专利名称：揭示传染性海棉状脑病-tse病理机制的实验模型与方法
技术领域：
本发明涉及了一种揭示揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法。它涉及生命科学领域、及医药领域。
背景技术：
传染性海棉状脑病-TSE是一类可以侵袭多种不同物种动物及人类中枢神经系统的退行性脑病，潜伏期长，具有100％致死率，并可在不同物种哺乳动物间传播。自1730年首次报道羊瘙痒病以来，目前已经在20多种哺乳动物动物及人类中发现了自然发生或感染的TSE，其中包括人类的克-雅氏病-CJD、羊瘙痒病-Scrapie、疯牛病-BSE等。动物及人类传染性海棉状脑病-TSE典型病理学改变表现为，造成动物中枢神经系统脑组织出现海棉状空泡变性，蛋白淀粉样沉积、神经元丢失与反应性胶质增生。自美国科学家Prusiner在1992年，把能够引发动物传染性海棉状脑病-TSE仅对被感染动物中枢神经系统造成严重病理损伤、对外周神经系统及其它器官也有一定损伤的致病传染因子确定为，一种不含核酸、具有自我复制能力的感染性蛋白颗粒——PrPSc-朊病毒以后，现代科学对传染性海棉状脑病-TSE进行了大量的相关科学研究。已经揭示了传染性海棉状脑病-TSE的致病传染因子，是由一种在人的细胞中和许多种哺乳动物的细胞中都存在的PrP基因正常表达的，蛋白分子三维空间构象含有40％α-螺旋没有β折叠的正常PrP朊蛋白——PrPc所转化出的，蛋白分子三维空间构象含有43％β-折叠的不正常PrP朊蛋白感染性蛋白颗粒——PrPSc朊病毒蛋白；因而使其获得了能够与细胞所表达的，蛋白分子三维空间构象含有40％α-螺旋没有β折叠的正常PrP朊蛋白——PrPc相结合，再将PrPc复制为蛋白分子三维空间构象含有43％β-折叠的不正常PrP朊蛋白感染性蛋白颗粒——PrPSc朊病毒蛋白，造成动物中枢神经系统脑细胞组织出现海棉状空泡变性，蛋白淀粉样沉积、神经元丢失与反应性胶质增生的，超出了现代生命科学的传统认识思维的朊病毒蛋白也能够具有自我复制性、传染性、致病性的特殊生物生命性质。但是现代生命科学对感染性蛋白颗粒——PrPSc-朊病毒的致病机制、与相关辅助致病因子、及辅助致病因子的致病机制等许多相关细节问题仍然没有搞清楚。
因而现代生命科学必须在针对传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤感染动物中枢神经系统的综合致病机制中所必不可少的各种相关辅助致病因子、与相关辅助致病因子的综合致病机制的综合基础科学研究方面，及科学认识思维、科学方法取得具有开拓创新重大科学突破；需要从认识揭示传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤动物及人的中枢神经系统综合致病机制中所必不可少的各种相关辅助致病因子、及相关辅助致病因子的致病机制细节问题入手，进行系统的、深入细致的综合生命科学研究，并取得科学突破，才能够在PrPSc-朊病毒严重损伤动物及人的中枢神经系统的综合致病机制的科学研究方面，取得科学突破。使现代生命科学未来能够通过认识揭示PrPSc-朊病毒需要与某些必不可少的相关辅助致病因子协同、才能严重损伤动物及人的中枢神经系统的综合分子致病机制，及它们的分子生物调控靶位，而寻找出可以有效抑制PrPSc-朊病毒严重损伤中枢神经系统所必不可少的、相关辅助致病因子的分子生物损伤致病机制，进而才会寻找出可以有效抑制传染性海棉状脑病-TSE的治疗方法、及药物！
发明内容
本发明公开了一种揭示传染性海棉状脑病-TSE辅助致病因子的实验与方法通过建立由TSE致病传染因子——PrPSc所造成的，严重损伤脑中枢神经组织、及脑中枢神经元细胞的TSE模型，一定程度损伤脊髓中枢神经组织、及脊髓中枢神经元细胞的TSE模型，与仅轻微损伤或不损伤外周神经组织、及某些种神经元细胞和某些种非神经细胞的对比NTSE模型；由增、减辅助致病因子的外加条件所造成的，能够增强PrPSc损伤缺乏辅助致病因子的神经元细胞和非神经细胞的TSE模型、减轻PrPSc损伤中枢神经元细胞的NTSE模型，与它们相应的那些缺乏辅助致病因子的神经元细胞和非神经细胞、仅会受到PrPSc轻微损伤或不会受到损伤的对比NTSE模型；并制作能够清楚显示表达那些模型的组织形态学、细胞形态学、亚分子形态学的变化与改变，可以通过计算机成象系统显示出它们的高清晰立体成象的，高质量的连续断层切片电镜标本。揭示传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤动物及人的中枢神经系统综合致病机制中所必不可少的某些种相关辅助致病因子、及相关辅助致病因子的致病机制。
本发明的目的是，提供一种揭示传染性海棉状脑病-TSE辅助致病因子的实验与方法。通过系统的建立由TSE致病传染因子——PrPSc所造成的，严重损伤脑中枢神经组织、及脑中枢神经元细胞的TSE模型，一定程度损伤脊髓中枢神经组织、及脊髓中枢神经元细胞的TSE模型，与仅轻微损伤或不损伤缺乏辅助致病因子的外周神经组织、及某些种神经元细胞和某些种非神经细胞的对比NTSE模型；由增、减辅助致病因子的外加条件所造成的，能够增强PrPSc损伤缺乏辅助致病因子的神经元细胞和非神经细胞的TSE模型、减轻PrPSc损伤中枢神经元细胞的NTSE模型，与它们相应的那些缺乏辅助致病因子的神经元细胞和非神经细胞、仅会受到PrPSc轻微损伤或不会受到损伤的对比NTSE模型；并制作能够清楚显示表达那些模型的组织形态学、细胞形态学、亚分子形态学的变化与改变，可以通过计算机成象系统显示出它们的高清晰二维、三维图象的，高质量的连续断层切片电镜标本。系统的对比分析由TSE致病传染因子——PrPSc所造成的，那些TSE模型标本与对比NTSE模型标本的组织形态学、细胞组织形态学发生的变化与改变的不同；对比分析由增添含有辅助致病因子外加条件所造成的那些增强PrPSc损伤的TSE模型标本，与它们相应的那些缺乏辅助致病因子仅会受到PrPSc轻微损伤或不会受到损伤的对比NTSE模型标本的，组织形态学、细胞组织形态学发生的变化与改变的不同。而能够揭示出传染性海棉状脑病(TSE)致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤动物及人的中枢神经系统综合致病机制，与综合致病机制中所必不可少的某些种相关辅助致病因子，及相关辅助致病因子的致病机制。使现代生命科学未来能够通过认识揭示PrPSc-朊病毒需要与某些必不可少的相关辅助致病因子协同，才能严重损伤动物及人的中枢神经系统的综合分子致病机制，及它们的分子生物调控靶位，而寻找出可以有效抑制PrPSc-朊病毒严重损伤中枢神经系统所必不可少的、相关辅助致病因子的分子生物损伤致病机制，进而才会寻找出可以有效抑制传染性海棉状脑病(TSE)的治疗方法、及药物！具体实施方式
为达到上述目的，实施本发明采用的方案准备传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子——PrPSc。
PrPSc可取自于自然中存在的羊瘙痒病—Scrapie发病动物、疯牛病-BSE发病动物、人克-雅氏病-CJD病人的TSE病变脑组织，可将其制作小块或均匀浆或提取的PrPSc。
但是，最好还是要采用基因重组具有复制生物活性的PrPSc，因为脑组织中存在PrPSc辅助致病因子可能会对以下的TSE实验造成干扰。可以通过克隆羊瘙痒病-Scrapie、人克-雅氏病-CJD、疯牛病-BSE的PrP表达基因，在原核或真核表达系统表达生产基因重组的羊、人、牛的，三维空间构象正常的PrP朊蛋白——PrPc。应用液相色谱法-HIC、IEC、SEC、AFC对表达系统表达生产的基因重组的蛋白及羊、人、牛的PrP朊蛋白——PrPc，实施复性提纯、及改变它的蛋白分子三维空间构象，获得由人工改变出含有β-折叠三维构象的基因重组的PrPSc。自1994年就有人首先利用AFC法，对基因重组的人朊病毒-rhPrion实施成功的复性——1.Sinha D，Bakhshi M，Vora R.Bio Techniques，1994，17509～514-2.Zahn R，Von Schroetter C，Wuthrich K.FEBS Lett，1997，417(3)400～404。“如果疏水色谱固定相给变性蛋白提供过高的能量，变性蛋白可能折叠成某些自然中不存在，但构象稳定的折叠中间体——摘自于耿信笃，白泉用疏水色谱复性并同时纯化蛋白质的机理及其应用；中国科学B辑，2002年10月等32卷第5期”。相关于能够将原核或真核表达系统表达生产的基因重组蛋白实施复性提纯的细节问题、与具体的科学方法，可向疏水色谱法HIC的发明人耿信笃等人直接请教、联系。电话86-029-8303817，8302808；传真86-029-8303817E-ailxdgeng@nwu.edu.cn。系统的建立由TSE致病传染因子——PrPSc所造成的，严重损伤脑中枢神经组织、及脑中枢神经元细胞的TSE模型，一定程度损伤脊髓中枢神经组织、及脊髓中枢神经元细胞的TSE模型，与仅轻微损伤或不损伤缺乏辅助致病因子的外周神经组织、及某些种神经元细胞和某些种非神经细胞的对比NTSE模型；由增、减辅助致病因子的外加条件所造成的，能够增强PrPSc损伤缺乏辅助致病因子的神经元细胞和非神经细胞的TSE模型、减轻PrPSc损伤中枢神经元细胞的NTSE模型，与它们相应的那些缺乏辅助致病因子的神经元细胞和非神经细胞、仅会受到PrPSc轻微损伤或不会受到损伤的对比NTSE模型；并制作能够清楚显示表达那些模型的组织形态学、细胞形态学、亚分子形态学的变化与改变，可以通过计算机成象系统显示出它们的高清晰二维、三维图象的，高质量的连续断层切片电镜标本。
创造动物神经组织TSE、NTSE对比模型及形态学标本实验1应用目前已有的生物个体遗传差异最小的近交系实验大鼠品种，特别繁殖出，实验需要用8只必须是同胎出生的同性鼠，能够使所创造的各种不同的TSE实验动物模型、与对照NTSE实验动物模型的生物个体遗传差异再近一步减小而可以忽略不计，每组需要有8只必须是同胎出生的同性鼠的，3组共24只同性近交系实验大鼠；将分为1、2、3组，每组8只实验大鼠分别编号1、2、3、4、5、6、7、8号。在每组实验鼠生长到80天时，分别给每组的1~2号鼠的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用脑定位仪和微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；在每组实验鼠生长到130天时，分别给每组的3~4号鼠的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用脑定位仪和微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；在每组实验鼠生长到180天时，分别给每组的5~6号鼠的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用脑定位仪和微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；创造具有不同PrPSc感染发病期的TSE的实验动物模型，每组的7~8号作没有受到PrPSc感染具有正常命机制的对照NTSE实验动物模型。在230天时，分别将24只实验大鼠麻醉后固定，应用4％多聚甲醛、0.2％戊二醛、0.2％苦味酸的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)400ml冷的4℃固定液实施活体灌注，速度10ml/mim、15mim后，分别取出每只实验大鼠的完整的脑组织、脊髓定位接种点处半径0.5cm的脊髓组织、颈上神经结。把取出的第1、2组实验鼠的神经组织保存在上述不含戊二醛的4℃固定液中备用。把取出的第3组实验鼠的6个TSE脑组织、6个TSE被接种处的脊髓组织、6个TSE颈上神经结、2个NTSE脑组织、2个NTSE对照处的脊髓组织、2个NTSE颈上神经结，分别制作出可以同时特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中表达存在形态，能够清楚显示表达标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态的，高质量的扫描电镜连续断层切片标本。通过计算机图像分析仪，利用这些能够清楚显示表达标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态，可以特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中的表达存在形态的，各种TSE模型标本、与对照NTSE模型标本的高质量的扫描电镜连续断层切片的标本图像，做各种不同的二维或三维TSE综合图像对比形象定量分析，二维或三维TSE、NTSE综合图像对比形象定量分析，就可以显示揭示实验大鼠的脑中枢神经组织被PrPSc接种感染以后，脑中枢神经组织、脑中枢神经元细胞、及它们的亚分子细胞器逐渐发生TSE病理损伤改变形态的变量，PrPc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的脑中枢神经组织中、脑中枢神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量，PrPSc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的脑中枢神经组织中、脑中枢神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量；显示揭示实验大鼠的脊髓中枢神经组织被PrPSc接种感染以后，脊髓中枢神经组织、脊髓枢神经元细胞、及它们的亚分子细胞器逐渐发生TSE病理损伤改变形态的变量，PrPc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的脊髓中枢神经组织中、脊髓中枢神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量，PrPSc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的脊髓中枢神经组织中、脊髓中枢神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量；显示揭示实验大鼠的颈上神经结组织被PrPSc接种感染以后，颈上神经结组织、颈上神经结神经元细胞、及它们的亚分子细胞器逐渐发生TSE病理损伤改变形态的变量，PrPc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的颈上神经结组织中、颈上神经结神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量，PrPSc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的颈上神经结组织中、颈上神经结神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量。而能够创造出一个，可以综合显示揭示传染性海棉状脑病-TSE严重损伤动物实验大鼠脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤动物脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞的综合致病机制；一定程度损伤动物实验大鼠脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度损伤动物脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞的综合致病机制；仅轻微损伤动物实验大鼠外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，轻微损伤动物外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞的综合致病机制的；综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台。
特别繁殖出实验需要用8只必须是同胎出生的同性鼠，能够使所创造的各种不同的TSE实验动物模型、与对照NTSE实验动物模型的生物个体遗传差异再近一步减小而可以忽略不计的，8只必须是同胎出生的同性近交系实验大鼠的方法在目前已有的生物个体遗传差异最小的近交系实验大鼠品种繁殖种群的，青年繁殖母鼠中特别选出若干只刚生育过3~5胎、头胎产仔不少于10只、以后产仔不少于12只、6~9月龄母性好的青年繁殖母鼠。从1只9~12月龄健康的青年种雄鼠体中人工采取精液，应用流式细胞仪、或免疫磁珠细胞分离技术，分选出精液中的X精子、或Y精子，对发情的青年繁殖母鼠实施人工授精；使人工授精的青年繁殖母鼠能够产出10~14只同性鼠。母乳哺育仔鼠2周后，对仔鼠实施定时、定量人工母乳哺育2周后，初选出不同个体之间的体重差不超过3g的仔鼠；再实施定时、定量饲养到80天，选出8只不同个体之间的体重差不超过5g的同胎出生的同性鼠。
制作可以同时特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中表达存在形态，能够清楚显示表达标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态的高质量的扫描电镜连续断层切片标本的方法把取出的第3组实验鼠的脑组织置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定浸泡4~6h后，把取出的脊髓组织、神经结组织置于上述固定液中固定浸泡1~2h后，用PBS液漂洗5次，每次20mim；分别对每一个神经组织块做震动切片厚20μm连续断层切片、或应用恒冻箱冷冻切片机做10μm连续断层切片；将每个神经组织的连续断层切片分别编号；将组织切片放入15％甘油、20％蔗糖的PBS液中浸泡沉底后，用液氮速0.5~1mim后，用PBS液迅速回温，再用PBS液漂洗5次，每次5mim后；用0.1/mol/L甘氨酸漂洗10mim，灭活自由醛基；用含有1％BSA的无钙Dulbecco’sPBS液漂洗15mim，以阻断对一抗的非特异结合；组织切片用适当稀释的、由10nm胶体金标记的PrPc一抗4℃孵育24h后，再在室温继续孵育2h，用无钙Dulbecco’sPBS液漂洗5次，每次5mim，以除去未结合的一抗；用含有1％BSA的无钙Dulbecco’sPBS液漂洗15mim；用适当稀释的、由20nm胶体金标记的PrPSc二抗4℃孵育24h后，再在室温继续孵育2h，用无钙Dulbecco’sPBS液漂洗5次，每次5mim，以除去未结合的二抗；室温下用2％多聚甲醛、2％戊二醛的4℃固定液中再固定1h；用0.1/mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗；可在暗房中再进行银加强染色、亦可不做银加强染色；置于1％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的4℃固定液中固定2h后；浸泡于2％单宁酸、5％戊二醛中做导电处理2h；用4℃双蒸馏水冲洗3次，每次1h；再用1％锇酸4℃固定2h；做脱水处理。首先制作出可以同时特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中表达存在形态的，扫描电镜连续断层切片标本；先用扫描电镜对切片标本做30000倍扫描放大图像，并在计算机中储存图像。而后将切片标本镀膜制作出能够清楚显示表达标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态的高质量的扫描电镜连续断层切片标本；再用扫描电镜对切片标本做30000倍扫描放大图像，并在计算机中储存图像。再将同一切片标本的2种扫描放大电镜图像，用计算机图像分析仪做综合图像分析、处理制作出那个切片标本的，可以同时特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中表达存在形态，能够清楚显示表达标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态的，高质量的扫描放大电镜图像。
由于本项实验是应用生物个体遗传差异最小的近交系实验大鼠品种特别繁殖出的8只同胎出生的同性鼠，创造揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台，能够使这个综合科学实验平台中的所有TSE实验动物模型、与对照NTSE实验动物模型的生物个体遗传差异再进一步减小，而可以忽略不计。因而能够通过计算机图像分析仪，对这个综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台所获得的，能够清楚显示表达各种TSE模型标本、与对照NTSE模型标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态，可以特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中的表达存在形态的，高质量的扫描电镜连续断层切片的标本图像，做各种不同的二维或三维TSE综合图像处理、对比形象定量分析，二维或三维TSE、NTSE综合图像处理、对比形象定量分析；显示揭示传染性海棉状脑病-TSE的综合病理机制，TSE传染致病因子——PrPSc的综合致病机制，与综合致病机制中所必不可少的相关辅助致病因子、及相关辅助致病因子的致病机制。例如将具有不同PrPSc感染发病期的TSE的实验动物模型、对照NTSE实验动物模型的脑中组织相同部位切片标本的高质量的扫描放大电镜图像，用计算机图像分析仪做各种不同的二维或三维TSE综合图像处理、对比形象定量分析，二维或三维TSE、NTSE综合图像处理、对比形象定量分析；能够显示揭示实验大鼠的脑中枢神经组织被PrPSc接种感染以后，脑中枢神经组织、脑中枢神经元细胞、及它们的亚分子细胞器逐渐发生TSE病理损伤改变形态的变量，它们的TSE病理损伤改变发生过程-机制；PrPc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的脑中枢神经组织中、脑中枢神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量，与调控它们的PrPc蛋白分子表达形态发生病理改变的过程-机制，及它的病理改变的过程-机制必须依赖某种或某些种能够调控PrPc蛋白分子发生病理表达改变的辅助因子——即由脑中枢神经细胞组织所表达分泌的、PrPSc综合致病机制中所必不可少的辅助致病因子；PrPSc蛋白分子在逐渐发生TSE病理损伤的脑中枢神经组织中、脑中枢神经元细胞中、及它们的亚分子细胞器中的表达存在形态逐渐发生改变的变量，与PrPSc蛋白分子能够趋向病变组织、细胞中浓缩沉积损伤病理改变的过程-机制，及它的病理改变的过程-机制必须依赖某种或某些种PrPSc浓缩沉积的趋化辅助因子、或结合载体蛋白辅助因子——即由脑中枢神经细胞组织所表达分泌的、PrPSc综合致病机制中所必不可少的辅助致病因子。应用相同的方法能够显示揭示传染性海棉状脑病-TSE一定程度损伤动物实验大鼠脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度损伤动物脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞的综合致病机制；以及它与严重损伤动物实验大鼠脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制的不同，和综合致病机制的不同，是由在脊髓中枢神经细胞组织中、不表达分泌PrPSc综合致病机制中某些种辅助致病因子。应用相同的方法能够显示揭示传染性海棉状脑病-TSE仅轻微损伤动物实验大鼠外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，轻微损伤动物外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞的综合致病机制；以及它与严重损伤动物实验大鼠脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制的不同，和综合致病机制的不同，是由在外神经结细胞组织中、不表达分泌PrPSc综合致病机制中某些种所必不可少起关键作用的辅助致病因子。
在目前已有的近交系实验动物小鼠的品种中，能够寻找到比近交系实验大鼠品种生物个体遗传差异更小的近交系实验小鼠品种；可以应用近交系实验动物小鼠的品种中，生物个体遗传差异最小的近交系实验动物小鼠品种，创造综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台。应用近交系实验动物兔，繁殖出多只同胎出生的同性兔，创造综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台，由于实验兔的体型大于实验大鼠10倍，而具有更好的操作性。传染性海棉状脑病-TSE羊瘙痒病-Scrapie的传染致病因子——PrPSc，是引发疯牛病-BSE的、再由疯牛病-BSE传染致病因子——PrPSc引发人类的克-雅氏病-CJD的传染源。通过应用羊创造综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台，与应用近交系实验大鼠创造综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台，近交系实验小鼠创造综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台，近交系实验动物兔创造综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台，综合揭示多种不同物种哺乳动物的传染性海棉状脑病(TSE)严重损伤动物脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤动物脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞的综合致病机制；一定程度损伤动物脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度损伤动物脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞的综合致病机制；仅轻微损伤动物外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，轻微损伤动物外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞的综合致病机制；在不同哺乳动物物种间存在的相同性、相似性、相异性，具有重大科学研究意义。创造动物羊神经组织TSE、NTSE对比模型及形态学标本实验2实验应用10只新出生的绵羊；最好是能够应用曾经过长期自我封闭繁殖的小繁殖种群中，特别选出不同个体的形态性状、与遗传差异都尽可能相似的新生绵羊；分别编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10号。在新生羊出生后0~3天，分别给1~2号羊的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；在新生绵羊生长到50天时，分别给3~4号羊的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；在新生绵羊生长到100天时，分别给5~6号羊的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；在新生绵羊生长到150天时，分别给7~8号羊的中脑中央灰质、腰椎脊髓灰质、颈上神经结3个部位，应用微量注射器分别定位、定量接种，10ug基因重组具有复制生物活性的PrPSc、或动物TSE病变脑组提取的PrPSc；创造具有不同PrPSc感染发病期的TSE的实验动物模型，9~10号羊作没有受到PrPSc感染具有正常命机制的对照NTSE实验动物模型。在1~2号实验羊中有一羊表现出病态时、或实验羊生长到200天时；分别将10只实验羊麻醉后固定，取出颈上神经结置于4℃固定液中，应用4％多聚甲醛、0.2％戊二醛、0.2％苦味酸的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)冷的4℃固定液，分别对中脑脑室、脊髓腔室内实施活体灌注，速度10ml/mim、30mim后，分别取出每只实验羊的中脑定位接种点处半径1.5~2cm的脑组织、脊髓定位接种点处半径1.5~2cm的脊髓组织。
将上述实验羊的神经组织分别制作出，可以同时特异区分显示出PrPc蛋白分子和PrPSc蛋白分子，在模型标本的组织中、细胞中、亚分子细胞器中表达存在形态，能够清楚显示表达标本的组织形态、细胞形态、亚分子形态的，高质量的扫描电镜连续断层切片标本。通过用计算机图像分析仪做各种不同的二维或三维TSE综合图像处理、对比形象定量分析，二维或三维TSE、NTSE综合图像处理、对比形象定量分析，创造出一个，可以综合显示揭示传染性海棉状脑病-TSE严重损伤动物实验羊脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，严重损伤动物脑中枢神经系统、与脑中枢神经元细胞的综合致病机制；一定程度损伤动物实验羊脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，一定程度损伤动物脊髓中枢神经系统、与脊髓中枢神经元细胞的综合致病机制；仅轻微损伤动物实验羊外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞所表达发生的病理变化与改变的微观量变，与微观量变发生过程-机制，致病传染因子——PrPSc-朊病毒，轻微损伤动物外神经结组织、与外神经结组织神经元细胞的综合致病机制的；综合TSE、NTSE实验动物模型科学实验平台的方法，完全类同于实验1。
权利要求
1.一种揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于应用传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子PrPSc(3)。接种多只近交系实验动物(1)。的神经组织(2)。创造具有不同神经组织(2)。TSE病理改变的实验动物模型；分别把TSE实验动物模型的TSE病变神经组织(2)。制作标本，对比分析不同TSE神经组织标本形态的不同，揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制。
2.根据权利要求1中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于多只近交系实验动物(1)。是同胎出生的同性近交系实验动物。
3.根据权利要求1中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于多只近交系实验动物(1)。是同胎出生的同性近交系实验动物小鼠。
4.根据权利要求1中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于多只近交系实验动物(1)。是同胎出生的同性近交系实验动物大鼠。
5.根据权利要求1至4中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于神经组织(2)。是动物的脑中枢神经组织。
6.根据权利要求1至4中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于神经组织(2)。是动物的脊髓中枢神经组织。
7.根据权利要求1至4中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于神经组织(2)。是动物的神经结组织。
8.根据权利要求1至7中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子PrPSc(3)。是动物TSE病变脑组织。
9.根据权利要求1至7中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子PrPSc(3)。是由动物TSE病变脑组织中提取的PrPSc。
10.根据权利要求1至7中所述的揭示传染性海棉状脑病-TSE病理机制的实验模型与方法，其特征在于传染性海棉状脑病-TSE致病传染因子PrPSc(3)。是基因重组PrPSc。
全文摘要
揭示传染性海棉状脑病－TSE病理机制的实验模型与方法，涉及生命科学领域、及医药领域。提供了一个能够系统的、逐步深入地揭示传染性海棉状脑病－TSE致病因子PrP
文档编号G09B23/00GK1529298SQ031544
公开日2004年9月15日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者叶新新 申请人:叶新新