专利名称：乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法
技术领域：
本发明涉及一种骨转移处理方法，尤其是一种建立医疗研究平台(乳腺癌骨转移机制研究平台)过程中使用的移植骨的处理方法，属于医疗研究技术领域。
背景技术：
众所周知，乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，随着普查技术和治疗水平的提高，早期乳腺癌的5年存活率达到98％以上，而转移性乳腺癌预后很差，5年存活率仅21％。骨是乳腺癌转移的好发部位之一，发生率在80％以上，并可导致骨骼疼痛，病理性骨折、神经压迫症状和高钙血症，严重降低了病人的生活质量，目前尚无有效的治疗手段。因而对乳腺癌骨转移的研究深受人们重视，无论是研究其机理，还是开发预防或治疗骨转移的药物，均需要乳腺癌骨转移的动物模型，故乳腺癌骨转移的研究已日趋成为国内外防治乳腺癌的热点之一。
据申请人了解，目前乳腺癌骨转移动物模型建立方法有四大类自发性乳腺癌骨转移动物模型、化学诱导乳腺癌骨转移动物模型、转基因诱导乳腺癌骨转移动物模型、癌细胞种植乳腺癌骨转移动物模型，其中前三大类动物模型因极少、甚则不发生骨转移、高钙血症等严重缺陷，故研究价值极低，实际运用极少。
癌细胞种植乳腺癌骨转移动物模型是通过将来源于自发性或诱发性动物乳腺肿瘤细胞株或人类乳腺癌细胞株，通过瘤细胞悬液注射、瘤组织小块接种等方法将肿瘤原位或异位植入动物体内而产生骨转移。优点是周期短、成本低、可使实验动物带有同样的肿瘤，生长速度较一致，但成功率与种植方法显著相关。
目前主要有三种骨转移模型原位种植乳腺癌骨转移模型(成功率＜10％)、局部骨内注射制作骨转移模型(成功率95％～100％)和通过血流播散制作骨转移模型(成功率30％～90％)，但均存在明显缺陷，①原位种植乳腺癌骨转移模型，骨转移的发生率偏低。②局部骨内注射制作骨转移模型，主要为骨干的转移，与临床上常见的骨骺端转移不同，这种方法省略了骨转移的早期步骤，不能反映整个过程。③通过血流播散制作骨转移模型，包括心脏穿刺和尾静脉注射，不能反映肿瘤细胞的组织和种属特异性，而且容易产生多器官广泛转移，实验动物于骨转移形成之前往往死于全身衰竭。
总之，上述癌细胞种植乳腺癌骨转移动物模型存在诸多缺陷，明显影响此类模型在研究人乳腺癌骨转移病生理、诊断和防治方面的广泛运用。
发明内容
本发明申请人经过长期深入研究探索，寻找到以下乳腺癌骨转移机制研究的理想平台——通过采用胎儿骨/成人骨移植于Balb/c-nu小鼠，以模拟乳腺癌在人体内骨转移转移的真实过程，且人乳腺癌细胞株与移植骨具有同源同种性，与临床具有较高的可比性，从而建立能更好模拟人类乳腺癌骨转移病生理过程的理想动物模型，作为防治骨髓微转移、骨转移药物治疗效果的评价方法及乳腺癌骨转移机制研究的平台。在此过程中，骨移植前需要经过特定处理。
本发明的目的在于考虑到上述癌细胞种植乳腺癌骨转移动物模型存在诸多缺陷，提出一种可以确保待移植骨活性和后续研究实验效果的乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法，从而为建立乳腺癌骨转移机制的理想研究平台提供保障。
为了达到以上目的，本发明乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法包括以下步骤1)、取骨——在无菌条件下切取符合条件的引产胎儿股骨、胫骨、肱骨，或损伤性(关节置换、非炎性及非肿瘤截肢等)患者成人骨；2)、清洗——将取下的骨组织在体积百分比0.5％～1％碘伏液中浸泡清洗；碘伏液化学名为聚维酮碘，是一种广谱消毒剂，能杀死病毒、细菌、芽孢、真菌、原虫，尤其对乙型肝炎病毒有灭活作用，可以有效防止肝炎病毒传染给动物，引起动物的死亡而导致实验失败。浓度范围以0.5％～1％为佳，因为此浓度的碘伏液能有效预防感染，且刺激性较少，浓度过高对组织刺激性大，影响骨的活性，浓度过低则防治效果较差。
3)、消毒——将清洗后的骨组织放入生理盐水和丁胺卡那混合液中浸泡，生理盐水和丁胺卡那的混合比例为1000ml∶0.2～0.4单位，贴标签作好标记；丁胺卡那水溶性好，性质稳定，抗菌谱广，肾毒性较低，使用方便，价格便宜。浓度范围以1000ml∶0.2～0.4单位为佳，因为此浓度的液体能有效预防感染，浓度过高则肾毒性较强，易增加动物肾毒性死亡的风险。
4)、保存——将消毒后的待移植骨冷藏保存，温度控制在2℃～4℃。
在整个处理骨过程中，必须严格掌握无菌技术，尤其在取骨时，否则污染的移植骨移植后容易导致裸鼠感染而死亡；取骨时必须取具有活性的骨组织，病理改变的骨，如死骨、骨折骨、疏松症骨等均不能选用，否则易导致实验失败；冰箱温度不宜过低、过高，过低会影响骨的活性，造成资源浪费，过高骨活性易造破坏；此外，应严格按照上述药物浓度的配比，否则易导致实验的失败。
需要使用时，将保存的待移植骨切成一定体积的骨块置入生理盐水，在雌性裸鼠皮肤上切口，分离与待移植骨同体积皮下组织，将待移植骨块随机植入肌肉组织中，消毒后缝合皮肤即可。
之后，将裸鼠放入笼中常规饲养；对胎儿移植骨块、成人移植骨块的成活性进行检测，筛选最佳接种骨；筛选最佳的异种移植骨再次造模后随机分组，分别用不同的人乳腺癌细胞株通过左心注射法接种于裸鼠；通过形态学、免疫组化和影像学等方法对骨转移病灶的状况进行评价，并对采用不同乳腺癌细胞株时骨转移成功率进行比较。这样建立的防治骨髓微转移、骨转移药物治疗效果评价及乳腺癌骨转移机制研究平台具有较好的时效性，较高的临床可比性，简便、科学、实用性强等优点。
可以预计，由于本发明上述介绍的乳腺癌骨转移机制研究平台具有以上优点，因此将得到推广应用。届时，本发明的骨转移处理方法将具有提供待移植骨的产业化前景。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为与本发明相关的一个异植骨活性评价过程示意图。
图2为在本发明基础上建立的乳腺癌骨转移机制研究平台评价过程示意图。
具体实施例方式
实施例一以下为采用本发明的骨转移处理方法进行异植骨活性评价的具体过程1.取骨——用无菌巾包扎母体健康(要求母体无传染病史，胚胎HAsAg阴性)的胎龄6～8个月水囊引产胎儿，2h内无菌条件下切取双侧股骨、胫骨和肱骨置入经消毒的盒内；2、清洗——在盒内加入0.5％碘伏液浸泡清洗；3、消毒——倒掉浸泡清洗液后，加入生理盐水500毫升和丁胺卡那0.2U浸泡，贴好标签，注明胎儿月龄及取骨时间；4、保存——清洗后，置入2℃～4℃冰箱内贮存，贮存时间控制在4-48小时(平均14小时)。之后，进行以下步骤的植骨5、将保存的胎儿骨在游标卡尺测定下，用骨刀切成1cm×0.5cm×0.5cm大小的移植骨块，置入生理盐水中备用；6、取5-6周龄雌性裸鼠32只，随机分为实验组(n＝16只)、对照组(n＝16只)。实验组，在裸鼠脊柱中点取纵性皮肤切口长约1cm，分离皮下组织到背部肌肉，严密止血，在脊柱中点旁开1.5cm，将胎儿移植骨块按1∶1比例随机植入肌肉组织中，消毒后用1#无菌丝线缝合皮肤；对照组参照上述方法切开、缝合，而不植入移植骨。
7、将处理后的裸鼠放入笼中常规饲养。
接着，进行以下步骤的实验研究8、第4、8周分别随机取对照组、实验组裸鼠各8只，过形态学、免疫组化和影像学等方法对胎儿移植骨块的成活性进行检测；以上过程参见图1。结果表明1).用上述胎儿骨的取材、保存和植入方法，乳腺癌异种骨转移模型的异种骨成活率100％；2).乳腺癌异种骨转移模型(实验组)，胎儿异种骨成活率100％，异种骨转移率发生37.5～75.0％，死亡率0％；乳腺癌骨转移模型(对照组)，骨转移发生率12.5～50.0％，部位以股骨、椎骨为主，死亡率8.3％。
由此表明，采用本发明的骨转移处理方法可以有效保证待移植骨的活性和实验效果，从而为骨移植的成功创造了条件，为理想的新型乳腺癌骨转移机制研究平台的建立奠定了基础。
实施例二本实施例乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法步骤为1、取骨——在无菌条件下切取损伤性(关节置换、非炎性及非肿瘤截肢等)患者成人骨；注意供体标准应满足①无感染病史或体检无感染症状；②无结核、肝炎、梅毒、疟疾、艾滋病或麻风病史；③无肿瘤病史；④无严重创伤，主要包括大面积烧伤、多发性刺伤；⑤无自身免疫性疾病或骨代谢性疾病；⑥应用类固醇不超过3个月，大剂量应用不超过1周；⑦使用呼吸机不超过72小时；⑧无药物中毒及其它中毒史；⑨未接受过同位素检查或治疗；2、清洗——将取下的骨组织用无菌巾包扎，在0.5％碘伏液中浸泡清洗；以下步骤参照实施例一，不再赘述。结果表明，成人骨成活率达75％，故不如胎儿骨。选用胎儿骨是最佳乳腺癌异种骨转移模型的移植骨。
归纳起来，以上人体异种骨移植活性的验证结果表明①异植骨常规病理提示胎儿骨小梁没钙化、成骨细胞、破骨细胞、骨基质细胞及部分造血细胞成活，并观察到新生血管及骨；而成人骨部分见到骨小梁钙化，成骨细胞等坏死，无明显新生血管；②观察异植骨周围血管上皮细胞的种族起源，采用免疫组化法测定人血管上皮细胞特异性抗体(CD34)，提示胎儿异植骨中间部分血管CD34(+)，而周围部分CD34(-)，而成人异植骨部分中间部分血管CD34(-)，而周围部分CD34(-)；③核素显像均提示胎儿异植骨均有放射性核素浓聚(99m-Tc-MDP)。证实异植骨已成活。而成人异植骨部分无放射性核素浓聚。④胎儿骨成活率100％，成人骨成活率75％，统计学处理胎两者有显著差异(x2＝4.4286，p＝0.0353)，证实胎儿骨为最佳异植骨。
在以上研究实验的基础上，申请人参照图2所示的过程，进行了新型乳腺癌骨转移机制研究平台的有效性验证。
取裸鼠48只，随机分组，实验组24只，对照组24只，用胎儿移植骨造模成功后再随机分组，第一组对照组(n＝8只)、MCF-7组(n＝8只)，第二组对照组(n＝8只)、MDA-MB-435组(n＝8只)，第三组对照组(n＝8只)、MDA-MB-435组(n＝8只)，分别用上述人乳腺癌细胞株通过左心注射法接种于裸鼠；第8周处死裸鼠，通过形态学、免疫组化和影像学等方法对骨转移病灶的状况进行评价，并对采用不同乳腺癌细胞株时骨转移成功率进行比较。
验证结果表明乳腺癌异种骨转移模型(实验组)异种骨成活率100％，实验组异种骨转移发生率分别为37.5％(MCF-7组)，75％(MDA-MB-231组)，62.5％(MDA-MB-435组)，MDA-MB-435组仅1例发生裸鼠股骨转移，死亡率0％；乳腺癌骨转移模型(对照组)，骨转移发生率分别为12.5％，37.5％，50％，部位以股骨、椎骨为主，死亡率8.3％。
以上实验结果提示胎儿骨为最佳异植骨，乳腺癌异种骨转移模型的人体移植骨与裸鼠自身骨比较，对人乳腺癌细胞株表现出较高的亲和力，能较好地模拟人类乳腺癌骨转移的生理过程，与临床具有较高的可比性，故可作为防治骨髓微转移、骨转移药物治疗效果的评价方法及乳腺癌骨转移机制研究的理想平台。
权利要求
1.一种乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法，其特征在于包括以下步骤1)、取骨——在无菌条件下切取符合条件的引产胎儿股骨、胫骨、肱骨，或损伤性患者成人骨；2)、清洗——将取下的骨组织在体积百分比0.5％～1％碘伏液中浸泡清洗；3)、消毒——将清洗后的骨组织放入生理盐水和丁胺卡那混合液中浸泡，生理盐水和丁胺卡那的混合比例为1000ml∶0.2～0.4单位，贴标签作好标记；4)、保存——将消毒后的待移植骨冷藏保存，温度控制在2℃～4℃。
2.根据权利要求1所述乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法，其特征在于所述保存步骤中的贮存时间控制在4-48小时。
3.根据权利要求2所述乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法，其特征在于所述引产胎儿的胎龄为6～8个月。
4.根据权利要求3所述乳腺癌骨转移机制研究平台的骨转移处理方法，其特征在于将保存的待移植骨用骨刀切成1cm×0.5cm×0.5cm大小的移植骨块，置入生理盐水中备用。
全文摘要
本发明涉及一种建立乳腺癌骨转移机制研究平台过程中使用的移植骨的处理方法，属于医疗研究技术领域。该方法包括对引产胎儿骨或损伤性患者成人骨的取骨、清洗、消毒、保存步骤完成待移植骨的准备。之后，将骨组织移植到裸鼠体内，分别用不同的人乳腺癌细胞株通过左心注射法接种于裸鼠，通过形态学、免疫组化和影像学等方法对骨转移病灶的状况进行评价，并对采用不同乳腺癌细胞株时骨转移成功率进行比较，建立起防治骨髓微转移、骨转移药物治疗效果评价及乳腺癌骨转移机制研究的理想平台。由于本发明介绍的乳腺癌骨转移机制研究平台具有诸多，因此将得到推广应用。届时，本发明的骨转移处理方法将具有提供待移植骨的产业化前景。
文档编号G09B23/28GK1846646SQ200610038
公开日2006年10月18日 申请日期2006年3月10日 优先权日2006年3月10日
发明者王水, 凌立君, 刘晓安, 王凤良, 赵佳 申请人:王水