专利名称：一株降解二氯甲烷的甲基细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株降解二氯甲烷的甲基细菌。
背景技术：
二氯甲烷，CH2Cl2，为无色液体，在制药工业中做反应介质，用于制备氨苄青霉素、 羟苄青霉素和先锋霉素等；还用作胶片生产中的溶剂、脱脂剂，气烟雾喷射剂、聚氨酯发泡剂等。二氯甲烷在中国用于胶片生产的消费量占总消费量的50%，医药方面占总消费量的 20%，清洗剂及化工行业消费量占总消费量的20%，其他方面占10%。二氯甲烷有麻醉作用，主要损害中枢神经和呼吸系统。人类接触的主要途径是吸入。据估计，在二氯甲烷的世界产量中，大约80%被释放到大气中去，但是由于该化合物光解的速率很快，使之不可能在大气中蓄积。其初始降解产物为光气和一氧化碳，因此二氯甲烷被认为是大气污染中毒性较大的卤代烃类物质，其广泛使用带来一系列环境污染问题， 严重危机人类健康，并且破坏臭氧层。自从1980年Rittman等首次从工业废水中分离出能以二氯甲烧作为唯一碳源和能源的甲基杆菌(Methylobacterium sp.)迄今为止包括假单胞菌、丝微菌在内10多株分解二氯甲烷的细菌中，有关甲基细菌(Methylobacter sp.)以二氯甲烷作为碳源与能源的生物降解国内未见报道。
发明内容
本发明提供一株甲基细菌(Methylobacter sp.)菌株,可高效降解二氯甲烧,可在有氧条件下降解二氯甲烷，为以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要基础。本发明降解二氯甲烧的甲基细菌为甲基细菌(Methylobacter sp. )Met26,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年I月4日，保藏号为CGMCC No. 5693;本发明甲基细菌 Met26为革兰氏阴性菌，短杆状，细胞大小为(O. 33 μ m O. 4 μ m) X (O. 39 μ m O. 46 μ m)， 无芽孢、无鞭毛；在1匪5培养基上28°C培养10d，菌落直径O. 5-lmm,圆形，透明，边缘整齐， 表面光滑。本发明甲基细菌Met26可在MNMS培养基上生长，最适生长温度为28°C，最适生长环境pH为6. 8。本发明的甲基细菌(Methylobacter sp. )Met26通过16S rDNA序列比对分析，与甲基细菌属(Methylobacter sp.)的亲缘关系最为接近,保守区相似性为99%。通过结合菌体形态特征、生长条件确定甲基细菌Met26为甲基细菌属(Methylobacter sp.)的一株新菌株，命名为甲基细菌Met26。本发明甲基细菌Met26能够高效降解二氯甲烷，甲基细菌Met26在以二氯甲烷为唯一碳源、二氯甲烷终浓度为30mmol/L的培养基中，培养IOd后二氯甲烷浓度下降63. 5 %，15d后二氯甲烷浓度下降78.6%。本发明的甲基细菌(Methylobacter sp. )Met26,属于甲基细菌属(Methylobacter sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年I月4日，保藏号为CGMCC No. 5693。
图I为甲基细菌Met26和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式降解二氯甲烷的甲基细菌为甲基细菌 (Methylobacter sp. )Met26,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年I月4日，保藏号为 CGMCC No. 5693。本实施方式甲基细菌Met26为革兰氏阴性菌，短杆状，细胞大小为(O. 33 μ m O. 4 μ m) X (O. 39 μ m O. 46 μ m)，无芽孢、无鞭毛；在MNMS培养基上28°C培养10d，菌落直径O. 5-lmm，圆形，透明，边缘整齐，表面光滑。本实施方式甲基细菌Met26可在MNMS培养基上生长，最适生长温度为28°C，最适生长环境pH为6. 8。
具体实施方式
二本实施方式甲基细菌(Methylobacter sp. )Met26由2010年8 月份采集于双鸭山宝山区新阳煤矿的600m煤层夹心岩中筛选得到。筛选按以下步骤进行 称取已晾干、粉碎好的夹心岩样品10. 0g，装入加有玻璃珠无菌水的三角瓶中，浸泡30min 后,在180r/min的振荡器上振荡30mim,然后静止,取悬池液在10000r/min离心10_15min, 静止备用。用2. 5ml医用注射器取Iml上清液加入到100ml MNMS液体培养基中，再通入 IOOml甲烷气体，每隔2-3天加一次甲烷气体，每次50-100ml。摇床培养120r/min 28°C培养9-15天，以发酵液浑浊，为第一次富集培养完成。再从第一次富集培养液中取Iml进行第二次富集培养，方法同上。连续富集培养不少于3次。得到单一纯菌后保藏，对初筛菌株进行二氯甲烷利用能力测定，在MNMS固体培养基上以二氯甲烷为唯一碳源和能源，提供纯净空气方法进行选择性培养，挑选单菌落，转接MNMS培养基，上摇床通过检测降解效率进行复筛，得到对二氯甲烷具有高效降解能力菌株甲基细菌Met26。MNMS培养基由I. 0g/L的磷酸二氢钾、2. 9g/L的十二水磷酸氢二钠、0. 32g/L的七水硫酸镁、3. 0g/L的硫酸二铵、IOmL微量元素溶液和990mL蒸馏水组成，pH值为6. 8。其中微量元素溶液组成(mg/L)如下0. 287mg/L七水硫酸锌、0. 223mg/L七水硫酸锰、0. 062mg/ L硼酸，0. 048mg/L 二水钥酸钠、0. 048mg/L六水三氯化钴、0. 083mg/L碘化钾、3. 5mg/L 二水氯化钙和蒸馏水组成。MNMS固体培养基由I. 0g/L的磷酸二氢钾、2. 9g/L的十二水磷酸氢二钠、0. 32g/ L的七水硫酸镁、3. 0g/L的硫酸二铵、IOmL微量元素溶液和990mL蒸馏水组成，pH值为6.8。其中微量元素溶液组成(mg/L)如下0. 287mg/L七水硫酸锌、O. 223mg/L七水硫酸锰、O. 062mg/L硼酸，O. 048mg/L 二水钥酸钠、O. 048mg/L六水三氯化钴、O. 083mg/L碘化钾、
3.5mg/L 二水氯化钙、琼脂和蒸馏水组成,其中琼脂的质量浓度为2%。对筛选得到的甲基细菌Met26进行分子鉴定，按以下步骤进行提取菌株的总 DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。甲基细菌(Methylobactersp. )Met26 的 16SrDNA 序列长度为 1498bp,其序列如 SEQ ID NO :I所示，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图I所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与甲基细菌属(Methylobacter sp.)的亲缘关系最为接近，保守区相似性为99 %。命名为甲基细菌Met26。通过结合菌体形态特征、生长条件确定甲基细菌Met26为甲基细菌属 (Methylobacter sp.)的一株新菌株,命名为甲基细菌Met26。对本实施方式甲基细菌Met26降解二氯甲烷的降解率进行测定，具体方法如下取106cfu/ml的菌悬液1ml，加入IOOmlMNMS培养基中摇床培养，以二氯甲烷为唯一碳源的培养基，即在MNMS培养基中添加二氯甲烷，二氯甲烷终浓度为30mmol/L，分4次加入。120r/min，28°C培养。检测生物量、pH、二氯甲烷浓度变化，每12h检测一次。结果 IOd后二氯甲烷浓度下降63. 5%,15d后二氯甲烷浓度下降78. 6%。
权利要求
1. 一株降解二氯甲烷的甲基细菌，其特征在于降解二氯甲烷的甲基细菌为甲基细菌 (Methylobacter sp. )Met26,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2012年I月4日，保藏号为CGMCC No.5693。
全文摘要
一株降解二氯甲烷的甲基细菌，它涉及一株降解二氯甲烷的甲基细菌，本发明提供一株甲基细菌菌株，可高效降解二氯甲烷，可在有氧条件下降解二氯甲烷，为以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要基础。本发明降解二氯甲烷的甲基细菌为甲基细菌Met26，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年1月4日，保藏号为CGMCC No.5693。本发明甲基细菌Met26能够高效降解二氯甲烷，甲基细菌Met26在以二氯甲烷为唯一碳源、二氯甲烷终浓度为30mmol/L的培养基中，培养10d后二氯甲烷浓度下降63.5％，15d后二氯甲烷浓度下降78.6％。
文档编号A62D101/22GK102586149SQ20121005155
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者吴皓琼, 曹亚彬, 殷博, 牛彦波, 甄涛, 郭立姝 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所