用漆酶使木质素解聚的方法

用漆酶使木质素解聚的方法
【专利摘要】本发明涉及使木质素解聚的方法，所述方法包括通过在至少一种溶剂中合并非酚型木质素、漆酶、氧化还原介体和氧源来使非酚型木质素氧化的步骤，由此获得包含经氧化的非酚型木质素的混合物；和通过添加氧化剂来使如此获得的经氧化的非酚型木质素解聚的步骤，所述非酚型木质素是从酚型木质素开始通过使所述酚型木质素的酚官能团官能化而获得的。
【专利说明】用漆酶使木质素解聚的方法
[0001] 本发明涉及使木质素解聚的方法。
[0002] 木质素是在纤维素之后最丰富的第二种可再生的生物聚合物，并且它们两者构成 了总生物质的超过70%。
[0003] 因此，木质素的再利用是一个重要的关键。
[0004] 在造纸工业中，作为副产品或废料而获得大量的木质素，其中仅极小部分以化学 形式进行再利用。在制糖工业中，也在从甘蔗中提取糖期间以废料的形式获得大量的木质 素。木质素主要用作粘合剂或分散剂，或者用于通过高温处理(800°C-100(TC)来制备沼气。 还存在牵涉氯化衍生物的使木质素解聚的方法，其从环境观点来看是不令人满意的。
[0005] 目前，存在很少的使用木质素作为原料来生产化学化合物的在经济上可行的方 法。
[0006] 因此，对于在经济上可行且从环境观点来看可接受的用于对木质素进行再利用的 新方法存在需要。
[0007] 本发明的目标在于提出有效的并且从环境观点来看合适的用于使木质素解聚的 新方法，其使得能够获得在各种不同的工业领域(例如，生物精炼、农产品加工或化妆品）中 可再利用的解聚产品。
[0008] 本发明的另一个目标为提出使得能够以受控的方式获得具有各种大小的解聚产 品的方法，所述解聚产品例如为3,4_二甲氧基苯甲酸（甲基化香草酸）、藜芦醛（甲基化香草 醛）、藜芦醚（甲基化愈创木酚)或甲基化二甲酰基愈创木酚。
[0009] 本发明的方法提出顺次地将酶的作用与氧化剂的作用相组合。
[0010] 更具体而言，本发明涉及使木质素解聚的方法，所述方法包括：
[0011] -通过在至少一种溶剂中合并非酚型木质素、漆酶、氧化还原介体和氧源来使非酚 型木质素氧化的步骤，由此获得包含经氧化的非酚型木质素的混合物，和
[0012] -通过添加氧化剂来使如此获得的经氧化的非酚型木质素解聚的步骤，
[0013] 所述非酚型木质素是从酚型木质素开始通过使所述酚型木质素的酚官能团官能 化而获得的。
[0014] 本发明的方法是非微生物学的，就不使用内源性地表达漆酶的微生物(例如真菌） 这一意义而言。
[0015] 发明人已令人惊讶地观察到，在氧化还原介体和氧源存在下漆酶对于非酚型木质 素的作用，以及随后的氧化剂的添加，具有有效地使木质素的结构解聚的效应。
[0016] 在该方法的第一个步骤(氧化步骤)期间，在所述非酚型木质素的苄基位置处的羟 基官能团被氧化为酮官能团。在该步骤期间，木质素的聚合结构未被片段化并且几乎没有 任何C-C键被切割。
[0017] 在该方法的第二个步骤(解聚步骤，也称为片段化步骤)期间，木质素的聚合结构 的C-C键被打断。在并不希望被束缚于特定理论的情况下，如此被打断的C-C键是位于在该 方法的第一个步骤期间形成的酮官能团附近的那些。
[0018] 本发明的方法可以用下面的举例说明性的流程来表示：
[0019]
[0020] 其中基团-OR表示所述非酚型木质素的经官能化的酚官能团，并且基团-R'表示所 示苯基基团的可能的另一个取代基(不同于酚官能团）。基团-R'的存在、数目和类型取决于 所使用的木质素。它可以例如为一个或多个甲氧基基团。
[0021] 上面的流程纯粹是举例说明性的，并且仅示意性地反映了木质素的结构。
[0022] 正如这将会在下文中进行阐述的，所述方法的两个步骤有利地在同一个反应器中 彼此相继地进行。
[0023] 本发明的方法的步骤的反应条件将会在下文中进行描述。
[0024] 通常，在本申请的范围内，"反应介质"是指这样的介质，在其中发生所述方法的步 骤，并且其包含木质素衍生物、漆酶、氧化还原介体、氧源、至少一种溶剂和可选地氧化剂 (根据它是否已经加入）。
[0025] 因此，"合并"是指将试剂添加到反应介质中。
[0026] 所述反应介质还可以包含其他试剂，正如它们在本申请中进行了描述那样。
[0027] 现在将描述在所述方法中所使用的原料，即非酚型木质素。
[0028] 非酚型木质素
[0029] "非酚型木质素"是指酚型木质素的衍生物，其是酚型木质素(也简单地称为"木质 素"）的酚官能团(Ph-ΟΗ)的官能化的反应产物。
[0030] 非酚型木质素是经修饰或经官能化的木质素，其中至少一个酚官能团被修饰。优 选地，木质素的酸官能团的至少50%，甚至至少60%，甚至至少70%，甚至至少80%，甚至至 少90%，甚至至少95%，甚至至少99%被修饰。
[0031 ] 非酸型木质素的一种类型尤其描述在Srebotnik等人（Journal of Biotechnology 81 (2000)，179-188)中。
[0032] 优选地，非酚型木质素不包含游离的(未官能化的)酚官能团。
[0033] 通过在所述方法的氧化步骤期间酚型木质素与能够将所述酚型木质素的酚官能 团转化为非反应性官能团的官能化试剂进行反应来获得非酚型木质素。木质素的官能化的 目的在于在所述方法的氧化步骤期间保护酚官能团并阻止其发生反应。因此，非酚型木质 素的经官能化的酚官能团在通过漆酶进行的氧化步骤期间不是反应性的。
[0034] 在本发明的范围内，"木质素的官能化"是指酚官能团的选择性官能化，即木质素 的其他羟基官能团（特别地，脂族醇)不被官能化。优选地，所述官能化是完全的，即所有酚 官能团都被官能化。
[0035] 发明人已发现，通过按照本发明的方法来使用酚型木质素，改善了木质素的解聚。
[0036] 烷基化是适合于实施所述方法的官能化的例子。为此，使用烷基化试剂作为官能 化试剂。
[0037] 根据一个实施方案，可以使用经烷基化的木质素作为非酚型木质素。
[0038] "经烷基化的木质素"是指这样的非酚型木质素，在其中酚官能团被烷基(典型地， Cl-Cl2烷基)官能化从而广生烷氧基官能团。
[0039] 优选地，所述经烷基化的木质素不包含游离的酚官能团，即它们全部（或几乎全 部)处于烷氧基官能团的形式。
[0040] 根据一个有利的实施方案，可以使用经甲基化的木质素作为非酚型木质素。
[0041 ]为此使用甲基化试剂作为官能化试剂。
[0042] "经甲基化的木质素"是指这样的经烷基化的木质素，在其中酚官能团被甲基官能 化从而产生甲氧基官能团。
[0043] 优选地，所述经甲基化的木质素不包含游离的酚官能团，即它们全部（或几乎全 部)处于甲氧基官能团的形式。
[0044] 在使酚型木质素官能化之后，为了控制官能化的比率和官能化的选择性，可以通 过31P NMR来定量可能剩余的酚官能团（其因此还未被官能化)的量。方法尤其描述在Granat 等人 J.Agric.Food Chem. ,1995,43(6) ,1538-1544中。
[0045] 根据一个实施方案，所述非酚型木质素为通过在碱性水溶液中合并酚型木质素和 烷基化试剂而获得的经烷基化的木质素。
[0046] 在本发明的范围内，烷基化试剂为这样的化合物，所述化合物能够通过烷基基团 来使酚官能团官能化，其中用烷基基团取代所述酚官能团的氢原子(从而产生烷氧基官能 团）。
[0047] 优选地，使用使得能够选择性地使木质素的酚官能团烷基化的烷基化试剂，即木 质素的其他羟基官能团(特别是仲醇)不被烷基化为烷氧基官能团。
[0048] 优选地，使用使得能够使木质素的酚官能团完全烷基化的烷基化试剂，即所有的 (或几乎所有的)木质素的酚官能团都被烷基化为烷氧基官能团。
[0049] 根据一个有利的实施方案，所述非酚型木质素为经甲基化的木质素，其优选地通 过在碱性水溶液中合并木质素和甲基化试剂来获得。
[0050] 在本发明的范围内，甲基化试剂为这样的化合物，所述化合物能够通过甲基基团 来使酚官能团官能化，其中用甲基基团取代所述酚官能团的氢原子。
[0051] 优选地，使用使得能够选择性地使木质素的酚官能团甲基化的甲基化试剂，即木 质素的其他羟基官能团(特别是仲醇)不被甲基化为甲氧基官能团。
[0052] 典型地，甲基化试剂的合并逐滴地进行。
[0053]典型地，在所述合并之后接着是在典型地50°C至100°C的温度下加热反应介质的 步骤。
[0054]作为甲基化试剂，可以提及硫酸二甲酯、碳酸二甲酯(DMC)、碘代甲烷和重氮甲烷。
[0055] 优选地，使用硫酸二甲酯，其使得能够完全地和选择性地使酚型木质素的酚官能 团甲基化。
[0056] 典型地，木质素的甲基化的步骤可以按照在Sadeghifar等人， Ind. Eng. Chem. Res .2012,51，16713-16720 中所描述的方法来进行。
[0057] 将木质素溶解在碱性水溶液中，典型地在氢氧化钠水溶液(例如0.7M)中。搅拌所 获得的混合物，典型地在环境温度下，并且添加甲基化试剂，优选地逐滴地(按照相对于酚 官能团的当量数而言大约50当量的甲基化试剂）。典型地，加热混合物(例如至80 °C)直至试 剂被消耗。然后，使混合物酸化、过滤，并且将所获得的固体用蒸馏水进行洗涤并进行干燥 从而提供经甲基化的木质素。
[0058]在并不希望被束缚于特定理论的情况下，发明人观察到，木质素的甲基化通过选 择性地和完全地封闭酚官能团而使得能够在漆酶作用期间非常有效地避免木质素的聚合 反应，并因此改善解聚。
[0059] 甲基化的效应尤其在下面所描述的比较实施例中进行举例说明。通过本发明的方 法进行处理的非酚型(未甲基化的)木质素不被解聚。
[0060] 酚型木质素
[0061 ]在本发明的范围内，"酚型木质素"或"木质素"是指木质素的天然形式，其包含游 离的酚官能团(Ph-〇H)。
[0062] 木质素的结构呈现为复杂的三维网格形式，其源自具有苯丙烷基元作为骨架的基 本单元的聚合。因此，木质素更通常地被称为"一些"木质素，根据构成其的基本单元。在木 质素的基本单元(也称为单体木素醇(monolignol))之中，可以主要提及对香豆醇、松柏醇 和芥子醇。
[0063] 在本发明的范围内，"解聚"是指这样的反应，在其过程中木质素的聚合结构的共 价键被打断，从而导致具有小于起始木质素的大小的解聚产物。
[0064] "小于......的大小"是指，按照本发明的方法而获得的解聚产物具有小于起始非 酸型木质素的分子量的分子量。
[0065] 然而，在本发明的范围内，术语"解聚"的含义不应当局限于非酚型木质素向上面 所描述的基本单元的转变。
[0066] 典型地，按照本发明的方法而获得的木质素的解聚产物由一个基本单元、几个基 本单元、甚至几十个基本单元形成。通常，获得解聚产物的混合物，其包含不同数目的基本 单元。
[0067]通常，考虑到木质素的复杂结构，本发明的方法提供了具有各种大小和结构的解 聚产物的混合物，所述解聚产物可以携带各种不同的官能团，例如酮基团、醛基团、酸基团、 酚基团、醇基团或甲氧基基团，优选地酸基团、甲氧基基团、醇基团和酮基团。
[0068]可以将所述解聚产物定义为非酚型木质素的"单体"、"低聚物"或"片段"。
[0069]因此，"解聚方法"也是指木质素结构的"片段化方法"。
[0070] 按照本发明的方法而获得的解聚产物具有在100g/mol和5000g/mol之间，优选地 在150g/mol和4000g/mol之间，有利地在200g/mol和3000g/mol之间，优选地在500g/mol和 2500g/mol之间的大小。
[0071] 典型地，木质素的解聚产物的混合物通过其平均分子量Mw来进行表征，其表示通 过每种产物的质量进行加权的分子量平均值，并且其具有下述公式：
[0072]
[0073] 其中m表不产物i的数目，和Mi表不产物i的分子量。
[0074]对于按照本发明的方法而获得的解聚产物的混合物，平均分子量Mw可以通过空间 排阻色谱法(SEC:大小排阻色谱法)来进行测量。
[0075] 典型地，解聚产物的混合物具有在100g/mol和5000g/mol之间，优选地在150g/mol 和4000g/mol之间，有利地在200g/mol和3000g/mol之间，优选地在500g/mol和2500g/mol之 间的平均分子量Mw。
[0076] 按照本发明的方法而获得的解聚产物的混合物还可以通过所述混合物的质均分 子量Mw与起始木质素的质均分子量Mug之间的摩尔比来进行表征。
[0077] 典型地，通过使用本发明的方法，获得了在1/3和1/10之间的Mw/Mlls#尔比。
[0078] 在本发明的方法中充当原料的非酚型木质素可以从任何可得的酚型木质素来源 (不论其是商业的，还是从富含木质素的工业残留物中提取的)开始通过任何本身已知的官 能化方法(烷基化、甲基化、...）来获得。
[0079] 作为酚型木质素的来源，可以使用下面所描述的木质素，优选地牛皮纸木质素(例 如源自黑液的），其任选地是经纯化的，或者甘蔗渣木质素，或者任何其他工业木质素。 [0080] 在本发明的范围内可使用的木质素尤其描述在Lignins and Lignans:Advances in Chemistry,Cyril Heitne,John Schmidt,CRC Press,Taylor&Francis Group,2010中。
[0081] 有利地，使木质素经历预处理以便使其在水性介质中可溶。
[0082] 作为酚型木质素，可以使用牛皮纸木质素，例如从黑液中提取的。
[0083]牛皮纸木质素（也称为硫代木质素）是源自通过使用硫酸根离子的纸浆的工业生 产的水溶性化合物。
[0084] 典型地，在本发明的方法中可使用的牛皮纸木质素通过对黑液进行提取来获得， 所述黑液是源自牛皮纸制造的蒸煮液。它是由从纸浆中溶解出的木质素和半纤维素残留物 以及其他无机化学化合物(溶解的盐)组成的水溶液。
[0085] 典型地，黑液的纯化如下来进行。使黑液酸化以沉淀木质素。将所获得的固体离 心、分离和用乙醇提取。回收液体级分，并通过蒸发乙醇来进行浓缩。将残留物用酸性溶液 进行洗涤以去除残留的盐。如此获得牛皮纸木质素。
[0086] 可以如下地进一步纯化从黑液中提取出的牛皮纸木质素以去除杂质（典型地，单 酚化合物和降解残留物）。将牛皮纸木质素与四氢呋喃合并，过滤所获得的混合物以去除固 体，通过蒸发溶剂来浓缩滤液，然后用二乙醚来洗涤所获得的固体以去除有机杂质例如单 酚化合物(香草醛、香草酸、...）和降解残留物。使所回收的固体干燥，从而产生经纯化的牛 皮纸木质素。
[0087] 作为酚型木质素，还可以使用源自甘蔗渣的木质素。
[0088] 甘蔗渣是在糖提取后获得的甘蔗的纤维性残留物。它构成了制糖工业的重要的废 料，其没有被足够地再利用。甘蔗渣木质素是商购可得的(Solvay)。
[0089] 还可以使用工业木质素来源，或者包含木质素的化合物的混合物，典型地包含木 质素和其他成分(例如纤维素和/或半纤维素）的生物质的混合物，或者牛皮纸木质素的混 合物。
[0090] 典型地，在本发明的方法中所使用的木质素具有在1000g/mol和10000g/mol之间， 优选地在l〇〇〇g/mol和5000g/mol之间的质均分子量(Mi ig)。
[0091] 起始木质素的质均分子量(Mug)表示通过每种木质素大小的质量进行加权的分子 量平均值，并且具有下述公式：
[0092]
[0093]其中nj表不具有大小j的木质素的分子数目，和Mj表不具有大小j的木质素的分子 量。
[0094]该值通常由木质素的供应商指明，或者可以通过如在上面所描述的空间排阻色谱 法测量来测定。
[0095]现在将描述本发明的方法的步骤。
[0096] 通过漆酶进行氧化的步骤
[0097] 本发明的方法的第一个步骤在于在至少一种溶剂中合并上面所描述的非酚型木 质素、漆酶、氧化还原介体和氧源。
[0098] 该步骤导致在氧源存在下通过"漆酶/介体"系统的作用来氧化非酚型木质素，由 此获得包含经氧化的非酚型木质素的混合物。
[0099] "经氧化的非酚型木质素"是指在上面所定义的非酚型木质素，其中在苄基位置处 的羟基官能团已被选择性地转化为酮官能团。
[0100] 在该步骤期间，非酚型木质素基本上不被解聚，即该步骤不(或非常少地)影响木 质素的聚合结构，特别地它不(或非常少地)打断C-C键。
[0101] SB
[0102] 漆酶(EC 1.10.3.2)是在众多植物、真菌和微生物中被发现的酶家族。
[0103] 在体内，漆酶具有氧化活性并且在酶促氧化过程之中作为催化剂起作用。
[0104] 在本发明的方法中可使用的漆酶可以源自植物、真菌或微生物。源自真菌的漆酶 尤其包括下列属的漆酶：曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)(例如，粗糙脉胞菌 (Neurospora crassa))、柄孢壳属（Podospora)、葡萄孢属（Botrytis)、金钱菌属 (Collybia)、层孔菌属（Fomes)、香燕属（Lentinus)、侧耳属（Pleurotus)、栓菌属 (Trametes)(例如，绒毛检菌（Trametes villosa)和变色检菌（Trametes versicolor))、丝 核菌属（Rhizoctonia)(例如，立枯丝核菌（Rhizoctonia solani))、鬼伞属（Coprinus)(例 如，灰盖鬼伞(Coprinus cinereus )、毛头鬼伞（Coprinus comatus)、费赖斯鬼伞(Coprinus friesii)和糟纹鬼伞(Coprinus plicatilis))、小脆柄燕属(？83也7代11&)(例如，黄盖小 脆柄燕（？83七117^113(3011(1611631^))、斑糟燕属（？31^6〇1118)(例如，蝶形斑糟燕 (Panaeolus papilionaceus))、毁丝霉属（Myceliophthora)(例如，嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila))、节格抱属（Schytalidium)(例如，嗜热节格抱 (Schytalidium thermophilum))、多孔菌属（Polyporus)(例如，Polyporus pinsitus)、射 脉菌属(Phlebia)(例如，射脉菌(Phlebia radiata))、密孔菌属(Pycnoporus)(例如，朱红 密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus))或革盖菌属(Coriolus)(例如，毛革盖菌(Coriolus hirsutus))。源自细菌的漆酶例如源自芽孢杆菌属(Bacillus)。
[0105] 优选地，使用由Sigma Aldrich销售的源自变色栓菌的漆酶。
[0106] 所合并的漆酶的量（以mg表示)与在反应介质中存在的非酚型木质素的起始量（以 克表示）的比例通常在0.1/1和5/1之间。
[0107] 在其体外使用的情形下，对于由体积大的分子(典型地，具有大于5000g/mo 1的分 子量)构成的底物的氧化，通常将漆酶与"氧化还原介体"相联合，后者是作为在漆酶分子与 待氧化的底物分子之间的氧化还原中间物起作用的、具有小的大小（典型地，具有低于 1000g/mol的分子量）的化学化合物。氧化还原介体尤其描述在Bourbonnais R.Appl.Enviro.Microbiol·1995,61，1876-1880中。
[0108] 氧化还原介体也称为电子转移试剂，因为它们促进在漆酶与待氧化的底物之间的 电子转移。
[0109] 氧化还原中介的原理是本身已知的技术。
[0110] 在用漆酶来处理木质素的情形下，在氧化还原介体不存在下，不利于漆酶(其是具 有大的大小的蛋白质）与木质素分子(其是具有大的大小的聚合物)之间的化学相互作用。 因此，添加氧化还原介体以便加速由漆酶所催化的酶促氧化过程。
[0111 ]所合并的氧化还原介体的量（以mmo 1表示）与所合并的漆酶的量（以mg表示）的比 例通常在1/1和1/50之间。
[0112] 优选地，按照本发明的方法所使用的氧化还原介体为2,2_连氮基-双-(3-乙基苯 并噻唑啉-6-磺酸）(ABTS)。
[0113] 该介体特别适合于用漆酶来氧化木质素。
[0114] 与其他氧化还原介体(例如，在漆酶存在下快速降解从而丧失其介体活性的羟基 苯并三唑(H0Bt)(H0Bt由于失去氧原子而变成HBt))相反，ABTS作为氧化还原介体具有更好 的活性。
[0115]下面的氧化还原介体也适合于本发明的实施:紫尿酸、羟基邻氨基苯甲酸、TEMPO、 N-羟基苯邻二甲酰亚胺(Chakar等人Can · J · Chem · 82:344- 352 (2004))。
[0116]麵
[0117] "氧源"是指能够使在上面所提及的酶促氧化过程的范围内所牵涉的漆酶的活性 位点再生(再氧化)的试剂，所述酶促氧化过程从非酚型木质素开始最后提供经氧化的非酚 型木质素。"氧"在此是指双氧(〇2)。
[0118]优选地，所述氧源为包含氧的气体，例如空气或纯氧。
[0119]作为氧源，可以提及纯氧(02)，其通过在大气压力下或在几个巴的压力下鼓吹入 在氧化步骤开始时包含非酚型木质素、漆酶、氧化还原介体和至少一种溶剂的反应介质中 来合并。如此，达到有利地使反应介质在溶解氧方面饱和。
[0120]作为氧源，还可以提及空气或者任何富含氧的气体混合物。
[0121] "氧源的合并"是指将所述氧源引入到本发明的方法的反应介质中。所述合并可以 按时地或延时地，优选地延时地进行，其中所寻求的目标是使反应介质在溶解氧方面饱和。
[0122] 备选地，代替氧源，可以使用任何能够使在上面所描述的酶促氧化过程中所牵涉 的漆酶的活性位点再生(再氧化)的氧化剂。
[0123] 所述方法的第一个步骤有利地在对于所使用的漆酶的反应性来说合适的pH和温 度条件下，即在不使漆酶的特性变性的pH和温度条件下进行。
[0124] 优选地，本发明的方法的第一个步骤在酸性介质中，典型地在pH = 4的缓冲液中进 行。
[0125] 优选地，本发明的方法的第一个步骤在处于20°C和60°C之间，优选地大约40°C的 温度下进行。
[0126] 这些条件特别适合于使用源自变色栓菌的漆酶。
[0127] 将可以采用与所使用的漆酶类型相关的最佳pH和温度条件，其中这些条件对于给 定的漆酶来说通常是已知的。
[0128] 根据本发明的方法的第一个步骤在至少一种溶剂存在下进行。
[0129] 根据一个实施方案，所述溶剂为包含水和极性有机溶剂的混合物。
[0130] 优选地，所述溶剂为包含具有酸性pH(典型地，pH=4)的缓冲溶液和极性有机溶剂 的混合物。
[0131] 这样的混合物作为溶剂的使用的优点在于使非酚型木质素以及所有所合并的试 剂增溶。如此，获得其中化学相互作用受到促进的均质的反应混合物。
[0132] 根据该实施方案，所述溶剂优选地包含相对于该溶剂的总体积而言30体积％至70 体积％，有利地40体积％至60体积％的水。
[0133] 溶剂的补足部分典型地由极性有机溶剂构成，所述极性有机溶剂优选地对于通过 蒸发(任选地在减压下)来分开解聚产物来说具有足够的挥发性。
[0134] 典型地，所述溶剂为用于使漆酶增溶的水和能够使非酚型木质素增溶的醚(例如， 二0恶烧)的混合物。典型地，可以使用二0恶烷/水(1/1)的混合物。
[0135] 第一个步骤按照这样的稀释度来进行，即对于lg非酚型木质素，使用10mL至 100mL，优选地30mL至70mL，典型地50mL的溶剂体积。
[0136] 技术人员将能够根据起始非酚型木质素的溶解度、反应的温度和/或反应混合物 的粘度来调整反应介质的稀释度。
[0137] 解聚步骤
[0138] 发明人已发现，通过将源自本发明的方法的第一个步骤的经氧化的非酚型木质素 与氧化剂相合并，达到了使木质素的结构有效地解聚从而获得木质素的解聚产物。
[0139] "氧化剂"是指能够将在反应介质中存在的种类氧化的物质。优选地，所述氧化剂 是亲核性的。
[0140] 作为亲核性氧化剂，可以提及例如，过氧化物例如过氧化氢(H2〇2)和过氧化苯甲 酰，或者诸如〇3、KMn〇4和NaI〇4的化合物，或者任何在有机化学中常规使用的亲核性氧化剂。
[0141] 所述氧化剂优选地为过氧化氢(H2〇2)。
[0142] 典型地，过氧化氢是以35质量％ (这等价于大约10M的体积摩尔浓度）的水溶液的 形式可得的。
[0143] 优选地，典型地当所述氧化剂为过氧化氢时，所合并的氧化剂的量（以mol表示)与 在反应介质中存在的经氧化的非酚型木质素的量（以克表示）的比例在0.01/1和0.02/1之 间。
[0144] 所述方法的第二个步骤优选地在碱性介质中发生，尤其是当所述氧化剂为过氧化 氢时。因此，当所述方法的第一个步骤已经在具有中性或酸性pH的介质中发生时，则需要转 换成碱性介质，并且这优选地在合并氧化剂之前。为了转换成碱性介质，可以使用任何本身 已知的方法，例如将碱性水溶液(典型地，氢氧化钠水溶液)添加到反应介质中。
[0145] 所述方法的实施
[0146] 现在将描述本发明的方法的典型实施。
[0147] 典型地，在同一个反应器中相继地实施所述方法的步骤。
[0148] 备选地，可以在两个不同的反应器中分开地施行这两个步骤。
[0149] 根据一个特别的实施方案，在装备有加热系统、搅拌工具和任选地冷却系统的反 应器中，引入非酚型木质素和一部分的溶剂，并且进行搅拌直至完全溶解。然后，添加在一 部分的溶剂中的氧化还原介体的溶液，随后添加在其余的溶剂中的漆酶的溶液。
[0150] 然后，合并氧源，优选地连续地，典型地通过鼓吹入反应介质中，当所述氧源为气 体的时。
[0151] 典型地，将混合物的温度维持在20°C和60°C之间，优选地大约40°C，直至达到非酚 型木质素的完全氧化。在该阶段，所述方法的第一个步骤就完成了。
[0152] 然后，可以回收经氧化的非酚型木质素。
[0153] 备选地，可以有利地通过在同一个反应器中施行第二个步骤来继续所述方法。根 据该方式，可以通过使反应介质碱化(如果需要)来处于碱性pH中。
[0154] 然后，可以添加氧化剂，优选地连续地，典型地逐滴地，当所述氧化剂为溶液时。
[0155] 典型地，将混合物的温度维持高于70°C，典型地大约90°C。
[0156] 通过SEC(空间排阻色谱法)来追踪反应的进展。
[0157] 继续搅拌和加热反应介质直至获得所希望的解聚程度。
[0158] -旦解聚结束，就可以通过使用本领域中的常规的纯化技术（即过滤、提取、蒸馏 和/或通过色谱法分开)来回收木质素的解聚产物。尤其，可以通过蒸发来撤除溶剂，任选地 在减压下。
[0159] 现在将借助于实施例和比较实施例来举例说明本发明的方法。 实施例
[0160] 麵
[0161] 黑液（由 SMURF IT Kappa 提供的）
[0162] 硫酸二甲酯（由Sigma Aldrich销售的）
[0163] 甘蔗渣木质素（由S0LVAY提供的）
[0164] 2，2-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS)(由Sigma Aldrich销售的）
[0165] 变色栓菌的漆酶（由Sigma Aldrich销售的）
[0166] 乙酸盐缓冲液(pH=4;50mM)
[0167] 过氧化氢(35% )(由Sigma Aldrich销售的）
[0168] 实施例1 一从黑液开始提取牛皮纸木质素
[0169] 通过进行酸处理以便使牛皮纸木质素沉淀，来从蒸煮液（由SMURFIT KAPPA销售 的）中提取牛皮纸木质素。用乙醇进行的后处理使得能够去除残留的钠盐。
[0170] 将800g黑液溶解在2L蒸馏水中，并且借助于6N HC1溶液使混合物缓慢地酸化(从 pH= 13至pH= 1.5)。然后，将混合物在4000rpm下离心10分钟，回收粒状沉淀，并且用pH = 1.5的HC1溶液再次进行处理和再次进行离心（用pH=l.3的HC1重做3次）。然后，向所获得的 固体添加乙醇。在过滤后，蒸发乙醇相，并且用pH=l.5的HC1溶液洗涤残留物以去除残留的 盐。在离心后，回收粒状沉淀并冻干。获得180g牛皮纸木质素。
[0171] 从180g如此获得的牛皮纸木质素中，抽取10g，将其溶解在200mL四氢呋喃（THF) 中。在超声下搅拌30分钟后，将混合物过滤以去除在THF中不溶的白色固体沉积物。在蒸发 THF后，获得9.2g棕色固体。将该棕色固体溶解在100mL二乙醚中（Et20)中。一个级分在Et20 中仍然是不溶的（8. lg)，和将可溶的级分(0.9g)在进行甲硅烷基化以便使这些化合物成为 挥发性的之后通过GC-MS来进行分析。
[0172] 该分析证明了单酚类例如香草醛或香草酸以及糖的降解残留物的存在。不溶的级 分由经纯化的牛皮纸木质素组成，其可以在后来用于甲基化和本发明的解聚方法。
[0173] 实施例2A-牛皮纸木质素的甲基化
[0174] 将lg牛皮纸木质素溶解在20mL的0.7M NaOH溶液(0.56g)中并在环境温度下搅拌 混合物10分钟，随后缓慢地添加(逐滴地)〇. 8mL硫酸二甲酯（(Me0)2S02)。在环境温度下继续 搅拌30分钟。然后，将反应混合物加热至80°C并持续4小时，同时添加0.7M NaOH溶液以使反 应介质均质化(添加额外的大约l〇mL的0.7M NaOH)。在反应4小时后，将混合物带回至环境 温度，并且借助于2M HC1溶液来进行酸化直至pH = 2。过滤反应粗制物，并且将所获得的固 体用蒸馏水进行洗涤，随后通过冻干来进行干燥。获得〇.874g经甲基化的木质素。
[0175] 实施例2B-甘蔗渣木质素的甲基化
[0176] 使用由S0LVAY所提供的甘蔗渣木质素，而无预先的预处理。
[0177] 将甘蔗渣木质素在实施例2A中所描述的条件下进行处理。获得0.92g经甲基化的 木质素。
[0178] 实施例3A-经甲基化的木质素(源自牛皮纸木质素)的解聚
[0179] 将lg在实施例2A中所获得的经甲基化的木质素溶解在25mL二卩恶烷中，并且在环 境温度下搅拌混合物直至完全溶解。
[0180] 然后，制备51mg 2，2-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS) (0 · lmmol) 在lmL乙酸盐缓冲液(pH=4; 50mM)中的溶液，将其添加至经甲基化的木质素的溶液中。
[0181] 然后，制备5mg漆酶在200mL乙酸盐缓冲液中的溶液，抽取24mL该溶液，将其缓慢地 添加至处于40°C的包含经甲基化的木质素的介质中。在添加漆酶后，通过在40°C下鼓吹1小 时来将气态氧引入到混合物中，其中使用充满氧的烧瓶。
[0182] 在于4°C下反应22小时后，添加 lmL的3M NaOH溶液，随后缓慢地添加 lmL过氧化氢 水溶液(35%，1 Ommo 1)，将混合物在90°C下进行搅拌。
[0183] 通过SEC (空间排阻色谱法)来追踪反应的进展。SEC分析通过使用三个串联的TSK-凝胶类型的柱子(3000PW、4000PW、3000PW)来进行，其中使用在渗透水中的直至pH=12的1M 氢氧化钠和NaN3(3%)作为洗脱剂。流量为lmL/分钟，并且用波长为280nm的UV来进行检测。
[0184] 所述反应的第一个步骤(漆酶/ABTS系统的作用）导致弱的解聚。第二个步骤(过氧 化氢的作用)导致强的解聚，其中形成已被分离和鉴定的低分子量的分子。
[0185] 在反应40小时后，借助于IN HC1溶液将混合物带回至pH=6-7,并且用二氯甲烷(3 X50mL)对反应粗制物进行提取。在将有机相通过硫酸钠(Na2S04)进行干燥并且使挥发性溶 剂蒸发之后，通过快速色谱法(洗脱剂为:二氯甲烷/甲醇99/1至90/10)来纯化该粗制物。
[0186] 如此，从lg在实施例2A中所获得的经甲基化的木质素开始分离出了30mg 3,4_二 甲氧基苯甲酸。
[0187] 比较实施例1
[0188] 作为比较，使在实施例1中所获得的经纯化的牛皮纸木质素经历漆酶/ABTS系统的 作用，其中直接应用在实施例3A中所描述的反应条件(即不施行木质素的甲基化）。
[0189] 通过SEC来追踪反应的进展(上面所描述的条件）：
[0190]
[0191] MP:分子量峰值，以g/mol表不
[0192] Mn:数均分子量，以g/mol表不
[0193] Mw:质均分子量，以g/mol表不
[0194] 观察到，所存在的种类的平均分子量随反应持续时间而增加。
[0195] 因此，当在未甲基化的牛皮纸木质素上施行漆酶/ABTS系统的作用时，没有观察到 解聚，而是相反地，观察到木质素的分子量的增加。
[0196] 实施例3B-经甲基化的木质素(源自甘蔗渣木质素)的解聚
[0197] 通过应用在实施例3A中所描述的反应条件(将漆酶的作用延长至65小时，其后添 加过氧化氢)来处理在实施例2B中所获得的经甲基化的木质素。
[0198] 通过SEC来追踪反应的进展(上面所描述的条件）：
[0199]
[0200] 所述反应的第一个步骤(漆酶/ABTS)导致弱的解聚。第二个步骤(在t = 65小时之 时添加过氧化氢)导致解聚，其中产生未被分离和鉴定的低分子量的酚类。
[0201] 比较实施例2
[0202]作为比较，使甘蔗渣木质素经历漆酶/ABTS系统的作用，其中直接应用在实施例3A 中所描述的反应条件(即不施行木质素的甲基化）。
[0203] 通过SEC来追踪反应的进展(上面所描述的条件）： 「02041
[0205] 观察到，所存在的种类的平均分子量随反应持续时间而增加。
[0206] 因此，当在未甲基化的甘蔗渣木质素上施行漆酶/ABTS系统的作用时，没有观察到 解聚，而是相反地，观察到木质素的分子量的增加。
[0207] 比较实施例3
[0208] 作为比较，使在实施例2B中所获得的经甲基化的木质素在碱性介质中经历过氧化 氢的作用，其中没有预先经历漆酶/ABTS系统的作用。
[0209] 将lg在实施例2B中所获得的经甲基化的木质素溶解在25mL二13恶烷中，并且在环 境温度下搅拌混合物直至完全溶解。
[0210]然后，向混合物添加25mL渗透水。
[0211] 添加 lmL的3M NaOH溶液，随后缓慢地添加 lmL过氧化氢水溶液（35%，10mmol)，其 中在90 °C下搅拌混合物。
[0212] 通过SEC来追踪反应的进展(上面所描述的条件）：
[0213]
[0214] ~观察到比当将它预先通过漆酶/ABTS系统的作用进行处理时少的量的经甲基化的 木质素解聚。
[0215] 在并不希望被束缚于特定理论的情况下，该部分解聚通过下述事实来解释:在木 质素中（和因此在经甲基化的木质素中），一定百分比的旨在通过合并"漆酶/介体"系统来 进行氧化的羟基官能团已经处于氧化状态，即以酮的形式。在这些酮官能团附近的C-C键的 氧化断裂引起部分解聚。
[0216] 然而，该实施例显示，所述方法的第一个步骤对于优化过氧化氢的解聚作用来说 是必需的。
[0217] 在实施例2B、3B结束后和在比较实施例3结束后获得的甘蔗渣木质素的比较分析 证明，当使经甲基化的木质素依次地经历漆酶/ABTS系统的作用和然后经历过氧化氢的作 用时，木质素的片段化是最有效的：
[0218]
【主权项】
1. 使木质素解聚的方法，所述方法包括： -通过在至少一种溶剂中合并非酚型木质素、漆酶、氧化还原介体和氧源来使非酚型木 质素氧化的步骤，由此获得包含经氧化的木质素的混合物，和 -通过添加氧化剂来使如此获得的经氧化的木质素解聚的步骤， 所述非酚型木质素是从酚型木质素开始通过使所述酚型木质素的酚官能团官能化而 获得的。2. 根据权利要求1的方法，其中所述非酚型木质素为经烷基化的木质素。3. 根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述非酚型木质素为经甲基化的木质素。4. 根据权利要求3的方法，其中所述经甲基化的木质素是通过在碱性水溶液中合并酚 型木质素和甲基化试剂而获得的。5. 根据权利要求4的方法，其中所述甲基化试剂为硫酸二甲酯。6. 根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述氧源为纯氧或空气。7. 根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述氧化还原介体为2,2_连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。8. 根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述氧化剂为过氧化氢。9. 根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述氧化步骤在碱性介质中进行。10. 根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述非酚型木质素源自牛皮纸木质素或 甘蔗渣木质素的酚官能团的官能化。
【文档编号】C12P7/00GK105899728SQ201480073131
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月26日
【发明人】S·格赫里埃, G·库巴尤亚
【申请人】波尔多聚合技术研究所, 波尔多大学, 国家科研中心