酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用以及生产法尼烯的方法与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因工程菌、一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法、所述方法构建得到的酿酒酵母基因工程菌、所述酿酒酵母基因工程菌在生产法尼烯中的应用、一种生产法尼烯的方法。

背景技术：

1、法尼烯，分子式为c15h24，是一种最简单的链状倍半萜化合物。法尼烯合成可以通过法尼烯合成酶一步转化前体法尼基焦磷酸(fpp)即可完成。植物中，fpp的天然合成途径主要包括两种：甲羟戊酸(mva)途径和2-甲基-d-赤藻糖醇-4磷酸(mep)途径。如果单纯依赖植物提取，需要消耗大量的人力和物力，获得的法尼烯含量很低，而且成分不单一。通过代谢工程和合成生物学策略，法尼烯的微生物合成已经成功实现。

2、目前，利用代谢工程改造酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)合成法尼烯产量较低，cn112094765a通过在酿酒酵母中过表达截短形式的hmg-coa还原酶thmg1编码基因以及过表达法尼烯焦磷酸合成酶erg20-来源于大豆的法尼烯合成酶fsso的融合蛋白，获得了一株酿酒酵母基因工程菌，虽然基因工程步骤简单，但该重组菌株摇瓶水平法尼烯的产量仍较低，仅有1.0g/l。因此，仍有必要进一步获得法尼烯产量高的酿酒酵母基因工程菌。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用基因工程手段构建的具备法尼烯生产能力的酿酒酵母基因工程菌ftx-4，该酿酒酵母基因工程菌在摇瓶水平发酵可以积累3.0g/l的法尼烯，具备更高的产量，为法尼烯的工业化生产提供了有效的策略。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因lsfso，抑制了角鲨烯合酶erg9的编码基因的表达。

3、优选地，所述来源于莴苣(lactuca sativa)的法尼烯合酶的氨基酸序列如seq idno:1所示；和/或

4、来源于莴苣(lactuca sativa)的法尼烯合成酶编码基因lsfso的核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明第二方面提供一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法，以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达来源于莴苣(lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因lsfso，抑制角鲨烯合酶erg9的编码基因的表达，得到酿酒酵母基因工程菌。

6、本发明第三方面提供如上所述的方法构建得到的酿酒酵母基因工程菌。

7、本发明第四方面提供如上所述的酿酒酵母基因工程菌在生产法尼烯中的应用。

8、本发明第五方面提供一种生产法尼烯的方法，该方法包括将如上所述的酿酒酵母基因工程菌接种到发酵培养基中进行发酵并生产法尼烯，其中，所述发酵培养基中含有甲硫氨酸。

9、本发明中利用基因工程手段构建了能够生产法尼烯的酿酒酵母基因工程菌ftx-4，其过表达甲羟戊酸途径中的酶基因和法尼烯焦磷酸合酶基因以及来自莴苣来源的法尼烯合酶编码基因lsfso，同时抑制角鲨烯合酶erg9的编码基因表达，使得在摇瓶水平发酵能够积累3.0g/l的法尼烯，为法尼烯的工业化生产提供了有效的策略。

技术特征：

1.一种酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因lsfso，抑制了角鲨烯合酶erg9的编码基因的表达。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，所述来源于莴苣(lactucasativa)的法尼烯合酶的氨基酸序列如seq id no:1所示；和/或

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，所述酿酒酵母基因工程菌过表达了甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因中的至少一个；

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，角鲨烯合酶编码基因erg9的启动子是甲硫氨酸抑制的启动子pmet3。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，所述酿酒酵母基因工程菌以酿酒酵母cen.pk2-1d为宿主。

6.一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达来源于莴苣(lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因lsfso，抑制角鲨烯合酶erg9的编码基因的表达，得到酿酒酵母基因工程菌；

7.根据权利要求6所述的方法，其中，过表达甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因的方式包括：转入包括至少一个拷贝的acetyl-coa乙酰基转移酶编码基因erg10、至少一个拷贝的hmg-coa合成酶编码基因erg13、至少三个拷贝的截短形式的hmg-coa还原酶编码基因thmg1、至少两个拷贝的甲羟戊酸激酶编码基因erg12、至少一个拷贝的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因erg8、至少一个拷贝的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶编码基因mvd1、至少一个拷贝的异戊二烯焦磷酸δ-异构酶编码基因idi1和至少一个拷贝的法尼烯焦磷酸合酶编码基因erg20；

8.权利要求6或7所述的方法构建得到的酿酒酵母基因工程菌。

9.权利要求1-5和8中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌在生产法尼烯中的应用。

10.一种生产法尼烯的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-5和8中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌接种到发酵培养基中进行发酵并生产法尼烯，其中，所述发酵培养基中含有甲硫氨酸；

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，公开了酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用以及生产法尼烯的方法，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因LsFSO，抑制了角鲨烯合酶ERG9的编码基因的表达。该酿酒酵母基因工程菌在摇瓶水平发酵72小时，可以积累3.0g/L的法尼烯，具有潜在的工业化应用价值。

技术研发人员：陈玲,王凌旭,路飞,冀勇良
受保护的技术使用者：上海博纳赛恩医药研发有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13