专利名称：一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型及构建方法
技术领域：
本发明属于蛋白质组学技术领域技，尤其涉及一种蛋白质组学技术领域，尤其涉及一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型及构建方法。
背景技术：
血清蛋白参与机体免疫、凝血、物质交换、运输、代谢、生长信号调节等多种重要的生理功能，尤其是低丰度蛋白质的组成和数量变化往往受一些病理状态的影响。血清蛋白质组学通过比较某种疾病血清中表达的全部蛋白质，寻找和鉴定有显著差异的蛋白，进一步研究其结构和功能，为研究疾病致病机理、生物标记物、药物作用靶点开辟新的途径。相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术可同时对八个样本中的所有蛋白质进行精确鉴定、定量和比较。该试剂已被广泛应用于生命科学的许多领域，包括生物标志物的发现、信号转导及翻译后修饰研究、基因与蛋白质表达相关分析、细胞膜与亚细胞结构分析和药物靶点分析等。
发明内容
本发明可以提供一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型和一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型的构建方法，为应用蛋白表达差异质谱技术，寻找血清生物标志物提供新的途径。本发明实施例是这样实现的，一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型包括肺结核与健康对照组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白I3DLI1、C4BPA、⑶14、SAA、IGHD, IGHM、SHBG, PPIA、PZP、MASP2、PEPD, ZYX、VffF, FLNA, TAGL2、FCN2、CD5L、F13A、FHR5、HBD、IBP2、HBB、GPV1、HYOUl、TTHY、HBA、LDHB、TLNl、NPC2、TENA、HABP2、TRMLl、CAH2、ITBl、C4BPB、HPT、FCGBP, PROFl、FIBB、4F2、ITIH3、SODE, FETUB_HUMAN、CALR、TIMPl 和下调蛋白PLF4、RET4、AP0M、LYSC、IL1AP、IBP5、FINC、AP0D、ANGT、ALBU、C1R、AP0C1、HGFA、N0E1、SAMP、MME、CHLE、CPN2、TRY1、CBG、LUM、IBPl、PEDF、BTD、TETN、KLKBl、ATRN、K1C10、LYVEl、PONl、TRFE, LMAN2、NGAL, LCAT, IPSP, APOF, NRPl、GPV, K2C1、P0N3、AP0A1、PHLD、ICAM2、FAl1、ANAG, C04B、GPX3、K1C9、TRFL, AFAM、C0L11、SAA4、AP0C2、CNDPl、AP0C4 构成。肺结核与肺炎组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白SAMP、CBPB2、IC1、HEP2、FLNA、AFAM、ZA2G、ANT3、KNGl、PLSL、THBG、C05、A2AP、LUM、MASPl、LBP、HABP2、GPX3、HYOUl、PROC、CHLE、APOH、C07、FKBIA、ATRN、TAGL2、CFA1、PROF1、RET4、CIQB、KLKB1、BTD、NEO1、PPIA、GPV、CBG, C1R、PROZ, SHBG, ANGT、PDIAl、F13B、ZP1、QS0X1、TLNl、C08B、HRG, KAIN、LYSC, C02、GP1BA、TETN、CPN2、CYTC, C06A3、MBL2、PEDF、NGAL, VffF, HGFL, APOCl、TRMLl、PRG4、FETUB,CAHl、CRIS3、C1RL、AMPN、PEPD, C08G、CD14、HGFA, FCG3B、1433Z、BGH3、FCGBP、4F2、D0P0,CALR、ZYX、CRACl、S0DE、PTCDS、FA10、FHRl、C1QA、PDLI1、IGF2、PLTP、EGLN、BSTl、NOEl 和下调蛋白 IGHAl、HPT、IGHG3、LAC2、IGKC、SAA、ALBU、IGHM、HBA、HBB、HPTR、PLF4、HBD、C4BPA、SAA4、CRP, TTHY, IGJ, CATA、PHLD、SLP1、LG3BP、PVR、FINC、IGLL5、APOM、FIBA、TENA、AP0L1、LCAT、KlClO、APOF、IBPl、PRDX2、ANAG、MAlAl、SEPPl、PODXL、SRCRL、PONl、CLUS、GGH、CXCL7构成。肺结核与肺癌组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白TAGL2、FLNA, TRMLU ALBU,PROFU SHBG, ZYX、PDLIU FETUB, CYTC, KNGl、SAA、TLNl、GPV1、CXCL7、C06A3、CRIS3、DOPO,SODE, NGAL, PPIA、PROZ, LYAMl、GP1BA、F13A、TENX, F13B、TTHY, BTD、NPC2、NCAMl、CALR、CFAD, HYOUl、CHLl、C07、CD14 和下调蛋白 HPT、HPTR、HBB、HBA、C4BPA、IGHG3、LAC2、PLF4、HBD、CADH5、FINC、LG3BP、AP0C2、IGHM、TRFL, SAA4、C4BPB、LBP、SLP1、PHLD, ITIH3、K2C1、A1AG2、CRP、AlAGl、ANGT、C06、APOLl、PROS、MAlAl、IGHAl、ATRN、FCN2、COIAl、C1R、CATD,PCSK9、C0L11、LCAT、C08B、FA5、APMAP、FIBB、SAMP、APOD、PLTP, HEP2、APOCl、K1C10、HGFL,SEPP1、C08A、CD5L_、CPN2、LMAN2、CFA1、ICAMU TRYl 构成。肺结核与COPD组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白ALBU、TAGL2、⑶14、FLNA,FETUB、PROF1、TENX、SODE、COMP、ZYX、TRML1、FAIO、PD IA1、KNG1、CRIS 3、TLNl、PROP、GPV1、PDLI1、PPIA、FKB1A, CBG, GPlBA、CRACl、FHRl、F13A、NPC2、ΙΒΡ5、VASN、1433Ζ、C04B、EGLN、PRG4、GGH、CFAD、CALR 和下调蛋白 HPT、IGHM、IGHG3、LAC2、HBB、HPTR、HBA、PLF4、C4BPA、HBD、IGKC、FINC、IGHAl、SAA、IGLL5、LBP、CRP、C4BPB、SAA4、ADIPO、AP0C2、A1AG2、TRFL, FIBB、ITIH3、PHLD、COLl1、CADH5、APOCl、APOD、C06、IGJ、C1R、ICAM2、AlAGl、CATA、ATRN、ANGT,FIBA、AP0C3、CLUS、LG3BP、PZP、PONU ALDOB, APOL1、SEPP1、C07、APOF、C08B、IGHD、PRDX2、C08A、LYVEl、CFA1、ENPL、GPNMB, CAH2、TENA、FA5、PROS、ICU MIME, ILlAP, FCGBP, K1C10、MRC1、CPN2、C05、GPX3、APMAP、CAHU VffF, AFAM、CATD, FBLN3 构成。蛋白表达差异质谱由相对和绝对定量的同位素标记血清全蛋白，经串联质谱分析检测蛋白质谱，再通过软件ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA) Software统计分析报告离子的相对定量。在相对定量分析中，采用质荷比114报告离子峰面积，以质荷比113、115、116、117的报告离子峰为对照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，选择比值^ 1.25^0.8的结果进行报告，其中，比值彡1. 25的为蛋白表达上调，比值彡0. 8的为蛋白表达下调。本发明实施例的另一目 的在于提供一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型的构建方法，包括以下步骤分别采集活动性肺结核组、健康对照组、肺炎组、肺癌组、COPD组的血清标本，分别对血清进行高丰度蛋白的去除和蛋白浓度的测定，将蛋白进行还原、封闭、烷基化、酶解消化，用相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记，得到相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记的肽段。再将多肽进行强阳离子交换和反向液相色谱分离，再进行串联质谱鉴定和相对定量分析，得到活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型。串联质谱鉴定过程中，采用喷雾电压2. 2kV，MS扫描范围400-1500U，MS/MS扫描范围100-2000u,并增加20%碰撞能量(collision energy)使iTRAQ的报告离子更易分离。一个谱图选择20个最强的母离子进行串级扫描。相对定量分析使用软件为ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA) Software。相对定量分析过程中设定蛋白置信度大于95 %或ProtScore (unused)大于1. 5。相对定量分析过程中，采用质荷比114报告离子峰面积，以质荷比113、115、116、117的报告离子峰为对照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，选择比值彡1. 25 ^ O. 8的结果进行报告，其中，比值彡1. 25的为蛋白表达上调，比值彡O. 8的为蛋白表达下调。根据分析报告，通过活动性肺结核组与健康对照组的蛋白表达差异质谱、活动性肺结核组与肺炎组的蛋白表达差异质谱、活动性肺结核组与肺癌组的蛋白表达差异质谱、活动性肺结核组与COPD组的蛋白表达差异质谱，建立活动性肺结核的表达差异质谱模型。上述得到的活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型，为应用相对和绝对定量的同位素标记血清全蛋白，经串联质谱分析检测蛋白质谱，提供了新的方案。本发明提供了一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型及构建方法，通过比较活动性肺结核组与健康对照组、肺炎组、肺癌组、COPD组的蛋白质组学差异，获得活动性肺结核的蛋白表达差异质谱。此外，本发明还涉及活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型构建的新方法，利用相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记及串联质谱技术，能有效地对血清里的蛋白进行鉴定和相对定量，采用该技术能获得活动性肺结核病人血清中的蛋白表达差异质
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图
及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。血清蛋白质组学通过比较某种疾病血清中表达的全部蛋白质，寻找有显著差异的蛋白，鉴定疾病相关蛋白质，并进一步研究其结构和功能，为研究疾病致病机理、生物标记物、药物作用靶点开辟新的途径。相对和绝对定量同位素标记技术，可同时对八个样本中的所有蛋白质进行精确鉴定、定量和比较。该试剂已被广泛应用于生命科学的许多领域，包括生物标志物的发现、信号转导及翻译后修饰研究、基因与蛋白质表达相关分析、细胞膜与亚细胞结构分析和药物祀点分析等。本实施提供了一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型的构建方法，具体步骤如下分别采集活动性肺结核组、健康对照组、肺炎组、肺癌组、COPD组的血清标本，分别对血清进行高丰度蛋白的去除和蛋白浓度的测定，将蛋白进行还原、封闭、烷基化、酶解消化，用相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记，得到相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记的肽段。再将多肽进行强阳离子交换和反向液相色谱分离，再进行串联质谱鉴定和相对定量分析，得到活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型。实施例1 :样本的采集及资料整理肺结核病人清晨空腹抽血，抽取前臂静脉全血5ml于一次性未经过抗凝处理的真空采血管，并在2-3小时内分离血清。不抗凝的血4°C、3000g/min离心IOmin取血清并分装，置_80°C冰箱内保存。活动性肺结核组女5例，男5例，平均年龄37. 00±11. 85 ；健康对照组女5例，男5例，平均年龄36. 20±8. 44 ;肺炎组女6例，男4例，平均年龄40. 90±9. 28 ;肺癌组女2例，男8例，平均年龄57. 50±9. 36 ;C0PD组女4例，男6例，平均年龄59. 50±4. 70。标本采集经医院伦理委员会批准和患者本人或家属的知情同意。实施例2 :血清高丰度蛋白的去除用安捷伦多重亲和去除系统Agilent multiple affinity removal LCcolumn-Human 14 (MARS)去除人血清中的高丰度蛋白。Buffer A与Buffer B为该柱子自带缓冲液。血清混合物用Buffer A稀释4倍，通过装有O. 22um孔径滤膜的离心管16000Xg离心Imin过滤去除颗粒杂质。以O. 125mL/min的速度进样200ul稀释的血清,紫外检测波长为214nm/280nm，于5-7.5min收集流出的低丰度蛋白组分，储存于-20°C。用100% BufferB以流速为1. OmL/min洗脱约5. 5min。再用100% Buffer A以1. OmL/min的流速平衡柱子9min。收集第一个峰(低丰度蛋白组分)，用Millipore的3K分子量截留超滤，去除洗脱液中的盐成分。用Bradford法测定蛋白质浓度。实施例3 ITRAQ标记选用Applied Biosystem的ITRAQ试剂盒标记。取各组样品各IOOug,每管加入预冷的丙酮(丙酮样品体积比=5 I), -20°C沉淀lh。然后12000rpm离心15min,弃上清。用试剂盒中自带的溶解液20uL溶解缓冲液(含有O. 5M TEABtriethylammoniumbicarbonate)和Iul变性剂(含有2% SDS)充分混悬溶解样品。加入2ul还原试剂(含有 50mM TCEP tris (2-carboxyethyl) phosphine)，60°C还原 lh。再加入 Iul 半胱氨酸封闭试剂(含有 20mM MMTS s-methyl methanethiosulfonate),混合后室温烧基化 IOmin 后，按照酶蛋白质=I 20的比例加入Trypsin酶(TPCK处理过的)，混合后37°C酶解过夜。将5种标记试剂离心，各加入异丙醇60uL混匀，加入各自对应样品液中，混匀离心，室温静置2h。标记和样品对应关系如下113-健康对照组，114-肺结核病组，115-大叶性肺炎组，116-肺癌组，117-C0PD组。合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。实施例4 2D LC-MS/MS 分析采用waters公司 的Sep-Pak Vac C18柱子脱盐。即将标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐除去，以便 于后续分析。首先是100 %乙腈冲洗柱子3次，然后用0. 1%TFA (水溶)，冲洗柱子三次。用400uL O. 1% TFA溶解样品，加载到柱子上，0. 1% TFA冲洗柱子3-5次后，用50%乙腈0.1% TFA 400uL洗脱下样品。将样品冷冻干燥后进行后续分析。第一维强阳离子柱(SCX)分离所用的柱子为Polysulfoethyl column,
2.5u, 200A, The Nest Group, Inc. MA。流动相 A 液含 10mmol/LKH2P04 和 25%ACN(acetonitrile)，pH 2. 6 ；B 液含 lOmmol/L KH2P04、350mmol/L KCl 和 25 % ACN, pH2.6。混合样品用阳离子交换加载缓冲液BuffferA SOuL溶解并上样。设紫外检测波长为214nm/280nm，流速为 200uL/min。线性梯度洗脱程序为5_40min，5% -25% B ;40_45min，25% -80% B ；45-50min,80% B ；50-60min,0% B。根据峰形和时间共收取20个梯度，真空离心浓缩(rotation vacuum concentrators, Christ RVC 2-25, Christ, Germany)后，每馏分用50uL反相液相色谱的A相溶解，进行第二维分析。第二维反相液质联用RPLC-MS :流动相A液为5% (体积分数)ACN和0.1 %甲酸溶液，流动相B液为95% ACN和0.1 %甲酸溶液。第一维的每组馏分真空干燥后，用反相液相色谱的A相溶解,通过QSTAR质谱仪(Applied Biosystem, USA)进行分析。肽段先经装有反相分离柱 ZORBAX 300SB-C18 column (5 μ m, 300A, 0.1x 150mm, microm, USA)的反相
液相色谱RPLC (岛津20AD)进行分离,色谱分离120min。流速为300nL/min。RPLC柱梯度洗脱程序为0-5min，上样；5-90min,5% -35% B ；90-95min, 35% -80% B ；95-100min, 80%B ；100-105min,80% -5% B ；120min 停止。质谱鉴定纳喷雾针直接连接于反相色谱柱末端作为喷雾接口，喷雾电压2. 2kV。MS扫描范围400-1800u, MS/MS扫描范围100_2000u，并增加20 %碰撞能量(collisionenergy)使iTRAQ的报告离子更易分离。一个谱图选择4个最强的母离子进行串级扫描。实施例5 :质谱数据分析通过ProteinPilot 3. O软件检索SwissProt数据库，搜索参数为物种为H. sapiens,消化酶为trypsin,烧化剂为甲基甲烧巯基磺酸(MMTS, MethylMethanethiosulfonate),样品采用iTRAQ标记赖氨酸和氨基末端。鉴定的原始结果经thePro Group Algorithm (Applied Biosystems)处理后导出。根据软件对鉴定到的蛋白质打分，设定报告阈值。鉴定蛋白所采用的置信Cutoff值为 ProtScore (unused) >1. 5, Confidence Interval > 95 %,满足 EF (error factor)< 2，且!) < 0.05。软件依据同位素报告基团的相对含量进行蛋白质定量，选择差异显著(P ( O. 05)的结果报告。鉴定的蛋白比值彡1. 25或者< O. 8被认为存在表达差异。结果分析肺结核组与健康对照组的比较蛋白质组学与健康对照组相比，肺结核组有45个蛋白表达上调，见表I ;55个蛋白表达下调，见表2。表I肺结核组与健康对照组相比表达上调的蛋白质
权利要求
1.一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型，其特征在于，该活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型包括 肺结核与健康对照组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白PDLI1、C4BPA、⑶14、SAA、IGHD、IGHM、SHBG, PPIA、PZP、MASP2、PEPD, ZYX、VffF, FLNA, TAGL2、FCN2、CD5L、F13A、FHR5、HBD、IBP2、HBB、GPV1、HYOU1、TTHY、HBA、LDHB、TLN1、NPC2、TENA、HABP2、TRML1、CAH2、ITB1、C4BPB、HPT、FCGBP, PROFl、FIBB、4F2、ITIH3、SODE, FETUB_HUMAN、CALR、TIMPl 和下调蛋白 PLF4、RET4、AP0M、LYSC、IL1AP、IBP5、FINC、AP0D、ANGT、ALBU、C1R、AP0C1、HGFA、N0E1、SAMP、MME、CHLE、CPN2、TRYU CBG, LUM、IBP1、PEDF、BTD、TETN、KLKBl、ATRN、K1C10、LYVEl、PONl、TRi7E、LMAN2、NGAL、LCAT、I PSP、APOF、NRP1、GPV、K2C1、PON 3、APOA1、PHLD、ICAM2、FA11、ANAG、C04B、GPX3、K1C9、TRFL, AFAM、C0L11、SAA4、AP0C2、CNDPl、AP0C4 构成； 肺结核与肺炎组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白SAMP、CBPB2、IC1、HEP2、FLNA、AFAM、ZA2G、ANT3、KNG1、PLSL、THBG、⑶5、A2AP、LUM、MASP1、LBP、HABP2、GPX3、HYOU1、PROC、CHLE、APOH、C07、FKBIA、ATRN、TAGL2、CFA1、PROF1、RET4、CIQB、KLKB1、BTD、ΝΕΟ1、PPIA、GPV、CBG、C1R、PROZ, SHBG, ANGT、PDIAl、F13B、ZP1、QSOXl、TLNl、C08B、HRG, ΚΑΙΝ、LYSC, C02、GPlBA、TETN、CPN2、CYTC, C06A3、MBL2、PEDF, NGAL, VffF, HGFL, APOCl、TRMLl、PRG4、FETUB, CAHl、CRIS3、C1RL、AMPN、PEPD, C08G、CD14、HGFA, FCG3B、1433Z、BGH3、FCGBP、4F2、DOPO, CALR、ZYX、CRACl、SODE、PTCDS、FAlO、FHRl、C1QA、PDLI1、IGF2、PLTP、EGLN、BSTl、ΝΟΕΙ 和下调蛋白 IGHAl、HPT、IGHG3、LAC2、IGKC、SAA, ALBU, IGHM、HBA, HBB、HPTR、PLF4、HBD、C4BPA、SAA4、CRP, TTHY, IGJ, CATA、PHLD、SLP1、LG3BP、PVR、FINC、IGLL5、APOM、FIBA、TENA, AP0L1、LCAT,K1C10、AP0F、IBPl、PRDX2、ANAG, MAlAl、SEPPl、PODXL, SRCRL, PONl、CLUS、GGH、CXCL7 构成；肺结核与肺癌组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白TAGL2、FLNA, TRMLl、ALBU, PR0F1、SHBG, ZYX、PDLI K FETUB, CYTC, KNGl、SAA、TLNl、GPV1、CXCL7、C06A3、CRIS3、D0P0, SODE,NGAL, PPIA、PROZ, LYAMl、GP1BA、F13A、TENX, F13B、TTHY, BTD、NPC2、NCAMl、CALR、CFAD,HY0U1、CHLl、C07、CD14 和下调蛋白 HPT、HPTR、HBB、HBA、C4BPA、IGHG3、LAC2、PLF4、HBD、CADH5、FINC、LG3BP、AP0C2、IGHM、TRFL, SAA4、C4BPB、LBP、SLPI, PHLD, ITIH3、K2C1、A1AG2、CRP、AlAGl、ANGT、C06、AP0L1、PROS、MAlAl、IGHAU ATRN, FCN2、C0IA1、C1R、CATD, PCSK9、C0L1U LCAT、C08B、FA5、APMAP、FIBB、SAMP、APOD、PLTP、HEP2、APOC1、KICIO、HGFL、SEPP1、C08A、CD5L_、CPN2、LMAN2、CFA1、I CAMl、TRYl 构成； 肺结核与COPD组的蛋白表达差异质谱，由上调蛋白ALBU、TAGL2、⑶14、FLNA, FETUB,PROF1、TENX、SODE、COMP、ZYX、TRML1、FAIO、PD IA1、KNG1、CRI S3、TLN1、PROP、GPV1、PDL11、PPIA、FKB1A, CBG, GP1BA、CRACl、FHRl、F13A、NPC2、ΙΒΡ5、VASN、1433Z、C04B、EGLN、PRG4、GGH、CFAD、CALR 和下调蛋白 HPT、IGHM、IGHG3、LAC2、HBB、HPTR、HBA、PLF4、C4BPA、HBD、IGKC、FINC、IGHAl、SAA、IGLL5、LBP、CRP, C4BPB、SAA4、ADIP0、AP0C2、A1AG2、TRFL, FIBB、ITIH3、PHLD、COLl1、CADH5、APOCl、APOD、C06、IGJ、C1R、ICAM2、AlAGl、CATA、ATRN、ANGT, FIBA、AP0C3、CLUS、LG3BP、PZP、PONU ALDOB, APOL1、SEPP1、C07、APOF, C08B、IGHD、PRDX2、C08A、LYVEl、CFA1、ENPL、GPNMB, CAH2、TENA, FA5、PROS、ICU MIME, ILlAP, FCGBP, K1C10、MRCl、CPN2、C05、GPX3、APMAP、CAHU VffF, AFAM、CATD, FBLN3 构成。
2.如权利要求1所述的活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型，其特征在于，蛋白表达差异质谱由相对和绝对定量的同位素标记血清全蛋白，经串联质谱分析检测蛋白质谱，再统计分析报告离子的相对定量。
3.如权利要求1所述的活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型，其特征在于， 在相对定量分析中，采用质荷比114报告离子峰面积，以质荷比113、115、116、117的报告离子峰为对照，按照114 113,114 115,114 116,114 117的比值，选择比值^ 1.25^0.8的结果进行报告，其中，比值彡1. 25的为蛋白表达上调，比值彡O. 8的为蛋白表达下调。
4.一种权利要求1的活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤 分别采集活动性肺结核组、健康对照组、肺炎组、肺癌组、COPD组的血清标本，分别对血清进行高丰度蛋白的去除和蛋白浓度的测定，将蛋白进行还原、封闭、烷基化、酶解消化，用相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记，得到相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记的肽段；再将多肽进行强阳离子交换和反向液相色谱分离，再进行串联质谱鉴定和相对定量分析，得到活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，串联质谱鉴定过程中，采用喷雾电压2. 2kV, MS扫描范围400-1500U，MS/MS扫描范围100_2000u，并增加20 %碰撞能量(collision energy)使iTRAQ的报告离子更易分离；一个谱图选择20个最强的母离子进行串级扫描。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，相对定量分析使用软件为ProteinPilot 4. 2beta(ABI, USA)Software。
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，相对定量分析过程中设定蛋白置信度大于 95 %或 ProtScore (unused)大于1. 5。
8.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，相对定量分析过程中，采用质荷比114报告离子峰面积，以质荷比113、115、116、117的报告离子峰为对照，按照114 113、114 115,114 116,114 117的比值，选择比值彡1. 25彡O. 8的结果进行报告，其中，比值>1. 25的为蛋白表达上调，比值< O. 8的为蛋白表达下调。
9.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，根据分析报告，通过活动性肺结核组与健康对照组的蛋白表达差异质谱、活动性肺结核组与肺炎组的蛋白表达差异质谱、活动性肺结核组与肺癌组的蛋白表达差异质谱、活动性肺结核组与COPD组的蛋白表达差异质谱，建立活动性肺结核的表达差异质谱模型。
全文摘要
本发明公开了一种活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型及构建方法，通过比较活动性肺结核组与健康对照组、肺炎组、肺癌组、COPD组的蛋白质组学差异，获得活动性肺结核的蛋白表达差异质谱。此外，本发明还涉及活动性肺结核蛋白表达差异质谱模型构建的新方法，利用相对和绝对定量的同位素ITRAQ标记及串联质谱技术，能有效地对血清里的蛋白进行鉴定和相对定量，采用该技术能获得活动性肺结核病人血清中的蛋白表达差异质谱。
文档编号G01N30/02GK103065065SQ20121049963
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月18日 优先权日2012年11月18日
发明者李继承, 徐丹丹 申请人:浙江大学