使用感兴趣的基因-报道物融合蛋白和光学成像的治疗送递和监测的制作方法

专利名称：使用感兴趣的基因-报道物融合蛋白和光学成像的治疗送递和监测的制作方法
使用感兴趣的基因-报道物融合蛋白和光学成像的治疗送递和监测发明领域本发明涉及在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触时，非介入性监测所 述细胞中所述感兴趣的基因的表达的方法。因此，本发明涉及在细胞与脱甲基药物接触时，监测所述细胞中感兴趣的基因的 表达增加的方法。本发明也涉及当细胞与RNAi接触时，监测所述细胞中感兴趣的基因的表 达减少的方法。所述方法可以在体内进行或在人或动物体外进行。本发明也涉及包含编码感兴趣的基因-多肽和荧光报道多肽的不同核酸分子。
背景技术：
当前医学的主要任务之一是开发能够选择性影响怀疑正在受到错误调节或已知 要被错误调节的基因的表达的治疗系统。根据受影响的基因，这可能展示在严重疾病，如癌 中。尽管在该领域已经进行了许多努力，仍然需要改进迄今所获得的结果，并且将它们与例 如能够容易地监测疗效和/或送递治疗化合物的系统结合。一般地，基因表达的概念可以概括为包括几个步骤在DNA水平，特定序列编码蛋 白或RNA，这两者都可以展示特定功能。在第一个步骤，将DNA转录为相应的RNA。该步骤 受到包括通常位于5’末端并且紧邻编码序列的所谓启动子区以及正面和负面影响转录的 其它上游或下游调节性DNA元件和转录因子的紧密控制。在蛋白是基因表达的终产物的情 况下，被转录的RNA称作mRNA。在第二个步骤中，该mRNA翻译为蛋白，并且所述蛋白随后在 后续步骤中任选进一步翻译后修饰。在RNA是终产物的情况下，被转录的RNA可以重排和 加工，并且包括在包含例如蛋白的复合物中。因此，可以通过例如影响第一个步骤，即转录 的靶向因子，在DNA水平上影响基因表达。同样，可以靶向第二个步骤在蛋白质为终产物 的情况下，mRNA的翻译可以被阻断，在RNA是终产物的情况下，加工等可以被阻断。如果一 种方法最终导致转录的RNA的降解，则不能获得终产物，并且抑制了第二个步骤。在疾病由基因的减量调节或甚至由其完全沉默导致的情况下，疗效应该是所述内 源基因增量调节到正常水平。对于某些癌类型，例如，显著的肿瘤抑制基因已知被沉默，并 且因此不能表现它们的相应肿瘤抑制物功能。DNA-甲基化已经被鉴定为基因减量调节/沉 默的主要原因。所述甲基化通常存在于相应基因的启动子区中。在这些情况下，可以通过 从DNA除去甲基而恢复基因表达。基因的减量调节/沉默也可能是由于作为该基因的负转 录因子的转录因子的增量调节，由此阻断基因表达而引起的。在这些情况下，治疗应该涉及 编码转录因子的基因的减量调节，由此降低转录因子的水平。如果基因的增量调节导致疾病，则疗效应该相应地是所述内源基因减量调节到正 常水平。在几乎所有癌类型中，已知基因是增量调节的。它们通常称作癌基因或原癌基因， 其中原癌基因可能不直接对例如细胞增殖起作用，但间接对其起作用，例如，通过导致其它 基因增量调节。可以使用RNAi方法，以便减量调节基因表达。与直接在“DNA水平”上起作 用的脱甲基药物相反，RNAi方法典型地作用于基因表达的第二个步骤，即，翻译为蛋白或加 工为相应的RNA。这些方法最终导致转录的RNA的降解。因此，基因表达的整个过程受到5RNAi的阻断。这也可以称作RNAi对基因的“沉默”。从机理上，加工人工导入的“RNA”(如 从载体转录，作为RNA-双链体导入，等等)，并且将一条链掺入复合物，所述复合物以序列 特异性方式识别转录的RNA。这样，导入的RNA的序列指定被靶定的“基因要沉默”。杂交 后，识别并形成复合物，被靶定的RNA通过其它机制降解。目前监测影响基因表达的治疗系统的效果的方法主要依赖于比较在应用治疗系 统之前和之后疾病如肿瘤的状态。因此，可以用例如X线或超声方法在治疗之前和之后确 定肿瘤的大小。但是，采用这样的系统，不能直接监测所述治疗对于基因表达的效果，也完 全不能分析相应化合物是否定位于受影响的组织。其它方法需要组织-样品来确定治疗的 结果。因此，活检或甚至手术步骤是必须的，这通常伴随额外的问题，如感染。此外，也只能 进行事后分析。因此，需要建立或改进影响基因表达的治疗和允许以非介入性方式监测这些治疗 的应用和对被靶定的基因表达的影响的方法。发明目的和概述本发明的一个目的是提供用于在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触 时，非介入性监测所述细胞中所述感兴趣的基因的表达的方法和化合物。可以从下面的说明书中明确的本发明的这些和其它目的，是通过独立权利要求的 主题解决的。从属权利要求涉及本发明的一些优选实施方案。根据本发明的一方面，提供了非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的方法， 该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与影响所述感兴趣的基因的表达的化合物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述化合物诱导的所述感兴趣的基因的表达的改变 赋值。在涉及上文所述方法的一个优选实施方案中，本发明描述了在体内非介入性监测 细胞中感兴趣的基因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)甲基化的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；
e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加 赋值。本发明在另一优选实施方案中描述了非介入性监测感兴趣的基因的表达的方法， 该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)甲基化的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加 赋值。本发明的另一实施方案涉及可以用于上述方法的分离的核酸分子，所述核酸分子 包含a)甲基化的启动子序列；b)与其操作性连接的编码感兴趣的基因多肽的序列；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列。编码序列(其包含与编码荧光报道多肽的序列融合的、编码感兴趣的基因多肽的 序列)包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端的单个终止密码子。本文使用的 术语“单个起始密码子”不排除存在其它的内部ATG密码子。然而，后面的这些密码子应该 不起始翻译。在本发明的一个优选实施方案中，感兴趣的基因在本发明的这方面是肿瘤抑制基 因或怀疑由于其沉默而导致疾病的基因。因此，在另一优选实施方案中，本发明涉及可以用于上述方法的分离的核酸分子， 该核酸分子包含a)甲基化的启动子序列；b)与其操作性连接的编码多肽的序列，所述多肽选自包含CADMl (SEQ ID No. 2)、 Rb (SEQ ID No. 1)、ZMYND10(SEQ ID No. 3)、RASSF5 (SEQ ID No. 4)、PTEN (SEQ ID No. 5), SERPINB5 (SEQ ID No. 6)、EPB41L3 (SEQ ID No. 7)禾口 DAPKl (SEQ ID No. 8)的多肽组；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端 的单个终止密码子。优选地，在上述b)项中提到的序列选自CADMl (SEQ ID No. 2)和/或Rb (SEQ ID No. 1)。7
在另一优选实施方案中，本发明描述了在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基因 表达的减少的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。本发明另外涉及可以用于所述方法的核酸分子，该核酸分子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；编码序列(其包含与编码荧光报道多肽的序列融合的、编码感兴趣的基因的非功 能性多肽的序列)包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端的单个终止密码子。 本文使用的术语“单个起始密码子”不排除存在其它的内部ATG密码子。然而，后面的这些 密码子应该不起始翻译。在本发明这方面的一个优选实施方案中，编码感兴趣的基因的非功能性多肽的感 兴趣的基因序列包含完整的感兴趣的基因序列的一部分或含有至少一个插入、至少一个缺 失、至少一个核苷酸交换或其混合物的完整的感兴趣的基因序列。从而获得感兴趣的基因 的非功能性多肽。但是，感兴趣的基因区不包含终止密码子。此外，在这方面的一个甚至更优选的实施方案中，本发明描述了如前面两段所概 括的核酸分子，其中感兴趣的基因是癌基因、原癌基因或怀疑由于其超量表达而导致疾病 的基因。因此，在另一优选实施方案中，本发明涉及可以用于上述方法的分离的核酸分子， 该核酸分子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码非功能性多肽的序列，所述非功能性多肽选自包含 VEGF (SEQ ID No. 10)、RAS (SEQ ID No. 11), Wnt (SEQ ID No. 12)、MYC (SEQ ID No. 13), ERK (SEQ ID No. 14)和 TRK (SEQ ID No. 15)的多肽组；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端 的单个终止密码子。优选地，在上述b)项中提到的序列选自VEGF (SEQ ID No. 10)和/或Wnt (SEQ ID No. 12)。因此，在本发明这方面的一个相应的优选实施方案中，编码选自包含VEGF(SEQ IDNo. 10) ,RAS(SEQ ID No. 11),Wnt (SEQ ID No. 12),MYC(SEQ ID No. 13) ,ERK(SEQ ID No. 14) 和TRK (SEQ ID No. 15)的多肽组的非功能性多肽的序列包含完整序列的一部分或含有至少 一个插入、至少一个缺失、至少一个核苷酸交换或其混合物的完整序列，从而获得非功能性 多肽。但是，该序列不包含终止密码子。在涉及这方面的一个另外的实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，该核酸分 子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码Her-2neu(SEQ ID No. 9)的非功能性多肽的序列，其中 所述序列包含至少一个插入、至少一个核苷酸交换或其混合物，从而获得非功能性多肽，但 是其中该序列不包含终止密码子；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端 的单个终止密码子。在本发明的另一方面，公开了一种方法，其中非介入性监测人或动物体外的细胞 中感兴趣的基因表达的减少，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。在上文概括的体内和体外方法的实施方案中，所述核酸分子和/或所述RNAi可以 通过声致穿孔(sonoporation)、局部注射或脂质体袋，或其混合辅助的转染而导入所述细 胞，所述脂质体袋携带用于正确靶向、鉴定和定位的、抗宿主细胞抗原的抗体。本发明的另一方面涉及上文公开的方法的用途。所述方法可以在体内或在人或动物体外应用。在一个实施方案中，所述方法用于 在使细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触时随时间监测所述细胞中所述感兴趣 基因的表达，从而用于监测所述化合物的效果。在另一实施方案中，上文公开的方法可以用于送递影响细胞中感兴趣的基因的表 达的化合物、监测所述化合物的送递，以及同时监测所述化合物诱导的对所述感兴趣的基 因的表达的影响。同样，这适用于体内状况并且适用于在人或动物体外的细胞中进行的方法。在另一优选实施方案中，上述体内或人或动物体外的方法用于调整影响感兴趣的 基因的表达的化合物的剂量，从而获得所述感兴趣的基因的表达的进一步改变。在本发明的另一方面，将涉及使用脱甲基药物的方法在一个实施方案中用于测试不同的脱甲基药物，从而分开或组合鉴定最有效的脱甲基药物。在方面在另一个优选实施方案中涉及包含RNAi的方法。因此，所述方法用于测试 针对一种感兴趣的基因定制的不同RNAi，从而分开或组合鉴定最有效的RNAi。


图1图解描述了本发明的可能的应用，即RNAi治疗及其在乳腺癌组织中进行监测 的示例步骤。这些步骤在本发明的实施例部分详细描述。发明详述发明人发现可以非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达。当影响所述感兴趣的 基因的表达的化合物与细胞接触时，可以使用这种系统。在详细描述本发明的示例实施方案的同时，提供了对于理解本发明重要的定义。如说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”和“一种”也包括各自的复 数形式，除非上下文明确指出相反的意思。在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”是指本领域技术人员理解仍然能够确 保考虑的特征的技术效果的准确度区间。该术语典型地表示偏离所指出的数值士 10%，优 选 士5%。应该理解术语“包含，，不是限制性的。对于本发明的目的，术语“组成，，考虑是术 语“包含”的优选实施方案。如果下文定义一个组至少包含特定数目的实施方案，这也表示 包括优选仅仅由这些实施方案组成的组。如上文所述，本发明涉及在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触时，非 介入性监测所述细胞中感兴趣的基因的表达的方法。因此，本发明在一个实施方案中涉及 非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与影响所述感兴趣的基因的表达的化合物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述化合物诱导的所述感兴趣的基因的表达的改变 赋值。在本发明的上下文中，术语“非介入性”监测是指在本发明方法的检测步骤b)和 d)中，为了监测感兴趣的基因的表达，不需要与患者的细胞和/或被监测组织直接物理接 触。因此，检测步骤过程中不需要手术或活检或其它涉及接触细胞的方法(例如体外测定 中的膜片钳)。“监测”广义上是表示随时间测定参数和保持跟踪参数的过程。10
本文使用的术语“感兴趣的基因的表达”包括至少两个步骤。因此，感兴趣的基 因转录为相应的RNA是基因表达的一个步骤。在蛋白由基因编码的情况下，所述RNA称作 mRNA。RNA可以进一步加工(如剪接)，并且，在第二个步骤中，mRNA翻译为蛋白。因此，蛋 白可以是基因表达的终产物。作为终产物的蛋白的量可能与基因表达水平相关。但是，RNA 分子也可以是基因表达的终产物。所述RNA也可以是第二个步骤中的加工和修饰的对象。本文使用的术语“影响基因表达的化合物”包括任何对内源基因表达具有正面或 负面影响的化合物。所述化合物可以在DNA水平上起作用。这表示所述化合物可影响例如DNA的甲基 化状态或导致DNA的结构重排，如从闭合到开放构象，而不影响DNA序列。由于已知DNA甲 基化(特别是在启动子区中)导致相应基因的沉默，已知作为脱甲基药物起作用的化合物 由于从DNA除去甲基而增加基因表达。组蛋白脱乙酰酶(HDACs)从DNA除去乙酰基，并且 参与基因抑制。因此，抑制HDACs的化合物也可以对基因表达具有正面影响。下文也将提 到这些通常称作HDAC抑制剂的药物。但是，在本发明的一个实施方案中，包括了正面影响 基因表达的化合物。在本发明的另一优选实施方案中，可以使用作用于基因表达的第二个步骤，即作 用于转录的RNA的化合物。在所述RNA被降解的情况下，基因表达受到负面影响。在本发 明的这种实施方案中，例如，可以使用RNAi，从而抑制翻译步骤。所述RNAi包括如下文详细 阐述的 siRNA、shRNA、miRNA 等。本文使用的“接触细胞”包括本领域技术人员已知的任何送递化合物，使得它能够 对细胞施加其作用的方式。这可以在体内进行，例如，通过静脉内注射、局部应用、吸入等。 对于细胞培养系统，可以简单地将诸如脱甲基药物的化合物添加到细胞培养基中，用于培 养。但是，也可以使用下文概括的转染方法，以便使化合物与细胞接触，并且，在下一个步骤 中，可以将所述化合物导入所述细胞中。术语“核酸分子”在本发明的上下文中是指DNA、RNA或其衍生物。优选地，它是指 双链DNA分子。所述核酸分子可以是环状或线性的，这依赖于用于将所述核酸分子导入细 胞中的机制。本发明上下文中的术语“导入细胞中”定义了核酸分子如DNA或RNA通过本领域 技术人员已知的任何方法导入相应的细胞中。此外，“导入”表示所述核酸分子存在于细胞 中，使得存在于所述核酸分子上的编码序列可以根据所述区域如何受到调节而表达。为此， 可以使用下文详细描述的技术，如转染方法。在本发明的上下文中，术语“编码区”或“编码序列”意欲包括在5’末端以起始密 码子，即ATG开始的DNA序列。当开始mRNA翻译时，该三联体编码相应蛋白的第一个氨基 酸，即甲硫氨酸。因此，编码区以终止密码子如TAG终止于3’末端，从而终止蛋白翻译。重 要的是注意，对于本发明，除了上文提到的位于3’末端的一个终止密码子，在编码序列内的 任何地方都不存在终止密码子。因此，概言之，将完整的编码序列转录为一个相应的mRNA。 mRNA的翻译得到一个蛋白，其可以包含至少两个不同的结构域/多肽/部分。但是，如下文 详细指出的，所述多肽不一定需要是功能性的；但是，对于所有编码序列，在所述一个编码 序列内可能存在编码至少两个多肽的至少两个序列。在本发明的一个优选实施方案中，核酸分子的所述编码序列包含位于5’末端的单11个起始密码子和位于3’末端的单个终止密码子。本文使用的术语单个起始密码子表示该 序列可能包含另外的内部ATG密码子，但是，其不能用于起始翻译。术语“感兴趣的基因序列”、“感兴趣的基因区”、和“编码所述感兴趣的基因多肽的 序列”是指要通过本发明的方法监测的感兴趣的基因的DNA序列。在本发明的上下文中，优 选地，所述术语包含翻译为蛋白并且怀疑由于错误调节而导致某特定疾病的基因。这将在 下文详述。因此，所述序列优选仅包含基因的编码区，即，仅外显子，无内含子。但是，在某 些实施方案中，它可以适用于也使用感兴趣的基因的内含子区。在下文中，将详细解释术语“报道多肽”和“报道物”。本段落涉及本发明的所有实 施方案，即，涉及下文详细提到的所有方法和本发明包括的所有核酸分子。重要的是指出编 码报道多肽的序列总是符合编码序列的5’末端的唯一 ATG的读框，使得相应多肽总是正确 表达，即，制备功能性多肽/蛋白。此外，在本发明的所有实施方案中，编码报道多肽的核酸 序列编码荧光报道多肽。所述荧光报道多肽可以选自蓝色、绿色、青色、红色或红外荧光蛋 白。在本发明的一个特别优选的实施方案中，报道序列编码绿色荧光蛋白。本发明中使用的术语“操作性融合的”定义了至少两个DNA区(如编码感兴趣的基 因多肽的序列和编码报道多肽的序列)彼此连接。因此，它们可以在一个优选实施方案中 形成一个表达产物，即一个蛋白的一个编码序列，所述表达产物包含至少两个不同的结构 域/多肽。因此，如上文提到的，仅仅存在一个编码相应蛋白的可读框，其中编码报道多肽 的序列总是符合所述可读框，以便表达功能性报道多肽。优选地，感兴趣的基因序列在5’与 报道序列融合从而编码蛋白，所述蛋白由感兴趣的基因多肽和随后的荧光报道多肽构成。在本发明的另一优选实施方案中，所述核酸分子的编码区可以额外包含位于融合 的感兴趣的基因和报道序列之间的编码多肽间隔基的间隔区。同样在此情况下，间隔区总 是符合所述可读框，以便表达功能性间隔多肽。术语“操作性连接的”表示上文定义的编码区的表达受到其它区域，如启动子或增 强子的机械控制。这些区域通常是也存在于核酸分子中的其它DNA区。所述操作性连接的 区域可以是核酸分子上的任何位置。但是，它们优选作为调节区，如编码序列5’的启动子 存在。在控制编码序列的表达的上下文中，术语“启动子序列”或简单地“启动子”是指 确定的DNA序列，其影响基因的表达。因此，典型的启动子序列包含由特定细胞因子识别的 特定长度的确定的碱基序列。通常，这些因子结合也这些保守的序列，并且作为基因表达的 正或负调节剂，并且因此通常称作“转录因子”。很多启动子序列是本领域技术人员已知的， 甚至人工核酸分子中不同启动子序列的组合也是可能的。根据本发明的方法，可以使用不同的启动子。因此，本发明的核酸分子在优选实施 方案中可以包含启动子序列，其中所述启动子序列是由至少一个诱导所述编码序列表达的 人转录因子识别的人启动子。此外，所述人启动子可以是强的组成型活性启动子。在其它 实施方案中，所述人启动子可以是强的诱导型如组织选择性启动子。在某些实施方案中，它 也可以是病毒启动子。在本发明的一个最优选的实施方案中，调节包含感兴趣的基因序列 等的编码序列的表达的核酸分子的启动子序列可以是内源性启动子序列(即，调节感兴趣 的内源基因表达的序列)，由此反映内源性状况。术语“通过非介入性光学成像方法检测”是指可以用于非介入性检测细胞中的荧光报道多肽的任何方法。由于该方法依赖于报道多肽，它使得能够了解所述多肽和表达所 述多肽的细胞的功能性和生物化学特性。“光学成像”方法典型地依赖于这样的试剂，其通 常称作造影剂；在本发明中，荧光报道多肽代表所述造影剂。优选地，通过荧光显微术、荧光成像、单光子和多光子共焦显微术、激光诱导的荧 光等进行根据本发明方法的荧光报道多肽的检测。由于荧光蛋白在激发后发射特定波长的 颜色，细胞中的荧光蛋白需要通过使用特定激发波长激发然后检测所发射的波长的光(例 如，GFP通过UV光激发，并且发射相应于绿色的波长的光)。因此，本发明中使用的成像方 法是指发射特定波长的光以便激发荧光多肽并且检测由发荧光的多肽发射的特定波长的 光的装置。该装置当然可以偶联于常规光学显微镜、监视器、数据存储装置等。所述装置可 以根据要监测的区域进行定位。所述区域可以是例如单细胞、细胞培养皿的特定区域中的 细胞簇或人或动物中细胞，优选是包含通过本发明的方法监测的人或动物体内的一些细胞 的组织。可以使用本领域技术人员已知的任何能够检测荧光多肽的装置。在本发明方法的步骤b)中，在细胞与影响感兴趣的基因表达的化合物接触前检 测荧光报道多肽的水平。然后，在后续步骤中，在所述影响感兴趣的基因表达的化合物与所 述细胞接触后再次检测报道多肽。这样，可以检测报道多肽的两个不同水平。然后可以如 步骤e)概括的那样“比较”这两个水平。但是，本发明不意欲排他地依赖于两个步骤。在 本发明另外的优选实施方案中，可以重复第二个检测步骤至少2、3、4、5、6、10或100次，以 便随时间获得数据。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中第二个检测步骤 d)进行数次，从而确定感兴趣的基因的表达随时间的改变。因此，在所述实施方案中，可以 随时间分析报道多肽的水平。在另一优选实施方案中也可以实时记录信号，以便获得读出结果，即荧光蛋白检 测的影像。这可以称作“活细胞成像”或“活组织成像”。当然，可以根据影响感兴趣的基因的表达的化合物调整时间点。例如，如果已知化 合物缓慢作用于感兴趣的基因的表达，在导入所述化合物后例如5、10、20、30或60分钟的 额外时间后检测荧光报道多肽的水平可能是有帮助的。在使用快速作用化合物的情况下， 可以在导入化合物数秒内执行第二个检测步骤。此外，术语“比较”应该理解为在所述至少两个检测步骤中比较报道多肽的相对 量。在一个优选实施方案中，本发明描述了上文概括的方法，其中通过分析在步骤b)和d) 中检测的报道多肽的相对量，进行比较步骤e)。这样，不是必须对所述多肽的绝对量进行定 量。但是，当使用所述相对量时，需要确保该量针对对照或在所述至少两个检测步骤中相同 的值进行了归一化，以便获得归一化的相对量。本发明上下文中的术语“给改变赋值”表示在所述比较后，将所述至少两个检测步 骤中的一种和多种差异分别表示为例如百分比。这可以包括报道多肽随特定检测时间的减 少百分比或增加百分比。这也可以得到以下结论当检测所述至少两个报道多肽时，报道多 肽的水平没有随时间改变，或在两个时间点之间没有改变。本发明的方法可以在体内或体外使用。在“体内状况下”，本发明的方法中提到的细胞可以是人或动物的组织的部分，或 可以是在人或动物体内循环的细胞。在本发明的上下文中，不仅仅是单个细胞，优选地，特 定组织的细胞或怀疑或已知导致特定疾病的细胞可以是本发明的靶。如上文概括的，某些重要的细胞调节物(如细胞周期调节物如PRB、细胞周期蛋白、CdKs等)的错误调节可能导 致疾病，如癌。在体内方案中，当施用影响表达的化合物时，本发明的方法可以用于监测例 如癌组织或肿瘤中感兴趣的基因的表达。根据本发明的该体内状况的优选实施方案将在下 文详细描述。因此，在一个优选实施方案中，本发明描述了在体内非介入性监测细胞中感兴趣 的基因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与影响所述感兴趣的基因的表达的化合物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述化合物诱导的所述感兴趣的基因的表达的改变 赋值。本发明在这种体内方案的一个优选实施方案中描述了上文概括的方法，其中所述 核酸分子和/或所述影响感兴趣的基因的表达的化合物(如RNAi)可以可以通过声致穿 孔、局部注射或脂质体袋，或其混合辅助的转染而导入所述细胞，所述脂质体袋携带用于正 确靶向、鉴定和定位的、抗宿主细胞抗原的抗体。所述技术是本领域技术人员已知的。此外，本发明在一个优选的体内实施方案中涉及这样的方法其中根据要监测的 组织的深度来选择报道序列编码的荧光报道多肽，即，对于表浅组织，荧光蛋白选自蓝色、 绿色或青色荧光蛋白，对于深组织，荧光蛋白选自红色或红外荧光蛋白。本发明的方法也可以体外使用。所述体外方案优选是指使用在细胞/组织培养系 统中培养的哺乳动物细胞或从人或动物体提取的细胞并且在人或动物体外使用和/或处 理的系统。根据本发明的“哺乳动物细胞培养系统”包括本领域技术人员已知和使用的所有 细胞系。这些细胞系可以是人、小鼠、大鼠、仓鼠或鸡细胞系，并且可以根据标准技术培养。 当然，可以使用不同的人细胞系，如HeLa细胞、293细胞、WI-38细胞、U20S细胞等等。因此，本发明的一个实施方案包括非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的方 法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与影响所述感兴趣的基因的表达的化合物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；14
e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述化合物诱导的所述感兴趣的基因的表达的改变 赋值。本发明在这种体外方案的一个优选实施方案中描述了上文概括的方法，其中所述 核酸分子和/或所述影响感兴趣的基因的表达的化合物(如RNAi)可以通过声致穿孔、脂 质体袋、电穿孔，或其混合辅助的转染而导入所述细胞。所述技术是本领域技术人员已知 的。根据本发明的方法监测的感兴趣的基因的表达改变可以是所述感兴趣的基因的 增量调节或减量调节。如上文所述，这可以在体内或体外分析。在第一种状况或疾病中，感 兴趣的基因可以减量调节，并且，因此，目标可以是所述感兴趣的基因的增量调节和所述增 量调节的监测。第二种状况可以是感兴趣的基因在疾病中增量调节。在这种状况下，目标 可以是减量调节相应的基因并且通过本发明的方法监测所述减量调节。针对任一种状况的 根据本发明的核酸分子和方法的优选实施方案在下文中描述。这些实施方案意欲举例说明 所述状况。因此，可以使用对基因表达的减量调节或增量调节具有相同的总体效果的其它 化合物。在感兴趣的基因被减量调节的情况下，本发明的方法在一个优选实施方案中可以 包括使用脱甲基化合物来增量调节所述基因。在相反的状况中，当感兴趣的基因的减量调 节可以作为目标时，本发明的方法在优选实施方案中是指使用RNAi。下面将进一步详细描 述这两组优选实施方案。为了分析基因是否由于DNA甲基化而减量调节/沉默，可以在确定治疗之前和使 用本发明的监测方法之前进行差别甲基化研究。这可以用细针抽吸细胞学进行。可以用这 种细针抽吸技术获得DNA样品并且分析它们的甲基。所述方法是本领域技术人员已知的。在下面的段落中，提到了本发明的优选实施方案，其涉及监测感兴趣的基因表达 增加的核酸分子和方法。因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，所述核酸分子包含a)甲基化的启动子序列；b)与其操作性连接的编码感兴趣的基因多肽的序列；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列。包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3末端的单个 终止密码子。本文使用的术语单个起始密码子表示序列可以包含另外的内部ATG密码子， 然而，其不能用于起始翻译。如上文已经提到的，已知DNA，特别是启动子的甲基化抑制所述启动子控制的基因 的表达。DNA的甲基化优选理解为碱基，优选胞嘧啶的甲基化。与甲基化的启动子序列操作 性偶联的基因可能没有描述，因此可能不是活性的。对于上述核酸分子，如果启动子序列是 甲基化的并且保持甲基化，将不会表达包含b)和c)的相应编码序列。但是，如果所述区域 不再被甲基修饰，所述序列是由至少一种诱导所述编码区表达的人转录因子识别的人启动 子序列。因此，所述甲基化的启动子区的脱甲基将导致未甲基化的区域能够驱动与所述区 域操作性偶联的基因表达。本发明在一个实施方案中包含如刚刚描述的核酸分子，其中在脱甲基药物的作用后，未甲基化的启动子序列是由至少一种诱导编码序列表达的人转录因 子识别的人启动子。在一个优选实施方案中，核酸分子的所述甲基化启动子与感兴趣的基 因的内源甲基化启动子相同。在本发明的一个优选实施方案中，上面段落中描述的要求保护的核酸分子包括感 兴趣的基因序列，其中感兴趣的基因是肿瘤抑制基因或怀疑由于其沉默而导致疾病的基 因。在所述实施方案的一个实例中，感兴趣的基因可以是RB。在其它情况下，感兴趣的基因 可以是 CADMl、ZMYND10、RASSF5、PTEN、SERPINB5、EPB41L3、DAPKl 等。在其它实施方案中，所述构建体/核酸分子可以用于本发明的体内方法或体外方 法中。本文使用的术语“脱甲基药物”或“脱甲基化合物”意欲包括任何能够在细胞中进 行DNA脱甲基，即从DNA，优选从胞嘧啶除去甲基的药物。所述化合物可以选自包括5-氮 杂胞苷等的化合物。5-氮杂胞苷的系统IUPAC命名是4-氨基-1-[3，4- 二羟基_5_(羟基 甲基)氧杂环戊烷(0101￡111)-2-基]-1，3，5-三嗪-2-酮)。分别在DNA复制和DNA转录 过程中将胞苷的所述化学类似物掺入DNA和RNA。这种掺入抑制甲基转移酶如DNMTl的活 性。这样，该掺入导致脱甲基。当然，本领域技术人员知道其他胞苷类似物和/或与5-氮 杂胞苷起相似作用的化合物，如5-氮杂_2’脱氧胞苷、1-( β -D-呋喃核糖基)、脱氢-5-氮 杂-胞苷、呋喃核糖基)-1，2_二氢嘧啶-2-酮](其也称作kbularine)等。它 们的作用机理也可以基于通过形成复合物抑制甲基转移酶和/或消耗甲基转移酶等。如上 文已经陈述的，所述药物对甲基化的启动子区的作用是激活受控制的基因。在一个优选实施方案中，本发明因此涉及在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基 因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)甲基化的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加 赋值。在另一优选实施方案中，本发明涉及至少包含以下步骤的方法a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)甲基化的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；16
d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加 赋值。在体内和体外方案的上下文中，本发明在优选实施方案中描述了一种方法，其中 可以根据上文列出的步骤f)中的赋值，增加或减少脱甲基药物的剂量。此外，本发明也在 一种优选实施方案中描述了一种方法，其中可以分开或组合测试不同的脱甲基药物，从而 获得根据上文列出的步骤f)中的赋值的、所述感兴趣基因的表达的最强增加。感兴趣的基因的减量调节也可以是由于相应DNA序列的构象限制。已知封闭构 象，特别是在启动子区中，可以负面影响基因表达。DNA的所述封闭或“填充的”构象似乎 与DNA的乙酰化状态相关。因此，DNA上的乙酰基似乎导致更开放的DNA构象，并且因此 正面影响基因表达。所述乙酰基通过组蛋白乙酰转移酶(HATs)转移到DNA，并且通过组 蛋白脱乙酰酶(HDACs)从DNA除去。通过抑制HDACs，DNA的乙酰化状态可以增加，并且 因此可以增量调节基因表达。用于本发明的方法中的典型HDAC抑制剂可以是3-(1-甲 基-4-苯基乙酰基-1H-2-吡咯基)-N-羟基-2-丙烯酰胺、环[(2S)-2-氨基-8-氧代癸 酰基-I-甲氧基-L-色氨酰-L-异亮氨酰42R)-2-piperidinexcarb0nyl]，丁酸钠、4， 5 8,9- 二脱水-1,2,6,7,11-五脱氧-D-苏-D-艾杜(ido)- ^-l，6_dienitol、6-(l， 3-二氧代-1H，3H-苯并[de]异喹啉_2_基)-己酸羟基酰胺、2_[ (2-羟基萘-1-基亚甲 基)氨基]-N-(l-苯乙基)苯甲酰胺、[R-(E，E)]-7-[4-( 二甲基氨基)苯基]-N-羟基-4， 6- 二甲基-7-氧代-2，4-庚二烯酰胺等。这些抑制剂由例如SigmaAldrich (参见http // www. sigmaaldrich. com/Area of Interest/Life Science/Cell_Signaling/Product_ Highlights/Histone_Deacetylase_Inhibitors. html)提供。HDAC 抑制剂的其它实例是 P)(D101(也称作Belinostat)和SAHA。特别在本发明的该实施方案中，用于本发明的方法 中的核酸分子的启动子区相应于感兴趣的基因的内源启动子，由此反映内源启动子的DNA 构象。在一个优选实施方案中，本发明因此涉及在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基 因的表达的方法，该方法至少包括a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)所述感兴趣的基因的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与HDAC抑制剂接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述HDAC抑制剂诱导的所述感兴趣的基因的表达的 增加赋值。
在另一优选实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)所述感兴趣的基因的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与HDAC抑制剂接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述HDAC抑制剂诱导的所述感兴趣的基因的表达的 增加赋值。在下面的段落中，将提到涉及用于监测感兴趣的基因的表达减少的核酸分子和方 法的本发明的优选实施方案。因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的体内方法的核酸分子，所述核酸分 子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的至少一个起始密码子和位于3’ 末端的单个终止密码子。在本发明的一个优选实施方案中，如上面段落描述的要求保护的核酸分子包含感 兴趣的基因序列，其中感兴趣的基因是癌基因或原癌基因或怀疑由于其超量表达导致疾病 的基因。在所述实施方案的一个实例中，感兴趣的基因可以是Her-2neU。在其它实例中，感 兴趣的基因可以是VEGF，RAS, ffnt, MYC, ERK, TRK等。参照本发明的这些优选实施方案，很明显为什么感兴趣的基因-多肽可以优选在 体内方案之中不是功能性的。在它是功能性的情况下，这会导致基因(在大多数情况下是 癌基因)表达的总体增加，这是由感兴趣的内源基因和外源基因序列的超量表达导致的。 这可能对细胞/组织是有害的。因此，在涉及本发明的核酸分子和涉及体内方法的优选实施方案中，编码非功能 性多肽的感兴趣的基因序列包含完整的感兴趣的基因序列的部分，或含有至少一个插入、 至少一个缺失、至少一个核苷酸交换或其混合物的完整的感兴趣的基因序列，从而获得感 兴趣的基因的非功能性多肽。但是，它不包含终止密码子。因此，例如可以通过由感兴趣 的基因序列中的至少一个插入或至少一个缺失导致的移码，获得感兴趣基因的非功能性多 肽。它也可以通过导致相应多肽中氨基酸取代的单个核苷酸交换获得，所述氨基酸取代导 致得到的蛋白的三维结构破坏。在癌基因是感兴趣的基因的情况下，可以去除编码得到的 癌基因的功能部分的序列(例如催化剂结构域、结合结构域、二聚化结构域等)，并且使用 其余的编码序列作为本发明的核酸分子中的感兴趣的基因序列。在这样进行中，得到的多 肽不是功能性的。本领域技术人员当然知道可以除去多个序列，并且根据感兴趣的基因，除18去的序列的长度可以改变。在感兴趣的基因编码转录因子的情况下，在本发明的这方面描述的核酸分子的启 动子序列可以在其它实施方案中是仅由感兴趣的基因编码的所述人转录因子识别的人启 动子。因此，在实现所述感兴趣的基因的减量调节的情况下，由于作为相应转录因子的感兴 趣的基因多肽的水平降低，编码序列(由此荧光报道多肽)的表达也将减量调节。在另外的实施方案中，所述构建体/核酸分子可以在根据本发明的体内方法或体 外方法中使用。在本文的上下文中，本发明描述了监测感兴趣的基因的表达减少的方法。所述减 少可以通过包括反义RNA、shRNA、siRNA、miRNA或其它具有相似功能的核酸分子的化合物 /分子实现，上述这些分子统称为“RNAi”或“RNA干扰”或“抑制剂分子”。所述分子可以额 外地通过例如纳米颗粒修饰。使用这些RNA干扰策略，关键的是使用仅仅特异性干扰感兴趣的基因表达而不干 扰其它不相关细胞因子表达的分子。所述基于RNA的抑制剂的选择、鉴定和生产是本领域 技术人员公知的。典型地，将根据例如可能对基于抑制性RNA的分子和各自的mRNA之间的体内相互 作用起抑制作用的二级结构元件的缺乏，鉴定感兴趣的基因的编码序列内可能受到反义策 略或基于siRNA的方法影响的序列。可以用计算机程序如SFOLD鉴定核酸的这样的区段。然后，在第二个步骤中，这些序列将与其它序列进行比较，从而确定它们对于各自 的感兴趣的基因是否是独特的。这可以通过例如在国家生物技术信息中心(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)进行 BLAST 检索而完成。一旦已经鉴定了独特的序列，可以使用优选与鉴定的序列精确匹配的互补序列选 择反义或siRNA抑制剂。当然，可以使用更低程度的互补性，前提是互补性不降低到可能发 生基于反义序列或siRNA的抑制剂和其它细胞因子的信使RNA之间的非特异性相互作用的 水平。典型地，基于抑制性RNA的分子和鉴定的特异性序列之间的互补性评级将是至少 90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或至少99%。术语“互补性”当然是本领域技术人员公知的，它涉及核酸分子基于腺苷与胸腺嘧 啶配对以及尿嘧啶和胍与胞嘧啶配对的能力而彼此杂交的基本特性。本领域技术人员当然理解赋予与感兴趣的基因的完整编码序列或其部分的互补 性的核酸序列必须具有确保互补序列实际上特异于感兴趣基因的特定最小长度。因此，抑制性分子内赋予与感兴趣的基因的互补性的核酸序列的长度应该是至少 10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、 至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至 少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300或至少400个核苷酸，并且形成连续 的区段。本领域技术人员当然也知道根据给感兴趣的基因的编码序列或其部分赋予互补 性的核酸序列长度，确保赋予互补性的核酸序列实际上仅仅特异性靶定感兴趣的基因所必 须的最小互补性程度将改变。因此，如果使用30、50、60、75、100个核苷酸的较长核酸分子，可以使用较低程度的互补性，并仍然确保抑制性分子与感兴趣的基因的编码序列或其部分 之间的特异性，而当然如果抑制性分子内的赋予互补性的核酸序列包括例如仅仅至少14、 15、16、17或19个核苷酸的区段，则必须有较高程度的互补性。如上文提到的，可以通过按照上文的概述设计的“RNAi”或“RNA干扰”或“抑制剂 分子”实现感兴趣的基因表达的减少。一类所述抑制剂分子因此可以是包含重组核酸分子的分子，所述核酸分子具有与 感兴趣的基因的完整编码序列或其部分互补的核酸序列。核酸序列分子可以由DNA、RNA或 其它基于核酸的分子构成，但是，代替核苷酸，其也可以至少部分包含核苷酸类似物，只要 得到的分子能够与感兴趣的基因的完整编码序列或其部分特异性杂交。在一个优选实施方案中，上文描述的抑制性分子优选包括反义RNA、shRNA、siRNA、 miRNA或与感兴趣的基因具有相似功能的其它核酸分子。这些术语明确给本领域技术人员指出了应该如何合成这些分子，应该考虑何种互 补性程度等。应该理解，根据本发明的反义RNA以及shRNA和siRNA应该满足上述关于这 些核酸分子的长度、它们的互补性程度等的标准。反义分子典型地将包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、50、70、100、150、200、300 或更多个核苷酸的长度。为了 RNA干扰的目的，可以使用所谓的短发夹RNA或合成的双链siRNA寡核苷酸。siRNA分子将典型地包含20、21、22、23、M或25个核苷酸的长度。典型地，由于表达了 shRNA分子，单链RNA分子形成分子内发夹结构。通过切酶的 细胞内加工，由其产生siRNA分子。如果shRNA双链体的两条链都是用单RNA分子或DNA分子形式的表达载体表达 的，则可以实现shRNA分子的细胞内转录。为此目的，转录的RNA链应该理想地包含有义 shRNA序列的19-21个核苷酸，并且理想地包含相应互补序列的19-21个核苷酸。两条序列 都应该理想地通过6个核苷酸长度的间隔区分开。公知的是siRNA介导的细胞靶转录物的抑制效率依赖于合适的siRNA序列的选 择。已经开发了设计有效siRNA分子的指南。这些指南典型地来自合成的siRNA寡核苷酸， 但也适用于shRNA分子的加工形式。不同于仅仅在细胞内表达和加工后获得的shRNA分子，合成的siRNA寡核苷酸由 典型是19-21个核苷酸长度的双链RNA分子组成。这些siRNA分子可以例如转染到上文提 到的细胞系统中并且因此将起始RNAi过程。被靶定的序列和siRNA序列基序的确定可以例如根据公知的公开文献如Tuschl 等人的公开文献来确定。因此，可以使用靶mRNA的编码区来仅仅鉴定合适的siRNA靶序列。 尽管优选的是选择的siRNA序列基序针对靶mRNA的编码区，它也可以针对感兴趣的基因的 调节区，如5’和3’非翻译区进行设计。如果信使RNA的编码序列用作靶序列，可以典型地使用从起始密码子下游70个核 苷酸开始并且终止于终止密码子上游50个核苷酸的序列。然后可以检索该序列区，得到序列motive AA (N19)，其中N代表任何核苷酸。得到 的siRNA序列然后将包含motive AA后的19个核苷酸，并且优选包含两个额外添加的尿苷 或胸苷残基。在合成的siRNA寡核苷酸的情况下，尿苷残基可以优选被胸苷替代。
在另一方法中，可以根据Reynolds等的文献使用指南。Reynolds等建议了以下用于选择潜在的shRNA或合成的siRNA靶序列的标准1. 30-50%鸟嘌呤-胞嘧啶含量2.有义链的第15-19位的至少3个腺嘌呤或尿嘧啶3.缺乏分子间发夹结构4.有义链第19位的腺嘌呤5.有义链第3位的腺嘌呤6.有义链第10位的尿嘧啶7.有义链第19位无鸟嘌呤或胞嘧啶8.有义链第13位无鸟嘌呤这8个标准可以根据以下方案加权⑴标准1、3、4、5和6是1分(ii) 15-19位，至少3个相应碱基的每个腺嘌呤或尿嘧啶是1分(标准2)(iii)不满足标准7-8，每个得到-1分。根据Reynolds，仅应该考虑根据该方案分值至少为6的siRNA或shRNA序列。然 后，这样的siRNA序列可以用于采用BLAST程序进行同源性检索。在此方法后，可以排除以 下这样的siRNA 由于它们与其它编码mRNA序列的同源性将导致靶结构的非特异性抑制。如果以此方式鉴定了 siRNA或shRNA序列，它们可以克隆到表达质粒中。因此，可 以将 RNA 序列克隆到质粒 pSuppressor(pSHH，Imgenex, San Diego, CA, USA)中。为了将 siRNA序列克隆到pSHH构建体中，可以使用杂交的DNA寡核苷酸，其包含siRNA有义序列、 间隔区、相应的反义序列和终止序列。在一个优选实施方案中，本发明因此涉及在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基 因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。在另一优选实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；21
c)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。在人或动物体外的细胞中监测RNAi的效果的上下文中，本发明的一个实施方案 涉及将步骤c)中的RNAi靶向于已经表达报道多肽的细胞的方法；因此，在所述细胞中已经 导入了核酸分子。所述实施方案包括含有第二编码序列的第二核酸分子或第一核酸分子上 的第二编码序列，其中所述第二编码序列操作性偶联于强的组成型启动子。在它是第二分 子的情况下，将其与第一核酸分子一起导入细胞中。所述第二编码区编码也在导入后表达 的跨膜蛋白。因此，表达感兴趣的基因多肽和报道多肽的细胞也表达跨膜蛋白。通过细胞定 位和加工信号而将蛋白靶向于细胞膜。但是，所述跨膜蛋白的细胞外部分是人工的，因此通 常不存在于细胞外。因此，该细胞外部分将细胞“标记”为已经内化，并且表达步骤a)的核 酸分子。它也可以作为被特异性靶向于跨膜蛋白的该细胞外部分的任何抗体的停泊位点。 所述抗体可以通过本领域技术人员已知的标准程序容易地获得。现在为了将步骤c)中的 RNAi特异性靶向于并且靶向进入已经表达核酸分子的编码序列的细胞，跨膜蛋白的人工部 分可以用作锚定区。如上文提到的，可以通过转染技术，尤其通过使用携带抗细胞的外部抗 原的抗体的脂质体袋的方法，导入RNAi。这些抗体可以抗跨膜蛋白的细胞外部分，并且因此 RNAi被特异性靶向于它们的靶细胞。需要理解，在本发明的任何涉及RNAi的方法中，用于所述方法的核酸分子的感兴 趣的基因序列至少包含感兴趣的基因中的区域，所述RNAi是针对该区域定制的。在体内和体外方案的上下文中，本发明在优选实施方案中描述了一种方法，其中 可以根据上文列出的步骤f)中的赋值，增加或减少RNAi的剂量。此外，本发明也在一种优 选实施方案中描述了一种方法，其中可以分开或组合测试针对一种感兴趣基因定制的不同 RNAi，从而获得根据上文列出的步骤f)中的赋值的、所述感兴趣基因的表达的最强增加。在另一方面，本发明涉及上文描述的方法和/或核酸的用途。在涉及体内方案的一个实施方案中，本发明因此涉及一种方法的用途，该方法用 于在用例如脱甲基药物治疗疾病时在体内随时间监测例如脱甲基药物诱导的感兴趣的基 因的表达的增加。因此，该方法可以用于监测脱甲基药物的疗效。相应地，本发明在另一 实施方案中涉及一种方法的用途，该方法用于在通过RNAi治疗疾病时在体内随时间监测 RNAi诱导的感兴趣的基因的表达的减少。此处，该方法可以用于监测RNAi的疗效。明显地， 在RNAi的情况下，第一个检测步骤应该在光学成像方法中产生信号，因为否则就不能检测 到减少。因此，在第一个检测步骤检测不到报道多肽的情况下，可以优化前面步骤的条件， 从而发现使检测成为可能的合适条件。只有那时才能施用治疗化合物。在本发明的核酸分子表达感兴趣的基因的功能性多肽的情况下，所述感兴趣基因 的功能性多肽也可以用作治疗剂。如上文概括的，在基因沉默的情况下，例如在癌中，发现 肿瘤抑制基因通常被沉默。这可以用脱甲基药物或HDAC抑制剂治疗，并且通过本发明的方 法监测。当使用所述方法时，可以导入感兴趣的基因序列编码的功能性肿瘤抑制多肽，并且 施加额外的积极疗效。
同样，在一个实施方案中，本发明的方法可以用于调整脱甲基药物或RNAi的剂 量，以便获得感兴趣的基因的表达的减少或增加。此外，该方法可以用于测试不同的甲基化 试剂或RNAi，以便分别地分开或与其它脱甲基药物和RNAi组合鉴定最有效的脱甲基药物/ RNAi0这适用于体内和体外状况两者。在体外方案，如上文提到的细胞培养系统中，可以优 选使用本发明的方法，从而筛选对感兴趣的基因表达的改变具有影响的化合物。因此，它可 以用作用于测试可能作用于基因表达的药物的快速筛选系统。本发明的方法或核酸在一个实施方案中可以用于送递脱甲基药物和监测所述药 物的送递并且同时监测所述药物诱导的感兴趣的基因的表达的增加。相应地，本发明的方 法或核酸在另一个实施方案中可以用于送递RNAi，监测所述RNAi的送递并且同时监测所 述RNAi诱导的感兴趣的基因的表达的减少。这也适用于体内和体外状况两者。本发明的另外的优选实施方案涉及1.非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与影响所述感兴趣的基因的表达的化合物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述化合物诱导的所述感兴趣的基因的表达的改变 赋值。2.在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的根据1的方法，该方法至少 包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含a.甲基化的启动子序列；b.与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；c.与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加 赋值。3.根据权利要求1的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含aa)甲基化的启动子序列；
bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加 赋值。4.在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的根据1的方法，该方法至少 包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含aa)启动子序列；dd)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；ee)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。5.根据权利要求1的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含a.启动子序列；b.与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；c.与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道 多肽水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。6.根据1-5的任一项的方法，其中通过声致穿孔、局部注射或脂质体袋，或其混合 辅助的转染将所述核酸分子和/或所述RNAi导入所述细胞，所述脂质体袋携带用于正确靶 向、鉴定和定位的抗宿主细胞抗原的抗体。7.分离的核酸分子，所述核酸分子包含a)甲基化的启动子序列；b)与其操作性连接的编码感兴趣的基因多肽的序列；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；24
其中包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端 的单个终止密码子。8.根据7的核酸分子，其中感兴趣的基因是肿瘤抑制基因或怀疑由于其沉默而导 致疾病的基因。9.分离的核酸分子，该核酸分子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列。其中包含b)和C)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端 的单个终止密码子。10.根据9的核酸分子，其中编码非功能性多肽的感兴趣的基因序列包含完整的 感兴趣基因序列的一部分或含有至少一个插入、至少一个缺失、至少一个核苷酸交换或其 混合物的完整的感兴趣的基因序列，从而获得感兴趣的基因的非功能性多肽，但是，其中感 兴趣的基因序列不包含终止密码子。11.根据9和10的核酸分子，其中感兴趣的基因是癌基因、原癌基因或怀疑由于其 超量表达而导致疾病的基因。12.根据1-6的任一项的方法用于在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物 接触时随时间监测所述细胞中所述感兴趣的基因的表达，从而监测所述化合物的效果的用途。13.根据1-6的任一项的方法用于送递影响细胞中感兴趣的基因的表达的化合 物、监测所述化合物的送递，以及同时监测所述化合物诱导的对所述感兴趣的基因的表达 的影响的用途。14.根据1-6的任一项的方法用于调整影响感兴趣的基因的表达的化合物的剂 量，从而获得所述感兴趣的基因的表达的进一步改变的用途。15.根据2和3的方法用于测试不同的脱甲基药物，从而分开或组合鉴定最有效的 脱甲基药物的用途。16.根据4和5的方法用于测试针对一种感兴趣的基因定制的不同RNAi，从而分 开或组合鉴定最有效的RNAi的用途。17.根据7-11的核酸分子用于在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触 时随时间监测所述细胞中所述感兴趣的基因的表达，从而监测所述化合物的效果的用途。13.根据7-11的核酸分子用于送递影响细胞中感兴趣的基因的表达的化合物、监 测所述化合物的送递，以及同时监测所述化合物诱导的对所述感兴趣的基因的表达的影响 的用途。14.根据7-11的核酸分子用于调整影响感兴趣的基因的表达的化合物的剂量，从 而获得所述感兴趣的基因的表达的进一步改变的用途。15.根据7-11的核酸分子用于测试不同的脱甲基药物，从而分开或组合鉴定最有 效的脱甲基药物的用途。16.根据7-11的核酸分子用于测试针对一种感兴趣的基因定制的不同RNAi，从而 分开或组合鉴定最有效的RNAi的用途。25
应该理解实施例和附图不解释为限制性的。本领域技术人员可以明确预见本文展 示的原理的其它修饰。实施例当将针对Her-2neu(已知在乳腺癌中超量表达的基因)定制的RNAi转染到乳腺 癌组织中时，非介入性监测所述组织中Her-2neU表达的方法的方案图1描述其步骤的示意图。步骤1 制备DNA构建体。所述构建体包含已知在乳腺癌组织中有活性的人启动 子。编码区与所述启动子操作性连接。该编码区包含与荧光蛋白(如GFP)的基因融合的 Her-2neu基因。例如通过移码突变修饰了 Her_2neu序列，使得表达Her_2neu的非功能性 多肽。在3’末端，荧光蛋白基因的序列与Her-2neU序列融合，使得得到的蛋白转录为一个 融合蛋白，并且得到的荧光多肽是功能性的。这表示在本实施例中，在Her-2neU序列中导 入的移码突变得到了在荧光蛋白的编码序列起始处导入的另外的移码突变的补偿，从而编 码功能性的荧光蛋白，如GFP。步骤2 然后，例如，通过注射携带构建体并且优选为了靶向的手段而携带抗乳腺 癌细胞抗原的抗体的脂质体袋，将上述构建体转染到乳腺癌组织中。应该注意，该靶向步骤 对于下面的显现步骤可能是有益的，因为仅仅检测癌组织。但是，这也可以在以下情况下实 现上文描述的启动子仅仅在乳腺癌细胞中有功能，这样，编码区(因此，荧光蛋白)仅仅在 这些细胞中表达。在任一情况下，融合基因在包含Her-2neU的非功能性结构域和功能性荧 光蛋白结构域如GFP的癌细胞中表达。步骤3 显现荧光蛋白结构域，由此乳腺癌组织发亮。这可以通过使用在特定波 长激发荧光蛋白的光学成像装置，然后检测在相应波长发射的光来完成。可以使用紫外 光来激发GFP，然后检测发射的绿色的光。优选地，可以使用红外光激发的化合物和/或 诸如亮远红荧光蛋白的化合物[例如公开于Shcherbo D. et al.，Nature Methods 4， 741-746(2007)]。步骤4 然后将针对Her-2neu定制的双链RNAi转染到乳腺癌组织中。这也可以 通过注射携带RNAi构建体并且优选为了靶向的手段而携带抗乳腺癌细胞抗原的抗体的脂 质体袋来完成。步骤5 现在阻断步骤2中导入的融合基因的表达和内源Her-2neu基因的表达。 这是通过选择性阻断从相应mRNA的翻译的RNAi实现的。由于Her-2neu基因与编码荧光 蛋白的序列的融合，荧光蛋白的表达也被阻断。因此，在RNAi的转染后，完全没有荧光蛋白 或仅仅小量荧光蛋白存在于乳腺癌组织中。步骤6 再次，在相应组织中显现荧光蛋白结构域。如上文阐述的，可以用紫外光 激发GFP，然后检测发出的绿色光。优选地，也可以使用由红外光激发的化合物。在导入的 RNAi导致从融合基因转录的mRNA的完全翻译阻断的情况下，不能检测到荧光蛋白。这样， 不再能够显现乳腺癌组织。在减少的情况下，与步骤3检测到的信号相比，信号更弱。总体 上，这强烈表明内源Her-2neU表达也完全被阻断，因此，实现了肿瘤抑制。概言之，以非介入的方式体内监测了 RNAi在乳腺癌组织中的疗效。
权利要求
1.非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含 aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列； cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与影响所述感兴趣的基因的表达的化合物接触；d)在步骤c)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道多肽 水平；f)基于步骤e)中的比较，给所述化合物诱导的所述感兴趣的基因的表达的改变赋值。
2.在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的根据权利要求1的方法，该方法 至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含a.甲基化的启动子序列；b.与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；c.与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽； C)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤C)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道多肽 水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加赋值。
3.根据权利要求1的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含 aa)甲基化的启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列； cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；c)使所述细胞与脱甲基药物接触；d)在步骤c)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道多肽 水平；f)基于步骤e)中的比较，给脱甲基药物诱导的所述感兴趣的基因的表达的增加赋值。
4.在体内非介入性监测细胞中感兴趣的基因的表达的根据权利要求1的方法，该方法 至少包括以下步骤a)将核酸分子导入所述细胞中，所述核酸分子包含 aa)启动子序列；bb)与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因的非功能性多肽的序列；cc)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；C)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤c)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道多肽 水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。
5.根据权利要求1的方法，该方法至少包括以下步骤a)将核酸分子导入人或动物体外的细胞中，所述核酸分子包含a.启动子序列；b.与其操作性连接的编码所述感兴趣的基因多肽的序列；c.与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；b)通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；C)使所述细胞与针对所述感兴趣的基因定制的RNAi接触；d)在步骤c)后通过非介入性光学成像方法检测所述细胞中的荧光报道多肽；e)比较在步骤b)中检测到的荧光报道多肽水平与在步骤d)中检测到的荧光报道多肽 水平；f)基于步骤e)中的比较，给RNAi诱导的所述感兴趣的基因的表达的减少赋值。
6.根据权利要求1-5的任一项的方法，其中通过声致穿孔、局部注射或脂质体袋，或其 混合辅助的转染将所述核酸分子和/或所述RNAi导入所述细胞，所述脂质体袋携带用于正 确靶向、鉴定和定位的抗宿主细胞抗原的抗体。
7.分离的核酸分子，该核酸分子包含a)甲基化的启动子序列；b)与其操作性连接的编码多肽的序列，所述多肽选自包含CADMl(SEQ ID No. 2)、 Rb (SEQ ID No. 1)、ZMYND10(SEQ ID No. 3)、RASSF5 (SEQ ID No. 4)、PTEN (SEQ ID No. 5), SERPINB5 (SEQ ID No. 6)、EPB41L3 (SEQ ID No. 7)禾口 DAPKl (SEQ ID No. 8)的多肽组；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和c)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端的单 个终止密码子。
8.分离的核酸分子，该核酸分子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码非功能性多肽的序列，所述非功能性多肽选自包含VEGF(SEQ ID No. 10)、RAS (SEQ ID No. 11), Wnt (SEQ ID No. 12)、MYC (SEQ ID No. 13)、ERK (SEQ ID No. 14)禾口 TRK (SEQ ID No. 15)的多肽组；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和c)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端的单 个终止密码子。
9.根据权利要求8的核酸分子，其中编码选自包含VEGF(SEQ IDNo. 10)、RAS (SEQ ID No. 11), Wnt (SEQ ID No. 12)，MYC (SEQ ID No. 13)、ERK (SEQ ID No. 14)禾口 TRK (SEQ IDNo. 15)的多肽组的非功能性多肽的序列包含完整序列的一部分或含有至少一个插入、至少 一个缺失、至少一个核苷酸交换或其混合物的完整序列，从而获得非功能性多肽，但是，其 中该序列不包含终止密码子。
10.分离的核酸分子，该核酸分子包含a)启动子序列；b)与其操作性连接的编码Her-2neU(SEQID No. 9)的非功能性多肽的序列，其中所述 序列包含至少一个插入、至少一个核苷酸交换或其混合物，从而获得非功能性多肽，但是其 中该基因序列不包含终止密码子；c)与其操作性融合的编码荧光报道多肽的序列；其中包含b)和c)的编码序列包含位于5’末端的单个起始密码子和位于3’末端的单 个终止密码子。
11.根据权利要求1-6的任一项的方法或根据权利要求7-10的任一项的核酸分子用于 在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触时随时间监测所述细胞中所述感兴趣的 基因的表达，从而监测所述化合物的效果的用途。
12.根据权利要求1-6的任一项的方法或根据权利要求7-10的任一项的核酸分子用于 送递影响细胞中感兴趣的基因的表达的化合物、监测所述化合物的送递，以及同时监测所 述化合物诱导的对所述感兴趣的基因的表达的影响的用途。
13.根据权利要求1-6的任一项的方法或根据权利要求7-10的任一项的核酸分子用于 调整影响感兴趣的基因的表达的化合物的剂量，从而获得所述感兴趣的基因的表达的进一 步改变的用途。
14.根据权利要求2和3的方法或根据权利要求7的核酸分子用于测试不同的脱甲基 药物，从而分开或组合鉴定最有效的脱甲基药物的用途。
15.根据权利要求4和5的方法或根据权利要求8-10的核酸分子用于测试针对一种感 兴趣的基因定制的不同RNAi，从而分开或组合鉴定最有效的RNAi的用途。
全文摘要
本发明涉及在细胞与影响感兴趣的基因的表达的化合物接触时，非介入性监测所述细胞中所述感兴趣的基因的表达的方法。本发明也涉及包含编码序列的不同的分离的核酸分子。所述编码序列包含编码感兴趣的基因多肽的感兴趣的基因序列，所述序列与编码荧光报道多肽的报道序列融合，并且与启动子序列操作性偶联。本发明也涉及本发明的方法和核酸用于送递影响细胞中感兴趣的基因表达的化合物、监测所述化合物的送递，以及同时监测所述化合物诱导的对所述感兴趣的基因的表达的影响的用途。
文档编号C12N15/62GK102046795SQ200980119396
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月14日 优先权日2008年5月27日
发明者C·米塔尔, N·迪米特罗瓦 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司