专利名称：可产生三维立体图像的光学显微成像方法
技术领域：
本发明涉及光学显微成像方法，特别涉及一种可产生三维立体图像的光学显微成像方法。
背景技术：
可产生三维立体图像的光学显微成像方法是应某些特殊样品的观察要求而产生的。以透明活细胞样品为例，由于其与周围介质有相近光吸收系数，仅在折射率上存在细微差别，因此很难用一般的显微方法进行观察。一种解决方法是将其染色，但通常染色后的细胞状态已经发生改变甚至死亡，无法满足对活细胞观察的要求。再以金相材料样品为例，通常希望获得材料上的不平整表面、裂纹、微孔、凹陷、晶界等信息，这就要求显微方法能够把其表面立体分布情况和有关细微结构都表现出来。为满足上述需求，目前已发展出的可产生三维立体图像的显微方法主要有微分干涉相衬法(Differential Interfere Contrast,DIC)和霍夫曼调制相衬法(Hoffman Modulation Contrast, HMC)。微分干涉相衬法所必需部件包括起偏器、检偏器、微分干涉相衬组件插板(DIK组件插板)。起偏器是把光源变为线偏振光；检偏器可以使满足干涉条件的相干光进行干涉。DIK组件插板是微分干涉相衬法的核心部件，其上装配有以渥拉斯顿棱镜为基础改良后的DIC棱镜。DIK组件插板上有两个调节旋钮，其中一个用来调节组成DIC棱镜的两个棱镜间的相对位置，使其厚度产生微小的改变从而引起光程或光程差的微小变化，产生明显的干涉相衬效果；较小的一个用来调节DIC棱镜的高低位置，以配合不同倍数物镜后焦平面位置上的差异，从而确保DIC观察视场中能获得均匀的照明。通过以上部件的组合，可以使样品上出现阴影效果，对图像起到衬托作用，从而产生具有三维立体感的浮雕图像。霍夫曼调制相衬法的基本原理是利用斜射光照射，它将相位梯度转换为光强度变化，可以使厚样品观察有立体感。利用霍夫曼调制相衬法实现对样品的立体成像需要三个专用附件:一个带狭缝的聚光镜，与其相对应的带狭缝(光强度调制)的物镜，聚光镜中还有一个可以旋转的起偏器。照明光经过起偏器后变为偏振光，再经过带狭缝的聚光镜，使光通量降低，照射到样品上的光与样品相互作用后会产生相位的差别，再经带狭缝(光强度调制)的物镜会将相位梯度变化转换为光强度变化，并将这种衬度放大，从而产生具有立体感的图像。上述两种三维成像显微方法虽可满足特殊样品观察的要求，但均存在以下缺点:首先，在使用不同放大倍数的物镜时都需要与之对应的一套专用附件；其次，部件繁多，结构复杂，调节困难；再次，对其中某些光学元件(如DIC棱镜)的光学质量要求甚高，价格昂贵，在一定程度上限制了其更广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可产生衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像的光学显微成像方法。
本发明的基本原理是:利用单一光源在被观察样品周围制造环形照明光，收集样品暗场光的同时收集少量明场光，通过调节照明或收集方式调节样品暗场光在收集光中的比例，可使被观察的样品形成衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像。本发明所述三维立体图像的光学显微成像方法的第一技术方案，该光学显微成像方法为透射式三维立体成像方法，包括以下步骤:(I)镜头选择:根据待观察的样品选取合适的物镜以及比此物镜NA值小的聚光镜，所述聚光镜需能产生环形照明光，将选取好的镜头分别安装在显微镜的物镜转盘和聚光镜平台上；(2)样品制备:将样品固定在载物台上；(3)样品聚焦:打开显微镜，利用单一光源通过聚光镜在样品周围制造环形照明光，先调节聚光镜，将光斑聚焦到样品上，再调节物镜，使其聚焦到样品上；(4)衬度调节:此时可观测到样品的三维立体光学显微图像，通过微调聚光镜在样品上的聚焦深度，或通过调节光阑及挡光片的尺寸，或选择NA值差别不同的物镜及聚光镜组合，或使用空间光调制器，可调节样品暗场光在收集光中的比例，实现衬度调节，可使被观察的样品形成衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像。在步骤(I)中，所述聚光镜可选择暗场聚光镜或选择普通聚光镜搭配挡光片。在步骤(3 )中，所述单一光源可为白光光源或单色光源，所述单色光源可为激光光源。本发明所述三维立体图像的光学显微成像方法的第二技术方案，该光学显微成像方法为反射式三维立体成像方法，包括以下步骤:(I)镜头选择:根据根据待观察的样品选取合适的物镜；(2)样品制备:将样品固定在载物台上；(3)样品聚焦:打开显微镜，利用单一光源入射光，调节物镜使其光斑聚焦到样品上；(4)挡光片放置:将尺寸合适的挡光片放置在入射光路中的孔径光阑处以挡住入射光中心，产生环形照明光；(5)衬度调节:通过调整光阑的大小，即可观测到样品的三维立体显微成像；通过调整光强强度使三维立体显微图像明亮清晰，可通过缩小孔径光阑的大小，或通过使用挡光面积更大的挡光片，或使用空间光调制器来调节样品暗场光在收集光中的比例，提高成像的衬度，如果光线过暗，且图像中心出现黑斑，则选择挡光面积更小的挡光片。 在步骤(3 )中，所述单一光源可为白光光源或单色光源，所述单色光源可为激光光源。与现有的技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果:(I)本发明提供了一种可以实现三维立体成像效果的简单易行、经济实用的光学显微成像方法。(2)本发明与微分干涉相衬法和霍夫曼调制相衬法相比，不需要任何外加的专用附件。(3)本发明在各种光学显微镜上采用各种不同倍率的物镜，以透射模式或反射模式均可实现。(4)本发明的应用范围广泛，对样品无限制。(5)本发明的立体成像效果显著，可以获得被观察样品衬度高、立体感强、细微结构表现丰富边界清晰的三维立体图像。(6)本发明在实现方式上简便易行，不需要外加的专用附件，不受显微镜类型(倒置或正置显微镜)及观察方式(透射式或反射式)的限制。本发明实现的三维立体效果清晰明显，不受样品类型的限制，对金相样品、活细胞样品、透明或非透明样品均可实现细节信息清晰丰富的三维立体图像效果。本发明可在细胞生物学、立体生物学以及各种金相材料观察等领域中广泛应用。
图1为采用本发明所述透射式三维立体成像方法，在正置光学显微镜上对样品进行三维立体成像的示意图(实施例1)。图2为采用本发明所述反射式三维立体成像方法，在倒置光学显微镜上对样品进行三维立体成像的示意图(实施例2)。图3为在倒置显微镜下采用现有透射明场照明方式对CasKi活细胞进行成像的图片。图4为在同一倒置显微镜下采用现有透射暗场照明方式对同一 CasKi活细胞同一位置进行成像的图片。图5为在同一倒置显微镜下采用本发明对同一 CasKi活细胞同一位置进行成像的图片(实施例3)。图6为在一倒置显微镜下采用现有明场照明方法对一微电极阵列芯片进行成像的图片。图7为在同一倒置显微镜下采用现有暗场照明方法对同一微电极阵列芯片同一位置进行成像的图片。图8为是在同一倒置显微镜下采用本发明对同一微电极阵列芯片同一位置进行成像的图片(实施例4)。
具体实施例方式实施例1采用本发明所述透射式三维立体成像方法，在普通正置光学显微镜上实现对样品进行三维立体成像观察的一种方式。如图1所示，将样品4固定在载物台3上，在样品4下方利用暗场聚光镜2或挡光片I产生环形照明光6照射到样品4上，在样品4上方由物镜5收集样品4的暗场光7，同时收集少量明场光6，对样品4进行三维立体成像。图1中的双头箭头Z表示聚光镜2上下移动方向，即表示可通过调节聚光镜2在样品上的聚焦深度来调节成像的衬度。其余箭头表示光线。实施例2采用本发明所述反射式三维立体成像方法，在普通倒置显微镜上实现对样品进行三维立体成像观察的一种方式。如图2所示，将样品4固定在载物台3上，在入射光路上加入挡光片I产生环形照明光6经半反半透镜片2后通过物镜5聚焦到样品4上，利用同一个物镜5收集样品4的暗场光7和少量明场光6，对样品4进行三维立体成像。图2中的双头箭头Z表示挡光片I上下移动方向，即表示可通过改变挡光片I的挡光面积来调节成像的衬度。其余箭头表示光线。实施例3如图3所示，为一 CasKi活细胞在普通透射明场照明方式下所成的像，可见在明场成像效果下，细胞轮廓虽清晰可见，但衬度较低，缺乏细胞表面的细节信息。如图4所示，为同一活细胞同一位置在暗场照明方式下所成的像，可见在暗场成像效果下，由于细胞表面的不均一性导致对光的散射程度的不同可以清晰的体现出来，但细胞整体成像效果模糊不清。与上述两种方法相比，如图5所示，以本发明所述透射式三维立体成像方法在一普通倒置显微镜上实现对活细胞的三维立体成像，成像物镜都采用NA值为0.55的50倍暗场镜头。利用本发明方法对同一样品的同一位置进行成像，可以获得成像衬度高、细胞立体感强、边界清晰的图像，例如细胞核部分以及胞间连丝等也清晰可见，细节信息丰富，如图5所示。具体方法是:样品上方使用一 NA值为0.25的10倍暗场聚光镜，使得照明光透过镜头时产生环形照明光照射到样品上，调节上下两个镜头到样品的距离，可以调节成像效果的衬度。实施例4如图6所示，为一微电极阵列芯片在普通反射明场照明方式下所成的像，明视场观察是光学显微镜中较普通的观察方法，可见它可以给出材料表面的整体信息，但缺乏对细微结构，如微痕和缺陷的表征。如图7所示，为同一微电极阵列芯片同一位置在普通反射暗场照明方式下所成的像，暗视场观察方法可强调材料表面微痕和缺陷的信息，但缺乏对样品表面整体状态的表征。与上述两种成像方法相比，利用本发明方法不仅可以获得材料表面清晰的整体图像，还能突出表面不平整状态、凹陷、微痕等细节信息。如图8所示，以本发明所述反射式三维立体成像方法在一通用倒置显微镜上实现对材料(微电极阵列芯片)表面不平整状态、凹陷、微孔的表征，成像物镜都采用NA值为0.55的50倍暗场镜头。具体方法是:在入射光路的视场光阑前同光轴处加入一片直径为5mm的圆形挡光片产生环形照明光，通过NA值为0.55的50倍镜头聚焦于样品，从样品的暗场光及少量照明光在通过半反半透的镜片后被同一镜头收集，形成衬度，通过改变挡光片挡光部分的尺寸可以调节成像效果的衬度。由上述实施例可见，利用本发明方法可产生衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像，且方法简单易行、经济实用，不需要任何外加的专用附件，对显微镜和样品无严格要求和限制，应用前景较广。
权利要求
1.可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于包括以下步骤: (1)镜头选择:根据待观察的样品选取合适的物镜以及比此物镜NA值小的聚光镜，所述聚光镜需能产生环形照明光，将选取好的镜头分别安装在显微镜的物镜转盘和聚光镜平台上; (2)样品制备:将样品固定在载物台上； (3)样品聚焦:打开显微镜，利用单一光源通过聚光镜在样品周围制造环形照明光，先调节聚光镜，将光斑聚焦到样品上，再调节物镜，使其聚焦到样品上； (4)衬度调节:此时可观测到样品的三维立体光学显微图像，通过微调聚光镜在样品上的聚焦深度，或通过调节光阑及挡光片的尺寸，或选择NA值差别不同的物镜及聚光镜组合，或使用空间光调制器，可调节样品暗场光在收集光中的比例，实现衬度调节，可使被观察的样品形成衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像。
2.如权利要求1所述的可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于在步骤(I)中，所述聚光镜为暗场聚光镜或普通聚光镜搭配挡光片。
3.如权利要求1所述的可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于在步骤(3)中，所述单一光源为白光光源或单色光源。
4.如权利要求3所述的可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于所述单色光源为激光光源。
5.可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于包括以下步骤: (1)镜头选择:根据待观察的样品选取合适的物镜； (2)样品制备:将样品固定在载物台上； (3)样品聚焦:打开显微镜，利用单一光源产生入射光，调节物镜使其光斑聚焦到样品上； (4)挡光片放置:将尺寸合适的挡光片放置在入射光路中的孔径光阑处以挡住入射光中心，产生环形照明光； (5)衬度调节:通过调整光阑的大小，即可观测到样品的三维立体显微成像；通过调整光强度使三维立体显微图像明亮清晰，可通过缩小孔径光阑的大小，或通过使用挡光面积更大的挡光片，或使用空间光调制器来调节样品暗场光在收集光中的比例，提高成像的衬度，如果光线过暗，且图像中心出现黑斑，则选择挡光面积更小的挡光片。
6.如权利要求5所述的可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于在步骤(3)中，所述单一光源为白光光源或单色光源。
7.如权利要求6所述的可产生三维立体图像的光学显微成像方法，其特征在于所述单色光源为激光光源。
全文摘要
可产生三维立体图像的光学显微成像方法，涉及光学显微成像方法。提供一种可产生衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像的光学显微成像方法。镜头选择；样品制备；样品聚焦；衬度调节。或镜头选择；样品制备；样品聚焦；挡光片放置；衬度调节。基本原理利用单一光源在被观察样品周围制造环形照明光，收集样品暗场光的同时收集少量明场光，通过调节照明或收集方式调节样品暗场光在收集光中的比例，可使被观察的样品形成衬度高、立体感强、细微结构表现丰富、边界清楚的三维立体图像。
文档编号G02B21/06GK103197413SQ20131012993
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者郑晓姗, 任斌, 崔颜, 宗铖, 刘必聚 申请人:厦门大学