小时。通过20mMNaH2P04,10mMNaCl，pH6.7緩沖液中的SEC层析(Superose6;GE)将未PEG化的纤连蛋白支架与PEG20-纤连蛋白支架-PEG20分开。合并含有PEG20-纤连蛋白支架-PEG20的级分并进一步纯化以除去单PEG化的纤连蛋白支架。这是通过阳离子交换层析(SP;GE)来实现的。将SP-HiTrap柱用缓冲液A(20mMNaH2P04,10mMNaCl,pH6.7)预平衡，应用SEC洗脱液，然后将柱用緩冲液A清洗，再然后运行5个柱体积的0-10%緩冲液B(20mMNaH2P04，1.0MNaCl，pH6.7)梯度并再保持5个柱体积。通过50%缓冲液B的洗脱自SP柱洗脱PEG20-纤连蛋白支架-PEG20。根据A280合并级分并通过G25层析(GE)交换緩冲液入PBS。IGF-IR-PEG-VEGFR2结合物的生成在微量天平上称量PEG20并在20mM磷酸钠/10mMNaClpH6.7中溶95解至100mg/ml(5mM)。将PEG溶液以5:1的摩尔比例(PEG:蛋白质)添加至克隆385A08(SEQIDNO:203)。将反应于室温带混合的温育至少l小时。为了将385A08-PEG20与未偶联的PEG、Bis-385A08、未PEG化的385A08单体和385A08二硫化物连接的二聚体分开，将PEG-蛋白质反应加载到用20mM磷酸钠/10mMNaClpH6.7(緩冲液A)平衡的HiTrapSP阳离子交换柱上。洗脱緩冲液(緩冲液B)是20mM磷酸钠/1.0MNaClpH6.7。10%B(100mMNaCl)等度洗脱分离了385A08-PEG20种类，将其用于与VEGFR2特异性结合物(SEQIDNO:128)的反应。将VEGFR2特异性结合物添加至385A08-PEG20-形成了385A08-PEG20-VEGFR2特异性结合物异二聚体。实施大小排阻层析将未偶联的单体和二聚体VEGFR2特异性结合物与385A08-PEG20-VEGFR2特异性结合物异二聚体分开。用20mM4f酸钠/10mMNaClpH6.7平衡Superdex200柱。以1.0ml/min流速应用将385A08-PEG20力口上VEGFR2特异性结合物反应混合物。合并与385A08-PEG20-VEGFR2特异性结合物对应的级分，作为最终的产物。可溶性基于纤连蛋白的支架蛋白的BIAcore分析使用BIAcore2000或3000生物传感器(PharmaciaBiosensor)测量基于纤连蛋白的支架蛋白结合蛋白对靶物的结合动力学。利用IGF-IR-Fc融合物开发了捕捉测定法。类似的试剂已经记载于Forbes等2002,EuropeanJ.Biochemistry,269,961-968。将人IGF-IR的胞外域(aal-932)克隆入含有人IgGl铰链和恒定域的哺乳动物表达载体。该质粒的瞬时转染产生了融合蛋白IGF-IR-Fc，随后通过蛋白A层析纯化并通过胺偶联捕捉到生物传感器CM5芯片上固定化的蛋白A上。动力学分析牵涉将IGF-IR-Fc捕捉到蛋白A上，接着在溶液中注入基于纤连蛋白的支架蛋白，并用甘氨酸pH2.0再生蛋白A表面。获得每个浓度的传感图并使用程序Biaevaluation，BIAEvaluation2.0(BIAcore)来评估，以测定速率常数ka(k加)和kd(koff)。自速率常数koff/k。n的比值计算解离常数Ko。典型的是，对纯化的基于纤连蛋白的支架蛋白的一系列浓度(2uM至0uM)评估对蛋白A捕捉的人IGF-IR-Fc融合蛋白的结合。对于测定对人胰岛素受体的结合的实验，遵循Biacore(Uppsala,Sweden)推荐的标准规程通过胺基团连接将重组人胰岛素受体(IR)和重组人VEGF-R2-Fc直接偶联至CM5生物传感器芯片。简言之，在流动槽2和3上，将在乙酸盐4.5中稀释的60ug/mLIR偶联/固定化至8300RU的水平，并将在乙96酸盐5.0中稀释的11.9ug/mLVEGF-R2-Fc固定化至9700RU的水平。在FC1上制备空白参照。通过扣除对空白参照流动槽1观察到的结合来计算IR或VEGF-R2-Fc的特异性结合。将基于纤连蛋白的支架蛋白在HBS-EP(10mMHepes,150mMNaCl,3mMEDTA，0.05%表面活性剂P20)中稀释至10uM，并于25。C在流动槽上以20uL/min注入3分钟，观察10分钟里的解离情况。差示扫描量热法实施中等规模克隆的差示扫描量热法(DSC)分析以测定热稳定性。通过在3个大气压下以每分钟1度的速率将温度自5。C上升至95。C,在N-DSCII量热计(CalorimetrySciencesCorp)中扫描适宜克隆的1mg/ml溶液。使用Orgin软件(OrginLabCorp)与适宜緩沖液的对照运行相比地分析数据。大小排阻层析在Agilent1100HPLC系统上使用TSKgelSuperSW2000柱(TOSOHBiosciences,LLC),4.6mmx30cm实施大小排阻层析(SEC)，伴有A214nm和A280nm的UV检测和荧光检测(激发=280nm,发射=350nm)。以IOOnL/min流速采用緩冲液100mM硫酸钠，100mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH6.8。以大约100(ig/mL的浓度分别注入样品(每种0.1-1吗)。使用凝胶过滤标准品(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)来进行分子量校准。IGF-1R纤连蛋白支架克隆的SECMALLS分析在配备有Waters2487UV检测仪、使用Superdex200柱(GEHealthcare)的WatersBreezeHPLC系统上实施大小排阻层析(SEC)，流动相为以0.6ml/min流速应用的100mM碌b酸钠，lOOmM磷酸钠，150mM氯化钠pH6.8。将样品用流动相稀释至大约l.Omg/ml并注入50(al。使用在UV;险测仪之后垂直联机的(plumbedin-line)miniDAWN光散射检测仪(WyattTechnologyCorporation)和OptilabDSP差示折光仪(WyattTechnologyCorporation)实施多角度激光散射(MALLS)分析。使用AstraV5.1.9.1版软件(WyattTechnologiesCorporation)实施对光散射数据的分析。为了通过280nm吸光度计算基于纤连蛋白的支架蛋白的浓度，使用基于氨基酸序列的理论摩尔消光系数。对于通过折光率的浓度测定，使用0.185mL/g的估计比折光率增量(dn/dc)。RP-HPLC层析使用在Agilent1100HPLC系统上加热至60°C的C4聚合物柱#259VHP5415(Vydac),4,6mmx15cm实施反相HPLC(RP-HPLC),伴有A214nm和A280nm的UV检测和焚光检测(激发=280nm,发射=350nm)。溶剂A由含0.01。/。TFA的MilHQ水组成，溶剂B是含0.01。/。TFA的100。/。HPLC级乙腈。釆用1mL/min的流速。洗脱方案组成如下10分钟10。/。B的平衡体积，接着是30分钟里升高至50。/。B的线性梯度。在这些条件下，基于纤连蛋白的支架蛋白在总运行时间的大约25-30分钟时洗脱。MALDITOF质谱使用VoyagerDEPRO质谱仪(AppliedBiosystems)通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析基于纤连蛋白的支架蛋白(图14)。将样品用0.1%TFA稀释至大约l.Omg/ml。将大约12!il样品加载到C4ZipTip(MilliporeCorporation)上并用0.1%三氟乙酸(TFA)清洗以除去盐和污染物。使用2pl芥子酸基质(70%乙腈，0.1。/oTFA中10mg/ml)将样品直接自ZipTip洗脱到目标板上。使用质量已知的两种蛋白质实施仪器的标定细胞色素C(12361.96Da)和脱铁卟啉肌红蛋白(16952.27Da),在芥子酸中制备5jnM的终浓度并点到板上。以如下仪器设置获取光谱加速电压25000V,栅极电压(GridVoltage)91%，导线(GuideWire)0.1%,提取延迟时间400nsec，激光强度3824。通过应用基线校正和高斯平滑算法(滤器宽度值为9),在DataExplorer4.5版(AppliedBiosystems)中力口工原谱。细胞有丝分裂测定法将人胰腺腺癌细胞系BxPC-3(ATCC,Manassas,VA)以2500个细胞每孔的浓度在含10。/o胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)的RPMI1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)中分配到96孔板中。次日，在由含0.1%BSA(Sigma，St.Louis,MO)的RPMI1640组成的饥饿培养基中清洗细胞。将清洗后的细胞在含各种浓度每种IGF-IR拮抗剂的饥饿培养基中预温育4小时。4小时预温育后，将细胞暴露于25ng/mL的IGF-I并于37。C,5%C02温育24小时。对于最后4小时温育，将细胞暴露于[3司-胸苷(0.25(iCi/孔；PerkinElmer，Wellesley，MA)。温育期后，将细胞在PBS中清洗，在100jiL由0.P/。SDS+0.5NNaOH组成的緩沖液中裂解，并在TopCountNXT闪烁计数器(PerkinElmer,Wellesley,MA)上计H。4吏用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分卄斤数据。基于细胞的受体阻断测定法将人乳腺腺癌细胞系MCF-7(ATCC,Manassas,VA)以50,000个细胞每孔的浓度在含10。/。胎牛血清(Hyclone，Logan,U丁)的RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad,CA)中分配到24孔板中。次日，在由含0.1%BSA(Sigma，St.Louis,MO)的RPMI1640组成的结合緩沖液中清洗细胞，然后在200^L含IGF-IR竟争物的结合緩沖液中在冰上预温育30分钟。预温育期后，将等同于大约60000计数每分钟的40pM[125I]-IGF-I(PerkinElmer,Wellesley,MA)添加至每个孔，并在水上温和搅动地再温育3小时。然后用含0.1%BSA的水冷PBS清洗孔。将细胞用500pL由0.1。/。SDS+0.5NNaOH组成的緩冲液裂解。使用Wallac1470伽马计数器(PerkinElmer,Wellesley,MA)测量溶胞物的放射性，并使用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析数据。NCI-H929细胞增殖测定法将人浆细胞瘤细胞系NCI-H929(ATCC，Manassas,VA)以10000或25000个细胞每孔的浓度在含10。/。胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、含各种浓度IGF-IR拮抗剂的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中分配到96孔板中。让细胞于37。C，5。/。C02增殖72小时。增殖期后，使细胞暴露于20pL细胞滴定96水性增殖试剂(Promega，Madison,WI)并再温育4小时。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上测量490nm吸光度，并使用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得数据。32D:IGF-IR细胞增殖测定法在96孔板中在含有10%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中在存在IOOng/mL人IGF-I(R&DSystems,Minneapolis,MN)和IGF-IR拮抗剂时接种细胞(104)。让细胞于37。C，5%C02增殖72小时。增殖期后，使细胞暴露于细胞滴定96水性增殖试剂(Promega,Madison,WI)并再温育4小时。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上测量490nm吸光度，并使用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得数据。Ba/F3:VEGFR2细胞增殖测定法将鼠IL-3依赖性原B(pro-B)细胞系Ba/F3改造成过表达嵌合VEGR2(胞外域)/EpoR(胞内域)，由此成为VEGF依赖性细胞系。在96孔板中在含10%胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI(Invitrogen,Carlsbad,CA)中在存在VEGFR2拮抗剂时接种BaF3:VEGFR2细胞(2.5x104)。让细胞于37。C,5%C02增殖72小时。增殖期后，使细胞暴露于细胞滴定96水性增殖试剂(Promega,Madison，WI)并再温育4小时。在SpectramaxPlus384(MolecularDevices,99Sunnyvale,CA)上测量490吸光度，并4吏用SigmaPlot(SystatSoftware,PointRichmond,CA)分析所得数据。IGF-IR-HAS缀合物生成将摩尔过量的BM(PEO)2添加至克隆385A08(SEQIDNO:203)。通过阳离子交换层析分离385A08-BM(PEO)2。将具有游离硫氢基的重组人血清清蛋白添加至385A08-BM(PEO)2以形成HSA-385A08。通过阴离子和阳离子交换层析进一步纯化缀合物。IGF-IR-Fc融合物生成将385A08(SEQIDNO:226)(以下划线标示)的羧基末端与Fc片段(Fc铰链-CH2-CH3)(以粗体标示)的氨基末端相连接。将间隔物(以小写字母标示)置于二者之间以使空间位阻的风险最小化。将表达载体设计成容许该分子在毕赤氏酵母细胞中表达，这比传统的哺乳动物细胞方法更快。表达载体还包含a因子信号肽(以斜体标示)以能够在毕赤氏酵母细胞中表达的过程中分泌。此信号肽在分泌时被切除，不是最终纯化的IGF-IR-Fc分子的一部分。下文给出了所得表达构建物的序列。MS7WM7丄層n7滞^U^E五GKSZ^腦^GVSDVPRDLEVVAATPTSLLIVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQdpgsEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF薩YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:247)将表达构建物线性化并转化入3种毕赤氏酵母宿主细胞，即X-33、GS115和KM17H。在zeocin板上选择转化子并在2ml培养物中筛选IGF-IR-Fc表达。在摇瓶中以不同pH培养所选择的克隆并通过蛋白A树脂纯化。在pH6.5-7.0观察到表达。使用一个克隆的l升摇瓶在pH6.7来表达IGF-IR-DPGG-Ig并经由蛋白A和大小排阻来纯化。图28描绘了纯化后的IGF-IR-Ig融合蛋白的SDSPAGE分析。正如能看到的，观察到的质量是未还原样品的大小的大约一半，正如对二硫化物相连接的完整IGF-IR-Ig所预期的。IGF-IR-HAS缀合物的体内肿瘤研究在棵鼠中繁殖肿瘤。对于人RH41异种移植物，每四周发生肿瘤传代。为了功效测试，将人肿瘤异种移植物植入棵鼠。所有胂瘤传代都是皮下的(sc)。在下述方面评估抗肿瘤活性a)痊愈和(对于鼠胂瘤模型)由治疗组(T)相比于对照组(C)的相对中值存活时间(MST)(即。/。T/C值)反映的寿命增量；和b)通过计算T和C小鼠肿瘤生长到预定"目标"大小(对于所有所描述的sc肿瘤模型而言是lgm)的相对中值时间测定并以T-C值(以天计)表述的主要(primary)肿瘤生长抑制。痊愈小鼠的定义为在处理后超过10倍肿瘤体积倍增时间(TVDT)评估时其肿瘤检测不到，或<35mg。胂瘤抑制/缩小的判据是符合21总体对数细胞杀伤(LCK)的主要肿瘤生长的统计学显著延迟。采用下式来计算LCK:LCK=T-C/(3.32xTVDT),其中TVDT:对照肿瘤达到目标大小的中值时间(天)-对照肿瘤达到目标大小一半的中值时间(天)。某种化合物产生最大治疗效果的剂量称作最佳剂量(OD)。若治疗组(通常8只小鼠)中有超过一例死亡可归于药物毒性，则认为是该治疗过度毒性，在抗肺瘤活性的评估中不使用该数据。最大耐受剂量(MTD)定义为刚刚低于发生过量毒性(即超过一例死亡)的水平的剂量水平。若接受处理的小鼠在其肿瘤达到目标大小前死亡，则i人为它死于药物毒性。4吏用Gehan的通用Wilcoxon检验(Gehan，Biometrika52:203-223，1965)来实施数据的统计学评估。385A08-Fc的Western印迹分析将Rh41人横紋肌肉瘤细胞在存在0.3。/。BSA时血清奴/喊过夜；然后将它们在用IGF-I、IGF-II、或胰岛素配体(50ng/ml)刺激5分钟后于37。C暴露于385A08-Fc达l小时，之后裂解。将细胞在TTG緩冲液(20mMTris-HCl，pH7.6，1%tritonX-100,5%甘油，0.15MNaCl，lmMEDTA,完全片剂，和石岸酸酶抑制剂鸡尾酒)中裂解。使用BSA作为标准品，测定总细胞裂解物的蛋白质浓度。将来自每份溶胞物的等量蛋白质加载入凝胶的每个孔中。通过SDSPAGE将蛋白质分开，转移至硝酸纤维素膜并在Odyssey封闭緩沖液(Li-CorBiosciences)中于4。C封闭过夜。用针对IGF-1R、Akt和MAPK的磷酸特异性抗体于室温探查膜达2小时，然后在含0.1。/。Tween-20的TBS中清洗3次。清洗后，101将膜与荧光标记的二抗一起温育。利用能够同时和独立检测荧光信号的Odyssey红外线成像系统(Li-CorBiosciences)实施蛋白质显影。才艮据使用Li-CorBiosciences成像系统进行的密度测定扫描，通过比專交未处理才羊品相比于受处理样品中的磷酸信号(针对用作加载对照的肌动蛋白或GAPDH进行标准化)来计算抑制效果。Rh41(人横紋肌肉瘤)和H929(人多发性骨髓瘤)中的细胞增殖通过暴露于试剂72小时后掺入DNA的[3H]-胸苷来评估增殖。分别以3500和8000个细胞/孔的密度将Rh41细胞和H929分配入96孔微量滴定板并在24小时后将它们暴露于一定范围的药物浓度。于37。C温育72小时后，将细胞用4pCi/ml[3H]胸苷(AmershamPharmaciaBiotech,UK)脉冲3小时，胰蛋白酶消化，收获到UniFilter-96,GF/B板(PerkinElmer，Boston,MA)上并在TopCount.NXT(Packard,CT)上测量闪烁。结果表述成IC50,即将细胞增殖抑制达未处理对照细胞的50%所要求的药物浓度。数据呈现了一式三^P分孔的平均值，并显示了标准偏差。权利要求1.一种多肽，其包含第十纤连蛋白III型(10Fn3)域，其中所述10Fn3域(i)包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG；(ii)具有至少一个选自环BC、DE、和FG的环，其具有相对于人10Fn3域的相应环的序列改变的氨基酸序列，且(iii)以约1μM或更小的解离常数结合人IGF-IR。2.权利要求l的多肽，其中所述"Fn3域以约10nM或更小的解离常数结合人IGF-IR。3.权利要求l的多肽，其中环BC和环FG具有相对于人^Fn3域的相应环的序列改变的氨基酸序列。4.权利要求l的多肽，其中所述"Fn3域包含SEQIDNO:2-125、184-203、或226之任一的氨基酸序列。5.权利要求l的多肽，其进一步包含一个或多个选自下组的药动学(PK)模块聚氣化烯模块、人血清清蛋白结合蛋白、唾液酸、人血清清蛋白、运铁蛋白、和Fc片段。6.权利要求5的多肽，其中所述PK模块是聚氧化烯模块且所述聚氧化烯模块是聚乙二醇。7.权利要求l的多肽，其进一步包含选自下组的第二域小于约50kD的抗体模块、脂笼蛋白的衍生物、四连蛋白的衍生物、avimer、锚蛋白的衍生物、和第二个第十纤连蛋白型III("Fn3)域，其中所述第二域结合人蛋白质，且其中所述第二个^Fn3域(i)包含环AB、环BC、环CD、环DE、和环FG;(ii)具有至少一个选自环BC、DE、和FG的环，其具有相对于人"Fn3域的相应环的序列随机化的氨基g吏序列，且(iii)'以约10nM或更小的解离常数结合不与人"0Fn3域结合的人蛋白质。8.权利要求7的多肽，其中所述第二域是第二个^Fn3域且包含SEQIDNO:2-125、184-203、或226之任一的氨基酸序列。9.权利要求7的多肽，其中所述第二域结合人IGF-IR。10.权利要求7的多肽，其中所述第二域结合人VEGFR2。11.权利要求7的多肽，其中所述第二域是第二个，n3域且包含SEQIDNO:126-183之任一的氨基酸序列。12.权利要求7的多肽，其中所述WFn3域和第二域经至少一个二硫键、肽键、多肽、聚合糖、或聚乙二醇模块可操作相连接。13.前述权利要求任一项的多肽，其中所述多肽抑制IGF-I或IGF-II对IGF-IR的结合且在基于细胞的测定法中在亚IC50浓度不活化IGF-IR。14.权利要求l的多肽，其中所述"Fn3域是通过包含以下步骤的方法选择的a)生成一群候选RNA分子，每种包含与人^Fn3域编码序列不同的候选第十纤连蛋白III型^Fn3)域序列，所述RNA分子每种都包含与所述候选'Vn3域编码序列可搡作相连接的翻译起始序列和起始密码子且每种都在3'端与核酸-。票呤霉素接头可操作相连接；b)在体外翻译所述候选WFn3域编码序列以生成一群候选RNA-"Fn3融合物；c)使所述候选RNA-Fn3融合物群与IGF-IR接触；并d)选择如下RNA-"Fn3融合物，其蛋白质部分具有相对于所述人，n3对IGF-IR的结合亲和力或特异性改变的对IGF-IR的结合亲和力或特异性。15.—种药学可接受组合物，其包含前述权利要求任一项的多肽，其中所述组合物基本上不含内毒素。全文摘要本发明提供了结合胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)的新蛋白质，以及其它重要蛋白质。本发明还提供了药物制剂中的新蛋白质和此类蛋白质的衍生物，及其在诊断、研究和治疗应用中的用途。本发明进一步提供了包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、和包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。文档编号C07K14/47GK101636410SQ200780049878公开日2010年1月27日申请日期2007年11月21日优先权日2006年11月22日发明者帕特里克·盖奇,戴维·法布里齐奥,约翰·门德莱因,雷·坎普豪森,马丁·C·赖特申请人:雅达思,百时美-施贵宝研究与开发公司