专利名称：激光共焦扫描显微镜的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种显微镜，特别是一种激光共焦扫描显微镜。
激光共焦扫描技术是最近几年迅速发展起来的一项高新技术，它是通过将共焦原理与高速激光扫描技术相结合，来获得物体的分层图象，并由计算机控制扫描层和进行图像处理，最终形成样品的三维形貌图像，它可广泛运用于生物医学、农业和材料科学等领域。发明人在98年3月23日向中国专利局提出了名称为“激光共焦扫描显微镜”的专利申请，专利申请号为98111188．2，该专利申请所述的激光共焦扫描显微镜是在德国Leica公司生产的TCS NT型激光共焦扫描显微镜和美国Bio rad公司生产的MRC-1024型激光共焦扫描显微镜基础上的改进。它在系统中采用一块45°设置的半反半透镜实现了激光激发光路、样品散射探测光路和观察光路三路合一的目的，与德国和美国的产品相比具有光路简单、结构紧凑、体积小巧且成本低廉的优点。但在实际使用中，该系统存在的不足是，由于采用了半反半透镜，使得激光在经过半反半透镜时有一半的光被浪费，同样，从样品散射出的散射光在透过半反半透镜进入探测系统时，也有一半被损失，这样就使得探测的信噪比大大降低，能量浪费很大，使得该系统只能适合于非荧光工作情况，如材料科学、金属表面等，而对于需要工作在荧光情况如生物医学、农业科学等效果较差，因此这一系统在实际使用中范围受到了限制。
本实用新型的目的在于提供一种既能适用于材料科学、金属表面，又能适用于生物医学、农业科学，且光路简单、结构紧凑、体积轻小的激光共焦扫描显微镜。
本实用新型是在专利申请“98111188．2”即“激光共焦扫描显微镜”基础上的进一步改进，为实现本实用新型的目的，其改进后的技术方案是这样的共焦扫描显微镜包括有激光激发光路、样品散射荧光探测光路和观察光路以及一个控制系统。激光激发光路包括有激光器和沿光路设置的聚焦透镜、X、Y扫描器、显微物镜；样品散射荧光探测光路有全反镜、显微物镜和光电倍增管；观察光路有承物台与纵深位移器、照明透镜、照明光源、反射棱镜和双目镜；X、Y扫描器和承物台与纵深位移器由控制系统中的计算机通过两个驱动器来分别控制驱动，光电倍增管的输出通过放大器进入计算机。本实用新型的特征在于，在激光激发光路中的聚焦透镜与X、Y扫描器之间的光路上顺序设置有小孔光兰、可变中性滤光片、中继透镜、激发滤光片和双色反射镜；在样品散射荧光探测光路中，双色反射镜与全反镜之间的光路上设置有抑制滤光片，显微物镜与光电倍增管之间的光路上，设置有与激光激发光路中小孔光兰共焦的另一小孔光兰；在双色反射镜与X、Y扫描器之间的光路上还设置有一块半反半透镜，它与其反射光路上的反射棱镜和双目镜构成显微镜的观察光路。在整个显微镜系统中，激发滤光片、双色反射镜和抑制滤光片是可替换的配对组合，它们可以根据被测样品所需的不同波带范围荧光要求，更换不同的组合，以保证系统的正常运作。其工作原理是当激光器发出的激光经聚焦透镜后聚焦到小孔光兰处，然后透过设置在一个可旋转圆盘上的某一光学密度的中性滤光片和中继透镜，再由组合配置中的激发滤光片滤出所需波长的激光，由双色反射镜将这一波长的激光全反射，并进入X、Y扫描器，在互相垂直方向上快速扫描，再经显微物镜的会聚，将激光聚焦至承物台与纵深位移器上的样品，此时，X、Y扫描器是由计算机操纵，通过驱动器控制进行快速扫描，计算机还通过另一驱动器对纵深位移器进行样品的纵深精密位移，这样就能使激光在样品上层层扫描，样品散射的荧光也就被顺序激发出来，被激发的荧光沿原光路返回至双色反射镜时，双色反射镜透射该波带范围的荧光，再由配套设置的抑制滤光片选择，充分地透过所需波带范围的荧光，经全反镜和显微物镜会聚，穿过小孔光兰，被光电倍增管接收，光电倍增管将接收的光信号转换为电信号后输出给放大器处理再送入计算机，由计算机对不断输入的样品三维数据进行处理，最终获得样品的三维形貌图像。
照明光源与照明透镜主要是为人眼观察样品提供照明，它的光照射样品后由半反半透镜反射、经反射棱镜后，由双目镜直接观察。
上述系统中，由于组合配置是可替换的，故当换上含有半反半透镜的组合配置时，则系统可用于非荧光工作情况。
本实用新型与现有技术相比，其显著的优点是由于采用了可替换的激发滤光片、双色反射镜和抑制滤光片组合，不但可以保留光路简化、结构紧凑、体积小和成本低廉的优点，还可以适用于各种荧光和非荧光样品的三维图像测试，能广泛应用于病理观察、解剖、生命科学、遗传学、血液、神经医学研究等有关医院、医学院以及材料科学、农业科学等研究机构。
本实用新型的具体结构由以下附图和实施例给出。
图1是根据本实用新型提出的激光共焦扫描显微镜的光路结构示意图。
图2是用于设置中性滤光片(4)的圆盘示意图。
以下结合附图，以波长范围为488nm和514．nm的激光共焦扫描显微镜为例，对本实用新型做进一步详细描述。
参见
图1，本实用新型所述的激光共焦扫描显微镜，它包括有氩离子激光器(1)和沿光路顺序设置的聚焦透镜(2)、小孔光兰(3)、可变中性滤光片(4)、中继透镜(5)、激发滤光片(6)、双色反射镜(7)、半反半透镜(8)、X、Y扫描器(9)、显微物镜(10)，它们构成了系统的激光激发光路；在双色反射镜(7)的透射光路设置有抑制滤光片(15)、全反镜(16)、显微物镜(17)、小孔光兰(18)和光电倍增管(19)，它们组成了系统的探测光路；在半反半透镜(8)的反射光路上设有反射棱镜(24)和双目镜(25)，它们与承物台与纵深位移器(11)、照明透镜(13)以及照明光源(14)构成了系统的观察光路。上述系统中激光器(1)的功率为50mw。小孔光兰(3)和小孔光兰(18)的孔径分别为5μm及20μm。设置时小孔光兰(3)位于聚焦透镜(2)的后焦点处，小孔光兰(3)又成像在被探测样品(12)的被扫描点处，在该点被激光激发的荧光又会聚到散射荧光探测光路的小孔光兰(18)处。系统设置了3块光学密度不同的中性滤光片(4)分布在一块可转动的圆盘上，还设有一个空档圆孔，见图2。它可以根据系统需要通过手动装置转动圆盘；将所需不同光学密度的中性滤光片(4)或空档圆孔转至光路处让激光透过。中继透镜(5)的设置应保证观察系统的观察面与激光的激发点在纵深上重合，激发滤光片(6)的滤波范围为488nm～514．5nm，双色反射镜(7)和抑制滤光片(15)应与激发滤光片(6)配对组合，即保证从激发滤光片(6)透过的激光经双色反射镜(7)全反射聚焦到被测样品(12)，后其散射的荧光能被双色反射镜(7)充分的透过，再被抑制滤光片(15)选择，光电倍增管(19)将接收的光信号转变为电信号输出，经放大器(20)处理后送入计算机(21)。在非荧光工作时，双色反射镜(7)应换为半反半透镜。
计算机(21)通过驱动器(22)控制X、Y扫描器(9)快速扫描样品的一层。计算机(21)又通过驱动器(23)控制承物台和纵深位移器(11)中的纵深位移器精密位移，使X、Y扫描器对样品(12)一层接一层的扫描，获得样品三维数据，从而获得样品的三维图像。
照明光源(14)为白炽灯，它通过照明透镜(13)后照射被测样品(12)，其透射光通过45°设置的半反半透镜(8)反射，再经反射棱镜(24)进入双目镜(25)，供人眼直接观看。
权利要求1.一种激光共焦扫描显微镜，它由激光激发光路、样品散射荧光探测光路、观察光路以及控制系统组合而成；激光激发光路包括有激光器[1]和沿光路设置的聚焦透镜[2]、X、Y扫描器[9]、显微物镜[10]；样品散射荧光探测光路有全反镜[16]、显微物镜[17]和光电倍增管[19]；观察光路有承物台与纵深位移器[11]、照明透镜[13]、照明光源[14]、反射棱镜[24]和双目镜[25]；X、Y扫描器[9]和承物台与纵深位移器[11]由控制系统中计算机[21]分别通过两个驱动器[22]和[23]控制与驱动，光电倍增管[19]的输出通过放大器[20]进入计算机[21]，其特征在于，在激光激发光路中聚焦透镜[2]与X、Y扫描器[9]之间的光路上顺序设置有小孔光兰[3]、可变中性滤光片[4]、中继透镜[5]、激发滤光片[6]和双色反射镜[7]；在样品散射荧光探测光路中，双色反射镜[7]与全反镜[16]之间的光路上设置有抑制滤光片[15]；在显微物镜[17]与光电倍增管[19]之间的光路上，设置有与小孔光兰[3]共焦的小孔光兰[18]；在双色反射镜[7]与X、Y扫描器[9]之间的光路上设置有半反半透镜[8]，它与其反射光路上的反射棱镜[24]和双目镜[25]构成显微镜的观察光路。
2.根据权利要求1所述的激光共焦扫描显微镜，其特征在于上述系统中，激发滤光片[6]、双色反射镜[7]和抑制滤光片[15]为可替换的配对组合。
专利摘要本实用新型公开了一种激光共焦扫描显微镜,它是由激光激发光电路、样品散射荧光探测光路、观察光路以及控制系统组合而成。本实用新型采用了一组由激发滤光片、双色反射镜、抑制滤光片组成的可替换配对组合,不但使系统保留了原有的光路简化、结构紧凑、体积小和成本低廉等优点,还使得系统实现了对各种荧光和非荧光样品的三维图像测试,可广泛应用于病理观察、解剖、生命科学、遗传学、血液、神经医学等有关医院、医学院以及材料科学、农业科学等研究机构。
文档编号G02B21/00GK2416510SQ0022010
公开日2001年1月24日 申请日期2000年4月25日 优先权日2000年4月25日
发明者陶纯堪, 高万荣, 卞松玲, 杨晓春, 黄琳, 胡茂海 申请人:南京理工大学