专利名称：多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药卫生用品技术领域，具体涉及一种用组织细胞体视学定量分析工具。
背景技术：
随着近代病理学技术的长足发展，人类对疾病病因、病理以及诊断治疗的认识已经深入到组织细胞水平。16世纪末荷兰人发明的显微镜是推动人类认识疾病微观世界的里程碑事件，而E. Ruska和M. Knoll在1932年发明的电子显微镜进一步将组织细胞的观察视野深入到亚细胞水平。在此过程中，人类对组织 细胞或亚细胞结构的观察借助于各种经典染色(如苏木素-伊红、结晶紫、孔雀绿)和免疫染色(如针对组织细胞特定抗原的抗体、细胞内RNA特异性结合片段、荧光标记探针)技术，清晰地揭示了大量疾病发生发展的细胞分子机制。然而，在此过程中，人类对微观世界的观察中，对于组织细胞各种病理变化主要通过定性的方法予以描述，比如出现某种异常组织细胞及其代谢产物(如非典型性增生细胞、肿瘤细胞、癌巢、角化珠)，或正常细胞的增多或减少(如炎性细胞、骨髓细胞)，因此，主流病理分析结果仍然停留在有和无、多与少的定性或半定量水平。对于有经验的病理医师，对细胞和细胞相关结构数量的判断通常会选择以加号或减号的多少(如+，++，+++, _，一，—等)判断病变的早晚或轻重或预后。因此，从形态学角度结合定量分析技术判断疾病的发生、发展以及预后是进一步提升病理诊断水平，夯实病理诊断金标准的关键环节。目前，对组织细胞定量分析判断涉及Hans-Elias提出的体视学方法，即借助计算机及数据处理系统和显微镜成像系统，将二维平面经过成像及计算机分析处理得到三维形态，以实现对组织细胞定量及形态结构分析。然而，在此过程中，对于组织细胞二维平面的观察和分析主要通过显微镜视野调节旋钮实现上下和左右的有序移动，通过图像捕捉结合特定软件(Image J、Photoshop、Image proplus)对相应图像中的组织细胞予以分割、计算。因此，如何准确、均匀、有序定位镜下视野少有关注。因此，目前在图像获取过程中存在的主要问题包括①对某一切片组织特定区域定位不够精确，缺乏定位参数；②连续捕捉不同视野，存在视野间隔不一致，或部分重叠或部分遗漏；③对组织区域特定染色细胞计数不够精确，易于造成遗漏或重复计数，对于阳性染色细胞密度较大的组织区域尤其如此；④在暗视野条件下，荧光染色切片组织定量或半定量视野分析难度进一步增加；⑤组织切片上组织区域面积直接计算较困难难于在镜下直接计算目的组织细胞的几何学参数(如数密度、面积密度和体积密度)。⑦不同镜下观察者捕捉图像操作过程因缺乏定位参数无法重复。事实上，以上七个方面引起的观察数据不精确或偏倚数据并不能够通过增加检测次数得到校正。因此，如何在二维平面完成组织细胞的精确定位和数量、形态参数计算是当前组织细胞定量分析标准化的难点所在
发明内容
针对组织细胞定量分析过程中，无法在显微镜下准确定位、视野捕捉过程无法准确重复、组织细胞几何学参数无法在镜下直接判断以及暗视野条件下上述定位和判断难度进一步增加等难题，本发明提出一套多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，使其能够实现普通视野和暗视野条件下，组织细胞定性、半定量以及定量评估过程中对于二维平面的精确定位，以及组织细胞几何学参数在显微镜下直接判断。有效实现组织细胞切片视野捕捉的可重复性，减少读片过程中依赖操作者经验的人为性评判，可显著降低显微镜操作者的熟练度要求，有效避免读片中因观察不仔细，时机掌握不好、视野调节旋钮旋转幅度不等造成的结果评估偏差，进一步简化和优化组织细胞体视学分析方法在二维平面的操作过程，对于进一步提高病理诊断金标准具有重要科学价值。该系统基于现有组织切片的配套量化系统，具有使用方便，兼容性好、体积小，成本低，功能强的优点。实现本发明目的技术方案如下一种多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其包括组织截面区域分析玻片、组织腔体结构分析玻片、靶点区组织细胞结构分析玻片、组织细胞量化分析玻片、体液细胞 量化玻片。本发明是在玻片上设置体视学定量分析功能区域，相应玻片的体视学定量分析功能区域是以倒置相差光学显微镜常规放大倍数(40-400)为依据而设置。所述组织截面区域分析玻片上设置有等距离纵横交叉的线条，线条的间隔为10Mffl,形成中等十字网格，即单元格面积为100Mm2，十字网格的区域大小以覆盖该玻片25mmX25 mm表面积为标准，作为体视学定量分析功能区域，用于定位分析、计算组织截面积，定位、计数不同视野下组织区域。所述组织腔体结构分析玻片上设置有等距离平行线条，线条的间隔为10 Mffl,形成平行网格，平行网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25 mm表面积为标准，作为体视学定量分析功能区域，用于定位含气组织(肺脏、骨小梁、腺体腔隙)在不同视野下的数目、间隔的厚度、表面积。所述靶点区组织细胞结构分析玻片上设置有环形辐射状网格，环形线条的半径间隔为5 Mm，径向线条等角度设置，辐射状网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25 mm表面积为标准，作为体视学定量分析功能区域，用于实现以镜下特定病灶区或靶点区域为中心，定向观察中心区域周边及外围组织区域组织细胞的病理变化，分析中心病灶对周边组织的影响。并能够对周边特定区域组织进一步放大观察。所述组织细胞量化分析玻片上设置有等距离纵横交叉的线条，线条的间隔为5Mm,形成细微十字网格，单元格面积为25Mm2，十字网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX 25mm表面积为标准，作为体视学定量分析功能区域，用于定位分析组织区域或薄膜表面(骨膜、角膜、醋酸纤维素膜或PVDF膜)内特定细胞的数目和数密度、面积密度等几何学参数；所述体液细胞量化分析玻片上设置有平行的且等长度等距的非连续线段，非连续线段的长度和间隔均为5 Mffl，非连续线段的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25 mm表面积为标准，作为体视学定量分析功能区域，在定位分析体液(血液、脑脊液、尿液、精液、细胞悬液)目的细胞基础上，计算不同细胞的数密度、面密度和体密度。以上各玻片的线条均采用圆弧形凹槽结构，暗视野操作时，凹陷内涂覆有荧光显色效果的无色酞酸酯复合荧光材料，凹槽的深度为较好的是，在玻片的设置线条一面的边缘部分设置磨砂。
镜下使用前，将目的组织细胞载玻片盖玻片区域与以上的一种玻片的特定功能区域对应并“背靠背”紧密贴合，即可在相应视野的显微镜下行体视学定量分析评估。通过采用上述玻片可对普通光学显微镜下组织细胞在二维平面准确定位、计算相应的几何学参数；同时，为保证在暗视野条件下，进一步定位、定量观察特定荧光染色的组织细胞或病变区域，根据特定的组织细胞荧光，对于上述五种分析玻片的线性区域覆盖对比度显著的无色酞酸酯复合荧光材料，以保证特定组织细胞在暗视野条件下能够为荧光色差显著的玻片分析区域覆盖，便于准确完成普通显微镜下的组织细胞定位和几何学参数计算。因此，该系统实现在普通光镜视野和暗视野条件下组织细胞的定位、定性和定量评估，特别是能够在一定空间分辨力基础上，用于有效定量数量、长度、表面积和体积参数，以确保二维图像能够准确反映器官、组织、细胞三维结构。具有使用方便，体积小，成本低，功能强的优点，为组织细胞临床病理学诊断和实验研 究提供了重要的辅助手段。本发明的核心为分析玻片能够满足不同成像系统(含荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、活细胞工作站)光源条件下，组织细胞区域内的特定靶组织或靶细胞准确定位、组织细胞几何学参数的计算以及病灶区域周边毗邻组织细胞的结构与功能相关性分析，实现体视学分析方法在二维平面准确定量，属简易即用型量化分析系统。与现有的依据观察者经验实施的镜下图像捕捉结合体视学软件定量分析方法相比，实现了一次性成像简捷分析、二维图像精准截取临床病理诊断及实验研究所需的组织细胞学评估数据；同时在组织细胞海量数据条件下，能够有效避免不同操作人员在组织细胞图像截取和分析中出现偏倚；尤其便于盲法条件下，提高病理诊断医师和实验研究人员对组织细胞病理诊断“金标准”的含“金”量。该分析系统结构简单，功能较全，成本低廉，检测数据稳定、可靠，是临床病理诊断和基础实验研究中不可替代的辅助定量手段，具有广泛的应用前景。
图1示出了本系统普通光镜视野或暗视野下组织截面区域量化分析玻片示意图；图1A是图1中十字网格区域的放大示意图；图2示出了本系统普通光镜视野或暗视野下组织腔体结构量化分析玻片实物图；图2A是图2中平行网格区域的放大示意图；图3示出了本系统普通光镜视野或暗视野下靶点区组织细胞结构量化分析玻片示意图；图3A是图3中辐射状网格区域的放大示意图；图4示出了本系统普通光镜视野或暗视野下组织细胞量化分析玻片示意图；图4A是图4中十字网格区域的放大示意图；图5示出了本系统普通光镜视野或暗视野下体液细胞量化分析玻片示意图；图5A是图5中非连续线段区域的放大示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述玻片的制作方法是首先按照常规病理组织载玻片制备的尺寸制作出玻片，在其一面的边缘进行磨砂处理，形成磨砂部位6 ;然后在距磨砂部位向中心20 mm处通过机械方法制备表面积为25 mmX25 mm的线条区域,具体是参见图1和图1A，组织截面区域分析玻片1:在玻片的线条区域制作等距离纵横交叉的线条，线条的间隔为10 Mffl，形成中等十字网格11，面积为100Mffl2/单元格，十字网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25 mm表面积为标准。参见图2和图2A，组织腔体结构分析玻片2 :在玻片的线条区域制作等距离平行线条，线条的间隔为10 Mffl，形成平行网格21，平行网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25mm表面积为标准。参见图3和图3A，靶点区组织细胞结构分析玻片3 :在玻片的线条区域制作环形辐射状网格31，辐射状网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25 mm表面积为标准，环形线条的半径间隔为5 Mffl，径向线条等角度设置。 参见图4和图4A，组织细胞量化分析玻片4 :在玻片的线条区域制作等距离纵横交叉的线条，线条的间隔为5 Mffl，形成细微十字网格41，面积为25Mffl2/单元格，十字网格的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25 mm表面积为标准。参见图5和图5A :体液细胞量化分析玻片5 :在玻片的线条区域制作平行的且等长度等距的非连续线段51，长度和间隔均为5 Mffl，线段的区域大小以覆盖该玻片25 mmX25mm表面积为标准。以上各玻片上的线条均为圆弧形凹槽，凹槽深度为另外，对于暗视野观察玻片，在线条凹槽中图上不同荧光显色效果的无色酞酸酯复合荧光材料，最终制成一套完善的组织细胞体视学定量分析系统。具体使用例例1:培养细胞形态的定量分析1.在普通或荧光显微镜/激光共聚焦扫描显微镜下，精确定位单个目的细胞，按照体视学方法，计算目的细胞的数目。例2 :培养细胞的迁移功能分析1.在普通或荧光显微镜/激光共聚焦扫描显微镜下，观察在生物电场或趋化物作用下，细胞或组织内目的细胞定向迁移速度，通过评估细胞的迁移活性，研究细胞定向运动功能。例3 :组织细胞形态的定量分析1.在普通或荧光显微镜/激光共聚焦扫描显微镜下，精确定位组织细胞，按照体视学方法，计算组织特定区域内的目的细胞数目。例4 :病灶或靶点区组织细胞形态的定量分析1.在普通或荧光显微镜/激光共聚焦扫描显微镜下，实现以镜下特定病灶区或靶点区域为中心，定向观察中心区域周边及外围组织区域组织细胞的病理变化，分析中心病灶对周边组织的影响。并能够对周边特定区域组织进一步放大观察。例5 :组织细胞形态的定量分析1.在普通或荧光显微镜/激光共聚焦扫描显微镜下，按照体视学方法，计算组织细胞的数量密度、面积密度和体积密度；并能够计算空腔脏器(肺脏腔、腺体腔)组织间隔的相对厚度。
综上所述，多功能组织细胞体视学定量分析系统有效提高实验操作的精确度和功能多样化，具有良好的开发前景，尤其对特定病变组织细胞精准观察和显著减少操作者的熟练度要求，显著观察中因观察不仔细，时间掌握不好等因素影响实验效果，大大提高病理诊断分析的可重复性和标准化。并且具有使用方便，体积小，成本低，功能强的优点，无疑是一种理想的选择。经使用证实，使用多功能组织细胞体视学定量分析系统，可适用于常规医学组织 细胞在明暗不同视野下的准确定位、图像捕捉和几何学参数评估，是临床病理诊断和基础实验研究中不可替代的定量分析玻片，具有广泛的应用前景。
权利要求
1.多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于，其包括组织截面区域分析玻片、组织腔体结构分析玻片和组织细胞量化分析玻片；所述组织截面区域分析玻片上设置有等距离纵横交叉的线条，线条的间隔为10 Mffl，形成中等十字网格，即单元格面积为100Mm2，用于定位分析、计算组织截面积，定位、计数不同视野下组织区域；所述组织腔体结构分析玻片上设置有等距离平行线条，线条的间隔为10 Mffl，形成平行网格，用于定位含气组织在不同视野下的数目、间隔的厚度、表面积；所述组织细胞量化分析玻片上设置有等距离纵横交叉的线条，线条的间隔为5 Mffl，形成细微十字网格，单元格面积为25Mffl2，用于定位分析组织区域或薄膜表面内特定细胞的数目和数密度、面积密度等几何学参数。
2.根据权利要求1所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于，还包括有靶点区组织细胞结构分析玻片，所述靶点区组织细胞结构分析玻片上设置有环形辐射状网格，环形线条的半径间隔为5 Mffl，径向线条等角度设置，用于实现以镜下特定病灶区或靶点区域为中心，定向观察中心区域周边及外围组织区域组织细胞的病理变化，分析中心病灶对周边组织的影响。
3.根据权利要求1或2所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于， 还包括有体液细胞量化玻片，所述体液细胞量化分析玻片上设置有平行的且等长度等距的非连续线段，非连续线段的长度和间隔均为5 Mffl，用于在定位分析体液目的细胞基础上，计算不同细胞的数密度、面密度和体密度。
4.根据权利要求1或2所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于，所述十字网格、平行网格、辐射状网格和非连续线段的区域大小都以覆盖各自玻片的25 mmX 25 mm表面积为标准。
5.根据权利要求4所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于，各玻片的线条采用圆弧形凹槽结构，凹陷内涂覆有荧光显色效果的无色酞酸酯复合荧光材料。
6.根据权利要求4所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于，所述凹槽的深度为l_2Mm。
7.根据权利要求4所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于所述线条设置在各玻片的一面的中间的面积为25 mmX25 mm的区域。
8.根据权利要求4所述的多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其特征在于所述玻片的设置线条一面的边缘部分有磨砂。
全文摘要
本发明涉及一种多功能组织细胞体视学定量分析玻片系统，其包括组织截面区域分析玻片、组织腔体结构分析玻片、靶点区组织细胞结构分析玻片、组织细胞量化分析玻片、体液细胞量化玻片。相应玻片的体视学定量分析功能区域以倒置相差光学显微镜常规放大倍数(40-400)为依据，由不同间隔(5 μm、10μm)的线性凹槽或半径间隔为5 μm的圆弧形的凹槽分割而成，凹槽深度为1-2μm；在满足普通光学显微镜光源观察的基础上，对于暗视野观察玻片，凹陷区域行不同荧光显色效果的无色酞酸酯复合荧光材料，构成一套完善的组织细胞体视学定量分析玻片系统。本发明能够实现普通视野和暗视野条件下，组织细胞定性、半定量以及定量评估过程中对于二维平面的精确定位，以及组织细胞几何学参数在显微镜下直接判断。
文档编号G02B21/34GK103013823SQ201210574138
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者杨策, 蒋建新, 李海胜, 王海燕, 杜娟, 高洁, 王正国 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院