专利名称：一种降解联苯菊酯的菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于化学农药生物降解技术领域，涉及一株对联苯菊酯具高效降解能力的 菌株及其应用，用于联苯菊酯的生物降解，以及该农药污染的水体，土壤以及农产品的生物 修复和生物净化。
背景技术：
拟除虫菊酯是目前使用量仅次于有机磷的一类杀虫剂，为杀虫剂中的第二大类， 约占世界杀虫剂市场的20%，在我国的施用面积已占杀虫剂总施用面积的1/3以上。近年 来，农药中毒事件及职业性中毒病例逐年增加。曾一度被人们认为低毒、使用安全的拟除虫 菊酯类农药，近年来相关研究表明，此类农药有蓄积毒性，人长期接触会引起慢性疾病，有 致癌、致畸、致突变的危险；另外对鱼类，蛘类等水生生物有很高的毒性。联苯菊酯和其他拟除虫菊酯类农药一样，残留在作物上然能引起人畜中毒，严重 危害人的健康。世界各国及组织(美国、欧盟、国际食品法典委员会(CAC)等)都对联苯菊 酯制定了严格的限量标准。由于联苯菊酯对光，热稳定，在环境中的半衰期较长，在自然环境下难分解，因此 用微生物降解自然环境和农产品中的农药具有重要意义，特别是针对应用广泛的联苯菊酯 农药的高效降解菌株，其应用价值和经济效益更为明显。
发明内容
本发明目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株对联苯菊酯具有高 效降解能力菌株。该菌株对联苯菊酯具有高效降解能力，达80%以上。本发明的另一目的 在于提供应用本发明菌株降解联苯菊酯农药的应用方法。本发明的技术方案概述如下本发明提供一株对联苯菊酯具有高效降解能力的降解菌株，该菌株为枯草芽孢杆 菌(Bacillus Subtilis)的菌株 LBKl ；所述菌株的 16SrDNA 序列为 SEQ ID :N0. 1。所述的菌株的应用，该菌株用于联苯菊酯农药的生物降解。所述的菌株的应用，降解组合条件为温度25°C -35 PH = 6-8,接种量 3% -10%，装液量 25-100ml。所述的菌株的应用，降解组合条件为温度30°C，PH = 7，接种量10%，装液量 50ml。该菌株生物学特性革兰氏阳性，周生鞭毛，杆状，菌落呈乳白色圆点且表面光滑， 接触酶、产H2S反应阳性；不能利用葡萄糖，不能水解淀粉。可以以联苯菊酯为唯一碳源。该 菌株在4°C 40°C，pH 4.0 8.0范围内均可生长。但是最适生长温度为30°C，最适生长 PH为7.0。该菌株对农药的耐受浓度为0.6mg/L，最适生长农药浓度为0. lmg/L。该菌株在 72h内对联苯菊酯的降解率可达80%以上。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。菌株的分离与筛选土样采集与浙江省某农药厂。所用培养基为=LB培养基(g/L)蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g, Nac 15. Ogo基础盐培养基(g/L)NaCl 1. 0g, NH4NO3L 0g, K2HPO4L 5g, KH2PO4O. 5g, MgSO4 · 7Η200· lg，FeSO4 · 7Η20 0. Olg，蒸 lOOOmL，调 ρΗ7· 0 左右。固体培养基向液体培养 基中加2%的琼脂。在无菌条件下向已装有100ml基础盐培养基的250ml锥形瓶中加入IOg污泥，内 含50mg/L联苯菊酯。于30°C，180r/min震荡培养7d后，按10%的接种量转接到含IOOmg/ L联苯菊酯的基础盐培养基里，同样条件培养7d。以后每7d按10%接种量进行驯化培养， 联苯菊酯浓度每次增加50mg/L。直到提高联苯菊酯浓度为400mg/L后，将培养液涂布在基 础盐固体培养基上，选取生长快，菌落规则，传代稳定的单菌落，划线培养3次后制成斜面， 保存于冰箱待用。菌株生化鉴定表1 LBKl菌株生理生化测定结果
测定项目Test Items结果Results
革兰氏染色+
淀粉水解试验-
接触酶试验+葡萄糖氧化发酵试验-
产H2S试验+
甲基红试验-
V-P实验-
明胶液化试验-菌株分子鉴定LBKl菌株经16SrDNA测定，获得如下序列SEQ ID :N0. 1 TGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCT TCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTG CCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTT GCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA CGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGC
4TCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAA TGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT ATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTT CCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAAT AATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTA CCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATC ACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGG CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCA CCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCA AACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACC CGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCA测序结果在NCBI的GeneBank里进行Blust比对，其结果与Bacillus Subtilis strain BEF5314同源性达到98%，因此LBKl在分子分类上鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)ο菌株的生物降解作用该菌的用途是降解联苯菊酯农药，适用于农药污染的水体、土壤及农产品的生物 修复或生物净化。种子液的制备将LBKl菌株在无菌操作条件下用接种环挑取一环接种于50ml LB 液体培养基中，于30°C、摇床120r/min培养48h。然后在4000r/min条件下离心IOmin收 集菌体，并用IOml的0. 02mol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤2次，再用同一缓冲液制成菌悬 液并调整菌体浓度使其0D600在1. 5左右，备用。LBKl对联苯菊酯的降解率的初步测定实验在基础盐液体培养基中添加联苯菊 酯标准溶液，使其浓度为200mg/L，总体系为50mL，按5%的接种量将种子液接入基础盐培 养液中，30°C，180r/min摇床培养。以不接菌的培养液为空白对照，每个处理设3个平行。LBKl对不同浓度联苯菊酯的降解在基础盐培养基中添加联苯菊酯标准溶液，使 其浓度分别为100、200、300、400mg/L，以5%的接种量接入LBK1，于30°C、180r/min的条件 下摇床培养。LBKl正交优化试验本实验考察温度、PH值、接种量和装液量四个因素对LBKl降解联苯菊酯的影响。 采用四因素三水平正交实验方案，根据L9(34)正交表，进行正交试验。运用SPSS软件对各 因素的影响程度进行评估，并给出最佳组合条件。最佳条件为A2B2C3D2即温度30°C，PH = 7，接种量10%，装液量50ml，在此条件下降解率可达95. 92%。测定结果如下表2 LBKl对联苯菊酯的降解
菌株初始浓度 (mg/L)培养时间(h)1224487296120CK200190.9188.6184.5184.5180.2180.2LBKl200166.1123.685.969.845.841.2 表3 LBKl对不同浓度联苯菊酯的降解
起始浓度 (mg/L)培养时间(h)24h48h72h96h120h10054.636.321.317.416.1200119.687.455.249.746.0300219.5168.6133.3116.8102.0400333.6305.1278.7254.5246.1 表4正交优化试验
因素温度PH接种量装液暈实验结果编号(A) °C(B)(C) %(D) ml降解率(％)125632584.29
权利要求
一种降解联苯菊酯的菌株，其特征在于，该菌株为枯草芽孢杆菌属的LBK1菌株；所述菌株的16SrDNA序列为SEQ IDNO.1。
2.根据权利要求1所述的菌株的应用，该菌株用于联苯菊酯农药的生物降解。
3.根据权利要求2所述的菌株的应用，其特征在于，降解组合条件为温度 250C -35°C, PH = 6-8，接种量 3% _10%，装液量 25-100ml。
4.根据权利要求3所述的菌株的应用，其特征在于，降解组合条件为温度30°C，PH= 7，接种量10%，装液量50ml。
全文摘要
本发明公开了一株对联苯菊酯高效降解的菌株及其用途。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)LBK1菌株，菌株生物学特性革兰氏阳性，周生鞭毛，杆状，菌落呈乳白色圆点且表面光滑，接触酶、产H2S反应阳性；葡萄糖氧化发酵反应、V.P.反应、M.R.反应、明胶液化反应为阴性；不能水解淀粉。菌株对联苯菊酯的降解率达80％以上。该菌株可以用于农药的生物降解，以及农药污染的水体，土壤以及农产品的生物修复或生物净化。
文档编号A62D3/02GK101967459SQ201010513259
公开日2011年2月9日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者冯贵颖, 呼世斌, 孔洁, 景岳龙, 朱凤晓 申请人:西北农林科技大学