绿色木霉h1在降解甲醛中的应用的制作方法

专利名称：绿色木霉h1在降解甲醛中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲醛降解菌技术领域，具体涉及一种绿色木霉HI在 降解甲醛中的应用。
技术背景关于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究很早以前就有报道，早期 人们着手于低浓度降解甲醛的研究，近年来高浓度降解甲醛时有报 道。Adroer等(1990)分离的Pseudomonas putida A2能降解甲醛 250mg*L"; Azachil等(1995)分离了的Halomonas sp. MAC仅能耐 受甲醛75-100 mg*L"; Doronina等(1997)分离的Pseudomonas. alcaligenes能降解甲醛200 mg吃-1，菌株Pseudomonas putida J3能降 解甲醛450 mg'I/1， Methylobacterium extorquens能降解甲醛500-1000 mg'L—1; —株Pseudomonas alcaligenes培养3天后能降解甲醛 2000mg.L-1。 Mirdamadi等(2005)J艮道Methylobacterium extorquens (ESS和PSS)和四株Pseudomonas pseudoalcaligenes (LSW， SSW, NSW， OSS)能降解甲醛1850 mg'L—、其中菌株Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS培养24 h3700 mg^I/1甲醛被100%消耗，培养 72h消耗5920 mg*L"甲醛70%， Methylobacterium extorquens ESS和 Methylobacterium extorquens PSS还能完全降解甲醛2960 mg'L"。 Bonastre等(1986)报道在C甲醛为2300 mg'dm—3的活性污泥做基质的实验里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧条件下被好氧菌降解；当以甲醛为碳源时降解甲醛400 mg，dm—3，在活性污泥厂的废水处理中完 全降解甲醛2300mg'dm—3和苯酚2400mg*dm—3(Zagornaya et al ， 1990)。 Yamazaki等(2001)从海水里分离了一株甲醛耐受细菌，发现它在3% 的氯化钠里能降解甲醛400 mg，dm-3，在Eiroa等(2004)设计的模型里， 指出硝化作用可以降解甲醛，当以甲醛为碳源、甲醇为伴生碳源时， 硝化细菌可以降解甲醛的浓度是30-3890 mg*dm—3，而反硝化细菌在 有甲醛和甲醇存在时可以降解1360mg*dm—3甲醛(Eiroa et al， 2006)。 然而大部分是降解甲醛细菌和降解甲醛酵母菌的研究，霉菌的研究报 道很少，Kondo等(2002)从土壤中分离了一株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomius IRI013，它能生长在最高w(甲醛尸0.459fc里并把它完 全消耗掉。降解甲醛机理也有相关的报道，羟甲基细菌含有己酮糖磷酸合成 酶(HPS)和己酮糖磷酸异构酶(Pffl)，也属于解毒系统(Mitsui et al， 2000)。耐热的甲基营养菌Bacillus brevis Sl(Yurimoto et al， 2002)的 HPS和PHI基因表达3-己酮糖-6-磷酸酶和6-己-3-磷酸酶，磷酸核酮 糖路径操纵子编码甲醛固定。近年来也有发现非羟甲基细菌也存在这 一途径，如Bacillus subtilis在与甲醛接触之后HPS和PHI也得到了 表达(Yasueda et al， 1999)。据Marx等,艮道Methylobacterium extorquens AMI有一个很好的体系来氧化和同化甲醛(Marx et al， 2003a; 2003b)， 它的转移/水解联合酶(Fhc)可将甲醇和甲醛氧化成C02，产生甲酸盐 (Pomper et al， 2002)。据Marx等报道Methylobacterium extorquens AMI有一个很好的体系来氧化和同化甲醛(Marx et al， 2003)，它的转移/ 水解联合酶(Fhc)可将甲醇和甲醛氧化成C02，产生甲酸盐(Pomper et al， 2002)。 Mitsui等人(2005)分离一株Methylobacteriumsp.MFl，會旨 生长在多种碳源的培养基上，也能生长在只有甲醛为碳源的培养基 上。当培养基使用1.2g*L—i的甲醛作为碳源时，在200h内将甲醛全部 消耗完。在有甲醇和甲醛同时存在时，Methylobacterium sp. MF1先 利用甲醇作为碳源并吸收甲醛，通过甲醇脱氢酶形成代谢媒介，甲醛 被甲醛脱氢酶以NAD+为辅酶、谷胱甘肽存在的条件下被代谢或吸收。 Cos等人(2005)在分批培养和补料分批培养中，发现酵母菌Pichia pastoris使用乙醇氧化酶和甲醛脱氢酶两个不同的调节催化剂时，表 达不同的蛋白质(脂肪酶)。Aggelis(2000)等人提出Candidaboidinii酵 母菌不但含有甲醛脱氢酶、甲酸盐脱氢酶还含有甲醇脱氢酶，当然也 能利用甲醛、甲醇等多样C源。Yasuhara等(2002)发现，Methylobacillus sp.(杆状细菌)，Pseudomonas sp.(假单胞菌)禾n Streptomyces moderates(链霉菌)细胞里含有醛氧化酶(ALOD)，该酶能广范围的氧 化醛类，包括甲醛、脂肪族的醛、芬芳族的醛，虽然该酶的诱导对各 种醛类的依赖程度不一样。对于绿色木霉Hl， 1996年Kuhls，K.和Lieckfeldt,E.等人对其进 行过研究报道，具体文献为"Kuhls，K.， Lieckfeldt，E.， Samuels，G.J.， Kovacs,W., Meyer，W" Petrini，O.， Gams,W., Bomer,T. and Kubicek， C.P. Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoder ma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocreajecorina.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (15)， 7755-7760 (1996)。"，到目前为止，有报道绿色木霉不但能产生多种具活性的酶系，而且又是资 源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用，还在 基因工程上有一定的应用。但是对于绿色木霉H1能降解甲酸，尚未见相关文献报道。 发明内容本发明的目的是提供一种绿色木霉H1在降解甲醛中的应用，其 可有效、快速地降解甲醛。本发明的上述目的通过以下技术方案实现一、甲醛降解菌一绿色木霉Hl的分离与鉴定1、培养基配方基本培养基1.0免(wv—1)葡萄糖，0.2%(wv-i)NaN03 ， 0.1呢(w.v")K2HP04， 0.059Kw.v、MgS。4.7H20 ， 0.05免(w-v"KCl ， 0.001免(w.v")FeS04.7H20， 0.019KwV"酵母膏，0.1免(w.v-i)甲醛(甲 醛用市售甲醛标准溶液)，培养基最终pH为6.0 (如没有特别说明， 以下基本培养基均为此配方培养基)。察氏培养基配方3.0免(w-v-1)蔗糖，0.3呢(w-v")NaN03 ， 0.1呢(w.v、K2HP04， 0.05呢(w一)MgS04.7H20 ， 0.05%(w.v-"KC1 ， 0.001免(w.v")FeS04.7H20， 1.5—2.0免(w.v")琼脂。麦芽汁培养基配方2.0免(w.v")麦芽浸膏，0.1免(wv")蛋白胨， 2.0免(w.v")葡萄糖，1.5—2.0呢(w.一)琼脂。PDA培养基配方20免(w.v")土豆(去皮)，2.0免(w.v")葡萄糖，1.5—2.0% (w.v—b琼脂。(土豆切碎，加水煮沸30min，用双层纱布过 滤，取其滤液。)2、分离纯化与结果分析样品采自未经过处理的家具厂出水口的淤泥，其甲醛气味浓烈， 甲醛污染严重，从而保证了甲醛降解目的菌的存在。将上述样品接种于基本培养基里，摇床上160r.mii^3(TC培养5d， 生长起来的霉菌再多次用PDA培养基平板画线，经多次纯化，分离 到一株霉菌，编号H1。然后将菌株H1分别接种于察氏培养基、麦 芽汁培养基、PDA培养基上，25'C培养8d，观察其菌落特征。同时， 显微镜下观察显微结构，并记录好结构特征，结合提取DNA，检测 DNA浓度和纯度，PCR 18S rDNA扩增等一系列的分子鉴定手段得出 结论本发明分离纯化得到的甲醛降解菌H1的18SrDNA序列与已 报道的绿色木霉(7Wc/io^w^ wW&)同源率达99.6%，其培养特征 及显微特征也与绿色木霉(7Wc/^^rm"wW^)最相似。绿色木霉Hl的报道文献为Kuhls，K.， Lieckfeldt，E.， Samuels，G丄, Kovacs，W.， Meyer，W.， Petrini,O.， Gams，W.， Borner，T. and Kubicek，C.P. Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderaia reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocreajecorina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (15)， 7755-7760 (1996)由此可见，本发明筛选到的降解甲醛菌HI为绿色木霉，18SrDNA 序列长度为1075bp，上传GenBank申请号码为bankit890445。二、绿色木霉H1的最佳生长pH值霉菌一般喜好生长在偏酸的环境里，但其嗜酸性的程度差别很 大，因此了解其最佳生长的pH，有利于对其进行快速培养和应用。1、 一级种子的制取选取产孢良好的绿色木霉Hl，接种在基本培养基中，摇床 160r.min—1， 30。C培养2 3d，当霉菌进入快速生长期时，定时测定 0/)475值，当6^475值快速上升时，此菌液即可作为一级种子。2、 样品制备选取大口 150mL三角瓶，配制pH分别为4.0， 4.5， 5.0， 5.5，6.0的液体基本培养基，瓶口用无菌封口培养膜封口 (无菌封口培养 膜是环凯公司生产的双层膜，上有直径0.6cm的圆孔两个，中间有直 径3cm的、孔径小于0.2pi的无菌滤纸片，多用于组培生产)，培养 一级种子(0/)475值为0.189)，除空白外接入一级种子5mL，置摇床 上30。C160r.min"培养，在接种的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h 取样，每次取2瓶测量菌丝干重，OZ)值测定用北京普析通用仪器有 限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，菌丝干重用重量法测 量，结果取其平均值作图。3、 结果分析绿色木霉Hl在5种不同pH培养基中培养144h (见图l)，菌 丝干重分别从0.0031、 0.0031、 0.0030、 0.0032、 0.0031 mg.1/1上升到 0.0996、 0.1049、 0.1000、 0.0922、 0.0818 mgL—1，菌丝干重最大的是 pH4.5。三、绿色木霉H1对甲醛的降解能力选取大口 150mL三角瓶，配制基本培养基，C(申船按约0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (w.v")加入，pH分别选取已经测得的最适pH (pH4.5)，瓶口用无菌封口培养膜封口，培养一级种子(0￡)475值为 0.192)，除空白外每瓶接入5mL，置摇床上SCTCWOr.min-1培养，并 在接种的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取样，每次取3瓶，其 中一瓶为空白，7000X离心15min、过滤，滤液用AHMT分光光度 法检测C(鴨)，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重， 菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。的检测用AHMT分光光度法，结果以实际测量数据为准， 并取其平均值作图。绿色木霉HI接种后144h，处理0.1%C (甲酵)从1047 mg.L"下降 到7.6mg.L-1，降解率为99.3%，实验空白在1056-1106 mg.L1，几乎 没有挥发损失，96h内，C(甲配下降迅速，菌丝增长缓慢，96h后， 菌丝干重增长迅速，但C(申醒)下降缓慢；处理0.15免C(甲醛)从1365 mg.L—1 下降到42mg丄"，降解率为96.9%，实验空白在1516-1581 mg-L"， 挥发损失很少，96h内，Cw酸)下降迅速，菌丝增长缓慢，96h后， 菌丝干重增长迅速，但C(甲整)下降缓慢；处理0.20呢C(甲酸)从2333mg丄—1 下降到628mg.1/1，降解率为73.1%，实验空白在2494-2581mg*L—、 挥发损失不多，48h内，C(甲醛)下降缓慢，48h后，C(甲酸)下降迅速， 菌丝干重增长缓慢；处理0.25%(^( )从2934mg.L—1下降到949mg.L—1， 降解率为67.7%，实验空白在3125-3372mg.L-1，挥发很少，48h内，C(甲&下降缓慢，72h后，C(申酸)下降迅速，菌丝干重增长缓慢。在4个不同浓度的处理中，菌丝干重分别从0.0030、0.0031、0.0030、0.0031g 'L"上升为0. 1047、 0.0825、 0.0162、 0.0164g'L—1。绿色木霉m的降解曲线总的规律是由慢到快，再由快到慢， 有两个阈值。在高浓度甲醛里曲线从缓慢下降转入到快速下降，这个阈值大约是1500mg丄—i左右；在低浓度甲醛里曲线从快速下降解转入 到缓慢下降，这个阈值大约是50mg丄"左右。 四、绿色木霉Hl的碳源代谢及最佳碳源选取4种常用碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉，按 培养基体积的10免添加(wv—、，设置5种不同处理的碳源，分别为 0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麦芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培养基，pH值 Hl为4.5， H2为5.0， H4为5.5，选用大口 150mL三角瓶分装，瓶 口用无菌封口培养膜封口，接入一级种子5mL (00475值为0.199)， 置摇床上30°C160r.min—4咅养，并在接种的第0， 24， 48， 72， 96， 120， U4h取样，每次取2瓶，测C顺)和菌丝干重值，H4培养基里 有葡萄糖的处理，加测C權萄糖)，并带只加葡萄糖不加菌的培养基空 白。OD值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可 见分光光度计，取样后7000X离心15min、过滤，滤液用来测量C押 醛)和C 萄糖)，C押薛)用AHMT分光光度法检测，C m萄糖)用蒽酮比色 法检测，滤纸和菌一起转入已称至恒重的烧杯中测菌丝干重。结果以 实际测量数据为准，并取其平均值作图。绿色木霉H1在5种不同的碳源里都能有效的降解甲醛，菌丝干重分别从0.0038、 0.0036、 0.0039、 0.0039、 0.0037 g'L"上升到0.0443、 0.1071、 0. 1021、 0. 1019、 0. 1068g'L"，在处理0.1%甲醛+10%蔗糖、 0.1%甲醛+10%麦芽糖、0.1%甲醛+10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖 中，C伸醛)分别从1231、 1204、 1194、 1229mg*L"下降到1.80、 2.70、 3.60、 5.10mg'L1，降解率分别为99.9、 99.8、 99.7、 99.6%， 96h内， C(甲醛)下降迅速，菌丝增长较慢，96h后，菌丝干重增长较快，但C(甲 瞎)下降缓慢。在只有甲醛作为碳源的处理中，培养144h时Hl的C押醒)从 1226mg'L—1降到142 mg*L—、降解率为88.4%，降解曲线24h后下降 速度加快，后期没有出现缓慢下降期，菌丝干重增长缓慢，没有出现 快速增长期。所以绿色木霉H1能单独利用甲醛为碳源并降解甲醛， 但降解效果不如加复合碳源。葡萄糖的加入量为13240 mg.L—1， C^萄糖)呈加速度下降，24h前 稍慢，仅消耗葡萄糖400 mg吃-1， 48h又消耗葡萄糖1191mg'1/1，以 后每隔24h消耗的量为1438、 4000、 3001、 3021mg'i;1，到144h C權 萄糖)是189 mg L—、只加葡萄糖没加菌的空白，C愤萄和稳定，计算葡 萄糖消耗量时可忽略此空白。绿色木霉H1以甲醛和葡萄糖为碳源的的利用规律是前期，C押 瞎)下降快，C，細下降比后斯侵，此时甲醛还能抑制菌体的繁殖， 绿色木霉H1先以甲醛和葡萄糖同时为碳源，并优先利用甲醛；当C 伸醛)减少到不足以抑制绿色木霉H1生长时，绿色木霉H1则主要以葡萄糖为碳源，C 下降速度比前期慢。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明研究发现 已有菌种绿色木霉HI具有降解甲醛的能力，同时提供了绿色木霉 Hl在降解甲醛的应用中的一系列数据，如最适生长pH、碳源和甲醛 降解能力等，极大地补充了降解甲醛菌的资料库，并且填补了国内甲醛降解菌研究的空白；2.绿色木霉在自然界中分布范围广，且具有繁 殖快，生长能力强等优点，所以本发明提供的绿色木霉H1在降解甲 醛中的应用，为甲酵污染的生物处理工程，提供了强有力的帮助。


图1为绿色木霉H1在察氏培养基(25°C， 7d)上的菌落形态； 图2为绿色木霉H1在在麦芽汁培养基(25°C， 7d)上的菌落形态；图3为绿色木霉H1在PDA培养基(加有孟加拉红，25°C， 7d) 上的菌落形态；图4为绿色木霉Hl的分生孢子梗、小梗；图5为绿色木霉Hl在不同pH时的生长曲线；图6为绿色木霉Hl在不同C 时的降解曲线；图7为绿色木霉Hl在不同C伸酸)时的生长曲线；图8为绿色木霉Hl在不同碳源里的C ，s)的降解曲线；图9为绿色木霉HI在不同复合碳源里的生长曲线；图IO为绿色木霉HI的C输萄糖)的下降曲线；图11为绿色木霉HI C伸酸)和C r葡萄糖)的下降曲线比较；其中，l为甲醛，2为甲醛+蔗糖，3为甲醛+麦芽糖，4为甲醛+ 淀粉，5为甲醛+葡萄糖，6为葡萄糖，ck为空白对照。通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明 性的，本发明并不受这些实施例的限制。
具体实施方式
实施例1甲醛降解菌的分离与鉴定1、 培养基的配制基本培养基配方1.0免(w-v")葡萄糖，0.2%(w*v—i)NaN03 ， 0.19Hw.v")K2HP04， 0.059Kw.一)MgSCV7H20 ， 0.05免(w.v")KCl ， 0.001呢(w'v")FeSCV7H20， 0.019Kw.v")酵母膏，0.19Hw.v")的甲醛(甲 醛用市售甲醛标准溶液)，培养基最终pH为6.0。察氏培养基配方3.0%(w.v—b蔗糖，0.3呢(w.v")NaN03 ， 0.1免(w.v")K2HP04， 0.05呢(w.v")MgS04.7H20 ， 0.05免(w.v")KCl ， 0.001呢(w'v")FeS04.7H20， 1.5 2.0免(w.v")琼脂。麦芽汁培养基配方2.09Kwv")麦芽浸膏，0.19Hw-v")蛋白胨， 2.09Kw.v")葡萄糖，1.5 2.0^(w.v")琼脂。PDA培养基配方20% (w.v-i)土豆，2.0免(w.一)葡萄糖，1.5 2.0% (w-v—、琼脂。(土豆去皮切碎，加水煮沸30，用双层纱布过滤，取其 滤液。)2、 分离样品采自未经过处理的家具厂出水口的淤泥，其甲醛气味浓烈，甲醛污染严重，从而保证了甲醛降解目的菌的存在。在超净工作台上，取10g上述淤泥样置于90mL无菌水中，振荡 15 min，放置20秒，取lmL上清液接种于培养液里，在摇床上 160r.mii^3(TC培养5d，生长起来的真菌再多次用PDA培养基平板画 线，经过多次画线纯化，分离到一株霉菌。3、鉴定(1) 平板观察选取察氏培养基、麦芽汁培养基、PDA培养基，将接种针经火 焰灭菌并冷却后，蘸取极少量的孢子，点植于平板的中间位置，将平 板置于25。C培养8d，观察菌落的特征并记录。(2) 显微观察用解剖针从培养皿的菌落上，姚取少许菌体，置载玻片的水滴中， 于显微镜下观察其形态特征并记录。(3) 分子鉴定DNA的提取参照CTAB法进行，DNA浓度和纯度的检测，采用核 酸/蛋白分析仪于Nucleic Acid程序下测定。PCR采用真菌18S rDNA扩 增通用引物(上游引物GATCCTGCCAGTAGTCATATGC;下游引 物GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，反应条件为94。C 5min， 30个 循环(94°C lmin、 56°C lmin、 72°C lmin) ， 72。C反应7min。用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳40min，于UVI凝胶成像系统分析结果。扩增产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成，测序结果在 Genbank数据库内进行同源序列搜索，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株。4、结果与分析经平板观察和显微观察，菌株在察氏培养基上生长不良，极稀薄， 呈蔓延状，扩展至整皿，有少量绿色物，为产孢结构(图l);在麦 芽汁培养基上菌丝生长茂盛，3d即可长满整皿，质地疏松，棉絮状， 接种点附近稍凹陷，菌丝淡白色，表面呈绿色，为产孢结构，反面淡黄色(图2);在PDA培养基上生长速度中等，3d长满半个皿，疏 松絮状，有绿色，为产孢结构(图3)。分生孢子梗有隔膜，垂直对生分枝，顶枝尖端细削，微弯，基部溢縮，中部膨大，呈瓶形或锥形，分生孢子着生于瓶梗顶端，球形，直径2-13,，孢壁具小疣状突起， 淡绿色(图4)。经分子鉴定，该菌株的18SrDNA序列与已报道的绿色木霉Hl (7Wc/w&rma wW&)同源率达99.6%，其培养特征及显微特征也与 绿色木霉H1 (7Wc/w&rmflvzW&)最相似。 绿色木霉H1的报道文献为Kuhls，K.， Lieckfeldt,E" Samuels,G丄，Kovacs，W.， Meyer，W" Petrini，O., Gams,W.， Borner,T. and Kubicek，CP. Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocreajecorina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (15), 7755-7760 (1996)。结合上述的平板观察、显微观察和分子鉴定结果，得出如下结论本发明筛选到的甲醛降解菌为绿色木霉Hl， 18SrDNA序列长度为1075bp，上传GenBank申请号码为bankit890445 。'实施例2绿色木霉H1的最佳生长pH值 霉菌一般喜好生长在偏酸的环境里，但其嗜酸性的程度差别很 大，因此了解其最佳生长的pH，有利于对其进行快速培养和应用。1、 一级种子的制取选取产孢良好的绿色木霉Hl，接种在基本培养基中，摇床 160r.mii!-1， 3(TC培养2 3d，当霉菌进入快速生长期时，定时测定 (9/)475值，当0/>475值快速上升时，此菌液即可作为一级种子。2、 培养基的配制选取大口 150mL三角瓶，配制pH分别为4.0， 4.5， 5.0， 5.5， 6.0的基本培养基，瓶口用无菌封口培养膜封口 (无菌封口培养膜是 环凯公司生产的双层膜，上有直径0.6cm的圆孔两个，中间有直径 3cm的、孔径小于0.2n的无菌滤纸片，多用于组培生产)，培养一 级种子(02>475值为0.189)，除空白外接入接入一级种子5mL，置摇 床上30。C160r.min"培养，在接种的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h 取样，每次取2瓶测量菌丝干重，OD值测定用北京普析通用仪器有 限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计，菌丝干重用重量法测 量，结果取其平均值作图。3、 菌丝干重的测量烧杯在105。C烘lh至恒重，记录称量结果，将菌液用滤纸过滤 后，连同滤纸一起转入已恒重的烧杯中，于8(TC烘至恒重，每次带空白两个以上。菌丝干重(g.L—1)=[(烧杯+菌的重量+纸)-(烧杯+纸)]*1000/样品量。菌丝干重取其平均值作图。4、结果与分析绿色木霉H1在5种不同pH培养基中(图5)，菌丝干重在接 种后24h相差不大，48h后菌丝干重开始随着pH的不同发生变化， 到144h不同处理之间就有了较大的差别，其中菌丝干重最大的是处 理pH4.5为0.1049 g'l/1，其次是pH4.0、 5.0、 5.5，菌丝干重分别为 0.0996、 0.1000、 0.0992g'L"， pH6.0菌丝生长稍慢，菌丝干重为0.818g L—、所以绿色木霉H1的适宜生长pH范围为pH4.0 5.5，最适pH 为pH4.5。实施例3绿色木霉Hl对甲醛的降解能力 1、样品制取选取大口 150mL三角瓶，配制基本培养基，C(甲醛)按约0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (w.v—b加入，pH分别选取已经测得的最适pH (pH4.5)，瓶口用无菌封口培养膜封口，培养一级种子(0￡>475值为 0.192)，除空白外每瓶接入5mL，置摇床上3(TC160r.min—1培养，并 在接种的第O， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取样，每次取3瓶，其 中一瓶为空白，7000X离心15min、过滤，滤液用AHMT分光光度 法检测C(￥S)，滤纸和菌一起转入己称至恒重的烧杯中测菌丝干重菌丝干重用重量法测量，结果取其平均值作图。C(鴨)的检测用AHMT分光光度法，原理为甲醛与4-氨基-3联 氨-5-巯基-l,2，4-三氮杂茂(简称AHMT)在碱性条件下縮合，然后经 高碘酸钾氧化成6-巯基-5-三氮杂茂[4，3-b]-S-四氮杂苯紫红色化合物， 其色泽深浅与甲醛含量成正比。上述样品经7000X离心15min并过滤后，滤纸和菌一起转入已 称至恒重的烧杯中测菌丝干重，取其平均值作图；滤液用AHMT分 光光度法检测C(甲薛)，具体步骤如下取100ml容量瓶，吸取l.Oml稀释了 100倍的上述滤液，加入 5mol.L—i氢氧化钾溶液1.0ml， 0.5%AHMT溶液l.Oml，盖上管塞， 颠倒混匀三次，放置20min，加入1.5%高碘酸钾0.3ml，充分振摇， 放置5min，定容至100ml。用lcm比色皿，波长550nm，随样品带空 白，测量吸光值，甲醛标液购自百灵威化学技术有限公司。甲醛标线 的操作步骤，跟样品的相同，制作标准曲线，得出标线方程，样品含 量由标线方程换算得出。3、结果与分析如图6、 7所示，绿色木霉Hl接种后144h，处理0.1免C(鴨)从 1047 mg.L—1下降到7.6 mg.L",降解率为99.3%，实验空白在1056-1106 mg.L—1，几乎没有挥发损失，96h内，C(甲酸)下降迅速，菌丝增长缓慢， 96h后，菌丝干重增长迅速，但C(,)下降缓慢；处理0.15呢Cw酵) 从1365 mg.L—1下降到42mg.L/1，降解率为96.9%，实验空白在1516-1581 mg.1/1，挥发损失很少，96h内，C(甲酵,下降迅速，菌丝增 长缓慢，96h后，菌丝千重增长迅速，但C(^)下降缓慢；处理0.20%C (甲醛)从2333mg.L"下降到628mg.L—1，降解率为73.1%，实验空白在 2494-2581mg.L—1，挥发损失可忽略，48h内，C(甲酵)下降缓慢，48h 后，C(甲醛)下降迅速，菌丝干重增长缓慢；处理0.25免C(甲醛)从2934mg-L" 下降到949mg.L—1，降解率为67.7%，实验空白在3125-3372mg丄"， 挥发很少，48h内，C(甲薛)下降缓慢，72h后，C(甲醛〉下降迅速，菌丝 干重增长缓慢。绿色木霉Hl的降解曲线总的规律是由慢到快，再由快到慢， 有两个阈值。在高浓度甲醛里曲线从缓慢下降转入到快速下降，这个 阈值大约是1500mgi—i左右；在低浓度甲醛里曲线从快速下降解转入 到缓慢下降，这个阈值大约是50mg.L"左右。实施例4绿色木霉Hl的碳源代谢及最佳碳源 选取4种常用碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉，按 培养基体积的10呢添加(wv—1)，设置5种不同处理的碳源，分别为 0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麦芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培养基，pH值 Hl为4.5， H2为5.0， H4为5.5，选用大口 150mL三角瓶分装，瓶 口用无菌封口培养膜封口，接入一级种子5mL (m、 H2、 H46>D475 值分别为0.199， 0.210， 0.187)，置摇床上30°C160r.min—1培养，并在 接种的第O， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取样，每次取2瓶，测Cw醛)和菌丝干重值，H4培养基里有葡萄糖的处理，加测C愤萄糖)，并带 只加葡萄糖不加菌的培养基空白。O"值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU:1800型紫外可见分光光度计，取样后7000X离心 15min、过滤，滤液用来测量C伸瞎)和C 用AHMT分光光度法检测，CV葡萄糖)用蒽酮比色法检测，滤纸和菌一起转入已称至 恒重的烧杯中测菌丝干重。结果以实际测量数据为准，并取其平均值 作图。绿色木霉H1在5种不同的碳源里都能有效的降解甲酸，在处理 0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麦芽糖、0.1%甲醛+10%淀粉、 0.1%甲醛+10%葡萄糖中，CV甲醛)分别从1231、 1204、 1194、 1229mg'L—1 下降到1.80、 2.70、 3.60、 5.10mg争L1 (图8)，降解率分别为99.9、 99,8、 99.7、 99.6%， 96h内，C(甲腔)下降迅速，菌丝增长较慢，96h 后，菌丝干重增长较快，但C(鴨)下降缓慢。绿色木霉m在5种不同的碳源里都能有效的降解甲醛(图8)，在处理0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麦芽糖、0.1%甲醛+10% 淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖中，降解甲醛速率相差不大，在144h甲 醛从1200mg'L—1左右降到10 mg'L"以下，前期48h以前C (甲酸)下降稍慢，菌丝干重上升也慢(图9) ， 96h后C押酸)和菌丝干重进入快 速变化阶段，4个碳源组合没有明显的优劣势。在只有甲醛作为碳源的处理中，144hC押薛)从1236mg'L-l左右 降到142mg'L-l， 96h后下降速度稍快，变化趋势也是先慢后快，菌 丝干重增长缓慢，没有出现快速增长期。所以绿色木霉H1能单独利用甲醛为碳源并降解甲醛，但降解效果不如加复合碳源。葡萄糖的下降(图10)， C(葡萄糖)从13240mg'L—1下降到189mg'L—1， 减少速率是先慢后快，C从1229mg，I^下降到5.1 mg*L—\降解 速度是先快后慢。在72h前，甲醛降解曲线下降迅速，C凍萄糖)的下 降曲线相对较慢，较高浓度的甲醛对菌体繁殖有抑制作用，绿色木霉 Hl以甲醛和葡萄糖同时为碳源，且有优先利用甲醛的趋势(图11); 72h后，CV甲醛)下降缓慢，CV葡萄糖)的曲线下降得很快，当C伸醛)减少 到不足以抑制霉菌生长时，绿色木霉H1则主要以葡萄糖为碳源，菌 丝干重快速上升。
权利要求
1、绿色木霉H1在降解甲醛中的应用。
全文摘要
本发明提供绿色木霉H1在甲醛降解中的应用。关于甲醛降解菌的研究很早以前就有报道，然而大部分是关于甲醛降解细菌和甲醛降解酵母菌的研究，甲醛降解霉菌的研究报道很少，目前尚无甲醛降解菌的报道，本发明公开了已有菌株——绿色木霉H1在降解甲醛中的应用，同时提供了绿色木霉H1在降解甲醛的应用中的一系列数据，如最适生长pH、碳源和甲醛降解能力等，极大地补充了降解甲醛菌的资料库，填补了国内甲醛降解菌研究资料的空白，此外，绿色木霉H1在自然界中分布范围广，繁殖快，生长能力强，因此本发明提供的绿色木霉H1在降解甲醛中的应用，为甲醛污染的生物处理工程，提供了强有力的帮助。
文档编号A62D101/28GK101250487SQ200810027399
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月14日 优先权日2008年4月14日
发明者卢普相, 周建民, 孙翠香, 陈能场, 黄赛花 申请人:广东省生态环境与土壤研究所