专利名称：发光试料摄像方法、发光细胞摄像方法及物镜的制作方法
技术领域：
本发明涉及对发光试料进行摄像的发光试料摄像方法及在该发光试料摄像方法中使用的物镜。此外，本发明涉及对导入了虫荧光素酶基因的发光细胞进行摄像的发光细胞摄像方法及在该发光细胞摄像方法中使用的物镜。
背景技术：
目前，在发光试料的观察中，进行来自发光试料的发光量的测量。例如，在导入了虫荧光素酶基因的细胞的观察中，为了调查虫荧光素酶基因的表达的强度(具体而言是表达量)，测量基于虫荧光素酶活性的来自细胞的发光量。并且，基于虫荧光素酶活性的来自细胞的发光量的测量是通过以下的步骤进行的首先将溶解了细胞的细胞溶解液与含有虫荧光素、ATP及镁等的基质溶液反应，接着通过利用光电子倍增管的光度计将来自与基质溶液反应后的细胞溶解液的发光量定量。即，发光量是在溶解了细胞后测量的。由此，能够将某个时刻的虫荧光素酶基因的表达量作为细胞整体的平均值来测量。这里，在将虫荧光素酶基因等的发光基因作为报告基因导入到细胞中的方法中，有例如磷酸钙法、脂质体 (Lipofectin)法及正电子法等，各方法根据目的及细胞的种类的不同而分开使用。此外，在作为报告基因而导入了虫荧光素酶基因的细胞中，在以基于虫荧光素酶活性的来自细胞的发光量为指标调查虫荧光素酶基因的表达的强度时，可以通过将目的DNA片段连接在导入到细胞中的虫荧光素酶基因的上游或下游，来调查该DNA片段给虫荧光素酶基因的复制带来的影响；此外，通过将认为会给导入到细胞中的虫荧光素酶基因的复制带来影响的复制因子等的基因连接在表达载体上并与虫荧光素酶基因一起表达，能够调查该基因的基因产物给虫荧光素酶基因的表达带来的影响。此外，为了沿着时间经过而捕捉发光基因的表达量，需要随时间经过测量来自活细胞的发光量。并且，来自活细胞的发光量的随时间经过的测量是通过以下步骤进行的 首先，对培养细胞的培养器添加作为分光测量计的光度计的功能，接着，利用光度计每一定时间测量来自培养中的整个细胞集团的发光量。由此，能够测量具有一定的周期性的表达节奏等，由此，能够捕捉细胞全体的发光基因的表达量的随时间经过的变化。另一方面，在发光基因的表达为一过性的情况下，在各个细胞中的表达量中有较大的偏差。例如，即使是 HeLa细胞等的克隆的培养细胞，通过细胞膜表面的受体做出的药剂的响应在各个细胞中也有偏差。进而，分光测量法虽然较迅速，但容器内的细胞数越多光强度越高，所以难以区别表达量和细胞数。因而，分光测量法的表达量缺乏定量性。即，有的情况下作为细胞全体的响应没有被检测到而几个细胞响应。因此，在发光基因的表达是一过性的情况下，不是从细胞全体而是从各个细胞随时间经过测量发光量是很重要的。并且，使用显微镜的来自活的各细胞的发光量的随时间经过的测量由于各细胞的发光很弱，所以是通过液体氮温度水平的冷却CCD摄像机长时间曝光、或使用安装有图像增强器的CCD摄像机和光子计数装置来进行的。由此，能够捕捉活的各细胞的发光基因的表达量的随时间经过的变化。最近，在生物学领域及医学领域的研究中，以活的试料为对象的图像的动态变化的随时间经过的观察的必要性增加。具体而言，在利用发光或荧光观察的研究领域中，为了捕捉试料内的蛋白质分子的动态功能表达而要求延时或运动图像摄像。在现状中，进行以荧光试料为对象摄影的图像的动态变化的观察(例如利用荧光的蛋白质单分子的运动图像观察)。在荧光试料的摄像的情况下，由于有通过持续照射激励光而从荧光试料发出的光量随着时间的经过而减少的性质，所以随着时间经过拍摄能够在定量的评价中使用的稳定的图像是很困难的，但是能够以较短的曝光时间拍摄鲜明的、即空间分辨率较高的图像。另一方面，在以发光试料为对象的图像的动态变化的随时间经过的观察中，由于来自发光试料的发光极弱，所以在发光试料的观察中，使用安装有图像增强器的CCD摄像机进行。在发光试料的摄像的情况下，由于不需要照射激励光，所以能够随时间经过拍摄能够在定量的评价中使用的稳定的图像。但是，在对微弱的发光的发光试料进行摄像的情况下，由于来自发光试料的发光量极少，所以有拍摄鲜明的图像所需的曝光时间变长的问题。此外，由于摄像的时间间隔受每单位时间的光量的制约，所以在对微弱的发光的发光试料进行摄像的情况下，有即使能够以很长的时间间隔、例如以60分钟以上的间隔随时间经过拍摄鲜明的图像，也很难以比较短的时间间隔、例如20 30分钟的间隔连续拍摄鲜明的图像的问题。进而，有以非常短的时间间隔、例如5 10分钟间隔使发光试料图像化是非常困难的问题。因此，能够以小于5分钟的间隔例如1 3分钟的间隔得到鲜明的图像是预料外的情况。一般，摄像所需的时间越长，表达量的变动分析越不正确，定量性越低。
发明内容
本发明是鉴于上述问题而做出的，目的是提供一种即使是发光量较少的发光试料也能够以较短的曝光时间、进而实时地拍摄鲜明的图像的发光试料摄像方法、发光细胞摄像方法及物镜。为了解决上述的问题而达到目的，本发明的技术方案1所述的发光试料摄像方法，对发光试料进行摄像，其特征在于，使用由数值孔径NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2 的值为0.01以上的物镜。此外，本发明是关于发光细胞摄像方法的发明，本发明的技术方案8所述的发光细胞摄像方法，对导入了虫荧光素酶基因的发光细胞进行摄像，其特征在于，使用由数值孔径NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上的物镜。此外，本发明是关于物镜的发明，本发明的技术方案9所述的物镜，在对发光试料进行摄像的发光试料摄像方法中使用，其特征在于，由数值孔径NA及投影倍率β表示的 (ΝΑ+β)2的值为0.01以上。此外，本发明是关于物镜的发明，本发明的技术方案16所述的物镜，在对导入了虫荧光素酶基因的发光细胞进行摄像的发光细胞摄像方法中使用，其特征在于，由数值孔径NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上。此外，本发明是关于物镜的发明，本发明的技术方案17所述的物镜，在对发光试料进行摄像的发光试料摄像方法中使用，其特征在于，在该物镜及/或包装该物镜的包装容器上标记有由数值孔径NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值。在有关本发明的发光试料摄像方法中，使用由数值孔径(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上的物镜。由此，具有如下效果即使是发光量较少的发光试料(例如发光蛋白质(例如从导入的基因(例如虫荧光素酶基因)表达的发光蛋白质)、 发光性的细胞或发光性的细胞的集合体、发光性的组织试料、发光性的个体(例如动物或脏器等)等)，也能够以较短的曝光时间、进而实时地拍摄鲜明的图像。此外，在有关本发明的发光细胞摄像方法中，由于使用由数值孔径(NA)及投影倍率(β)表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上的物镜，所以具有如下效果能够以导入了虫荧光素酶基因的发光细胞为摄像对象、以较短的曝光时间进而实时地拍摄鲜明的图像。此外，本发明的物镜由于由数值孔径(NA)及投影倍率(β)表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上，所以具有如下效果即使是发光量较少的发光试料(例如发光蛋白质(例如从导入的基因(例如虫荧光素酶基因)表达的发光蛋白质)、发光性的细胞或发光性的细胞的集合体、发光性的组织试料、发光性的个体(例如动物或脏器等)等)，也能够以较短的曝光时间、进而实时地拍摄鲜明的图像。具体而言，具有如下效果能够以导入了虫荧光素酶基因的发光细胞为摄像对象、以较短的曝光时间进而实时地拍摄鲜明的图像。此外，本发明的物镜与以往的物镜相比具备数值孔径较大和倍率较小两者，所以如果使用本发明的物镜则能够高分辨率拍摄较大范围。由此，能够将例如移动的发光试料或分布在较大范围内的发光试料作为摄像对象。此外，本发明的物镜在该物镜及/或包装该物镜的包装容器(包装)上标记有由数值孔径(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+ β )2的值(例如0. 01以上)。由此，具有如下效果例如进行发光图像观察的人只要确认标记的(ΝΑ+ β )2的值，就能够容易选择适合以较短的曝光时间进而实时拍摄发光试料的物镜。进而，本发明人还发现，在相同的培养皿内培养的多个细胞中，基因表达的变动模式不同。进而，根据本发明者钻研的光学条件，表明在用数值孔径(NA)/投影倍率(β)的平方表示摄像装置的物镜的光学条件为0. 071以上的情况下，能够提供在1 5分钟以内进行图像化、还能够进行图像分析的细胞图像。将通过储存型的摄像装置对这些发光图像进行显微镜观察的发光分析系统称作发光显微镜。发光显微镜优选地具有具备用来遮光的开闭盖(或开闭窗)的遮光机构，通过该遮光机构的开闭来设置或更换所需的生物体试料。根据目的，也可以通过手动或自动地进行对收容生物体试料的容器进行化学或物理刺激的操作。在后述的本发明的优选的一实施方式中，发光显微镜搭载有公知或独自的培养装置。培养装置具备将温度、湿度、ΡΗ、外部空气成分、培养基成分、培养液成分维持为最佳的功能，以便能够长期间进行系统内的分析。
图1是表示用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置的结构的一例的图。图2是表示标记有(ΝΑ/ β )2的值的物镜2的一例的图。图3是简略地表示物镜的图。图4是表示目前市售的一般的显微镜的物镜的像的亮度(ΝΑ/ β)2的一例的图。
图5是表示在实施例1中使用的物镜的数值孔径(NA)及投影倍率(β )的条件的图。图6是表示在实施例2中使用的物镜的数值孔径(NA)及投影倍率(β )的条件的图。图7是表示在实施例2中摄像的HeLa细胞的图像的图。图8是表示在实施例3中使用的物镜的数值孔径(NA)的条件的图。图9是表示在实施例3中摄像的HeLa细胞的图像的图。图10是表示在实施例3中使用的物镜的(ΝΑ/β )2的值与图9所示的图像的发光强度的关系的图。
具体实施例方式以下，基于附图详细地说明本发明的发光试料摄像方法、发光细胞摄像方法及物镜的实施方式。另外，并不由该实施方式来限定本发明。参照图1说明用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置的结构。图1是表示用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置的结构的一例的图。如图1所示，用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置是用来在较短的曝光时间内进而实时地对作为摄像对象的样本1进行摄像的装置，由物镜2、聚光透镜3、CXD摄像机4和监视器5构成。另外，该装置也可以还具备如图示那样的变焦透镜6。样本1是发光试料，例如是发光蛋白质(例如从导入的基因(虫荧光素酶基因、水母发光蛋白基因、本y夕夕基因等)表达的发光蛋白质)、发光性细胞、发光性细胞的集合体、发光性组织试料、发光性的脏器、发光性的个体(动物等)。此外，样本ι具体而言也可以是导入了虫荧光素酶基因的发光细胞。这里，作为发光试料的来源的生物学材料可以举出例如真核动物、来自蓝色细菌的细胞或组织。在医学用途中，可例示包括从哺乳类、特别是人的要检查的部位通过活组织检查切除的细胞的试料。在再生医疗中，至少一部分是人工改良或合成的生物体试料，能够用于检查是否良好地维持生物学活性的目的。另一方面，本发明的检测对象并不限于来自动物的细胞或生物体组织，也可以是来自植物或昆虫的细胞或生物体组织。在菌、病毒中，能够将通过以往的光度计不能执行的容器内的各部分的分析作为对象。通过将无数的试料(例如每1孔(well) 100万个以上)累积在孔或培养皿等容器内，能够通过光度计迅速地得到强大的发光量。在本发明中，由于生成了通过肉眼完全看不到的各个发光试料的图像，所以即使各个细胞以能够识别的程度的密度收容在容器内，也能够分析个别的细胞乃至生物体组织。这样的个别的分析包括仅将发光的细胞统计性合计或平均化的分析方法。由此，能够进行有关每1个细胞的正确的相互作用的评价。此外，在混合存在多个的发光试料中，能够识别具有同样的发光量或发光模式的细胞群或组织区域。作为收容样本1的试料容器，可以举出培养皿、玻璃载片、微板、流腔(flow cell)。这里，容器底面当然是透光性的材料(玻璃、塑料等)，更优选为具有宽度较宽(或扁平)的底面的容器，以便容易得到2维数据。在将多个收容部分一体化的孔或试管中，各收容部分的分隔部分整面优选由遮光性的材料或染料成形。此外，对于培养皿等具有上部开口的容器，优选地覆盖防蒸发用的盖，并且对盖的内表面实施防反射用的覆膜或染色对于提高S/N比方面更优选。也可以代替这样的硬质的盖而在容器内的试料的上表面上配置矿物油那样的液状的盖。也可以使用来载置试料容器的试料台如一般的显微镜那样在X轴方向及Y轴方向上移动，根据需要而变更为其它摄像用的视场。物镜2的由数值孔径(NA) 及投影倍率(β)表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上。这里，物镜2也可以以倒立形式配置在样本1的下方。物镜2也可以通过适当的加热机构(珀耳帖元件、热风加热器等)加热，以使活的发光试料在如培养条件的恒温环境下稳定地发挥功能。物镜2还可以在作为光轴方向的Z轴方向上驱动(在图中是上下方向)。装备有Z轴驱动机构，将物镜2沿着Z 轴(光轴方向)自动驱动。作为物镜2的Z轴驱动机构，作为例子可以举出齿条小齿轮机构及摩擦辊机构。此外，物镜2根据希望的倍率可以适当地做成油浸式。此外，选择哪个倍率可以根据要评价(或分析)的试料的尺寸而任意地设定。具体而言，可以是能够观察细胞及组织的程度的低倍率(例如从5倍到20倍)或者能够观察细胞内或细胞外的微小物质的程度的高倍率(例如从40倍到100倍)。聚光透镜3将经由物镜2到达的来自样本1 的发光聚集。CXD摄像机4是0°C左右的冷却CXD摄像机，经由物镜2及聚光透镜3对样本 1进行摄像。监视器5输出由CXD摄像机4拍摄的图像。此外，优选地通过监视器5具备以运动图像显示发光试料的图像信息的机构，提供以实时的影像观察有关1个以上的希望的细胞的活性的变化那样的分析方法。由此，能够以具有临场感和跳动感的影像，按时间序列观察细胞单位或组织单位的发光状况。并且，在物镜2及物镜2的包装容器(包装)上，标记(ΝΑ/β)2的值。这里，参照图 2对标记了(ΝΑ/β)2的值的物镜2的一例进行说明。图2是表示标记了(ΝΑ/β)2的值的物镜2的一例的图。在以往的物镜上，标记有透镜种类(例如“PlanApo”)、倍率/NA油浸(例如“100X1.40oil”)及无限远/盖玻璃厚(例如“⑴/0.17”)。但是，在本发明的物镜(物镜2)上，除了透镜种类(例如“PlanApo”)、倍率/NA油浸(例如“ 100X 1. 40oil”)及无限远/盖玻璃厚(例如“⑴/0.17”)以外，还标记有射出开口角(例如“(嫩邝)2:0.05”)。如以上说明，在用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置中，物镜2的由数值孔径(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+ β)2的值为0. 01以上。由此，即使是发光量较少的发光试料(例如发光蛋白质(例如从导入的基因(例如虫荧光素酶基因)表达的发光蛋白质)、发光性的细胞或发光性的细胞的集合体、发光性的组织试料、发光性的个体(例如动物或脏器)等)，也能够以较短的曝光时间、进而实时地拍摄鲜明的图像。具体而言，以导入了虫荧光素酶基因的发光细胞为摄像对象，能够以较短的曝光时间、进而实时地拍摄鲜明的图像。此外，物镜2与以往的物镜相比，数值孔径较大且倍率较小，所以如果使用物镜2 则能够以高分辨率摄像较大范围。由此，能够将例如有活动的发光试料或移动的发光试料、 或分布在较大范围内的发光试料作为摄像对象。此外，物镜2在该物镜2及/或包装该物镜2的包装容器(包装)上标记了由数值孔径(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+ β )2的值(例如0. 01以上)。由此，如果例如进行发光图像观察的人确认了标记的(ΝΑ+ β)2的值，则能够容易选择适合以较短的曝光时间、进而实时地对发光试料进行摄像的物镜。以往，在使用虫荧光素酶基因的报告基因检测中，由于在将细胞溶解后测量发光量，所以只能捕捉某个时刻的表达量，并且成为作为细胞全体的平均值的计测。此外，在一边培养一边进行的计测中，虽然能够捕捉细胞群体的表达量的随时间经过的变化，但不能捕捉各个细胞中的表达量的变化。并且，为了通过显微镜观察各个细胞的发光，由于来自活的细胞的发光量极弱，所以必须利用液氮温度水平的冷却CCD摄像机长时间曝光，或利用安装有图像增强器的CCD摄像机进行光子计数等。因此，发光检测的摄像机成为昂贵而大规模的设备。但是，在通过显微镜观察表示作为报告基因产物的虫荧光素酶活性的各个细胞的发光时，如果利用用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置，则能够不安装图像增强器而使用0°C左右的冷却CCD摄像机取得定量的图像。即，如果利用用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置，则能够通过0°C左右的冷却CCD摄像机观察在活的状态下各个细胞的发光，所以不需要用来进行图像增强器或光子计数的装置。即，能够以低成本进行发光试料的摄像。此外，如果利用用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置，则能够一边培养一边随时间经过观察各个活的细胞的发光，还能够实时地观察。此外，如果利用用来实施本发明的发光试料摄像方法的装置，则对于相同的细胞能够监视不同条件下的药剂或刺激的响应。这里，为了使本发明的发光试料摄像方法、发光细胞摄像方法及物镜的理解变得容易，对以往的物镜及使用它的发光图像观察简单地进行说明。一般，显微镜观察中的空间分辨率ε用下述的算式1表示。ε =0.61 X λ+NA......(算式 1)(在算式1中，λ是光的波长，NA是数值孔径。)此外，观察范围的直径d用下述的算式2表示。d = D+M......(算式 2)(在算式2中，D是视场数，M是倍率。另外，视场数一般为22至沈。)以往，显微镜用物镜的焦距在国际标准中为45mm。并且，最近开始使用使焦距为 60mm的物镜。如果以该焦距为前提设计NA较大、即空间分辨率较高的透镜，则动作距离 (WD) —般为0.5mm左右，此外，在长WD设计的透镜中也是8mm左右。在使用这样的物镜的情况下，观察范围是0. 5mm直径左右。但是，在进行分散到盘或玻璃底盘上的细胞群或组织、个体的观察的情况下，有时观察范围会达到Icm 几cm。在想要以高分辨率观察这样的范围时，必须在低倍率的同时以较大的值维持NA。换言之，由于NA是透镜半径与焦距的比，所以能够在NA较大的状态下观察较大范围的物镜需要是低倍率的。结果，这样的物镜成为大口径。另外，在大口径的物镜的制造中，一般对于光学材料的物性的均勻性或镀层的均勻性、还有对透镜形状也要求较高的精度。此外，在显微镜观察的情况下，光学系统的透过率、物镜的数值孔径、C⑶摄像机的芯片面上的投影倍率及CCD摄像机的性能等对图像的亮度有较大的影响。并且，图像的亮度是通过将数值孔径(NA)用投影倍率(β)除后的值的平方、即(ΝΑ/β)2来评价的。这里， 如图3所示，在物镜中，一般在入射开口角NA与射出开口角ΝΑ’之间有下述算式3的关系， NA' 2是表示达到观察者的眼睛或CXD摄像机等的亮度的值。NA，= NA+ β......(算式 3)(在算式3中，NA是入射开口角(数值孔径)，ΝΑ，是射出开口角，β是投影倍率。)在一般的物镜中，ΝΑ，较高是0.04，ΝΑ，2是0.0016。此外，调查了目前市售的一般的显微镜的物镜的图像的亮度(ΝΑ/β )2的值，如图4所示，是从0. 0005到0. 002的范围。但是，即使利用安装有图4所示的目前市售的物镜的显微镜，例如观察在细胞内表达虫荧光素酶基因并发光的细胞，也不能通过目视观察来自该细胞的发光，并且即使观察使用冷却到0°C左右的CCD摄像机摄像的发光图像也不能确认来自细胞的发光。另外，在观察发光试料的情况下，不需要荧光观察所需的激励光的投影。例如，在落射荧光观察中， 物镜满足激励光投影透镜和将荧光聚光而形成图像的透镜的两者的功能。所以，为了通过图像观察光量较少的发光，需要具有较大的NA和较小的β的特性的物镜。并且，结果该物镜有变为大口径的趋势。另外，在这样的物镜中，要求不考虑激励光投影的功能而使功能简单化以便容易设计、制造。此外，在利用发光或荧光观察的研究领域中，为了捕捉试料内的蛋白质分子的动态的功能表达而要求延时(time lapse)或运动图像摄影。最近，进行利用荧光的蛋白质单分子的运动图像观察。在这些摄像中，单位时间的摄像帧数越多，图像每1帧的曝光时间越短。在这样的观察中，需要明亮的光学系统、特别是明亮的物镜。但是，由于发光蛋白质的光量比荧光少，所以每1帧的摄像大多需要例如20分钟的曝光时间。以这样的曝光时间进行延时观察仅限于动态变化非常缓慢的试料。例如，在约1小时内分裂一次的细胞中，不能观察其周期内的变化。因而，为了在较高地维持信噪比的同时将较少的光量高效地图像化， 提高光学系统的亮度是很重要的。遵循以上的内容制造的本发明的物镜与一般市售的物镜(例如参照图4)相比，具有较大的NA和较小的β的特性。由此，本发明的物镜的ΝΑ’ 2是较大的值。S卩，本发明的物镜可以说是明亮的物镜。由此，如果使用本发明的物镜那样的明亮的物镜，则能够利用图像观察来自光量较少的发光试料的发光。此外，为了观察更暗的像，通过将数值孔径较大的本发明的物镜安装在实体显微镜上，即使不安装图像增强器，通过冷却到0°C左右的CXD摄像机也能够通过图像观察细胞的发光。此外，虽然有使用液氮冷却的CCD摄像机提高灵敏度的方法，但在此情况下CCD摄像机变得非常昂贵、大规模。此外，如果仅单纯地提高灵敏度，则外来噪声也增加，所以高S/N比的测量很困难。但是，如果使用本发明的物镜，则通过珀耳帖冷却的CCD摄像机也能够通过图像观察细胞的发光，所以能够不导致外来噪声(例如宇宙射线)造成的S/N比降低而正确地进行发光测量。此外，本发明的物镜是例如5 IOcm左右的大口径。由此，能够将以往不能作为摄像对象的移动的发光试料、或分布在较大范围、例如相当于5 50mm直径、优选为例如10 30mm直径的区域中的发光试料等作为摄像对象。该较大的观察范围可以通过物镜的倍率及变焦机构自如地调节。以上的本发明的方法及装置也可以通过用来控制所需的装置结构或联动的软件或以该软件为特征的计算机程序的方式来提供。此外，通过将本发明的方法或装置与相同或单独配置的数据库电连接，能够不受图像容量或分析信息量的限制而提供高速且可靠性与质量较高的分析结果。实施例1在本实施例1中，研究能够通过图像观察导入了虫荧光素酶基因的HeLa细胞的发光那样的物镜的(ΝΑ/β)2的条件。本实施例1的摄像对象(上述实施方式中的样本1)是转染了虫荧光素酶基因 "pGL3 control vector" ( 口乂力社(公司名))的HeLa细胞。另外，在该HeLa细胞的发光图像观察时，在将HeLa细胞转染后培养1天，用通过Hanks平衡盐类溶液清洗后，置换为含有ImM的虫荧光素的Hanks平衡盐类溶液。在本实施例1中使用的物镜(上述实施方式中的物镜2)的数值孔径(NA)及投影倍率(β )的条件如图5所示。图5是表示在实施例1中使用的物镜的数值孔径(NA)及投影倍率(β)的条件的图。如图5所示，物镜的NA 是从0. 074到0. 4的值，物镜的β是从0. 27到1. 5的值。在本实施例1中使用的CXD摄像机(上述实施方式中的CCD摄像机4)是0°C的冷却CCD摄像机，该CCD摄像机的像素数是765 X 510、像素尺寸是9 μ mX9 μ m、芯片的面积是6. 89X4. 59 (mm2)、量子效率是550nm 下55%的规格。另外，在本实施例1中，HeLa细胞的摄像是在将所使用的整个装置(例如参照图1)用暗幕覆盖的状态下进行的。在本实施例1中，如图5所示，示出了在研究的所有的(ΝΑ/β)2的条件下能够进行发光图像的观察的情况。由此，表示只要使用(ΝΑ/β)2为0.071以上的物镜，就能够进行导入了虫荧光素酶基因的HeLa细胞的发光图像观察。实施例2在本实施例2中，以不同的曝光时间研究能够通过图像观察导入了虫荧光素酶基因的HeLa细胞的发光那样的物镜的(ΝΑ/β)2的条件。本实施例2的摄像对象与上述的实施例1相同。此外，在本实施例2中使用的物镜的数值孔径(NA)及投影倍率(β )的条件如图6所示。图6是表示在实施例2中使用的物镜的数值孔径(NA)及投影倍率(β)的条件的图。另外，在本实施例2中使用的物镜对应于上述实施例1的图5记载的“0. 4Χ”、“0. 83Χ”及“1. 5Χ”。此外，在本实施例2中使用的C⑶摄像机与上述的实施例1相同。并且，曝光时间如图6所示，是1分钟或5分钟。另外，与上述的实施例1同样，在本实施例2中，HeLa细胞的发光图像摄像也在将所使用的整个装置用暗幕覆盖的状态下进行。在本实施例2中，如图7所示，在利用“0. 4Χ”的物镜以5分钟的曝光时间拍摄的图像Α、利用“0. 83Χ”的物镜以5分钟的曝光时间拍摄的图像B、利用“1. 5Χ”的物镜以5分钟的曝光时间拍摄的图像C、以及利用“1. 5Χ”的物镜以1分钟的曝光时间拍摄的图像D的所有的图像中，能够进行发光图像观察。从而，在使用(ΝΑ/β)2为0.071以上的物镜的情况下，即使曝光时间为1分钟，也能够进行导入了虫荧光素酶基因基因的HeLe细胞的发光图像观察。实施例3在本实施例3中，将能够通过图像观察导入了虫荧光素酶基因的HeLa细胞的发光那样的物镜的(ΝΑ/β)2的条件设为更高倍率来进行研究。本实施例3的摄像对象与上述的实施例1或实施例2相同。此外，在本实施例3中使用的物镜是奥林巴斯公司制造的“UApo40X Oil Iris”。另外，物镜的数值孔径(NA)的条件如图8所示，各数值孔径(NA)是通过改变物镜的光圈来设定的。图8是表示在实施例3 中使用的物镜的数值孔径(NA)的条件的图。如图8所示，数值孔径(NA)的值是从0.65到 1.35。并且，物镜(A E)的投影倍率(β)的值在聚光透镜中都设定为8倍。由此，如图 8所示，物镜的(ΝΑ/β )2的值在0. 007 0. 028内变动。此外，在本实施例3中使用的CXD 摄像机是奥林巴斯公司制造的“DP30BW”，其工作温度为5°C，像素数是1360X10M，像素尺寸是6 μ mX6 μ m，芯片的面积(mm2)是13.8X9. 18。并且，曝光时间是2分钟。另外，与上述的实施例1及实施例2同样，在本实施例3中，HeLa细胞的摄像也在将所使用的整个装置用暗幕覆盖的状态下进行。
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在本实施例3中，如图9所示，对于用NA为从0. 83到1. 35的物镜拍摄的从图像 B到图像E，能够容易确认HeLa细胞的发光。S卩，从图9的图像B到图像E能够容易观察发光。另一方面，对于用NA为0.65的物镜拍摄的图像A，难以定量地确认发光。另外，图9所示的各图像是通过改变40倍的物镜(奥林巴斯公司制造的“UApo40X Oil Iris”)的光圈位置来使其NA从0.65到1.35阶段性地改变来进行摄像的。由此，在曝光时间是2分钟的情况下，表示只要(ΝΑ/β)2的值为0.01以上，就能够进行导入了虫荧光素酶基因的HeLa细胞的发光图像观察。这里，根据在实施例3中使用的(图8所示的)物镜的(ΝΑ/β )2的值与图9所示的图像(图像Α、图像B及图像C)的发光强度的关系(参照图10)，研究适合于细胞的发光图像观察的物镜的(ΝΑ/β )2的条件。图10是表示以物镜的(ΝΑ/β )2的值为横轴绘制图9 所示的图像(图像Α、图像B及图像C)的发光强度的图。另外，所谓的发光强度，是从来自包括发光而明亮的区域的规定的区域(例如在图9的图像A中用四边形表示的区域)整体的光强度(CCD摄像机的输出值)减去来自不包括发光而明亮的区域(包括不发光而黑暗的区域)且具有与上述规定的区域的面积相同的面积的区域整体的光强度(CCD摄像机的输出值)后的值。如图10所示，能够根据各图像的发光强度的偏差(能够取得图像的发光强度的范围)定量地检测到在图9的图像A的发光强度与图像B的发光强度之间有显著差异、以及在图9的图像B的发光强度与图像C的发光强度之间有显著差异。此外，在图10中图9的图像A的发光强度也包括负的值，所以由图10可知，图9的图像A不适合发光图像观察。因而，根据以上的研究，表示只要物镜的(ΝΑ/β)2的值是0.01以上，就能够充分且可靠地进行细胞的发光图像观察。即，表示适于细胞的图像观察的物镜的(ΝΑ/β)2的值是0.01以上。工业实用性以上，有关本发明的发光试料摄像方法、发光细胞摄像方法及物镜适合在例如以虫荧光素等的发光基因为报告基因、控制基因表达的启动子或增强子的分析、研究复制因子等的效应物基因或各种药剂等的效果等的报告基因检测中使用。
权利要求
1.一种发光试料摄像方法，对发光试料进行摄像，其特征在于，使用由物镜的数值孔径NA、及、投影倍率β表示的、(ΝΑ+β)2的值为0.01以上的物镜和聚光透镜。
2.如权利要求1所述发光试料摄像方法，其特征在于， 上述发光试料是发光蛋白质。
3.如权利要求2所述发光试料摄像方法，其特征在于， 上述发光蛋白质是由导入的基因表达的。
4.如权利要求3所述发光试料摄像方法，其特征在于， 上述基因是虫荧光素酶基因。
5.如权利要求1所述发光试料摄像方法，其特征在于， 上述发光试料是发光性的细胞或发光性的细胞的集合体。
6.如权利要求1所述发光试料摄像方法，其特征在于， 上述发光试料是发光性的组织试料。
7.如权利要求1所述发光试料摄像方法，其特征在于， 上述发光试料是发光性的个体。
8.一种发光细胞摄像方法，对导入了虫荧光素酶基因的发光细胞进行摄像，其特征在于，使用由数值孔径NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值为0.01以上的物镜。
全文摘要
本发明的目的是提供一种能够以较短的曝光时间、进而实时地拍摄鲜明的图像的发光试料摄像方法、发光细胞摄像方法及物镜。在本发明的发光试料摄像方法中，使用由数值孔径(NA)及投影倍率(β)表示的(NA/β)2的值为0.01以上的物镜(2)、聚光透镜(3)、0℃左右的冷却CCD摄像机(4)、监视器(5)，以较短的曝光时间进而实时地拍摄作为发光试料的样本(1)。
文档编号G02B21/36GK102156345SQ20111008687
公开日2011年8月17日 申请日期2005年11月28日 优先权日2004年11月26日
发明者铃木浩文 申请人:奥林巴斯株式会社